專利名稱：修飾的因子Ⅷ的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尤其是向人施用的且特別是用于治療用途的多肽。該多肽是修飾的多肽，所述修飾導(dǎo)致該多肽當(dāng)給予人被試者時具有減少的引起免疫反應(yīng)的傾向。本發(fā)明具體地涉及對人因子VIII(FVIII)進(jìn)行修飾，從而導(dǎo)致當(dāng)體內(nèi)應(yīng)用時與任何未修飾的對應(yīng)物相比基本無免疫原性或具低的免疫原性的因子VIII蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及來源于所述未修飾的蛋白質(zhì)的T細(xì)胞表位肽，通過這些肽可以構(gòu)建具有降低的免疫原性的FVIII修飾變體。
背景技術(shù)：
有許多關(guān)于治療性蛋白質(zhì)的功效受對該治療性蛋白質(zhì)有害的免疫反應(yīng)限制的例子。幾種小鼠單克隆抗體已顯示出有希望用作許多人類疾病情形的治療劑，但在某些情況下由于引起顯著程度的人抗-鼠抗體(HAMA)反應(yīng)而失敗[Schroff，R.W.等人(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等人(1985)J.Immunol.1351530-1535]。對于單克隆抗體已發(fā)展了許多技術(shù)來試圖減少HAMA反應(yīng)[WO8909622；EP0239400；EP0438310；WO9106667]。這些重組DNA方法通常減少最終抗體構(gòu)建體中小鼠的遺傳信息，同時增加最終構(gòu)建體中人的遺傳信息。但是，在幾種情況下，結(jié)果所得的“人源化”抗體仍然在患者中引起免疫反應(yīng)[Issacs，J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等人(1999)Transplantation681417-1420]。
抗體不是唯一一類作為治療劑給藥而可產(chǎn)生免疫反應(yīng)的多肽分子。即使人來源的且與人體內(nèi)存在的蛋白質(zhì)具有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)也可誘導(dǎo)人體內(nèi)免疫反應(yīng)。顯著的例子包括粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子[Wadhwa，M.等人(1999)Clin.Cancer Res.51353-1361]和干擾素α2[Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)New Engl.J.Med.3181409-1413]等的治療應(yīng)用。在這些人蛋白質(zhì)具有免疫原性的情況下，原本在這些個體中起作用的針對這些蛋白質(zhì)的免疫耐受性，推測將被破壞。
這種將人蛋白質(zhì)用作替代療法的情形是不同的，例如用在所說蛋白質(zhì)天然不足的遺傳性疾病的治療中，諸如血友病、Christmas病、Gauchers病之類疾病以及許多其它例子中。在這樣的情況中，治療用的替代蛋白質(zhì)從開始就可起到免疫學(xué)上外源分子的作用，并且當(dāng)個體能對治療劑產(chǎn)生免疫應(yīng)答時，治療的效力有可能被顯著降低。
無論所說的蛋白質(zhì)治療劑是否被宿主免疫系統(tǒng)認(rèn)作外源分子，或現(xiàn)存的對這些分子的耐受性是否被克服，對這些蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性的機(jī)制是相同的。誘發(fā)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵是在這些蛋白質(zhì)內(nèi)存在能通過呈遞于II型MHC分子上而刺激T細(xì)胞活性的肽，即，所謂的“T細(xì)胞表位”。這樣的T細(xì)胞表位通常被定義為能結(jié)合II型MHC分子的任何氨基酸序列。言外之意，“T細(xì)胞表位”指當(dāng)結(jié)合MHC分子時能被T細(xì)胞受體(TCR)識別并至少在原則上能通過結(jié)合TCR促進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答而引起這些T細(xì)胞活化的表位。
II型MHC分子是一組在輔助T-細(xì)胞的選擇和活化中起重要作用的高度多態(tài)的蛋白質(zhì)。人類DR類白細(xì)胞抗原(HLA-DR)是該組蛋白質(zhì)的主要同種型，然而同種型HLA-DQ和HLA-DP也發(fā)揮相似的功能。在人類群體中，每個個體攜帶2-4個DR等位基因、2個DQ和2個DP等位基因。對于DR同種型來說約存在70種不同的同種異型，對于DQ是30種不同的同種異型，對于DP是47種不同的同種異型。許多DR分子的結(jié)構(gòu)已得到了解析，這些結(jié)構(gòu)顯示為具有許多疏水口袋的開放式(open-ended)肽結(jié)合溝，這些疏水口袋與肽的疏水殘基(口袋殘基)嚙合[Brown等人Nature(1993)36433；Stern等人(1994)Nature368215]。MHC DR分子由在C末端插入細(xì)胞膜的α鏈和β鏈組成。每個異二聚體都具有能結(jié)合9-20個氨基酸長度的肽的配體結(jié)合域，但是結(jié)合溝最大能容納11個氨基酸。最近的研究顯示DQ分子具有同源結(jié)構(gòu)，而且預(yù)期DP家族蛋白質(zhì)將非常相似。確立不同II型MHC分子同種異型的多態(tài)性造成了肽結(jié)合溝中多種多樣的不同肽結(jié)合表面，且在群體水平上確保了能夠最大的靈活度地識別外源蛋白質(zhì)及對病原體生物產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
對治療性蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)通過II型MHC肽呈遞途徑進(jìn)行。在此，外源蛋白質(zhì)被吞入并經(jīng)加工以與DR、DQ或DP類的II型MHC分子結(jié)合進(jìn)行呈遞。II型MHC分子是由專門的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞等表達(dá)的。II型MHC肽復(fù)合物與T-細(xì)胞表面上關(guān)連T-細(xì)胞受體的結(jié)合，加上某些其他共同受體如CD4分子的交互結(jié)合可誘導(dǎo)T-細(xì)胞內(nèi)的活化狀態(tài)。該活化導(dǎo)致細(xì)胞因子的釋放，從而進(jìn)一步活化其他淋巴細(xì)胞如B細(xì)胞以產(chǎn)生抗體，或者活化T殺傷細(xì)胞而形成完全的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
T-細(xì)胞表位的鑒定是表位消除的第一步，然而在本領(lǐng)域中幾乎沒有清楚的案例將鑒定表位和去除表位整合在單個方案中。WO98/52976和WO00/34317講授了鑒定多肽序列的計算穿線(computational threadingapproach)方法，該多肽序列具有與人II型MHC DR同種異型亞型結(jié)合的潛力。在這些講授中，預(yù)測的T-細(xì)胞表位通過在目的蛋白質(zhì)中應(yīng)用合理的氨基酸替代而去除。然而利用該方案和其他鑒定表位的基于計算的程序[Godkin，A.J.等人(1998)J.Immunol.161850-858；Sturniolo，T.等人(1999)Nat.Biotechnol.17555-561]，預(yù)測能夠與II型MHC分子結(jié)合的肽可能并不會在所有情況下，特別是在體內(nèi)(由于加工途徑或其他現(xiàn)象)發(fā)揮T-細(xì)胞表位的功能。此外，這些預(yù)測T-細(xì)胞表位的計算方法通常不能夠預(yù)測具有DP或DQ限制性的表位，盡管這些系統(tǒng)的表位識別通常相互重疊。
除計算技術(shù)之外，存在測量合成的肽與II型MHC分子結(jié)合能力的體外方法。一種示例性的方法應(yīng)用具有限定的MHC同種異型的B-細(xì)胞系作為II型MHC結(jié)合表面的來源，且可應(yīng)用于II型MHC配體的鑒定中[Marshall K.W.等人(1994)J.Immunol.1524946-4956；O’Sullivan等人(1990)J.Immunol.1451799-1808；Robadey C.等人(1997)J.Immunol.1593238-3246]。然而，這種技術(shù)不適用于篩選可針對廣泛多樣的MHC同種異型的多重潛在表位，且它們也不能證實結(jié)合的肽能否發(fā)揮T-細(xì)胞表位的功能。
最近采用重組MHC分子與合成的肽的可溶性復(fù)合物的技術(shù)已得到應(yīng)用[Kern，F(xiàn).等人(1998)Nature Medicine4975-978；Kwok，W.W.等人(2001)TRENDS in Immunol.22583-588]。這些試劑和方法可用于鑒定來自人或?qū)嶒瀯游锉辉囌叩耐庵苎簶悠分惺欠翊嬖谀軌蚪Y(jié)合特定的MHC-肽復(fù)合物的T-細(xì)胞克隆，但這些方法和試劑也不適用于篩選可針對廣泛多樣的MHC同種異型的多重潛在表位。
T-細(xì)胞活化的生物學(xué)測定法可提供實際的選擇方案，通過該方案可讀出所檢測的肽或整個蛋白質(zhì)序列引起免疫反應(yīng)的能力。該類方法的例子包括Petra等人的工作，該工作對細(xì)菌蛋白質(zhì)葡萄球菌激酶應(yīng)用T-細(xì)胞增殖測定，隨后用合成的肽刺激T-細(xì)胞系以對表位進(jìn)行作圖[Petra，A.M.等人(2002)J.Immunol.168155-161]。類似地，應(yīng)用合成的破傷風(fēng)毒素蛋白質(zhì)的肽進(jìn)行的T-細(xì)胞增殖測定導(dǎo)致對毒素中免疫優(yōu)勢表位的確定[Reece J.C.等人(1993)J.Immunol.1516175-6184]。WO99/53038公開了所測試蛋白質(zhì)的T-細(xì)胞表位可用分離的人免疫細(xì)胞亞群進(jìn)行確定的方法，其中細(xì)胞分離后，促進(jìn)其在體外分化并在合成的目的肽存在時進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在培養(yǎng)的T-細(xì)胞中對任何誘導(dǎo)的增殖進(jìn)行測量。相同技術(shù)也由Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)J.Immunotherapy23654-660]描述，其中在兩種情況下該方法應(yīng)用于在細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶中探測T-細(xì)胞表位。這種技術(shù)需要仔細(xì)地應(yīng)用細(xì)胞分離技術(shù)和利用多種細(xì)胞因子補(bǔ)充物進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)以便獲得想要的免疫細(xì)胞亞群(樹突細(xì)胞、CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞)，且不利于應(yīng)用多個供體樣品的快速通量篩選。
如上所述，由此期望從給定的原則上有治療價值但最初為免疫原性的肽、多肽或蛋白質(zhì)中鑒定并去除或至少減少T-細(xì)胞表位。這種治療上有價值的分子之一是FVIII。本發(fā)明提供除去了一個或多個T細(xì)胞表位的修飾形式的人FVIII。
FVIII是固有的血液凝固途徑中的一個凝血因子。FVIII是因子IXa的輔因子，其在鈣離子和磷脂存在的條件下將因子X轉(zhuǎn)變成活化形式Xa?，F(xiàn)已對FVIII的分子遺傳學(xué)有了很好的研究，相當(dāng)重要的原因是當(dāng)X-連鎖基因中缺乏FVIII時會導(dǎo)致A型血友病。FVIII基因編碼兩種可選擇剪切的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可產(chǎn)生A同種型的大糖蛋白FVIII和較小的B同種型。在天然狀態(tài)下可鑒別到來源于A同種型前體的多種降解或加工形式，且特定的功能活性已被定位于特定的片段。FVIII分子被劃分為6個結(jié)構(gòu)域三個A結(jié)構(gòu)域(A1、A2、A3)，一個富碳水化合物且非必需的中央結(jié)構(gòu)域(B-結(jié)構(gòu)域)和兩個C結(jié)構(gòu)域(C1、C2)。FVIII的凝血酶和因子Xa蛋白水解位點在殘基372、740和1689之后。Xa與活化的蛋白質(zhì)C一道的裂解位點發(fā)生在殘基336之后。
