專利名稱：修飾的因子Ⅶ多肽的液體組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有修飾的因子VII多肽的液體含水組合物，和制備以及使用這些組合物的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及對化學和/或物理降解穩(wěn)定的液體組合物。
背景技術：
已經(jīng)鑒定了與血液凝固過程有關的多種因子，包括因子VII，一種血漿糖蛋白。血管壁損傷后暴露于循環(huán)血的組織因子(TF)與循環(huán)中存在的FVIIa之間復合物的形成啟動止血(haemostasis)，F(xiàn)VIIa的含量相當于總FVII蛋白量的約1％。FVII在血漿中主要以單鏈酶原存在，其被FXa切割成兩條鏈的活化形式——FVIIa。已經(jīng)研制了重組活化因子VIIa(rFVIIa)作為一種止血(pro-haemostatic)劑原。
修飾的因子VII分子是凝血因子VII的衍生物，其中該分子(例如催化部位)被修飾，使得活性形式——因子VIIa——的催化活性降低，而與組織因子結合的能力保留。這些修飾的因子VII分子已經(jīng)在WO92/15686、WO 94/27631、WO 96/12800和WO 97/47651中描述。因此，與天然因子VIIa分子類似，修飾的因子VIIa將結合組織因子，但是與天然因子VIIa相反，修飾的因子VII不會激活外源性凝血途徑的后續(xù)步驟。因此，修飾的因子VII分子只是作為血纖蛋白凝塊形成的一種抑制劑。因此，已經(jīng)建議修飾的因子VIIa分子通過阻斷凝血酶的產(chǎn)生和隨后血纖蛋白的沉積用于血管損傷的治療(WO 97/47651)。
作為一種蛋白質，修飾的因子VII分子易于被物理降解，包括變性和聚集，如形成可溶的或不可溶的二聚體、寡聚體和多聚體形式的聚合體，或者易于被化學降解，包括例如水解、脫酰胺和氧化?？偟暮蠊ㄐ揎椀囊蜃覸II分子的活性喪失，形成毒性和免疫原性的降解產(chǎn)物，在注射降解的修飾因子VII分子后造成血栓形成的嚴重危險，注射用針頭的堵塞，和非均一性的危險。因此，含有修飾的因子VII的藥物的安全性和有效性與修飾的因子VII的穩(wěn)定性直接有關。
因此，含有修飾的因子VII分子的組合物需要穩(wěn)定。具體而言，需要貯存和處理含有修飾的因子VII的藥物，而不需要冰箱，其中組合物在使用前可以長期貯存，如至少6個月。
希望的是制備修飾的因子VIIa的施用形式，適于貯存和遞送。理想地，藥物產(chǎn)品作為一種液體貯存和施用。此外，藥物產(chǎn)品也可以凍干，即冷凍干燥，然后在患者使用之前才添加適當?shù)南♂寗┲亟ā＠硐氲?，藥物產(chǎn)品具有足以長期貯存(即6個月以上)的穩(wěn)定性。
決定制成的藥物產(chǎn)品是以液體形式保存還是凍干保存通常以這些形式的蛋白質藥物的穩(wěn)定性為基礎。蛋白質穩(wěn)定性能夠受如離子強度、pH、溫度、重復凍融循環(huán)和暴露于剪切力等因素影響。由于物理不穩(wěn)定性，包括變性和聚集(可溶的和不可溶的聚合體形成)，以及化學不穩(wěn)定性，包括如水解、脫酰胺和氧化等，活性蛋白質可能丟失。關于蛋白質藥物穩(wěn)定性的綜述，參見，例如Manning等人，PharmaceuticalResearch 6903-918(1989)。
盡管可能發(fā)生蛋白質的不穩(wěn)定性已經(jīng)普遍知道，但是預測一種具體蛋白質的具體的不穩(wěn)定性問題是不可能的。所有這些不穩(wěn)定性都能導致蛋白質副產(chǎn)物或衍生物的形成，它們具有降低的活性、提高的毒性和/或提高的免疫原性。實際上，蛋白質沉淀可以導致血栓形成，劑型和劑量的不均一性，以及注射器堵塞。此外，翻譯后修飾，如N端某些谷氨酸殘基的γ羧化，和碳水化合物側鏈的加入，也提供了在貯存后容易修飾的潛在位點。因此，一種蛋白質的所有藥物組合物的安全性和有效性與其穩(wěn)定性直接有關。以液體劑型保持穩(wěn)定性一般不同于凍干劑型，因為分子運動的可能性大大提高，因此分子相互作用的可能性提高。以濃縮形式保持穩(wěn)定性也是不同的，因為在升高的蛋白質濃度時傾向于形成聚合體。
研制一種液體組合物要考慮許多因素。短期(即不到6個月)液體穩(wěn)定性通常依賴于避免總體結構改變，如變性和聚集。這些方法在關于大量蛋白質的文獻中有描述，并且存在穩(wěn)定劑的許多例子。眾所周知，可有效穩(wěn)定一種蛋白質的試劑實際上可以使另一種不穩(wěn)定。一旦蛋白質對于總體結構改變穩(wěn)定，研制一種具有長期穩(wěn)定性(例如6個月以上)的液體組合物依賴于針對該蛋白質特異的降解類型進一步穩(wěn)定蛋白質?？赡馨ǜ嗟木唧w降解類型，例如二硫鍵不規(guī)則、某些殘基氧化、脫酰胺、環(huán)化。盡管不總是能夠確定個別的降解種，但是發(fā)展了測定法監(jiān)測細微的改變，以監(jiān)測具體賦形劑獨特地穩(wěn)定目的蛋白質的能力。
除了穩(wěn)定性考慮之外，人們通常選擇全世界多家醫(yī)藥管理機構批準的賦形劑。組合物接近等滲、組合物在注射/輸液后pH處于生理適當范圍內是希望的，可能導致患者的其它疼痛和不適。
關于蛋白質組合物的綜述，參見，例如Cleland等人，穩(wěn)定的蛋白質組合物的研發(fā)詳述蛋白質聚集、脫酰胺和氧化，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1993，10(4)307-377；和Wang等人，蛋白質和肽的腸胃外組合物穩(wěn)定性和穩(wěn)定劑，Journal ofParenteral Science and Technology 1988(增刊)，42(2S)。
關于蛋白質穩(wěn)定的其它重要公開文本如下U.S.20010031721.A1(American Home Products)涉及高度濃縮、凍干的液體因子IX組合物。
U.S.5,770,700(遺傳學研究所)涉及液體因子IX組合物。
WO 97/19687(美國紅十字會)涉及血漿蛋白(特別是因子VIII和因子IX)的液體組合物。
U.S.4,297,344公開了凝血因子II和VIII、抗凝血酶III和纖溶酶原對熱的穩(wěn)定，方法是添加選擇的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、羥脯氨酸、谷氨酰胺和氨基丁酸，和碳水化合物，如單糖、寡糖或糖醇。
研制修飾的因子VIIa的含水組合物具有以下優(yōu)點消除了重建的錯誤，從而提高了劑量精確性，以及簡化了產(chǎn)品的臨床應用，從而提高了患者的順應性。理想地，修飾的因子VIIa的組合物應當在寬蛋白質濃度范圍內穩(wěn)定6個月以上。這使得施用方法具有靈活性。濃縮形式通常允許施用較小的體積，從患者的角度出發(fā)這是非常希望的。關于施用和使用的容易程度，液體組合物比凍干產(chǎn)品有許多優(yōu)點。