FVIII蛋白質(zhì)在功能上可定義為能矯正A型血友病患者血漿中凝血缺陷的因子。為了治療A型血友病，已生產(chǎn)來自人或豬血漿的純化形式的FVIII，最近還通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)FVIIII。1984年，人FVIII基因被至少兩個獨立的實驗小組分離和表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞中[Toole，J.J.等(1984)，Nature312342-347；Gitschier，J.等(1984)，Nature312326-330；Wood，W.I.等(1984)，Nature312330-337；Vehar，G.A.等(1984)，Nature312337-342；WO87/04187；WO88/08035；WO88/03558；US4757006]。從cDNA中推知了其氨基酸序列并已開發(fā)了治療用量的FVIII的重組生產(chǎn)，例如US4965199公布了一種用于在哺乳動物宿主細(xì)胞中生產(chǎn)FVIII和純化人FVIII的方法。已有關(guān)于在CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞和BHKC(幼倉鼠腎細(xì)胞)中表達(dá)人FVIII的報道，而最近FVIII已被修飾成缺失部分或全部的B結(jié)構(gòu)域[美國專利申請4868112]，且這樣的分子已在臨床試驗中顯示出了功效[Lusher，J.M.等(2003)Haemophilia938-49]。這一分子事實上已獲得了應(yīng)用許可-Refacto是遺傳研究所和Pharmacia Upjohn合作在CHO細(xì)胞中制備的。
盡管可以得到治療量的FVIII，仍然繼續(xù)需要具有增強(qiáng)特性的FVIII類似物。期望達(dá)到的增強(qiáng)作用包括蛋白質(zhì)表達(dá)和純化的可選擇方案和形式，還有尤其是對蛋白質(zhì)生物學(xué)特性的改進(jìn)。在用作治療劑時特別需要增強(qiáng)其體內(nèi)特性。在這方面，非常期望的是提供減少或缺失在人受試者體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答的潛力的FVIII。預(yù)期這樣的蛋白質(zhì)會呈現(xiàn)出在人受試者體內(nèi)循環(huán)時間增加且對慢性和復(fù)發(fā)性疾病尤其有益，諸如A型血友病，尤其是在血友病患者可能對外源重組因子VIII敏感且原本產(chǎn)生會限制其治療效力的抗因子VIII抗體的情況下尤其有益。
其它文獻(xiàn)也提供了FVIII分子和特別是重組修飾FVIII[US4757006；US5633150；US5668108]，但它們之中無一認(rèn)識到T細(xì)胞表位對于該蛋白質(zhì)免疫原性的重要，也無一考慮到按本發(fā)明的方案以特異且受調(diào)控的方式直接影響這些特性。
本領(lǐng)域中關(guān)于FVIII修飾的許多例子中包括US5948407，為了產(chǎn)生對治療用蛋白質(zhì)抗原的抑制性T細(xì)胞全部組分，此文獻(xiàn)中公布了用于產(chǎn)生能經(jīng)粘膜(如口腔)施用該蛋白質(zhì)的制劑的方案。
其它文獻(xiàn)也試圖修飾FVIII以達(dá)到提高其在受試血友病患者體內(nèi)的半衰期的目的，例如US6037452描述的聚(環(huán)氧烷)因子VIII綴合體。
在A型血友病治療中的一種特殊的并發(fā)癥是在某些病人中誘發(fā)針對所施用FVIII制品的抑制性抗體?，F(xiàn)已提出幾種策略來克服血友病患者中對FVIII的免疫學(xué)應(yīng)答。耐受性誘導(dǎo)治療是這些方法中的一種，但目前需要在血友病患者的極早期施用很大劑量(且昂貴)的FVIII制品。此方法只在部分病例中成功獲得了耐受性[Colowick，A.B.等(2000)Blood961698-1702]。在預(yù)先未接受治療的受試者中進(jìn)行的兩種不同的重組產(chǎn)物的臨床試驗報告顯示，在20％左右的病例中有抑制物的產(chǎn)生[Lusher，J.M.等(1993)N.Engl.J.Med328453-459；Bray，G.L.等(1994)Blood832428-2435]。FVIII抑制物是在血漿中中和FVIII活性的免疫球蛋白抗體。在用FVIII濃縮品或重組FVIII治療的約25％嚴(yán)重血友病患者和5-15％輕度至中度患者中所說的抑制物作為同種抗體出現(xiàn)。
對于含有抑制物的病人還采用了因子IX復(fù)合物或“凝血酶原復(fù)合物”進(jìn)行治療。通常這些藥劑是包括如因子II、VII、IX和X在內(nèi)的多種不同因子的混合制品。EP0044343-B1提供這樣一種以已活化的成分(FVIIa)為特征的凝血酶原復(fù)合物。類似地，US6358534描述了包含小部分FVIII蛋白和相對較高比例的其它凝血蛋白因子及載體蛋白的免疫耐受性凝血酶原復(fù)合物。
US5543145提供了組合物以抑制FVIII抑制物的產(chǎn)生，該組合物包括例如以與FVIII混合的F(ab’)2形式的多克隆抗體或單克隆抗體。US4769336提供了結(jié)合并由此封閉FVIII抗體抑制物的FVIII片段。
其它的策略是利用豬因子VIII替代人FVIII，不過這樣的治療是一種暫時的方法，因為豬VIII本身是會產(chǎn)生免疫性的。
其它可選擇的方法包括用免疫抑制性藥物進(jìn)行治療并/或通過體外療法從循環(huán)中除去抑制物，可以理解的是這些方法代表了對目前所出現(xiàn)問題的極端和冒險的解決方案。遺傳工程技術(shù)的確為治療用途的FVIII分子的修飾和產(chǎn)生提供了相當(dāng)大的機(jī)會。A型血友病的藥用組合物和療法由文件US4965199、US5618788和US5668108和外國同族專利提供，應(yīng)被認(rèn)為是本領(lǐng)域中可獲得的在此題目上進(jìn)行大規(guī)模工作的典型例子。
用重組方法進(jìn)行FVIII修飾的另外類型的例子參見文件US5859204、US6376463、US6485563和US6180371，它們共同提供了FVIII蛋白質(zhì)及它們的編碼基因，其中的定位替代導(dǎo)致了對抑制性抗體反應(yīng)性的降低。在這些具體的文件中替代被限制在FVIII A結(jié)構(gòu)域的第484-509位氨基酸之間。這樣的修飾雖然改變了FVIII分子的表面布局從而使特定構(gòu)象表位不再能被病人血清中的特定交叉反應(yīng)抗體所識別，但是沒有涉及驅(qū)使B細(xì)胞產(chǎn)生抗體所需的潛在T細(xì)胞表位。
其它文獻(xiàn)已使用了重組DNA方法來提供通過定位氨基酸替代[WO87/07144]或相關(guān)分子間的結(jié)構(gòu)域交換來修飾的FVIII分子。后一種方法的例子參見WO90/05530，其中提供了以人因子V的B結(jié)構(gòu)域替代FVIII B結(jié)構(gòu)域的FVIII分子。
還有其它文獻(xiàn)提供了包含重組FVIII分子的嵌合FVIII制品，通過遺傳工程化使其含有人和豬(或其它物種)來源的序列結(jié)構(gòu)域。這樣的雜合分子參見US5744446、US5663060、US5583209、US5364771、US5888974及其它文獻(xiàn)中。
US5171844提供了遺傳工程化的FVIII分子，該分子可能具有增強(qiáng)的活性和/或降低的免疫原性。后一種特性涉及通過刪除缺失分子的某一部分。US4868112和國外同族專利中所述的較早工作提供了缺失B結(jié)構(gòu)域的FVIII功能性刪除突變體。
對FVIII蛋白質(zhì)的其它遺傳工程修飾致力于蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程的改進(jìn)，US6,271,025提供了具體實例。提供此實例作為本領(lǐng)域可利用的且已知的許多更多相似工作的例示。
發(fā)明概述和描述本發(fā)明提供了修飾形式的人因子VIII，此處稱作“FVIII”，其中免疫特征通過減少或去除潛在T-細(xì)胞表位的數(shù)目而被修飾。
本發(fā)明公開了在FVIII一級序列中鑒定到的序列，該序列由于其II型MHC結(jié)合潛力而是潛在的T細(xì)胞表位。本公開尤其同樣涉及2332個氨基酸殘基的同種型A完整人FVIII蛋白質(zhì)以及該蛋白質(zhì)中缺少B域的較小版本。
本發(fā)明還公開了在保持最大程度的蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的前提下可以通過特定的氨基酸替代、添加或缺失進(jìn)行改變的本發(fā)明分子的一級序列中的特定位點。在只有同時喪失生物學(xué)活性才能去掉免疫原性的情況下，可通過在所述蛋白的氨基酸序列中做進(jìn)一步的改造以恢復(fù)所述的活性。
本發(fā)明還公開了用于生成這些經(jīng)修飾分子的方法，首先是用于鑒定為了降低或消除免疫原性位點而需要改變的T細(xì)胞表位的方法。
本發(fā)明提供了預(yù)期在體內(nèi)展示增強(qiáng)特性的經(jīng)修飾形式的FVIII蛋白質(zhì)。本發(fā)明公開了在人體內(nèi)具有免疫原性的FVIII一級序列的主要區(qū)域，并提供了為了消除或降低這些位點的免疫原性效力而對序列進(jìn)行的修飾。在一個實施方案中，為了提升對完整分子的耐受原性應(yīng)答(tolerogenic response)，可在藥學(xué)組合物中提供包含免疫原性區(qū)域的合成肽。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾FVIII分子可用于制藥學(xué)組合物。
概括而言，本發(fā)明涉及下面的要點●一種經(jīng)修飾的分子，其具有FVIII的生物學(xué)活性，且當(dāng)其在體內(nèi)應(yīng)用時基本上無免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物學(xué)活性但未經(jīng)修飾的分子；●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過從原始的未經(jīng)修飾的分子中去除一個或多個T-細(xì)胞表位而實現(xiàn)的；●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過減少能與由所述分子衍生的肽相結(jié)合的MHC同種異型的數(shù)量來實現(xiàn)的；●如上所述的分子，其中，去除了一個T-細(xì)胞表位；●如上所述的分子，其中，原本存在的T-細(xì)胞表位是II型MHC的配體，或表現(xiàn)出經(jīng)II型分子呈遞作用后有刺激或結(jié)合T-細(xì)胞的能力的肽序列；●如上所述的分子，其中，所述的肽序列選自如下肽a-ka)＝ILLFAVFDEGKSWHS，b)＝SYKSQYLNNGPQRIG，c)＝GPQRIGRKYKKVRFM，d)＝Y(jié)KWTVTVEDGPTKSD，e)＝ASNIMHSINGYVFDS，f)＝VAYWYILSIGAQTDF，g)＝MSSSPHVLRNRAQSG，h)＝CNIQMEDPTFKENYR，i)＝STLFLVYSNKCQTPL，j)＝ISQFIIMYSLDGKKW，k)＝IARYIRLHPTHYSIRSTLRM；●如上所述的分子，其中所述肽序列選自表1和/或表2中的肽；●如上所述的分子，其中，所述的肽序列選自如