修飾的因子VII現(xiàn)在能夠在液體制劑中提供，需要在-80℃下凍存。
因此，本領域需要提高修飾的因子VII多肽的穩(wěn)定性和提供適于在2-8℃下長期貯存6個月以上的液體組合物的方法。因此，本發(fā)明的一個目的是提供修飾的因子VII多肽的含水組合物，它將可接受地控制降解產(chǎn)物。
發(fā)明概述我們發(fā)現(xiàn)，修飾的因子VII或其類似物(“修飾的因子VII多肽”)，當與適于將pH保持在約4.0-約8.0的試劑、抗氧化劑和鈣鹽一起在水溶液中配制時，在物理和化學上是穩(wěn)定的。
一方面，本發(fā)明提供一種液體含水組合物，其含有(i)一種修飾的因子VII多肽；(ii)一種試劑，其適于將pH保持在約4.0-約8.0范圍；(iii)一種抗氧化劑；和(iv)一種試劑，其選自鈣鹽、鎂鹽或其混合物。
在不同實施方案中，pH保持在約4.0-約7.0，如約4.5-約7.0，約5.0-約7.0，約5.5-約7.0，或約6.0-約7.0。
在一個實施方案中，抗氧化劑(iii)選自L-或D-甲硫氨酸，甲硫氨酸類似物，含甲硫氨酸的肽，甲硫氨酸同源物，抗壞血酸，半胱氨酸，高半胱氨酸，谷胱甘肽(gluthatione)，胱氨酸和胱硫醚；優(yōu)選地，該抗氧化劑是L-甲硫氨酸。
在不同實施方案中，抗氧化劑以約0.1-約5.0mg/ml的濃度存在，如約0.1-約4mg/ml，約0.1-約3mg/ml，約0.1-約2mg/ml，或約0.5-約2mg/ml。
在另一個實施方案中，該組合物還含有(v)一種張力調節(jié)劑(tonicity modifying agent)。在一個實施方案中，張力調節(jié)劑(v)選自中性鹽；單糖、二糖或多糖；糖醇；氨基酸；或小肽，或至少兩種該改良劑的混合物。在一個優(yōu)選實施方案中，張力調節(jié)劑是甘露醇或一種中性鹽，優(yōu)選地是氯化鈉。在一個實施方案中，張力調節(jié)劑(v)以1mM-500mM的濃度存在，如10-250mM。
在另一個實施方案中，該組合物還含有(vi)一種非離子表面活性劑。在一個實施方案中，該非離子表面活性劑(vi)的含量為0.005-2％重量。在一個實施方案中，非離子表面活性劑是一種聚山梨醇酯(polysorbate)或泊洛沙姆(poloxamer)或聚氧乙烯烷基醚，如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80，或聚氧23月桂醚。
在本發(fā)明的一個實施方案中，適于將pH保持在約4.0-約8.0的試劑(ii)選自下列酸和鹽檸檬酸鹽、乙酸鹽、組氨酸、蘋果酸鹽、磷酸鹽、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、咪唑、TRIS、乳酸鹽、甘氨酰甘氨酸、PIPES、甘氨酸或至少兩種該試劑的混合物。在一個實施方案中，試劑(ii)的濃度為約1mM-約50mM，如約10mM。
在再一個實施方案中，鈣鹽和/或鎂鹽(試劑(iv))以約5mM-約150mM的濃度存在，如約5mM-約100mM，約5mM-約50mM，如約10mM-約50mM。
在優(yōu)選實施方案中，鈣鹽選自氯化鈣、乙酸鈣、葡糖酸鈣和乙酰丙酸(laevulate)鈣，鎂鹽選自氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂、葡糖酸鎂和乙酰丙酸鎂。
在另一個實施方案中，該組合物還含有(vii)一種防腐劑，如苯酚、芐醇、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、氯芐烷銨或芐索氯銨(benzaethonium chloride)。
在一個實施方案中，該組合物是等滲的。在一個實施方案中，該組合物為了藥物施用而配制。在一個實施方案中，該組合物在2-8℃下穩(wěn)定和/或被穩(wěn)定至少6個月。
在本發(fā)明的一個實施方案中，當使用如本說明書所述的凝血測定、蛋白水解測定或TF結合測定法中一種或多種檢測時，修飾的因子VII多肽相對于野生型因子VIIa，其生物活性小于野生型因子VIIa的比活性的約25％，優(yōu)選地小于約10％，更優(yōu)選地小于約5％，最優(yōu)選地小于約1％。
在一系列實施方案中，修飾的因子VII多肽選自人和牛因子VII，其中活性部位殘基Ser344被修飾，被替換為Gly、Met、Thr或更優(yōu)選地Ala；人因子VII，其中殘基Lys341被替換；人因子VII，其中殘基Asp242被替換；人因子VII，其中殘基His193被替換；FVII-(K341A)；FVII-(S344A)；FVII-(D242A)；FVII-(H193A)；活性部位修飾的一種因子VII多肽，此修飾是通過與選自下列的試劑反應肽基氯甲基酮或肽基氯代甲烷；氮雜肽(azapeptide)；?；瘎?，如多種胍基苯甲酸衍生物和3-烷氧基-4-氯異香豆素；磺酰氟，如苯甲磺酰氟(PMSF)；氟磷酸二異丙酯(DFP)；甲苯磺酰丙基氯甲基酮(TPCK)；甲苯磺酰賴氨酰氯甲基酮(TLCK)；硝基苯磺酸；雜環(huán)蛋白酶抑制劑，如異香豆素和香豆素；活性部位修飾的一種因子VII多肽，此修飾是通過與選自下列的試劑反應L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，和丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮。
在優(yōu)選實施方案中，修飾的因子VII多肽選自FVII-(S344A)；FVII-(H193A)；和活性部位修飾的一種因子VII多肽，此修飾是通過與選自下列的試劑反應L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，和丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮和丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮。
在一系列實施方案中，修飾的因子VII多肽以約0.1mg/ml-約15mg/ml的濃度存在，如約0.5mg/ml-約10mg/ml，約0.5mg/ml-約5.0mg/ml，或約1.0mg/ml-5.0mg/ml。
另一方面，本發(fā)明提供一種方法，用于制備修飾的因子VII多肽的液體水組合物，該方法包括在一種溶液中提供修飾的因子VII多肽，該溶液含有(ii)一種試劑，其適于將pH保持在約4.0-約8.0；(iii)一種抗氧化劑；和(iv)一種試劑，其選自鈣鹽、鎂鹽或其混合物。
另一方面，本發(fā)明涉及該組合物在制備用于抑制血液凝固的藥物中的用途。另一方面，本發(fā)明涉及該組合物在制備用于抑制組織因子介導的反應的藥物中的用途。
另一方面，本發(fā)明涉及一種抑制受試者中血液凝固的方法，該方法包括對需要的受試者施用有效量的液體水組合物，其中含有(i)一種修飾的因子VII多肽，(ii)一種試劑，其適于將pH保持在約4.0-約8.0；(iii)一種抗氧化劑；和(iv)一種試劑，其選自鈣鹽、鎂鹽或其混合物。
另一方面，本發(fā)明涉及一種抑制受試者中組織因子介導的反應的方法，該方法包括對需要的受試者施用有效量的液體水組合物，其中含有(i)一種修飾的因子VII多肽，(ii)一種試劑，其適于將pH保持在約4.0-約8.0；(iii)一種抗氧化劑；和(iv)一種試劑，其選自鈣鹽、鎂鹽或其混合物。
在不同的實施方案中，不希望的血液凝固與選自下列的條件有關血管成形術，深靜脈血栓形成，肺栓塞，中風，彌散性血管內凝血(DIC)，與革蘭氏陰性內毒素血癥有關的組織(例如肺和/或腎)中的血纖蛋白沉積，和心肌梗死。
在不同的實施方案中，組織因子介導的反應與選自下列的疾病有關全身性炎癥反應綜合征(SIRS)，急性呼吸系統(tǒng)疾病綜合征(ARDS)，多器官功能衰竭(MOF)，HUS和TTP。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的組合物可用作穩(wěn)定的、優(yōu)選地即用的修飾的因子VII多肽的組合物。當貯存于2-8℃時，該組合物至少穩(wěn)定6個月，優(yōu)選地可達36個月。當在2-8℃至少貯存6個月時，該組合物是化學和/或物理穩(wěn)定的，特別是化學穩(wěn)定的。
“穩(wěn)定的”是指組合物在2-8℃貯存6個月后，至少保留其最初生物活性的50％，其測定是使用基本如WO 92/15686(實施例III)所述的競爭性凝血測定法，或如本說明書中所述的測定法5-8中的一種或多種(參見下文“測定法”部分)。優(yōu)選地，穩(wěn)定的組合物在2-8℃貯存6個月后，至少保留其最初活性的80％。
術語“物理穩(wěn)定的”是指一種組合物，其目視保持澄清。組合物的物理穩(wěn)定性的評價方法是，該組合物在不同溫度下貯存不同時間后，通過目視檢查和根據(jù)濁度評價。組合物的目視檢查在暗背景和銳聚焦光線下進行。一種組合物當目視可見混濁時，被分類為物理不穩(wěn)定的。
術語修飾的因子VII多肽的“物理穩(wěn)定性”與修飾因子VII多肽的二聚、寡聚和多聚形式的不溶性和/或可溶性聚合物的形成，以及分子的任何結構變形和變性有關。
術語“化學穩(wěn)定的”是指一種組合物，其在2-8℃貯存6個月后，至少保留其最初生物活性的50％，其測定是使用基本如WO92/15686(實施例III)所述的競爭性凝測血定法，或如本說明書中所述的測定法5-8中的一種或多種(參見下文“測定法”部分)。
術語“化學穩(wěn)定性”與加速條件下以溶解或固體狀態(tài)貯存后，修飾的因子VII多肽的任何化學改變的形成有關。例子包括水解、脫酰胺和氧化。具體而言，含硫氨基酸傾向于氧化，形成相應的亞砜。
該組合物含有修飾的因子VII多肽、抗氧化劑、鈣和/或鎂離子、緩沖劑，和任選地其它賦形劑，它們可進一步穩(wěn)定修飾的因子VII多肽，包括張力調節(jié)劑。修飾的因子VII多肽的濃度為約0.1mg/mL-約15mg/mL。
如此處所用的術語“張力調節(jié)劑”包括有助于溶液的重量摩爾滲透壓濃度(osmolality)的試劑。張力調節(jié)劑包括但不限于氨基酸；小肽(例如含有2-5個氨基酸殘基)；中性鹽；單糖或二糖；多糖；糖醇，或至少兩種所述改良劑的混合物。張力調節(jié)劑的例子包括但不限于氯化鈉、氯化鉀、檸檬酸鈉、蔗糖、葡萄糖、甘氨酰甘氨酸和甘露醇。改良劑的濃度通常為約1mM-約500mM；約1mM-約300mM；約10mM-約200mM；或者約20mM-約150mM，這取決于所含的其它成分?？梢允褂弥行喳}，如氯化鈉或氯化鉀。“中性鹽”是指當溶解于水溶液時既不是酸也不是堿的鹽。
術語“適于將pH保持在約4.0-約8.0的試劑”包括這樣的試劑它使溶液的pH保持在約4.0-約8.0的可接受范圍內，如約4.0-約7.0，約4.5-約7.0，約5.0-約7.0，約5.0-約6.5，約5.5-約7.0，約5.5-約6.5，約6.0-約7.0，約5.0-約6.0，約6.4-約6.6，或者約6.5，約5.2-約5.7，或者約5.5。該術語可以與“緩沖劑”互換使用。包括但不限于下列酸和鹽檸檬酸(鈉或鉀)，乙酸(銨、鈉或鈣)，組氨酸(L-組氨酸)，蘋果酸，磷酸(鈉或鉀)，酒石酸，琥珀酸，MES，HEPES，咪唑，TRIS，乳酸，谷氨酸，甘氨酰甘氨酸，PIPES，甘氨酸，或至少兩種所述緩沖劑的混合物。選擇緩沖液的嘗試范圍以保持溶液的優(yōu)選pH。緩沖劑也可以是至少兩種緩沖劑的混合物，其中該混合物能夠提供指定范圍的pH值。在備選實施方案中，緩沖液的濃度為約1mM-100mM；1mM-約50mM；約1mM-約25mM；約2mM-約20mM；或約10mM。
任選地，該組合物也可含有表面活性劑或去污劑。“表面活性劑”或“去污劑”通常包括那些保護蛋白質免于空氣/溶液界面誘導的應力和溶液/表面誘導的應力(例如導致蛋白質聚集)的試劑。去污劑優(yōu)選地是一種非離子去污劑，包括但不限于聚山梨醇酯(例如Tween)，如聚山梨醇酯20或80；聚氧乙烯烷基醚或泊洛沙姆，如泊洛沙姆188或407(例如Pluronic多元醇)，和其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物，或聚乙二醇(PEG)，如PEG8000。所含表面活性劑的量為約0.005-2％。
該組合物也含有一種抗氧化劑?？寡趸瘎┌ǖ幌抻诳箟难?，半胱氨酸，高半胱氨酸，胱氨酸，胱硫醚，甲硫氨酸，谷胱甘肽，和含有半胱氨酸或甲硫氨酸的其它肽，特別是含有2-5個氨基酸殘基的肽，其中至少一個殘基是甲硫氨酸或半胱氨酸殘基；甲硫氨酸，特別是L-甲硫氨酸，是優(yōu)選的。所含抗氧化劑的濃度為0.1-5mg/ml，如0.1-4、0.1-3、0.1-2或0.5-2mg/ml。
該組合物也可含有一種防腐劑，用來阻止微生物的生長，從而允許“多用途”包裝FVII多肽。防腐劑包括苯酚、芐醇、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、氯芐烷銨和苯索氯銨。所含防腐劑的濃度通常為0.1-20mg/ml，取決于防腐劑的pH范圍和類型。任選地，該組合物也可含有一種能夠抑制脫酰胺作用的試劑。
在此使用時，指定的量理解為±約10％，例如，約50mM包括50mM±5mM；例如，4％包括4％±0.4％，等等。
當指溶解于溶液中的固體和混合到溶液中的液體時，百分數(shù)是(重量/重量)。例如，對于Tween，是100％原液的重量/溶液的重量。
術語“等滲的”含意是“與血清等滲”，即，約300±50毫滲透分子/千克。張力是溶液在施用前的重量摩爾滲透壓濃度的量度。