圖1所示的肽；●如上所述的分子，其中，任何原本存在的T-細(xì)胞表位中的1-9個氨基酸殘基，優(yōu)選1個氨基酸殘基發(fā)生了改變；●如上所述的分子，其中，所述氨基酸殘基的改變是在特定的位置對原本存在的氨基酸殘基進(jìn)行缺失或用其他的氨基酸殘基進(jìn)行替代、添加；●如上所述的分子，其中，在需要時常通過替代，添加或缺失特定的氨基酸作進(jìn)一步改變以恢復(fù)所述分子的生物學(xué)活性；●與上文肽序列a-k之任一共享超過90％氨基酸同一性的上文肽分子；●與上文肽序列a-k之任一共享超過80％氨基酸同一性的上文肽分子；●與表1或圖1之任一肽序列共享超過90％氨基酸同一性的上文肽分子；●與表1或圖1之任一肽序列共享超過80％氨基酸同一性的上文肽分子；●能夠結(jié)合II型MHC的上述肽序列；●如上所述的FVIII分子，其中在對應(yīng)于上文肽a-k之任一中的任一所示氨基酸的位置進(jìn)行了一個或多個氨基酸替代；●如上所述的FVIII分子，其中在對應(yīng)于表1或圖1中任一所示氨基酸的位置進(jìn)行了一個或多個氨基酸替代；●包含具有結(jié)合II型MHC的活性的上文任一個肽或修飾的肽的藥物組合物；●編碼任何上述和下述經(jīng)修飾分子的DNA序列或分子；●包含具有FVIII生物學(xué)活性的經(jīng)修飾分子的藥物組合物；●上述和/或權(quán)利要求中定義的藥物組合物，其任選地包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑；●制造如上引用的任何權(quán)利要求中所定義的具有FVIII生物學(xué)活性的經(jīng)修飾分子的方法，該方法包括下述步驟(i)確定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通過任意方法，包括利用體外或硅片(in silico)技術(shù)或生物學(xué)試驗確定所述肽與MHC分子的結(jié)合，由此鑒定所述蛋白的氨基酸序列中潛在的一個或多個T-細(xì)胞表位；(iii)設(shè)計新的序列變體，其中，經(jīng)鑒定的潛在T-細(xì)胞表位內(nèi)有一個或多個氨基酸經(jīng)過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細(xì)胞表位的活性，這一效果可由體外或計算機(jī)技術(shù)或生物學(xué)試驗通過所述肽與MHC分子的結(jié)合來確定；(iv)通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建所述序列變體，并檢測所述的變體以便鑒定一個或多個具有所需性質(zhì)的變體；和(v)任選地重復(fù)步驟(ii)-(iv)；●如上所述的方法，其中步驟(iii)是通過在任何原本存在的T-細(xì)胞表位中替代、添加或缺失1-9個氨基酸殘基來進(jìn)行的；●選自圖1的具有潛在的II型MHC結(jié)合活性且由未經(jīng)修飾的FVIII產(chǎn)生的13肽T-細(xì)胞表位肽，及其在制造在體內(nèi)使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物學(xué)活性的任何未經(jīng)修飾的分子的FVIII中的用途；●由上述的13肽T-細(xì)胞表位肽中的至少9個連續(xù)的氨基酸殘基組成的肽序列，及其在制造在體內(nèi)使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低于任何未經(jīng)修飾的分子并具有人因子VIII的生物學(xué)活性的FVIII中的用途。
●選自表1或圖1中序列的具有潛在的II型MHC結(jié)合活性且由未經(jīng)修飾的FVIII產(chǎn)生的13肽T-細(xì)胞表位肽，及其在制造在體內(nèi)使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低于任何未經(jīng)修飾的分子并具有人因子VIII的生物學(xué)活性的FVIII中的用途；●由來自表1或圖1中任一序列的13肽T-細(xì)胞表位肽中的至少9個連續(xù)氨基酸殘基組成的肽序列，及其在制造在體內(nèi)使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低于任何未經(jīng)修飾的分子并具有人因子VIII的生物學(xué)活性的FVIII中的用途。
根據(jù)對本發(fā)明的理解，術(shù)語“T-細(xì)胞表位”是指具有下述能力的氨基酸序列，即能結(jié)合MCH II、能刺激T-細(xì)胞和/或也能以與MHC II形成復(fù)合物的形式結(jié)合(但不一定可測量地激活)T-細(xì)胞。
此處及后附權(quán)利要求中所用的術(shù)語“肽”是指包含兩個或多個氨基酸的化合物。氨基酸之間通過肽鍵相連(定義見下)。肽的生物生產(chǎn)中涉及20種不同的天然氨基酸，任意數(shù)量的所述氨基酸可按任意的順序連接形成肽鏈或環(huán)。用于生物生產(chǎn)肽的天然氨基酸全部具有L-構(gòu)型?？蓱?yīng)用常規(guī)的合成方法利用L-氨基酸、D-氨基酸或兩種不同構(gòu)型的氨基酸的各種組合制備合成肽。一些肽僅包含少量的氨基酸單元。例如含有不到10個氨基酸單元的短肽有時被稱作“寡肽”。其他的包含大量氨基酸殘基，例如達(dá)100個或更多個氨基酸殘基的肽稱作“多肽”。習(xí)慣上將含有3個或3個以上氨基酸的任何肽鏈多看作“多肽”，而將“寡肽”視為特定類型的短“多肽”。因而本文所提到的“多肽”也包括“寡肽”。而且，所用到的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白。不同的氨基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此，可形成的多肽的數(shù)量以及不同蛋白的數(shù)量實際上是無限的?！唉撂?Cα)”是肽鏈中碳-氫(CH)組分中的碳原子?！皞?cè)鏈”是Cα的側(cè)基，其可包含簡單的或復(fù)雜的基團(tuán)或部分，且具有與所述肽的大小相比可顯著變化的外形大小。
本發(fā)明可應(yīng)用于與此處公開的FVIII具有基本上相同的一級氨基酸序列的任何FVIII分子，因此包括利用基因工程手段或其他方法獲得的、可以包含多于或少于2332個氨基酸殘基的FVIII分子。
對于特別優(yōu)選的FVIII分子，分子中缺乏B結(jié)構(gòu)域，而且任何剩余結(jié)構(gòu)域中還包含一個或多個氨基酸替代，導(dǎo)致序列中一個或多個T細(xì)胞表位的消除。缺失了B結(jié)構(gòu)域的1438個氨基酸殘基的治療性FVIII分子已經(jīng)進(jìn)行了成功的臨床試驗，正如Lusher等人及其中參考文獻(xiàn)所述[Lusher，J.M.等(2003)Haemophilia 938-49]。本文圖9描述了這種蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
FVIII蛋白，如從其他哺乳動物來源中鑒定出的相關(guān)蛋白與本發(fā)明中公開的肽序列之間存在大量共有序列，且與列表中公開的肽序列間存在大量基本上相同的共有序列。因此這樣的蛋白序列也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明設(shè)計用于克服實際應(yīng)用中存在的下述問題，即將可溶性蛋白引入自體生物中可引發(fā)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生可與所述可溶性蛋白相結(jié)合的宿主抗體。對于許多A型血友病患者，針對現(xiàn)有治療性FVIII制劑的抗體應(yīng)答是處理他們疾病的重大問題。在任何個體中，少數(shù)T細(xì)胞表位能夠驅(qū)動T輔助細(xì)胞信號傳導(dǎo)而導(dǎo)致針對天然FVIII蛋白質(zhì)中許許多多由B細(xì)胞所識別的表面暴露決定簇的持續(xù)抗體應(yīng)答。對來自A型血友病患者的編碼抑制劑抗體的基因的分析顯示許多這樣的抗體經(jīng)歷了親和力成熟[Jacquemin，M.G.等(1998)Blood 92496-506；van den Brink，E.N.等(2000)Blood 95558-563]。親和力成熟下面的超變現(xiàn)象只發(fā)生于應(yīng)答T細(xì)胞輔助的B細(xì)胞中，同樣早就認(rèn)識到高比例的FVIII抑制劑抗體屬于IgG4亞型[Andersen，B.R.和Terry，W.D.(1968)Nature 217174-175]，而且類似地此必需的類型轉(zhuǎn)變反應(yīng)是T輔助細(xì)胞依賴性事件。應(yīng)答FVIII的抗體是由T細(xì)胞驅(qū)動的其它證據(jù)來自具有FVIII抑制劑的HIV陽性患者中的觀察結(jié)果，即FVIII抗體應(yīng)答由于T細(xì)胞數(shù)目下降而喪失[Bray，G.L.等(1993)Am.J.Hematol.42375-379]。因此，本發(fā)明試圖通過提供在施用于人體時引發(fā)免疫應(yīng)答的傾向發(fā)生改變的FVIII蛋白來解決這一問題。存在這樣一種理解，當(dāng)多數(shù)B細(xì)胞表位在經(jīng)修飾的FVIII表面保持完整時，在缺乏持續(xù)T細(xì)胞輔助時抑制劑滴度將最終降低，而且對于接受這種療法的新患者而言將開始就不能獲得建立。
根據(jù)本文所述方法，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了FVIII分子中包含關(guān)鍵T細(xì)胞表位的區(qū)域，這些表位驅(qū)動針對該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明中形成經(jīng)修飾的FVIII的一般方法包括下述步驟(a)確定多肽或其中一部分的氨基酸序列；(b)通過任意方法，包括利用體外或計算機(jī)技術(shù)或生物學(xué)試驗確定所述肽與MHC分子的結(jié)合，由此鑒定所述蛋白的氨基酸序列中潛在的一個或多個T-細(xì)胞表位；(c)設(shè)計新的序列變體，其中，經(jīng)鑒定的潛在T-細(xì)胞表位內(nèi)有一個或多個氨基酸經(jīng)過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細(xì)胞表位的活性，這一效果可由體外或計算機(jī)技術(shù)或生物學(xué)試驗通過所述肽與MHC分子的結(jié)合來確定。構(gòu)建此序列變體以避免由所述的序列變體產(chǎn)生新的潛在T-細(xì)胞表位，否則所述的新的潛在T細(xì)胞表位又通過此種方式進(jìn)行修飾以基本上減弱或消除T-細(xì)胞表位活性；和(d)根據(jù)已知的重組技術(shù)通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建所述序列變體，并檢測所述的變體以便鑒定一個或多個具有所需性質(zhì)的變體。
對于步驟(b)中對潛在T-細(xì)胞表位的鑒定可依照本領(lǐng)域已公知的方法進(jìn)行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317；WO02/069232中公開了適當(dāng)?shù)姆椒?，可以用于鑒定FVIII-衍生的肽對II型MHC分子的結(jié)合傾向。在實踐中，已經(jīng)通過聯(lián)合應(yīng)用生物學(xué)離體人T細(xì)胞增殖測定法和采用WO02/06922中所略述方案的軟件工具衍生了本發(fā)明的組合物，而且其中所述軟件工具是本發(fā)明的一個實施方案。
軟件在肽-II型MHC結(jié)合相互作用的水平模擬抗原呈遞過程，為任何指定肽序列提供了結(jié)合評分。這種評分針對群體中現(xiàn)存的許多主要II型MHC同種異型而確定。由于此方案能夠測試任何肽序列，因此能夠預(yù)測氨基酸替代、添加或缺失在肽與II型MHC結(jié)合溝相互作用的能力方面的后果。因此，可以設(shè)計包含減少數(shù)目的能夠與II型MHC相互作用從而發(fā)揮免疫原性T細(xì)胞表位功能的肽的新序列組合物。當(dāng)生物學(xué)測定法能夠評估任一指定供體樣品與最多4種DR同種異型的結(jié)合時，硅片(in silico)方法可以同時用超過40種同種異型測試相同肽序列。在實踐中，這種方法能夠指導(dǎo)與多種MHC同種異型相互作用的能力受到損害的新序列變體的設(shè)計。
作為這種硅片方法的實例，圖1提供了在完整人FVIII序列上進(jìn)行的分析的結(jié)果。圖中列出了衍生自FVIII且經(jīng)檢測具有以顯著結(jié)合評分結(jié)合一種或多種II型MHC同種異型能力的13mer肽序列。從總體上看，針對人FVIII蛋白質(zhì)，這組13mer肽數(shù)據(jù)集被認(rèn)為以高度確定性提供了全部容許的MHC型配體。出于諸如對體內(nèi)完整FVIII多肽的蛋白水解加工和導(dǎo)致FVIII肽呈遞的其它生理學(xué)步驟的需要等原因，顯然整個肽庫中相對少數(shù)的肽將具有最終的生物學(xué)適用性。為了進(jìn)一步鑒定這些生物學(xué)相關(guān)肽，發(fā)明人開發(fā)了采用離體人T細(xì)胞增殖測定法的方法。
這種方法已經(jīng)被證明是一種特別有效的方法，而且在本文中公開作為本發(fā)明的實施方案。該方法可用于測試部分序列，例如缺乏所有或部分B結(jié)構(gòu)域的FVIII蛋白質(zhì)；該方法可用于序列中的選定區(qū)域，例如FVIII肽子集諸如圖1中所列的所有或一些肽；或者該方法可用于測試完整FVIII序列。在本研究中，該方法包括在方案中測試重疊的FVIII衍生肽序列以掃描并測試缺乏B結(jié)構(gòu)域的FVIII序列。對合成的肽測試它們在體外人T細(xì)胞培養(yǎng)物中引發(fā)增殖應(yīng)答的能力。在使用來自健康供體的幼稚人T細(xì)胞進(jìn)行這類方法時，本發(fā)明人確定了在這種測定法的操作中等于或大于2.0的刺激指數(shù)是所誘導(dǎo)增殖的有用測量值。刺激指數(shù)常規(guī)地通過用在有檢驗的肽時測量到的增殖分?jǐn)?shù)(例如如果應(yīng)用3H-胸苷摻入則為每分鐘的放射性計數(shù))除以在不與檢驗的肽接觸的細(xì)胞中測量到的增殖分?jǐn)?shù)而獲得。