術語“藥學有效的量”或“有效的量”是由有資格的醫(yī)生確定的有效劑量，他們可以滴定劑量以達到希望的反應。劑量的考慮因素包括效能，生物利用性，希望的藥代動力學/藥效學分布，治療條件，與患者有關的因素(例如體重、健康、年齡等)，共同施用藥物的存在(例如其它抗凝劑)，施用時間，或醫(yī)生所知的其它因素。
術語“治療”被定義為，為了對抗疾病或紊亂，對受試者(如哺乳動物，特別是人)的處理和護理，包括施用修飾的因子VII多肽，以防止癥狀或并發(fā)癥的發(fā)生，或者緩解癥狀或并發(fā)癥，或者根除疾病或紊亂。含有修飾的因子VII多肽的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以對需要這種治療的患者腸胃外施用?？梢岳米⑸淦?，任選地筆樣注射器，通過皮下、肌肉內或靜脈內注射進行腸胃外施用。此外，腸胃外施用也能夠利用輸液泵進行。
使用方法根據(jù)本發(fā)明的制劑，其含有修飾的因子VII多肽，生物活性大大低于野生型因子VII，可以作為抗凝劑，例如對接受血管成形術或其它手術操作的患者使用，這些操作可以增加血栓形成或血管阻塞的危險，如再狹窄中所發(fā)生的。抗凝劑適用的其它醫(yī)學適應證包括但不限于深靜脈血栓形成，肺栓塞，中風，彌散性血管內凝血(DIC)，與革蘭氏陰性內毒素血癥有關的組織(例如肺和/或腎)中的血纖蛋白沉積，心肌梗死；急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，全身性炎癥反應綜合征(SIRS)，溶血性尿毒性綜合征(HUS)，MOF和TTP。
根據(jù)本發(fā)明配制的因子VII多肽術語“人因子VII”或“FVII”是指通過包括天然來源提取和純化的方法，以及由重組細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生的人因子VII。它的序列和特征如美國專利號4,784,950所述。術語“因子VII”包括未切割(酶原)形式的因子VII多肽，以及經(jīng)過蛋白水解加工可產(chǎn)生各自的生物活性形式的多肽，這種活性形式可以被稱為因子VIIa。一般而言，因子VII在殘基152與153之間切割，產(chǎn)生因子VIIa。術語“因子VII”也包括但不限于含有野生型人因子VII的氨基酸序列1-406的多肽(如美國專利號4,784,950所公開的)，以及來源于其它種的野生型因子VII，例如，牛、豬、犬、鼠和鮭魚因子VII。還包括因子VII的自然等位基因變異，這些變異可在一個個體到另一個個體之間存在及發(fā)生。糖基化或其它翻譯后修飾的程度和位置也可能隨所選宿主細胞和宿主細胞環(huán)境的性質而不同。
在此使用時，“修飾的因子VII多肽”包括但不限于因子VIIa的生物活性與野生型人因子VIIa的活性相比大大改變或降低的多肽。這些多肽包括但不限于化學修飾的因子VII或因子VIIa，和已經(jīng)引入一個或多個將改變或破壞多肽生物活性的具體氨基酸序列改變的因子VII變體。該術語涵蓋因子VII的置換、缺失和插入氨基酸變體或翻譯后修飾。與野生型因子VII相比生物活性大大改變或降低的修飾的因子VII包括但不限于與人因子VII相比已經(jīng)化學修飾的因子VII多肽，和/或與人因子VII相比含有一個或多個氨基酸序列改變的多肽(即因子VII變體)，和/或與人因子VII相比含有截短的氨基酸序列的多肽(即因子VII片段)。
修飾的因子VII還包括含有修飾的N端(包括N端氨基酸缺失或添加)的多肽。
當使用如測定法1-4(參見下文“測定法”部分)所述的一種或多種凝血測定、蛋白水解測定或TF結合測定法檢測時，生物活性比野生型因子VIIa大大降低的修飾的因子VII多肽，包括變體，顯示低于同一細胞型產(chǎn)生的野生型因子VIIa的比活性的約25％，優(yōu)選地低于約10％，更優(yōu)選地低于約5％，最優(yōu)選地低于約1％。
如此處所用的術語“修飾的因子VII多肽”是指含有至少一個修飾的因子VII多肽，這種修飾大大抑制了修飾的因子VII激活血漿因子X或因子IX的能力。包括但不限于催化活性大大降低的因子VII多肽，及其片段。無活性的因子VII多肽以高親和力和特異性與組織因子結合，但是不啟動血液凝固。術語“無催化活性的因子VII多肽”、“無活性的因子VII多肽”或“FVIIai”可以與“修飾的因子VII多肽”或“修飾的因子VII”互換使用。
在本發(fā)明的一個實施方案中，修飾的因子VII多肽包括以下多肽當使用如本說明書所述的一種或多種TF結合測定法檢測時，其顯示野生型因子VIIa的特異TF結合親和力的至少約10％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約90％、至少約100％、至少約110％、至少約1 20％或至少約130％。在一個優(yōu)選實施方案中，TF拮抗劑顯示野生型因子VIIa的結合親和力的至少約75％。如此處所用的術語“TF結合活性”是指FVIIa多肽或TF拮抗劑抑制重組人125I-FVIIa與人細胞表面TF結合的能力。TF結合活性可以如(本說明書的)測定法3所述測定。
在另一個實施方案中，修飾的因子VII多肽包括以下多肽當使用如本說明書的測定法1-4所述的一種或多種凝血測定或蛋白水解測定法檢測時，其顯示低于野生型因子VIIa的比活性的約25％，更優(yōu)選地低于約10％或5％或3％或2％，最優(yōu)選地低于約1％。
生物活性與野生型因子VII相比大大降低或改變的因子VII變體的非限制性例子包括R152E-FVIIa(Wildgoose等人，Biochem293413-3420，1990)，S344A-FVIIa(Kazama等人，J.Biol.Chem.27066-72，1995)，F(xiàn)FR-FVIIa(Holst等人，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.15515-520，1998)，和缺乏Gla域的因子VIIa(Nicolaisen等人，F(xiàn)EBSLetts.317245-249，1993)。非限制性例子還包括人FVIIa，其位點341處的賴氨酸殘基被置換為另一種氨基酸殘基；人FVIIa，其位點344處的絲氨酸殘基被置換為另一種氨基酸殘基；人FVIIa，其位點242處的天冬氨酸殘基被置換為另一種氨基酸殘基；人FVIIa，其位點193處的組氨酸殘基被置換為另一種氨基酸殘基；FVII-(K341A)；FVII-(S344A)；FVII-(D242A)；和FVII-(H193A)?；瘜W修飾的因子VII多肽和序列變體的非限制性例子如美國專利號5,997,864所述。
催化中心的化學衍生或三聯(lián)體可以抑制因子VIIa的催化活性。衍生可以如下實現(xiàn)通過因子VII與一種不可逆的抑制劑反應，該抑制劑如有機磷化合物、磺酰氟、肽鹵甲基酮或氮肽，或者通過酰化，例如肽氯甲基酮或肽基氯代甲烷；氮肽；?；瘎?，如不同的胍基苯甲酸衍生物和3-烷氧基-4-氯異香豆素；磺酰氟，如苯甲磺酰氟(PMSF)；氟磷酸二異丙酯(DFP)；甲苯磺酰丙基氯甲基酮(TPCK)；甲苯磺酰賴氨酰氯甲基酮(TLCK)；硝基苯磺酸；雜環(huán)蛋白酶抑制劑，如異香豆素和香豆素。
優(yōu)選的肽鹵甲基酮包括Phe-Phe-Arg氯甲基酮，Phe-Phe-Arg氯甲基酮，D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，Phe-Pro-Arg氯甲基酮，D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，Phe-Pro-Arg氯甲基酮，D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，和D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-GLu-Gly-Arg氯甲基酮，和丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮。
在優(yōu)選實施方案中，可以在因子VII催化三聯(lián)體的氨基酸序列內進行氨基酸置換，在此被定義為含有有助于因子VIIa催化部位的氨基酸的區(qū)域。催化三聯(lián)體中的置換、插入或缺失通常位于或鄰近構成催化部位的氨基酸。在人和牛因子VII蛋白中，構成催化“三聯(lián)體”的氨基酸是Ser344、Asp242和His193(數(shù)字編號表示在人野生型因子VII中的位點)。來自其它哺乳動物種的因子VII的催化部位可以用目前可用的技術確定，包括蛋白質分離和氨基酸序列分析。催化部位也可以如下確定將一種序列與其它絲氨酸蛋白酶(特別是胰凝乳蛋白酶)的序列進行比對，后者的活性部位以前已經(jīng)確定(Sigler等人，J.Mol.Biol.35143-164(1968)，在此引用作為參考)，從而根據(jù)這種比對確定類似的活性部位殘基。
為了防止或以其它方式抑制因子VIIa對因子X和/或IX的激活，進行氨基酸置換、插入或缺失。但是，這樣修飾的因子VII應當也保留與未修飾的(authentic)因子VII和/或因子VIIa在血凝級聯(lián)中競爭結合組織因子的能力。例如，利用如此處所述的凝血測定法，或者使用例如含有細胞表面組織因子的細胞系(如人膀胱癌細胞系J82)的競爭結合測定法(Sakai等人，J.Biol.Chem.2649980-9988(1989))，可以容易地測定這種競爭。
構成因子VII的催化部位的氨基酸，如人和牛因子VII中的Ser344、Asp242和His193，可以被置換或缺失。優(yōu)選地只改變一個氨基酸，從而使提高分子抗原性或抑制結合組織因子的能力的可能性最小化，然而，可以進行兩個或多個氨基酸的改變(置換、添加或缺失)，也可以進行置換、添加和缺失的組合。在人和牛因子VII的一個優(yōu)選實施方案中，Ser344優(yōu)選地被置換為Ala，但是Gly、Met、Thr或其它氨基酸也能夠被置換。優(yōu)選地用Glu置換Asp，用Lys或Arg置換His。通常選擇盡可能小地破壞蛋白質三級結構的置換。人們可以向人、牛或其它種的適當因子VII序列的催化部位中引入如上所述的殘基改變，如此處所述檢測獲得的蛋白質的希望的催化活性抑制水平和產(chǎn)生的抗凝活性。
在人和牛因子VII的優(yōu)選實施方案中，活性部位殘基Ser344被修飾，被置換為Gly、Met、Thr，或者更優(yōu)選地Ala。這種置換能夠分開進行，或者與催化三聯(lián)體的其它位點(包括His193和Asp242)處的置換組合進行。
因子VII多肽的生物活性因子VIIa在血液凝固中的生物活性來源于其(i)結合組織因子(TF)和(ii)催化因子IX或因子X的蛋白水解切割，產(chǎn)生活化的因子IX或X(分別為IXa或Xa)的能力。
對于本發(fā)明，因子VII多肽的生物活性(“因子VII生物活性”)可以如下定量如美國專利號5,997,864或WO 92/15686所述，使用缺乏因子VII的血漿和促凝血酶原激酶，測定一種制品促進血液凝固的能力。在該測定中，生物活性表示為凝血時間相對于對照樣品的減少，通過與含有1U/ml因子VII活性的合并人血清標準對比，將其轉化為“因子VII單位”。此外，因子VIIa生物活性也可以如下定量——在一個含有包埋于脂膜中的TF和因子X的系統(tǒng)中，測定因子VIIa或因子VIIa相當物產(chǎn)生活化的因子X(因子Xa)的能力。(Persson等人，J.Biol.Chem.27219919-19924，1997)；——在一個水系統(tǒng)中測定因子X的水解(“體外蛋白水解測定法”，見下文)；——使用一種以表面胞質團共振為基礎的儀器，測定因子VIIa或因子VIIa相當物與TF的物理結合(Persson，F(xiàn)EBS Letts.413359-363，1997)；和——測定因子VIIa和/或因子VIIa相當物對一種合成底物的水解(“體外水解測定法”，見下文)；和——在一個不依賴于TF的體外系統(tǒng)中測定凝血酶的產(chǎn)生。
適于測定因子VII多肽的生物活性的測定法根據(jù)本發(fā)明有用的因子VII多肽可以通過適當?shù)臏y定法選擇，這些測定能夠象簡單的體外預試驗那樣進行。因此，本說明書公開了一種測定因子VII多肽活性的簡單試驗(稱為“體外水解測定法”)。
體外水解測定法(測定法1)可以測定天然(野生型)因子VIIa和因子VII多肽(下文均稱為“因子VIIa”)的比活性。它們也可以平行測定，以直接比較它們的比活性。該測定在微孔板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)上進行。在含有0.1MNaCl，5mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白的50mM Hepes，pH7.4中，向因子VIIa(終濃度為100nM)中加入終濃度為1mM的顯色底物D-Ile-Pro-Arg-對硝基苯胺(S-2288，Chromogenix，Sweden)。用SpectraMaxTM340讀板儀(Molecular Devices，USA)連續(xù)測量405nm的吸光度。在20分鐘溫育過程中產(chǎn)生的吸光度，在減去不含酶的空白孔的吸光度后，用來計算因子VII多肽與野生型因子VIIa的活性之比比＝(A405nm因子VII多肽)/(A405nm因子VIIa野生型)。
據(jù)此可以鑒定活性低于、相當于或高于天然因子VIIa的因子VII多肽，如因子VII多肽活性與天然因子VII(野生型FVII)活性之比高于約1.0的因子VII多肽。
因子VII多肽的活性也可以用一種生理底物測定，如濃度適當?shù)貫?00-1000nM的因子X(“體外蛋白水解測定法”)，其中在加入適當?shù)娘@色底物(例如S-2765)后測定產(chǎn)生的因子Xa。另外，活性測定可以在生理溫度下進行。