在這種方法的另一個實施方案中，本發(fā)明人提供了使用離體生物學(xué)T細(xì)胞測定法對FVIII序列掃描以確定T細(xì)胞表位的存在和定位的方法，其中T細(xì)胞來源于血友病患者。對于這些患者的一部分而言，F(xiàn)VIII蛋白質(zhì)在體內(nèi)構(gòu)成外來蛋白質(zhì)和有力抗原。本發(fā)明人確定了有可能在體外由這些個體的PBMC衍生多克隆和原則上單克隆T細(xì)胞系，而且這些細(xì)胞系可以在FVIII蛋白質(zhì)的T細(xì)胞表位作圖中用作有效試劑。
這是按如下實現(xiàn)的將血友病PBMC T細(xì)胞在體外進(jìn)行幾輪抗原(FVIII)刺激，隨后立即在存在IL-2時進(jìn)行擴(kuò)增。對于建立多克隆T細(xì)胞系而言，2-3輪抗原刺激通常足以生成大量的抗原特異細(xì)胞，而且這些細(xì)胞可以冷凍保存繼而在需要時使用。細(xì)胞被用于篩選大量的合成肽。
在本情況中，使用每個庫包含8種不同肽序列的一系統(tǒng)庫分析了合成肽。圖2圖示了肽庫方案。在包括將FVIII與PBMC一起孵育7天的最初一輪抗原(FVIII)刺激之后，隨后在存在自體經(jīng)照射PBMC作為抗原呈遞細(xì)胞時用抗原再次刺激。這些輪次的抗原選擇進(jìn)行3-4天，并以包括用IL-2進(jìn)行刺激的擴(kuò)增階段間隔，IL-2可以每3天添加一次，總計大約9天。使用“靜息”的T細(xì)胞，即大約4天未經(jīng)IL-2刺激的T細(xì)胞進(jìn)行最后一次的再刺激。
如先前所述，使用最優(yōu)選的自體抗原呈遞細(xì)胞用抗原(如合成肽或完整蛋白質(zhì))刺激這些細(xì)胞大約4天，然后測量后繼增殖應(yīng)答(如果有的話)。組織這些肽庫使得每個庫包含與后繼庫重疊的肽。通過這種方式任何一個T細(xì)胞表位都出現(xiàn)在2個不同庫中，而且將由使用這兩個庫的處理中檢測到誘導(dǎo)的增殖。在對任何指定肽庫檢測增殖應(yīng)答后，對肽庫解碼，使用分離的各個庫成員重復(fù)此測定法。
在本方案中，特別希望采用來自稱為“抑制劑患者”的患者類型的PBMC樣品，因為可以預(yù)期由來自這些個體的T細(xì)胞集合所定義的FVIII蛋白質(zhì)表位圖譜將代表能夠在體內(nèi)環(huán)境中呈遞的最普遍肽表位。在這方面，來自先前已被證明有免疫應(yīng)答的患者的PBMC是體內(nèi)致敏步驟的產(chǎn)物，而且可以預(yù)期這具有實踐優(yōu)勢，即能夠針對任何指定的刺激肽引起強(qiáng)得多的增殖應(yīng)答。這降低了進(jìn)行增殖測量的技術(shù)難度。
本研究揭示了能夠引發(fā)顯著增殖應(yīng)答(即SI＞2.0)的38種肽序列。這些肽在表1中列出，而且是本發(fā)明的一個實施方案。在這組肽中，又鑒定了一個肽子集，經(jīng)鑒定子集中的肽在2個或更多個供體樣品中引發(fā)顯著增殖應(yīng)答，而且對于這些應(yīng)答中的某些而言，應(yīng)答水平事實上顯著高于SI＝2.0。這些肽在表2中列出，而且是本發(fā)明的另一個實施方案。
表1
*依照B結(jié)構(gòu)域缺失的序列進(jìn)行序列編號(圖9)
表2能離體刺激來自2個或2個以上供體樣本的人T細(xì)胞的FVIII肽序列
*依照B結(jié)構(gòu)域缺失的序列進(jìn)行序列編號(圖9)本文所公開的肽序列是構(gòu)建其中這些表位的一個或多個遭到破壞的經(jīng)修飾FVIII分子所需要的關(guān)鍵信息。在本發(fā)明的方案中，通過突變破壞表位從而導(dǎo)致序列不再能夠發(fā)揮T細(xì)胞表位的作用。可以用重組DNA方法來完成這些靶序列的定向誘變，許多這樣的技術(shù)在本領(lǐng)域是可以獲得的且眾所周知的。
當(dāng)本發(fā)明的目的是修飾上文表1所列舉的至少一個或多個肽的氨基酸序列時，最優(yōu)選修飾表2所示的肽P1-P11中的一個或多個序列。此處公布了能夠達(dá)到雙重目的的適宜修飾，所述目的即在作為一種或多種II型MHC同種型分子的配體的水平上，或者更特別地在能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖(尤其是在T細(xì)胞是體外培養(yǎng)的人T細(xì)胞的情況)的水平上，降低或消除受試肽序列作為T細(xì)胞表位的能力。
這樣一套優(yōu)選修飾中的一個例子是破壞肽P10所包含的T細(xì)胞表位，P10的序列為ISQFIIMYSLDGKKW。此表位定位于FVIII的C1結(jié)構(gòu)域，而且是能夠引發(fā)來自血友病患者血液和健康非血友病個體的離體T細(xì)胞增殖的表位的一個典型例子。
以該肽序列在II型MHC配體活性方面的硅片分析結(jié)果為指導(dǎo)，將定點誘變方法用于在殘基F1207、I1208、I1209和M1210處產(chǎn)生替代。殘基依照缺失了B結(jié)構(gòu)域的成熟FVIII序列進(jìn)行編號(圖9)。在F1207處的誘變導(dǎo)致了FVIII表達(dá)的喪失，而且在所采用的檢測法中沒有可檢測的活性。相反，生成了包含I1208A或I1208T或I1208N和/或I1209C和/或M1210K或M1210N替代的活性FVIII分子。因此，具有一個或多個上述替代的活性FVIII蛋白是本發(fā)明方案下的優(yōu)選組合物。尤其優(yōu)選的替代是I1208A、I1209C、M1210K或M1210N，這些經(jīng)過替代修飾的FVIII蛋白是本發(fā)明另外的實施方案。
同樣優(yōu)選的實施方案還包括在肽P8所具有的T細(xì)胞表位中包含替代的FVIII分子，P8序列為CNIQMEDPTFKENYR。此表位定位于FVIII蛋白質(zhì)的A3結(jié)構(gòu)域。定點誘變方法已應(yīng)用于此序列，而且為了提供在Coatest分析法及硅片(in silico)免疫學(xué)參數(shù)和體外免疫學(xué)檢測多方面看都保持了功能活性的分子，已生成了M1013K、I1011A或C或D或E或G或H或K或P或Q或R或S或T的替代。因此包含M1013K、I1011A或C或D或E或G或H或K或P或Q或R或S或T替代的FVIII分子是本發(fā)明的其它實施方案。
同樣優(yōu)選的實施方案還包括在肽P7所具有的T細(xì)胞表位中包含替代的FVIII分子，P7序列為MSSSPHVLRNRAQSG。此表位也定位于FVIII蛋白質(zhì)的A3結(jié)構(gòu)域。在V823位的替代被認(rèn)為是特別期望的修飾而且也是本發(fā)明的一個實施方案。定點誘變方法已應(yīng)用于此序列，且為了提供在Coatest分析法和硅片免疫學(xué)參數(shù)及體外免疫學(xué)檢測多方面看都保持了功能活性的分子，已生成了V823A或D或E或G或H或N或P或S或T的替代。因此包含V823A或D或E或G或H或N或P或S或T替代的FVIII分子是本發(fā)明的其它實施方案。
在血友病患者血樣中顯示有活性的另一T細(xì)胞表位肽序列例子是肽P11，其序列為IARYIRLHPTHYSIRSTLRM。此表位定位于FVIII蛋白的C1結(jié)構(gòu)域，而且原來已被鑒定為FVIII抑制劑產(chǎn)生的重要驅(qū)動劑[Jacquemin，M.等(2003)Blood1011351-1358]。在位點Y1254、I1255、L1257、Y1262、I1264、L1268處的替代被認(rèn)為是尤其合乎需要的修飾，而且都是本發(fā)明的實施方案。
其它類似的優(yōu)選實施方案有于肽P9(STLFLVYSNKCQTPL)所含表位的L1119、F1120、L1121、V1122和Y1123位點含有替代，以及于肽P6(VAYWYILSIGAQTDF)所含表位的Y636、Y638、I637、L638和I639位點含有替代；于肽P5(ASNIMHSINGYVFDS)所含表位的I613和I617位點含有替代；于肽P4(YKWTVTVRDGPTKSD)所含表位的V515和V517位點含有替代；于肽P3(GPQRIGRKYKKVRFM)所含表位的I419位點含有替代；于肽P2(SYKSQYLNNGPQRIG)所含表位的Y407、Y411和L412位點含有替代；于肽P1(ILLFAVFDEGKSWSH)所含表位的L197、L198、F199、V201和F202位點含有替代的FVIII分子。
從上文可見，依照本發(fā)明可生成許多FVIII蛋白質(zhì)變體并檢測其期望的免疫和功能特性。用于制備和檢測這些FVIII變體蛋白質(zhì)的示例方法參見實施例。所有這些功能性蛋白質(zhì)都是本發(fā)明的實施方案。而且，所進(jìn)行的修飾均已被證明生成了不能以與親本或“野生型”(wt)肽序列相同的親合力結(jié)合II型MHC分子的肽序列，所用的證實方法是WO02/069232的預(yù)測性硅片II型MHC結(jié)合工具。此外，使用離體人T細(xì)胞生物學(xué)增殖測定法進(jìn)行了這些例示性變體肽表位的實際測試，證實這些肽支持T細(xì)胞增殖的能力并由此起到T細(xì)胞表位的功能如所期望的喪失了。在本案例中這包括用生物學(xué)測定法鑒定并由此證實能支持T細(xì)胞激活的肽序列。有意義的是許多這樣的肽能夠促進(jìn)來自血友病患者血液的T細(xì)胞體外增殖，因而是經(jīng)過加工的表位的代表而不能被認(rèn)為是隱蔽的或免疫學(xué)無關(guān)的決定簇。
盡管有其它的方法，包括可考慮化學(xué)合成FVIII片段，但變體蛋白質(zhì)最優(yōu)選用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。很容易利用本文所提供的蛋白質(zhì)序列信息來推斷任何優(yōu)選變體FVIII分子或片段的多核苷酸(DNA)。最容易的是利用諸如DNAstar軟件包(DNAstar Inc.Madison WI，美國)或類似的計算機(jī)軟件為工具來完成此推斷。任何編碼本發(fā)明多肽或其重要同源物的這些DNA序列都應(yīng)被認(rèn)為是本發(fā)明的實施方案。
本發(fā)明涉及其中至少一個氨基酸已被替代的FVIII類似物，其中在所選位置的替代導(dǎo)致蛋白質(zhì)的一個或多個潛在T細(xì)胞表位的消除或活性明顯降低。在圖1所示任一潛在II型MHC配體中或更優(yōu)選的是表1和2的肽表位序列中，特殊位點處的一個或多個氨基酸替代可能導(dǎo)致產(chǎn)生在作為治療劑施用于人宿主時其免疫原性潛能有所降低的FVIII分子。
最優(yōu)選的是提供在親代分子最具免疫原性的區(qū)域進(jìn)行氨基酸修飾(如替代)而產(chǎn)生的FVIII分子。為了消除T-細(xì)胞表位，氨基酸替代優(yōu)選在肽序列中預(yù)期可實現(xiàn)T-細(xì)胞表位活性的基本減少或消除的適當(dāng)位點上進(jìn)行。在實踐中，適當(dāng)?shù)奈稽c優(yōu)選等同于可以在II型MHC結(jié)合溝所提供的其中一個口袋中結(jié)合的氨基酸殘基。最優(yōu)選地是改變肽在所謂的肽P1或P1錨定位置處與裂縫的第一個口袋的結(jié)合。在肽的P1錨定殘基和II型MHC結(jié)合溝的第一個口袋之間的結(jié)合相互作用質(zhì)量被公認(rèn)為是完整肽的總結(jié)合親和力的主要決定因素。在肽的該位置中的適當(dāng)替代可為替代為較不易于容納于口袋中的殘基，如替代為更親水的殘基。肽中對應(yīng)于與MHC結(jié)合裂縫其他口袋區(qū)域結(jié)合的位置的氨基酸殘基也可以加以考慮并且屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
正如本發(fā)明技術(shù)人員所清楚的，進(jìn)行多重復(fù)合替代可達(dá)到去除不想要的表位的目的。然而，所產(chǎn)生的序列被認(rèn)為與本文所公布的具體組合物極為同源并因而屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