體外蛋白水解測定法(測定法2)天然(野生型)因子VIIa和因子VII多肽(下文均稱為“因子VIIa”)平行測定，以直接比較它們的比活性。該測定在微孔板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)上進行。因子VIIa(10nM)和因子X(0.8μM)在含有0.1M NaCl，5mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白的100μL 50mMHepes，pH7.4中溫育15分鐘。然后加入含有0.1M NaCl，20mMEDTA和1mg/ml牛血清白蛋白的50μL 50mM Hepes，pH7.4，終止因子X的切割。加入終濃度為0.5mM的顯色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-對硝基苯胺(S-2765，Chromogenix，Sweden)，測定產(chǎn)生的因子Xa的量。用SpectraMaxTM340讀板儀(Molecular Devices，USA)連續(xù)測量405nm的吸光度。在10分鐘期間產(chǎn)生的吸光度，在減去不含F(xiàn)VIIa的空白孔的吸光度后，用來計算因子VII多肽與野生型因子VIIa的蛋白水解活性之比比＝(A405nm因子VII多肽)/(A405nm因子VIIa野生型)。
據(jù)此可以鑒定活性低于、相當于或高于天然因子VIIa的因子VII多肽，如因子VII多肽活性與天然因子VII(野生型FVII)活性之比大約高于1.0的因子VII多肽。
因子VIIa或因子VII多肽產(chǎn)生凝血酶的能力也能夠用一種測定法(測定法3)測定，其中包括生理濃度的所有有關的凝血因子和抑制劑(當模擬血友病A條件時，除去因子VIII)和活化的血小板(如Monroe等人，(1997)Brit.J.Haematol.99，542-547，543頁所述，在此引用作為參考)。
因子VII多肽的活性也可以用基本如WO 92/15686或US5,997,864所述的一步凝血測定法(測定法4)測定。簡言之，待測樣品用50mM Tris(pH7.5)稀釋、0.1％BSA稀釋，100μl稀釋樣品與100μl缺乏因子VII的血漿和200μl含有10mM Ca2+的促凝血酶原激酶C溫育。測定凝血時間，與使用參考標準或一組連續(xù)稀釋的檸檬酸化正常人血漿獲得的標準曲線進行對比。
競爭測定法FVIIa/sTF酰胺分解活性的抑制(測定法5)修飾的因子VII對FVIIa-TF催化的酰胺分解活性的抑制使用可溶性TF(10nM)、重組人FVIIa(10nM)和濃度提高的修飾的因子VII檢測。不同濃度的修飾的因子VII與10nM sTF和10nM FVIIa在BSA緩沖液(50mM Hepes，pH7.4，100mM NaCl，5mM CaCl2和1mg/ml BSA)中室溫預溫育60分鐘，然后加入底物S2288(1.2mM，Chromogenix)。在405nm下連續(xù)測量顯色30分鐘。酰胺分解活性表示為mOD/min?？梢杂嬎阈揎椀囊蜃覸II抑制FVIIa/TF酰胺分解活性的IC50值。
FXa產(chǎn)生的抑制(測定法6)
脂化TF(10pM)、FVIIa(100pM)和修飾的因子VII(0-50nM)在BSA緩沖液(參見測定法4)中室溫溫育60分鐘，然后加入FX(50nM)。加入1/2體積的終止緩沖液(50mM Hepes，pH7.4，100mM NaCl，20mM EDTA)10分鐘后終止反應。加入底物S2765(0.6mM，Chromogenix)，并連續(xù)測量405nm的吸光度10分鐘，測定產(chǎn)生的FXa的量?？梢杂嬎阈揎椀囊蜃覸II抑制FVIIa/脂化TF介導的FX激活的IC50值。
依賴TF的凝血測定法(測定法7)該測定在ACL300 Research凝血裝置(ILS Laboratories)上進行。修飾的因子VII用50mM咪唑，pH7.4，100mM NaCl，0.1％BSA稀釋，與25mM CaCl2以2∶5比例混合，加至該凝血裝置的樣品杯中。來自人、大鼠、兔、狒狒或豬的促凝血酶原激酶用咪唑緩沖液稀釋，使得不含修飾的因子VII的樣品達到約30秒的凝血時間，將該稀釋液置于試劑容器2中，人、大鼠、兔、狒狒或豬血漿置于試劑容器3中。在分析過程中，將70μl修飾的因子VII和CaCl2混合物轉移到25μl促凝血酶原激酶試劑中，預溫育900秒，之后加入60μl血漿，測定凝血時間。最大凝血時間設為400秒。用稀釋的促凝血酶原激酶作標準曲線，將凝血時間轉化為相對于未加修飾FVII的對照的TF活性。
修飾的因子VII對FVIIa/細胞表面TF催化的FX激活的抑制(測定法8)表達人TF的細胞單層，例如人肺成纖維細胞WI-38(ATTC No.CCL-75)、人膀胱癌細胞系J82(ATTC No.HTB-1)、人角質細胞系CCD 1102KerTr(ATCC no.CRL-2310)、人膠質母細胞瘤細胞系U87或人乳腺癌細胞系MDA-MB231，用作FVIIa/TF催化的FX激活中的TF來源。在24、48或96孔板中鋪滿的細胞單層用緩沖液A(10mMHepes，pH7.45，150mM NaCl，4mM KCl，和11mM葡萄糖)洗滌一次，用緩沖液B(添加1mg/ml BSA和5mM Ca2+的緩沖液A)洗滌一次。向細胞中同時添加溶于緩沖液B的FVIIa(1nM)、FX(135nM)和不同濃度的修飾的因子VII。此外，在添加rFVIIa和FX之前，細胞也與修飾的因子VII預溫育15分鐘。FXa的形成在37℃下進行15分鐘。從每孔中取出50μl等份，加入50μl終止緩沖液(添加10mMEDTA和1mg/ml BSA的緩沖液A)。通過將50μl上述混合物轉移到微孔板的孔中，并向孔中加入25μl Chromozym X(終濃度為0.6mM)，測定產(chǎn)生的FXa的量。連續(xù)測量405nm的吸光度，利用FXa標準曲線將最初的顯色速度轉化為FXa濃度。
修飾的因子VII多肽的制備和純化適于根據(jù)本發(fā)明配制的修飾的因子VII分子及其生產(chǎn)已經(jīng)在WO92/15686、WO 94/27631、WO 96/12800和WO 97/47651中描述。
通常，純化的人因子VIIa優(yōu)選地通過DNA重組技術制備，如Hagen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 832412-2416，1986所述，或如歐洲專利號200.421(ZymoGenetics，Inc.)所述。