可以理解的是在給定的潛在T細(xì)胞表位中單個氨基酸替代是最優(yōu)選的消除表位的途徑。在單個表位中也可以考慮進(jìn)行組合替代，例如當(dāng)單獨限定的表位相互重疊時組合替代可能是特別適當(dāng)?shù)?。此外，可以在就II型MHC結(jié)合溝而言非“口袋殘基”的位置，在肽序列中任何位點處進(jìn)行氨基酸替代，該氨基酸替代可以是于給定的表位中的單個替代或于單個表位中的組合替代。替代可參照同源結(jié)構(gòu)或由本領(lǐng)域已知的計算機(jī)技術(shù)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)方法進(jìn)行，也可以根據(jù)本發(fā)明分子的已知結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行。所有此類替代均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
尤其可考慮與所列舉肽中的替代相聯(lián)合在以上限定的肽之外進(jìn)行氨基酸替代。例如，可考慮進(jìn)行某種改變來恢復(fù)變體分子的結(jié)構(gòu)或生物學(xué)活性。這樣的補(bǔ)償性改變和包括從FVIII多肽中缺失或添加特殊氨基酸殘基從而產(chǎn)生具有期望活性的變體的改變與任何已公布肽中的改變相聯(lián)合均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
就本發(fā)明來說，它還涉及已修飾的FVIII和含此已修飾FVIII蛋白質(zhì)或其片段的組合物，且所涉及的組合物應(yīng)認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這方面的相關(guān)例子可以是開發(fā)肽介導(dǎo)的耐受性誘導(dǎo)策略，其中一個或多個已公布的肽以免疫治療的目的施用于病人。因此，合成的肽分子，例如一個或多個表1中所列舉的肽分子，是本發(fā)明已考慮過的實施方案。在另一方面，本發(fā)明涉及編碼已修飾的FVIII的核酸。在又一方面，本發(fā)明涉及用已修飾的FVIII蛋白質(zhì)對人進(jìn)行治療的方法。在還有一方面，本發(fā)明涉及利用含有序列與本文公布序列相同或部分相同的肽或衍生分子的藥物制品進(jìn)行治療的方法。
現(xiàn)在將用以下實施例對本發(fā)明進(jìn)行描述，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。前文所述以及下面的實施例涉及以下附圖圖1提供了在人因子VIII中具有人II型MHC分子結(jié)合活性的一系列肽序列。肽長為13聚體，氨基酸以單字母密碼表示。
圖2描述了篩選肽庫的方案。在本研究中肽為15聚體，且每個與后續(xù)的肽重疊12個殘基。
圖3提供的柱形圖描述用FVIII衍生的合成肽處理后體外T細(xì)胞增殖測定法的結(jié)果。在此實施例中，用分離自血友病患者供體的FVIII T細(xì)胞系來篩選跨FVIII序列的重疊肽庫。箭頭指示誘發(fā)T細(xì)胞增殖并隨后被解碼的肽庫。
圖4提供的柱形圖描述用FVIII衍生的合成肽處理后體外T細(xì)胞增殖測定法的結(jié)果。在此實施例中，使用分離自血友病患者供體的FVIII特異性T細(xì)胞系解碼誘發(fā)T細(xì)胞增殖的兩個肽庫。含T細(xì)胞表位的肽用箭頭指示。
圖5提供的柱形圖描述用FVIII衍生的合成肽處理后得到的體外T細(xì)胞增殖測定法結(jié)果。在此實施例中，用分離自兩個供體的細(xì)胞來篩選跨越FVIII序列的肽。1#供體(A)和2#供體(B)具有相同的HLA-DR同種異型(DRB1*03、DRB1*04、DR3和DR4*01)。箭頭指示含T細(xì)胞表位的肽。
圖6提供了顯示肽8(P8)突變體的活性數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的圖陽性對照是野生型因子VIII。M1013K描述了含M1013K替代的FVIII分子的表達(dá)和活性數(shù)據(jù)。其它柱子代表了同時含有M1013K替代以及I1011位變換成所顯示氨基酸的改變的FVIII分子。
圖7提供了顯示肽7(P7)突變體的活性數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的圖陽性對照是野生型因子VIII，陰性對照是轉(zhuǎn)染中未加入DNA。其它的樣品是具有所指示氨基酸改變的V823突變體。
圖8提供了示例性T細(xì)胞測定數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)給出在野生型序列肽顯示刺激指數(shù)＞2.0的條件下具有刺激指數(shù)＜2.0的肽突變體。肽序列及PBMC供體同種異型數(shù)據(jù)已制成表格。
圖9顯示了用軟件模擬肽與II型MHC分子結(jié)合所獲的代表性結(jié)果。所示結(jié)果針對18種不同的HLA-DR同種異型，每個直立柱表示對單一同種異型的結(jié)合。A圖顯示在肽7周圍針對野生型FVIII序列檢測所得的結(jié)合圖。肽7序列被加深標(biāo)出。B圖顯示對含替代V823A的已修飾肽7序列進(jìn)行檢測得到的結(jié)合圖，證實其丟失了針對多種同種異型的高親和力配體。在每一圖中通過標(biāo)明每個13肽II型MHC配體的第一個殘基來描述預(yù)期的MHC結(jié)合。以所示的各配體對各同種異型分子的計算結(jié)合分值為基礎(chǔ)，用H、M或L表示結(jié)合強(qiáng)度。先前的物理結(jié)合研究已顯示數(shù)值小于500000為可忽略的結(jié)合相互作用。
圖10顯示了野生型(WT)B結(jié)構(gòu)域缺失的人FVIII序列的氨基酸序列及其編號。用單字母密碼表示氨基酸。
實施例1建立T細(xì)胞系和克隆的方法從血友病患者血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)并低溫保存于液氮中。血樣的提供得到完全的知情同意并在當(dāng)?shù)谹ddenbrooke’s HealthCare Trust的批準(zhǔn)下進(jìn)行加工。通過用FVIII刺激大量培養(yǎng)中的抗原特異性T細(xì)胞，隨后進(jìn)行幾個循環(huán)的IL-2誘導(dǎo)的擴(kuò)增來建立T細(xì)胞系。最初在24孔板中將PBMC以2×106的密度保溫(37℃、含5％CO2的潮濕空氣中)于2ml含4μg/ml FVVIII(RefactoTM)的AIM V培養(yǎng)基中。保溫7天后加入100U/ml的IL-2，繼續(xù)培養(yǎng)3天。10天的抗原/IL-2刺激完成后收集T母細(xì)胞(T blast)并計數(shù)。為了保持抗原特異性，用經(jīng)γ輻射的自體PBMC作為抗原呈遞細(xì)胞對T母細(xì)胞進(jìn)行第二輪抗原刺激。這一步的完成方法為在用4000拉德γ射線進(jìn)行輻射前將24孔板中的1×106個/孔的自體PBMC與4μg/ml FVIII在0.75ml AIMV(含5％的熱失活人AB血清)中孵育1小時。將0.25ml AIM V中的自體T母細(xì)胞以4×105個細(xì)胞/ml的濃度加入經(jīng)γ輻射的抗原呈遞細(xì)胞(預(yù)負(fù)載FVIII)中并孵育3天。通過用100U/ml IL-2刺激細(xì)胞3天擴(kuò)增T母細(xì)胞，然后每隔3天向培養(yǎng)物提供新鮮的IL-2(終濃度100U/ml)共9天。為了保證所有的擴(kuò)增T母細(xì)胞都是抗原特異的，進(jìn)行第三輪抗原刺激，其中T母細(xì)胞被收集并以4×105個細(xì)胞/ml的濃度重懸于AIMV培養(yǎng)基中。如前文所述通過將24孔板中的1×106個γ輻射的自體PBMC與4μg/ml FVIII在0.75ml AIMV(含5％的熱失活人AB血清)中孵育1小時來產(chǎn)生抗原呈遞細(xì)胞。將0.25ml AIM V中的自體T母細(xì)胞以4×105個細(xì)胞/ml的濃度加入經(jīng)γ輻射的抗原呈遞細(xì)胞中并孵育3天。最終在10U/ml的IL-2中擴(kuò)增3天，然后收集T母細(xì)胞并用于篩選肽庫。
從大量培養(yǎng)物克隆在用FVIII抗原進(jìn)行第三輪刺激后，收集T母細(xì)胞并通過系列稀釋將其重懸至密度4×102-1×104個細(xì)胞/ml(2x培養(yǎng)物終密度)。融化自體PBMC并以2×106個細(xì)胞/ml(2x培養(yǎng)物終密度)的密度重懸于聚丙烯管中。然后將PBMC暴露于4000拉德γ射線輻射并用作抗原呈遞細(xì)胞，通過限制稀釋選擇呈抗原反應(yīng)性的T細(xì)胞克隆。將經(jīng)γ射線輻射的抗原呈遞細(xì)胞(1×106終濃度)與T母細(xì)胞(2×102-5×103終濃度)、1-10μg/ml FVIII抗原和100U/ml IL-2混合。通過在Terasaki平板中每孔加入20μl APC、T母細(xì)胞、FVIII和IL-2混合物而建立T細(xì)胞克隆。用一個Terasaki平板上2-50個T母細(xì)胞/孔的稀釋度進(jìn)行有限稀釋克隆。
T細(xì)胞克隆的篩選和維持T母細(xì)胞與FVIII抗原、IL-2和經(jīng)γ射線輻射的自體抗原呈遞細(xì)胞一起孵育約14天。鑒定所含細(xì)胞呈現(xiàn)明確生長的孔后，將T母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含1×105經(jīng)γ輻射的同種異體PBMC、100U/ml IL-2和1μg/ml植物凝集素(PHA)的圓底96孔板的單個孔中，終體積為200μl AIMV(含1％的熱失活人AB血清)。在細(xì)胞匯合后將T細(xì)胞克隆傳代，最后轉(zhuǎn)移至含1×106經(jīng)γ輻射的同種異體PBMC(飼養(yǎng)細(xì)胞)、100U/ml IL-2和1μg/ml植物凝集素(PHA)的24孔板的單個孔中，終體積為2ml AIMV(含1％的熱失活人AB血清)。T細(xì)胞克隆的常規(guī)維持包括每隔2-3周(取決于細(xì)胞生長狀態(tài))用新鮮的PHA和同種異體飼養(yǎng)細(xì)胞刺激一次，以及用100U/mlIL-2每周刺激2次。只有被證實為FVIII特異性的T細(xì)胞克隆才被擴(kuò)增并用于篩選FVIII肽。
自體B細(xì)胞的EBV轉(zhuǎn)化通過在4×106個PBMC中加入3ml已過濾(0.45μ)的B95.8上清并在37℃保溫1小時，將來自PBMC制品的B細(xì)胞無限增殖化以產(chǎn)生B類淋巴母細(xì)胞系(BLCL)。沉淀PBMC并重懸于含5％熱失活胎牛血清(FCS)和1μg/ml環(huán)孢菌素A的2ml RPMI中。保溫7天后，用含5％FCS和2μg/ml環(huán)孢菌素A(達(dá)到終濃度為1μg/ml環(huán)孢菌素A)的新鮮RPMI置換1ml培養(yǎng)基。在第14和21天重復(fù)此飼喂方案，此后如需要用含5％FCS的RPMI進(jìn)行細(xì)胞傳代并擴(kuò)大至組織培養(yǎng)瓶。
用T細(xì)胞系/克隆篩選FVIII肽合成長度為15個殘基且通過增加12個氨基酸而與先前的肽重疊的肽(Pepscan，荷蘭)。為了保存，最初將肽以10mM的濃度溶于100％的二甲亞砜(DMSO)。建立肽庫以便同時針對FVIII特異性T細(xì)胞系篩選大量肽。組織肽庫以便每個庫都與隨后的庫包含重疊肽，通過使用此方法，與兩種肽重疊的T細(xì)胞表位將誘導(dǎo)兩個不同庫的增殖。通常每個庫由8種肽組成，以1或5μM的濃度測試每種肽。肽庫策略如圖2所述。
自體PBMC(對于T細(xì)胞系來說)或EBV轉(zhuǎn)化的BLCL(對于T細(xì)胞克隆來說)被用作抗原呈遞細(xì)胞，將1×105個PBMC或BLCL懸浮于50μL AIMV培養(yǎng)基中并隨后加入96孔圓底板的各個孔中。對于每個庫來說分別以兩個濃度(1或5μM)將肽庫加入三個平行孔中。在暴露于4000拉德γ射線輻射之前將抗原呈遞細(xì)胞和肽庫于37℃孵育1小時。當(dāng)用作T細(xì)胞克隆的抗原呈遞細(xì)胞(代替已γ輻射的自體PBMC)時，BLCL在37℃用1μg/ml絲裂霉素C預(yù)處理1小時，隨后在AIMV中洗4次。然后將抗原特異性T細(xì)胞系或T細(xì)胞克隆以5×104個細(xì)胞/孔的濃度加入并培養(yǎng)3天。第三天在每個孔中加入1μCi[3H]-胸腺嘧啶核苷至少脈沖8小時。在濾墊上收獲平板后用Wallac小平板β計數(shù)器測定cpm/孔。圖3顯示了用T細(xì)胞系產(chǎn)生的表位圖譜，其中T母細(xì)胞被用于鑒定含T細(xì)胞表位的肽庫，隨后將這些庫解碼以鑒別含T細(xì)胞表位的單個肽。
用來自健康供體的PBMC繪制幼稚T細(xì)胞表位圖譜用來自40名健康HLA-DR類型供體的血液分離PBMC，將此PBMC用于在兩個濃度(1和5μM)篩選各FVIII肽。由于來自每個供體的PBMC數(shù)目不足以篩選所有的FVIII肽，供體被分成兩組，其中前20個供體用于篩選跨越前半段分子的肽，第二組供體用于篩選剩余的肽。為了覆蓋呈現(xiàn)于世界人群中的多種同種異型，按所表達(dá)的II型MHC同種異型來選擇供體。檢測MHC同種異型。