因子VII也可以利用Broze和Majerus，J.Biol.Chem.255(4)1242-1247，1980，和Hedner和Kisiel，J.Clin.invest.711836-1841，1983所述的方法生產(chǎn)。這些方法產(chǎn)生的因子VII不含可檢測的量的其它凝血因子。以另外一步凝膠過濾作為最終的純化步驟，可以獲得進一步純化的因子VII制劑。然后利用已知的方法，例如使用幾種不同的血漿蛋白，如因子Xlla、IXa或Xa，將因子VII轉化為活化的因子VIIa。此外，如Bjoern等人(Research Disclosure，269September 1986，pp.564-565)所述，因子VII的活化方法也可以是通過離子交換層析柱，如MonoQ(Pharmacia fine Chemicals)等，或者在溶液中自活化。
因子VII多肽，無論它是分離的還是重組產(chǎn)生的，然后可以如下所述化學修飾，例如WO 92/15686，WO 94/27631，WO 96/12800和WO 97/47651，或Sorensen等人.J.Biol.Chem.27211863-11868，1997(FFR-rFVIIa活性部位用D-Phe-L-Phe-L-Arg-氯甲基酮封閉的FVIIa)。
因子VII變體可以通過野生型因子VII的修飾或者利用重組技術產(chǎn)生。與野生型因子VII相比氨基酸序列改變的因子VII相當物可以如下產(chǎn)生使用公知的方法，例如位點特異的誘變，改變編碼天然因子VII的核酸中的氨基酸密碼子或除去某些氨基酸密碼子，修飾編碼野生型因子VII的核酸序列(參見，例如Cunningham和Wells，1989，Science 2441081-1085)。
從來源細胞中分離多肽可以用本領域公知的任何一種方法實現(xiàn)，包括但不限于從貼壁細胞培養(yǎng)物中取出含有希望的產(chǎn)物的細胞培養(yǎng)基；離心或過濾，除去非貼壁細胞；等等。
任選地，修飾的因子V多肽可以進一步純化。純化可以用本領域公知的任何一種方法完成，包括但不限于親和層析，例如使用抗因子VII抗體柱(參見，例如Wakabayashi等人，J.Biol.Chem.26111097，1986；和Thim等人，Biochem.277785，1988)；疏水相互作用層析；離子交換層析；大小排阻層析；電泳方法(例如制備等電聚焦(IEF)，差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)，或提取，等等。通常參見Scopes，《蛋白質純化》(Protein Purification)，Springer-Verlag，New York，1982；和《蛋白質純化》，J.C.Janson和Lars Ryden編著，VCH Publishers，New York，1989。純化后，制劑中所含的來自宿主細胞的非因子VII多肽優(yōu)選地不到約10％重量，更優(yōu)選地不到約5％，最優(yōu)選地不到約1％。
使用因子XIIa或具有胰蛋白酶樣特異性的其它蛋白酶，如因子IXa、激肽釋放酶、因子Xa和凝血酶，通過蛋白水解酶切，可以將因子VII多肽轉化為雙鏈形式。參見，例如Osterud等人，Biochem.112853(1972)；Thomas，美國專利號4,456,591；和Hedner等人，J.Clin.Invest.711836(1983)。此外，因子VII多肽也可以如下活化通過離子交換層析柱，如Mono Q(Pharmacia)等，或者在溶液中自活化。獲得的多肽然后可以如本申請所述配制和施用。
下列實施例說明了本發(fā)明的實施。這些實施例只是用于說明目的，而非意在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1A.測定方法聚合體的含量通過非變性大小排阻HPLC測定。氧化形式的含量通過RP-HPLC測定。酶降解形式的含量通過RP-HPLC測定。
非變性大小排阻層析在7.5×300mm的Waters Protein Pak 300SW柱上進行，使用0.2M硫酸銨，5％ 2-丙醇pH7.0作為流動相。流速0.5ml/min。檢測215nm。上樣25μg FVIIa。
反相HPLC在顆粒大小為5μm、孔徑為300的專利4.5×250mm丁基鍵合硅石(butylbonded silica)柱上進行。柱溫度70℃。A-緩沖液0.1％v/v三氟乙酸。B-緩沖液0.09％v/v三氟乙酸，80％v/v乙腈。該柱在30分鐘內用從X到(X+13)％B的線性梯度洗脫。調節(jié)X，使得FVIIa以大約26分鐘的保留時間洗脫。流速1.0ml/min。檢測214nm。上樣25μg FVIIa。
實施例2含有甲硫氨酸作為抗氧化劑的Phe-Phe-Arg氯甲基酮-滅活的因子VII(FFR-rFVIIa)水制劑的化學穩(wěn)定性制備兩種不同的制劑。制劑的組成如下FFR-rFVIIa 2mg/mlNaCl 2.8-2.9mg/mlCaCl2，2H2O 1.4-1.5mg/ml甘氨酰甘氨酸 1.3mg/ml甲硫氨酸 0或1mg/mlpH 7.0該制劑由含有FFR-rFVIIa、NaCl、CaCl2和甘氨酰甘氨酸的液體FFR-rFVIIa本體(bulk)溶液制成。甲硫氨酸溶解于水中?；旌螰FR-rFVIIa本體溶液和甲硫氨酸溶液，然后調節(jié)溶液的pH為7.0。過濾該制劑(0.2μm)，裝到小瓶中(每個小瓶2.2ml溶液)。這些小瓶貯存于35℃。取出樣品，在下表所述的時間點(通過RP-HPLC)分析氧化形式的含量。該表顯示氧化形式的含量(％)。
結果表明，加入甲硫氨酸減慢了制劑的氧化速度。
權利要求
1.一種液體、含水組合物，其含有(i)一種修飾的因子VII多肽；(ii)一種適于將pH保持在約4.0-約8.0范圍內的試劑；(iii)一種抗氧化劑；和(iv)一種選自鈣鹽、鎂鹽或其混合物的試劑。
2.根據(jù)權利要求1的組合物，其中pH保持在約4.0-約7.0，如約4.5-約7.0，約5.0-約7.0，約5.5-約7.0，或約6.0-約7.0的范圍內。
3.根據(jù)權利要求1或權利要求2的組合物，其中抗氧化劑(iii)選自L-或D-甲硫氨酸、甲硫氨酸類似物、含甲硫氨酸的肽、甲硫氨酸同系物、抗壞血酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、胱氨酸和胱硫醚。
4.根據(jù)權利要求3的組合物，其中所述抗氧化劑是L-甲硫氨酸。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一項的組合物，其中所述抗氧化劑以約0.1mg/ml-約5.0mg/ml，如約0.1mg/ml-約4mg/ml，約0.1mg/ml-約3mg/ml，約0.1mg/ml-約2mg/ml，或約0.5mg/ml-約2mg/ml的濃度存在。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一項的組合物，它還含有(v)一種張力調節(jié)劑。
7.根據(jù)權利要求6的組合物，其中所述張力調節(jié)劑(v)選自中性鹽；單糖、二糖或多糖；糖醇；氨基酸；或小肽，或至少兩種所述調節(jié)劑的混合物。
8.根據(jù)權利要求7的組合物，其中所述張力調節(jié)劑是甘露醇和/或一種中性鹽，優(yōu)選地氯化鈉。
9.根據(jù)權利要求6-8中任一項的組合物，其中所述張力調節(jié)劑(v)以1mM-500mM的濃度存在。
10.根據(jù)權利要求9的組合物，其中濃度為10-250mM。
11.根據(jù)權利要求1-10中任一項的組合物，它還含有(vi)一種非離子表面活性劑。
12.根據(jù)權利要求11的組合物，其中所述非離子表面活性劑是一種聚山梨醇酯或泊洛沙姆或聚氧乙烯烷基醚，如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80，或聚氧23月桂醚。
13.根據(jù)權利要求1-12中任一項的組合物，其中適于將pH保持在約4.0-約8.0范圍內的試劑(ii)選自下列酸和鹽檸檬酸鹽、乙酸鹽、組氨酸、蘋果酸鹽、磷酸鹽、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、咪唑、TRIS、乳酸鹽、甘氨酰甘氨酸、PIPES、甘氨酸或至少兩種所述試劑的混合物。
14.根據(jù)權利要求13的組合物，其中試劑(ii)的濃度為約1mM-約50mM。
15.根據(jù)權利要求14的組合物，其中試劑(ii)的濃度約為10mM。
16.根據(jù)權利要求1-15中任一項的組合物，其中鈣鹽和/或鎂鹽(試劑(iv))以約5mM-約150mM，如約5mM-約100mM，約5mM-約50mM，如約10mM-約50mM的濃度存在。
17.根據(jù)權利要求1-16中任一項的組合物，其中鈣鹽選自氯化鈣、乙酸鈣、葡糖酸鈣和乙酰丙酸鈣。
18.根據(jù)權利要求1-16中任一項的組合物，其中鎂鹽選自氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂、葡糖酸鎂和乙酰丙酸鎂。
19.根據(jù)權利要求1-18中任一項的組合物，其還含有(vii)一種防腐劑，如苯酚、芐醇、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、氯芐烷銨或芐索氯銨。
20.根據(jù)權利要求1-19中任一項的組合物，它是等滲的。
21.根據(jù)權利要求1-20中任一項的組合物，它是為了藥物施用而配制的。
22.根據(jù)權利要求1-21中任一項的組合物，它在2-8℃下至少穩(wěn)定6個月。
23.根據(jù)權利要求1-22中任一項的組合物，其中當使用如本說明書所述凝血測定、蛋白水解測定或TF結合測定法中的一種或多種檢測時，修飾的因子VII多肽相對于野生型因子VIIa，其生物活性小于野生型因子VIIa的比活性的約25％，優(yōu)選地小于約10％，更優(yōu)選地小于約5％，最優(yōu)選地小于約1％。
24.根據(jù)權利要求1-23中任一項的組合物，其中修飾的因子VII多肽選自人和牛因子VII，其中活性部位殘基Ser344被修飾，被替換為Gly、Met、Thr或更優(yōu)選地Ala；人因子VII，其中殘基Lys341被替換；人因子VII，其中殘基Asp242被替換；人因子VII，其中殘基His193被替換；FVII-(K341A)；FVII-(S344A)；FVII-(D242A)；FVII-(H193A)；活性部位修飾的一種因子VII多肽，此修飾是通過與選自下列的試劑反應肽氯甲基酮或肽基氯代甲烷；氮雜肽；?；瘎?，如多種胍基苯甲酸衍生物和3-烷氧基-4-氯異香豆素；磺酰氟，如苯甲磺酰氟(PMSF)；氟磷酸二異丙酯(DFP)；甲苯磺酰丙基氯甲基酮(TPCK)；甲苯磺酰賴氨酰氯甲基酮(TLCK)；硝基苯磺酸；雜環(huán)蛋白酶抑制劑，如異香豆素和香豆素；活性部位修飾的一種因子VII多肽，此修飾是通過與選自下列的試劑反應L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，和丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮。
25.根據(jù)權利要求24的組合物，其中修飾的因子VII多肽選自FVII-(S344A)；FVII-(H193A)；和活性部位修飾的一種因子VII多肽，此修飾是通過與選自下列的試劑反應L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，和丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮·氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，和丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮。
26.根據(jù)權利要求1-25中任一項的組合物，其中修飾的因子VII多肽以約0.1mg/ml-約15mg/ml，如約0.5mg/ml-約10mg/ml，約0.5mg/ml-約5.0mg/ml，或約1.0mg/ml-5.0mg/ml的濃度存在。
27.一種制備修飾的因子VII多肽的液體含水組合物的方法，包括提供修飾的因子VII多肽的溶液，該溶液含有(ii)一種試劑，其適于將pH保持在約4.0-約8.0的范圍；(iii)一種抗氧化劑；和(iv)一種選自鈣鹽、鎂鹽或其混合物的試劑。
28.根據(jù)權利要求1-26中任一項的組合物在制備用于抑制血液凝固的藥物中的用途。
29.根據(jù)權利要求1-26中任一項的組合物在制備用于抑制組織因子介導的反應的藥物中的用途。
30.一種抑制受試者血液凝固的方法，該方法包括對需要的受試者施用有效量的含水液體組合物，該組合物中含有(i)一種修飾的因子VII多肽，(ii)一種試劑，其適于將pH保持在約4.0-約8.0的范圍；(iii)一種抗氧化劑；和(iv)一種選自鈣鹽、鎂鹽或其混合物的試劑。
31.一種抑制受試者中組織因子介導的反應的方法，該方法包括對需要的受試者施用有效量的水性液體組合物，該組合物中含有(i)一種修飾的因子VII多肽，(ii)一種試劑，其適于將pH保持在約4.0-約8.0的范圍；(iii)一種抗氧化劑；和(iv)一種選自鈣鹽、鎂鹽或其混合物的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種液體含水組合物，其中含有(i)一種修飾的因子VII多肽；(ii)一種試劑，其適于將pH保持在約4.0－約8.0；(iii)一種抗氧化劑；和(iv)一種試劑，其選自鈣鹽、鎂鹽或其混合物。
文檔編號A61K47/14GK1606452SQ02825643
公開日2005年4月13日 申請日期2002年12月20日 優(yōu)先權日2001年12月21日
發(fā)明者B·L·漢森, M·B·詹森, T·科菲爾特 申請人:諾沃娜第克公司