用購買到的試劑體系(Dynal，Wirral，英國)來檢測所有PBMC樣品的組織類型。按供應(yīng)商推薦的方案用標(biāo)準(zhǔn)的輔助試劑及瓊脂糖電泳體系來進(jìn)行檢測。
PBMC包含生理性數(shù)量的幼稚T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞。這些細(xì)胞以2×105個細(xì)胞/孔(96孔平底板)的密度用于篩選三份平行200μL培養(yǎng)物中1μM和5μM的肽。將細(xì)胞與肽在37℃保溫6天，然后在每個孔中加入1μCi[3H]-胸腺嘧啶核苷至少脈沖8小時。收獲培養(yǎng)物于濾墊上后用Wallac小平板β計數(shù)器測定cpm/孔。圖5顯示了用兩組供體分別篩選分子兩半部分所產(chǎn)生的FVIII表位圖譜。
實施例2克隆和表達(dá)因子VIII的方法mRNA提取和cDNA合成從醫(yī)院病理學(xué)系獲取人的肝組織。將樣品切成方塊并分成50mg的等分試樣，保存于液氮中。將一份50mg試樣勻漿并直接用PolyA TractSystem1000試劑盒(Promega)按制造商說明書提取mRNA，得到約10μg mRNA。用ImProm-II逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega)以寡(dT)15為引物按制造商的說明書將1μg等分試樣的mRNA在20μL反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后在70℃加熱15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。
因子VIII序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增由于待克隆的是B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII變體，所以此cDNA以兩半段的方式擴(kuò)增。用以下引物擴(kuò)增5’端的mRNASEQ ID NO.1GCATCGCGCGCTAGCAATAAGTCATGCAAATAGAGSEQ ID NO.2GAAGCTCCTAGGTTCAATGGCATTGTTTTTACTCASEQ ID NO.1包含為方便克隆的兩個限制性酶切位點加上因子VIIImRNA序列ATG起始密碼子(粗體)周圍的24個核苷酸。SEQ ID NO.2與因子VIII mRNA的第2420-2454位核苷酸互補(bǔ)并在第2445和2448位(粗體)包含兩個改變的核苷酸，這樣就引入了一個新的限制性酶切位點同時使蛋白質(zhì)序列未受影響。
用以下引物對擴(kuò)增因子VIII基因的3’端SEQ ID NO.3TGAGTCTTAAGCTAGCTAGATACCTAGGAGCTTCTCCCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCCSEQ ID NO.4TACGTCTCGAGTCAGTAGAGGTCCTGTGCCTCGCASEQ ID NO.3包含限制性酶切位點NheI以便克隆，并包含與第5140-5164位核苷酸融合的因子VIII mRNA的第2442-2457位核苷酸。此引物因此建立了重鏈和輕鏈之間的聯(lián)結(jié)，在此幾乎整個B結(jié)構(gòu)域缺失。此引物還含有在第2445和2448位點(粗體顯示)處的核苷酸改變，這樣就建立了也能在SEQ ID NO.2中找到的新限制性酶切位點。SEQ ID NO.4包含因子VIII編碼序列的最后24個核苷酸加上一個方便克隆的限制性酶切位點。
用Expand HiFi聚合酶(Roche)及供應(yīng)的含MgCl2的緩沖液進(jìn)行PCR反應(yīng)，終體積50μL。反應(yīng)體系是1x緩沖液中含dNTP各200μM、引物各50pmol(或者是seq ID No.1加No.2，或者是seq ID No.3加No.4)、2.5個單位的RNaseH和5μL逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)混合物。為了提高PCR反應(yīng)的效率將反應(yīng)在37℃保溫30分鐘使RNA/cDNA雜交體中的RNA被RNaseH所降解。然后將反應(yīng)在94℃加熱2分鐘預(yù)變性，隨后的循環(huán)使用以下的溫度和時間94℃30秒，55℃30秒，72℃2.5分鐘。在第一個退火步驟期間加入推薦量的聚合酶，反應(yīng)進(jìn)行20個循環(huán)。在第20個延伸步驟后的退火步驟中加入第二等份聚合酶并再進(jìn)行20個循環(huán)的反應(yīng)。然后將反應(yīng)在72℃保溫10分鐘以保證所有的鏈完全聚合。
因子VIII基因的克隆和組裝用1％的瓊脂糖凝膠分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物的一半，切下相應(yīng)于因子VIIIcDNA 5’端的2286bp帶和相應(yīng)于3’端的2015bp帶并通過Qiagen凝膠提取試劑盒將這兩條帶從瓊脂糖中純化出來。然后按制造商的說明將PCR產(chǎn)物連入PCR產(chǎn)物克隆載體(pGEM-T Easy Vector System，Promega)。按供應(yīng)商所推薦的用0.1cm間距的電擊杯將連接反應(yīng)液各1μL電穿孔轉(zhuǎn)化入20μL電感受態(tài)大腸桿菌菌株XL1-Blue(Stratagene)中。還按供應(yīng)商所推薦的方法重懸細(xì)胞并使其復(fù)蘇。將10μL和100μL等份的電穿孔細(xì)胞鋪于含100μg/ml氨芐青霉素、80μg/ml Xgal和0.5mM IPTG的LB瓊脂板上并在37℃培養(yǎng)過夜。
挑選白色菌落并分散于20μL水中。用供應(yīng)的緩沖液和Taq聚合酶(Roche)以20μL的反應(yīng)體積通過PCR分析來自各重懸菌落的樣品。反應(yīng)體系為在1x緩沖液中包含dNTP各200μM、標(biāo)準(zhǔn)M13正向和反向引物(本文的SEQ ID Nos5和6)各50pmol和1μL的重懸菌落。然后將反應(yīng)在94℃加熱2分鐘預(yù)變性，隨后的20個循環(huán)使用以下的溫度和時間94℃30秒，60℃30秒，72℃2分鐘。然后將反應(yīng)在72℃保溫10分鐘以保證所有的鏈完全聚合。
取各反應(yīng)樣品5μL于1％的瓊脂糖凝膠上分離。含有約2300bp大小條帶的樣品被認(rèn)為對于因子VIII 5’半側(cè)的插入片段來說是陽性的，而含有約2150bp條帶的樣品被認(rèn)為對于因子VIII 3’半側(cè)的插入片段來說是陽性的。對于各插入片段，將8個菌落分別接種于含100μg/ml氨芐青霉素的5ml2YT肉湯液體培養(yǎng)基中并在37℃振蕩培養(yǎng)過夜。用Qiagen小量提取試劑盒從1.5ml各培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒并將質(zhì)粒送到合同測序機(jī)構(gòu)進(jìn)行序列測定，所用引物如下5’半側(cè)的克隆SEQ ID No.5 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC (M13正向)SEQ ID No.6 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA (M13反向)SEQ ID No.7 ATGATCAGACCAGTCAAAGG(因子VIII mRNA nt573-592)SEQ ID No.8 CAGGAAATCAGTCTATTGGC(因子VIII mRNA nt975-994)SEQ ID No.9 TGGGTACATTACATTGCTGC(因子VIII mRNA nt1372-1391)SEQ ID No.10 ACAGTGACTGTAGAAGATGG(因子VIII mRNA nt1768-1787)SEQ ID No.11 GTCTTCTTCTCTGGATATACC (因子VIII mRNA nt2179-2199)3’半側(cè)的克隆SEQ ID No.5 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC (M13正向)SEQ ID No.6 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA (M13反向)SEQ ID No.12 GAGTAGCTCCCCACATGTTC(因子VIII mRNA nt5370-5361)SEQ ID No.13 GTGCACTCAGGCCTGATTGG(因子VIII mRNA nt5786-5767)SEQ ID No.14 AGGTGTTTTTGAGACAGTGG(因子VIII mRNA nt6187-6168)SEQ ID No.15 GAGGAAATTCCACTGGAACC(因子VIII mRNA nt6594-6575)SEQ ID No.16 AATCTCTGCTTACCAGCATG(因子VIII mRNA nt6993-6974)已發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pCF85編碼因子VIII基因5’半側(cè)的正確氨基酸序列。質(zhì)粒pCF83則被發(fā)現(xiàn)編碼因子VIII基因3’半側(cè)的正確氨基酸序列。
用Bst98I和XhoI消化pCF83并通過瓊脂糖凝膠電泳純化所得到的含因子VIII基因3’半側(cè)的2.0Kbp片段，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其克隆入同樣酶切和純化的pLitmus(NEB)中。如上所述通過PCR鑒別陽性菌落并選擇一個克隆-pCLF83進(jìn)行培養(yǎng)和DNA制備。
用BssHII消化pCF85并在dNTP各100μM存在的條件下用T4 DNA聚合酶將末端補(bǔ)平。然后將反應(yīng)在70℃加熱10分鐘并隨之以AvrII消化。通過瓊脂糖凝膠電泳純化酶切釋放的2.3kbp片段，將其克隆入已用Bst98I消化并如上補(bǔ)平及用AvrII消化并進(jìn)行凝膠純化的pCLF83中。如上所述用引物Seq ID No.11和Seq ID No.17(ATCAGTAAATTCCTGGAAAAC[因子VIII mRNA第5448-5428位核苷酸])通過PCR篩選鑒別陽性菌落。這對引物擴(kuò)增了跨越因子VIII基因兩半間連接區(qū)的片段，因此只有在克隆成功的情況下才能得到約570bp的產(chǎn)物。選擇陽性菌落并命名為pCLF8。培養(yǎng)此菌落，然后進(jìn)行DNA制備和測序。用引物Seq ID No.6和Seq ID No.5證實了連接序列的正確。此5’和3’兩半之間的連接也用引物Seq ID No.17得到了證實。
因子VIII的表達(dá)和活性分析用已修飾的載體pCI變體(Promega，Southampton，英國)表達(dá)此FVIII蛋白。未修飾的pCI載體長4.0kbp，含用于哺乳動物表達(dá)的CMV增強(qiáng)子/啟動子和SV40晚期聚腺苷酸化信號，還包含細(xì)菌繁殖所必需的序列。該載體還含有噬菌體F1的起點，用限制性酶BamHI和EcoO109I消化此質(zhì)粒去除該起點。如上所述用T4 DNA聚合酶將消化產(chǎn)物補(bǔ)平，然后通過1％的瓊脂糖凝膠分離。從凝膠中純化3.2kbp的載體片段，自連接并如上所述轉(zhuǎn)化入細(xì)菌菌株XL1-blue中。如上所述挑選菌落、培養(yǎng)過夜并小量制備質(zhì)粒。用酶切位點出現(xiàn)于F1起點序列內(nèi)的限制性酶NgoMIV消化已純化的質(zhì)粒樣品并通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。挑選抗性質(zhì)粒并稱之為pCIΔ。
用限制性酶NheI和XhoI消化pCIΔ并通過瓊脂糖凝膠電泳純化載體片段。用同樣的酶消化pCLF8并通過瓊脂糖凝膠電泳純化含有因子VIII基因的4.4kbp片段，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其克隆入酶切的pCIΔ中。用如上所述引物Seq ID No.11和Seq ID No.17通過PCR分析鑒別陽性菌落。
選擇一陽性菌落，命名為pCIF8，將其接種入含100μg/ml氨芐青霉素的50ml 2YT肉湯培養(yǎng)基中37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。用Qiagen小量制備試劑盒制備高純度的質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA用分光光度法定量，稀釋至0.2μg/μL并通過0.2μm孔徑、1.5cm直徑的濾器(Nalgene)進(jìn)行無菌過濾。
HEK293細(xì)胞(ATCC CRL-1573)連續(xù)培養(yǎng)維持于75cm2組織培養(yǎng)瓶的DMEM中，此DMEM中含有Glutamax-I、丙酮酸鈉和4500mg/ml葡萄糖(Invitrogen目錄號31966-021)，補(bǔ)充有10％的熱滅活胎牛血清(Perbio目錄號CH30160.03)。細(xì)胞生長于37℃/5％CO2中并每48小時1/5稀釋進(jìn)行傳代培養(yǎng)。HEK293細(xì)胞只微弱粘附于組織培養(yǎng)塑料制品上，通過洗滌培養(yǎng)瓶表面就使其脫離。
用Lipofectamine2000(Invitrogen)按制造商所述在聚L-賴氨酸包被的24孔組織培養(yǎng)皿(Beckton Dickinson)中轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌75cm組織培養(yǎng)瓶中幾乎匯合的細(xì)胞，并用胰蛋白酶/EDTA溶液使其從組織培養(yǎng)瓶上分離下來。加入等體積的生長培養(yǎng)基滅活胰蛋白酶。用血球計數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并將細(xì)胞懸浮液以1200rpm離心5分鐘。去除上清，以4×105個細(xì)胞/ml的密度將細(xì)胞沉淀重懸于生長培養(yǎng)基中。在24孔組織培養(yǎng)皿的每孔中分配0.5ml細(xì)胞懸浮液并在37℃/5％CO2中培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染前去除各孔中的培養(yǎng)基并置換成新鮮的0.5ml培養(yǎng)基。將0.8μg質(zhì)粒pCIF8和陰性對照質(zhì)粒pCIΔ分別在Optimem(Invitrogen目錄號51985-026)中稀釋至50μL。對于每次轉(zhuǎn)染，將2μL Lipofectamine2000稀釋至50μL，室溫放置5分鐘后與已稀釋的質(zhì)?；旌?，隨后再室溫放置20分鐘。進(jìn)行三份平行的轉(zhuǎn)染，然后在24孔板的每個孔中分別滴加100μL質(zhì)粒/脂質(zhì)混合物。然后將平板在37℃/5％CO2中保溫。在24小時、48小時和72小時三個時間點從各轉(zhuǎn)染樣品中取出10μL的等分試樣。將來自三個平行樣品的等分試樣合并得到每個樣品的總體積為30μL，在進(jìn)行活性分析前凍存于-80℃。
按制造商的說明書用Coatest F8C/4試劑盒(Chromogenix)以微量滴定的形式檢測上清液中的因子VIII活性。在冰上融化上清液樣品，1/20和1/100稀釋于檢測緩沖液中并以雙份平行樣品進(jìn)行檢測。標(biāo)準(zhǔn)品是已對照因子VIII活性的國際標(biāo)準(zhǔn)(Chromogenix)定量的凍干血漿樣品。按制造商說明書將一小瓶血漿重溶于1ml水中。對于血漿中因子VIII活性水平參考所附數(shù)據(jù)表，然后將血漿通過添加檢測緩沖液進(jìn)行100％稀釋(1IU/ml)。然后按制造商提供的微量滴定檢測方案中所述的步驟稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。24小時后發(fā)現(xiàn)來自pCIF8所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清中含0.16IU/ml活性，在48小時時增加到了0.74IU/ml，然后在72小時時又回落到0.5IU/ml。在用對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清中未觀察到活性。因此因子VIII以足夠測定突變體活性的量成功表達(dá)。
肽P10中氨基酸的誘變(表2)肽10包含的4個疏水殘基具有作為與II型MHC分子相互作用的主要錨定位點的潛能F1207、I1208、I1209及M1210(按B結(jié)構(gòu)域缺失的成熟序列編號)。因此這四個殘基被選為突變的目標(biāo)殘基，以突變成不可能作為主要錨定位點的那些殘基。F1207改變成A、H、K、N、Q和R；I1208改變成A、T、D、N；I1209改變成A、C、D、N、P；M1210改變成A、K、N和Q。用本領(lǐng)域眾所周知的已建立的方法通過交迭PCR進(jìn)行誘變。肽10位于因子VIII核苷酸序列中被PspOMI和SphI限制性位點所限定范圍的片段內(nèi)。合成用于擴(kuò)增這些片段的PCR引物(下文的Seq IDNo.18和Seq ID No.19)，它們相應(yīng)于緊鄰此區(qū)域外側(cè)的序列。對于F1207的誘變，合成的內(nèi)部引物如下所述SEQ ID No.18 GGACACATTAGAGATTTTCA (基因nt.3463-3482)SEQ ID No.19 CAGTAATCTGTGCATCTGAT (基因nt.3949-3930)SEQ ID No.20 CTGAGAGATGTAGAGGCT (基因nt.3675-3658)SEQ ID No.21 AGCCTCTACATCTCTCAGgccATCATCATGT (F1207A)SEQ ID No.22 AGCCTCTACATCTCTCAGcacATCATCATGT (F1207H)SEQ ID No.23 AGCCTCTACATCTCTCAGaagATCATCATGT (F1207K)SEQ ID No.24 AGCCTCTACATCTCTCAGaacATCATCATGT (F1207N)SEQ ID No.25 AGCCTCTACATCTCTCAGcagATCATCATGT (F1207Q)SEQ ID No.26 AGCCTCTACATCTCTCAGcgcATCATCATGT (F1207R)用Expand HiFi聚合酶(Roche)及供應(yīng)的含MgCl2的緩沖液進(jìn)行PCR反應(yīng)，終體積50μL。5’片段的反應(yīng)體系是1x緩沖液中含dNTP各200μM、引物各50pmol(Seq ID No.18加No.20)、100ng pCIF8和2.5個單位的Expand聚合酶。建立6個3’片段反應(yīng)，體系為1x緩沖液中含dNTP各200μM、引物各50pmol(Seq ID No.19加Seq ID No.21、22、23、24、25或26)、100ng pCIF8和2.5個單位的Expand聚合酶。然后將反應(yīng)在94℃加熱2分鐘預(yù)變性，隨后的循環(huán)使用以下的溫度和時間94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒。反應(yīng)進(jìn)行20個循環(huán)，然后在72℃保溫10分鐘以保證所有的鏈完全聚合。
在1％瓊脂糖凝膠上分離各PCR的一半反應(yīng)產(chǎn)物，將226bp的5’片段和292bp的6個不同的3’片段從凝膠上切下來并用Qiagen凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化。然后如下將5’片段與各個3’片段連接如上所述用ExpandHiFi聚合酶進(jìn)一步進(jìn)行6個PCR反應(yīng)，以已洗脫的5’片段2μL和6個已洗脫的3’片段各2μL作為模板，引物是Seq ID No.18和Seq ID No.19。將這些反應(yīng)液各一半在1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離并如上所述純化6個486bp大小的片段。用限制性酶PspOMI和SphI在37℃消化各PCR產(chǎn)物過夜，總反應(yīng)體積為50μL。同樣在37℃消化4μg質(zhì)粒pCIF8 2小時，并將質(zhì)粒和PCR片段消化產(chǎn)物的一半進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠中切下7.2kbp的載體帶和391bp的PCR片段并如上所述進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物分別溶于水中，終體積為30μL。在標(biāo)準(zhǔn)10μL連接反應(yīng)體系中用T4DNA連接酶和所供應(yīng)的緩沖液(Invitrogen)將1μL載體與6種片段各3μL連接。反應(yīng)液在室溫放置4小時。按供應(yīng)商所推薦的用0.1cm間距的電擊杯將連接反應(yīng)液各1μL電穿孔轉(zhuǎn)化入20μL電感受態(tài)大腸桿菌菌株XL1-Blue(Stratagene)中。還按供應(yīng)商所推薦的方法重懸細(xì)胞并使其復(fù)蘇。將10μL和100μL等份的電穿孔細(xì)胞鋪于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂板上并在37℃培養(yǎng)過夜。
從各連接產(chǎn)物所鋪的板上挑選4個菌落并在含100μg/ml氨芐青霉素的5ml 2YT液體培養(yǎng)基中37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。用Qiagen Mini-Prep試劑盒從各1.5ml培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA。用引物Seq ID No.18對各質(zhì)粒樣品進(jìn)行DNA測序。從4個一組中挑選序列正確的一個質(zhì)粒保存以備通過轉(zhuǎn)染進(jìn)行活性和表達(dá)水平的分析。
在此相同的一般步驟后對I1208、I1209和M1210進(jìn)行突變。用于各氨基酸的引物如下I1208SEQ ID No.18 GGACACATTAGAGATTITCA (基因nt.3463-3482)SEQ ID No.19 CAGTAATCTGTGCATCTGAT (基因nt.3949-3930)SEQ ID No.20 CTGAGAGATGTAGAGGCT (基因nt.3675-3658)SEQ ID No.27 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTgccATCATGT (I1208A)SEQ ID No.28 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTaccATCATGT (I1208T)SEQ ID No.29 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTgacATCATGT (I1208D)SEQ ID No.30 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTaacATCATGT (I1208N)I1209SEQ ID No.18 GGACACATTAGAGATTTTCA (基因nt.3463-3482)SEQ ID No.19 CAGTAATCTGTGCATCTGAT (基因nt.3949-3930)SEQ ID No.20 CTGAGAGATGTAGAGGCT (基因nt.3675-3658)SEQ ID No.31 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCgccATGTATA (I1209A)SEQ ID No.32 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCtgcATGTATA (I1209C)SEQ ID No.33 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCgacATGTATA (I1209D)SEQ ID No.34 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCaacATGTATA (I1209N)SEQ ID No.35 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCcccATGTATA (I1209P)M1210SEQ ID No.18 GGACACATTAGAGATTTTCA (基因nt.3463-3482)SEQ ID No.19 CAGTAATCTGTGCATCTGAT (基因nt.3949-3930)SEQ ID No.20 CTGAGAGATGTAGAGGCT (基因nt.3675-3658)SEQ ID No.36 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCgccTATAGTC(M1210A)SEQ ID No.37 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCaagTATAGTC(M1210K)SEQ ID No.38 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCaacTATAGTC(M1210N)SEQ ID No.39 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCcagTATAGTC(M1210Q)如上所述，在24孔聚-L-賴氨酸平板中將已通過序列分析證實的各突變克隆一式兩份轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染在37℃/5％CO2中進(jìn)行48小時。合并各轉(zhuǎn)染的平行試樣上清并如上所述檢測因子VIII的活性。還用配對的抗因子VIII抗體ELISA試劑盒(Affinity Biologicals)檢測上清中的因子VIII表達(dá)水平。修改此檢測法使其有效地對組織培養(yǎng)上清物質(zhì)進(jìn)行定量，步驟如下將捕捉抗體以1/100稀釋于pH9.6的碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液中，按100μl/孔加入Dynex Immulon4 96孔ELISA平板中。此平板在4℃放置過夜。用洗滌緩沖液(含0.1％Tween20的Tris緩沖鹽水[TBS25mMTris，137mM NaCl，3mM KCl，在25℃pH7.4])將孔洗4次，100μl/次，將雙份100μl等分試樣的平行稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和組織培養(yǎng)上清加入各個孔中。標(biāo)準(zhǔn)品是已對照因子VIII活性的國際標(biāo)準(zhǔn)(Chromogenix)定量的凍干血漿樣品。按制造商說明書將一小瓶血漿重溶于1ml水中。參考所附數(shù)據(jù)表顯示的血漿中因子VIII活性水平，然后添加樣品稀釋緩沖液(含1％w/v的牛血清白蛋白)進(jìn)行100％稀釋(1IU/ml)。然后用樣品稀釋緩沖液將其1/4稀釋得到100％的ELISA標(biāo)準(zhǔn)。然后再用樣品稀釋緩沖液對其進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋得到代表75％、50％、25％和5％的標(biāo)準(zhǔn)。用樣品稀釋緩沖液1/4稀釋組織培養(yǎng)上清。平板在室溫放置2小時后用洗滌緩沖液漂洗4次，100μl/孔。在每個孔中加入100μl已綴合辣根過氧化物酶的抗體并室溫放置1小時。如前文所述漂洗平板，然后在每個孔中加入100μl底物(現(xiàn)配的TMB/過氧化物溶液Sigma目錄號T0440)。將平板室溫放置15分鐘后加入終止液(2M硫酸)。在Anthos HTII平板閱讀器上用450nm波長的濾片對平板進(jìn)行讀數(shù)。
活性值及表達(dá)水平的比較顯示了所有對F1207的改變都導(dǎo)致了無表達(dá)從而無活性。I1208突變成A產(chǎn)生與未修飾的因子VIII相似的表達(dá)和活性，而突變成T和N則導(dǎo)致25％和50％的活性損失。對于I1209來說，只有突變成C才使突變體的表達(dá)和活性與未修飾的因子VIII相似。所有對于M1210的改變都導(dǎo)致了具明顯活性的蛋白質(zhì)表達(dá)，其中具K和N的蛋白與未修飾的因子VIII無差別。因此，I1208A、I1209C、M1210K和M1210N是用于去除肽10內(nèi)T細(xì)胞表位的有用突變。
肽8中氨基酸的誘變(表2)肽8包含兩個有可能作為結(jié)合II型MHC分子的主要錨定位點的氨基酸I1011和M1013(按B結(jié)構(gòu)域缺失的成熟序列進(jìn)行編號)。因此這兩個殘基也是突變的靶殘基，突變成除了可能是主要錨定位點的殘基之外的殘基。與其它物種(狗、小鼠和大鼠)的因子VIII序列比較的結(jié)果顯示，在狗的因子VIII中，M1013是K。K也被證實對于肽10的M1210誘變來說它是最好的置換殘基。因此只將M1013突變成K，并與在I1011處不可能形成主要錨定位點的所有氨基酸(即A、C、D、E、K、N、P、Q、R、S、T)相結(jié)合。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的已建立的方法通過交迭PCR進(jìn)行誘變。肽8位于因子VIII核苷酸序列中被PflM1和PspOMI限制性位點所限定范圍的片段內(nèi)。合成用于擴(kuò)增此片段的PCR引物(下文的Seq ID No.40和SeqID No.41)，它們相應(yīng)于緊鄰此區(qū)域外側(cè)的序列。對于M1013K和I1011X的誘變，合成的內(nèi)部引物如下所述SEQ ID No.40ATGAGACCAAAAGCTGGT (基因nt.3026-3043)SEQ ID No.41AGGCATTGATTGATCCG (基因nt.3559-3543)SEQ ID No.42ATTGCAGGGAGCCCTGCAGT(基因nt.3087-3068)SEQ ID No.43ACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGaagGAAGA(M1013K)SEQ ID No.44ACTGCAGGGCTCCCTGCAATgccCAGaagGAAGA(I1011A，M1013K)SEQ ID No.45ACTGCAGGGCTCCCTGCAATtgcCAGaagGAAGA(I1011C，M1013K)SEQ ID No.46ACTGCAGGGCTCCCTGCAATgacCAGaagGAAGA(I1011D，M1013K)SEQ ID No.47ACTGCAGGGCTCCCTGCAATgagCAGaagGAAGA(I1011E，M1013K)SEQ ID No.48ACTGCAGGGCTCCCTGCAATggcCAGaagGAAGA(I1011G，M1013K)SEQ ID No.49ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcacCAGaagGAAGA(I1011H，M1013K)SEQ ID No.50ACTGCAGGGCTCCCTGCAATaagCAGaagGAAGA(11011K，M1013K)SEQ ID No.51ACTGCAGGGCTCCCTGCAATaacCAGaagGAAGA(I1011N，M1013K)SEQ ID No.52ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcccCAGaagGAAGA(I1011P，M1013K)SEQ ID No.53ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcagCAGaagGAAGA(I1011Q，M1013K)SEQ ID No.54ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcgcCAGaagGAAGA(I1011R，M1013K)SEQ ID No.55ACTGCAGGGCTCCCTGCAATagcCAGaagGAAGA(I1011S，M1013K)SEQ ID No.56ACTGCAGGGCTCCCTGCAATaccCAGaagGAAGA(I1011T，M1013K)用與上述肽10誘變相同的常規(guī)步驟進(jìn)行誘變，不同處在于5’片段長度為62bp及3’片段長為492bp。此連接片段長為534bp，用PspOMI和PflMI消化后克隆入同樣酶切消化的pCIF8。
對于各個突變來說選擇一個序列正確的克隆并如上所述分析它們的活性和表達(dá)水平，但不同之處在于轉(zhuǎn)染以三份平行形式進(jìn)行，且各上清單獨分析以便評估表達(dá)/活性中的變化。
對以上突變體的表達(dá)水平和活性的比較結(jié)果顯示單獨的M1013K突變與未修飾的因子VIII非常相似。此外，含M1013K加上I1011A、E、P、S或T的聯(lián)合突變體也與未修飾的因子VIII無差別。因此這些突變可用于去除與肽8相關(guān)的T細(xì)胞表位。
肽P7中氨基酸的誘變(表2)肽7包含一個有可能作為結(jié)合II型MHC分子的主要錨定位點的氨基酸V823(按B結(jié)構(gòu)域缺失的成熟序列進(jìn)行編號)。因此這個殘基也是突變的靶殘基，突變?yōu)椴豢赡苁侵饕^定位點的殘基(即A、C、D、E、K、N、P、Q、R、S、T)。
如前文所述用已建立的方法通過交迭PCR進(jìn)行誘變。肽7位于因子VIII核苷酸序列中被AvrII和PflM1限制酶位點所限定范圍的766bp片段內(nèi)。合成用于此片段擴(kuò)增的PCR引物(下文的Seq ID No.57和Seq ID No.58)，它們相應(yīng)于緊鄰此區(qū)域外側(cè)的序列。對于V823X的誘變，合成的內(nèi)部引物如下所述SEQ ID No.57CGAGGACAGTTATGAAG (基因nt.2214-2230)SEQ ID No.58AGTGGGATCTTCCATCTG(基因nt.3108-3091)SEQ ID No.59ATGTGGGGAGCTACTCATCCC (基因nt.2523-2503)SEQ ID No.60GGGATGAGTAGCTCCCCACATgccCTAAGAAACAG (V823A)SEQ ID No.61GGGATGAGTAGCTCCCCACATtgcCTAAGAAACAG (V823C)SEQ ID No.62GGGATGAGTAGCTCCCCACATgacCTAAGAAACAG (V823D)SEQ ID No.63GGGATGAGTAGCTCCCCACATgagCTAAGAAACAG (V823E)SEQ ID No.64GGGATGAGTAGCTCCCCACATgggCTAAGAAACAG (V823G)SEQ ID No.65GGGATGAGTAGCTCCCCACATcacCTAAGAAACAG (V823H)SEQ ID No 66GGGATGAGTAGCTCCCCACATaagCTAAGAAACAG (V823K)SEQ ID No.67GGGATGAGTAGCTCCCCACATaacCTAAGAAACAG (V823N)SEQ ID No.68GGGATGAGTAGCTCCCCACATcccCTAAGAAACAG (V823P)SEQ ID No.69GGGATGAGTAGCTCCCCACATcagCTAAGAAACAG (V823Q)SEQ ID No 70GGGATGAGTAGCTCCCCACATcgcCTAAGAAACAG (V823R)SEQ ID No.71GGGATGAGTAGCTCCCCACATagcCTAAGAAACAG (V823S)SEQ ID No.72GGGATGAGTAGCTCCCCACATaccCTAAGAAACAG (V823T)用與肽10誘變相同的常規(guī)步驟(見上文)進(jìn)行誘變，不同處在于5’片段長度為310bp及3’片段長為606bp。此連接片段長為894bp，用AvrII和PflMI消化后克隆入同樣酶切消化的pCIF8。
對于各個突變來說選擇一個序列正確的克隆并如上所述分析它們的活性和表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染以雙份平行形式進(jìn)行并在檢測前合并上清。
對以上突變體的表達(dá)水平和活性比較的結(jié)果顯示多種改變都基本上未影響表達(dá)水平和活性。這些數(shù)據(jù)見圖7。V823改變成A、D、E、G、H、N、P、S或T所產(chǎn)生的突變體具有至少與野生型因子VIII相同的表達(dá)和活性。因此這些突變可用于去除與肽7相關(guān)的T細(xì)胞表位。
實施例3合成含有突變的FVIII來源肽并用離體試驗檢測它們所保持的促進(jìn)T細(xì)胞增殖的能力。所說的肽是15聚體的序列，且是為檢測I1011A或I1011T與M1013K聯(lián)合替代而設(shè)計的。用原先顯示對野生型肽序列有響應(yīng)的4個PBMC供體樣品測試所說的肽。在所有的案例中所檢測的突變肽都不能以SI＞2.0刺激增殖。包括供體同種異型詳情和肽序列在內(nèi)的此試驗結(jié)果如圖8所示。
在96孔平底板中以2×106個PBMC/孔的密度用蛋白質(zhì)和肽抗原刺激PBMC。在加入3H-胸苷前將PBMC在37℃孵育7天。產(chǎn)生了具有所述替代的肽，并相對于分離自原先已顯示對FVIII P8肽序列有響應(yīng)的4個健康供體的PBMC，對各個肽進(jìn)行分別篩選。在各供體試驗中使用了來自流感血凝素的對照肽和有效的非回憶型抗原匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。
將肽溶于DMSO中至終濃度10mM，然后將這些貯液以1/500稀釋于AIMV培養(yǎng)基中(終濃度20μM)。將肽加入平底96孔板中，于100μl中達(dá)終濃度2μM和20μM。用臺盼藍(lán)染料排除法估計已融化的PBMC的存活力，然后以2×106個細(xì)胞/ml的密度重懸細(xì)胞，分別將100μl(2×105個PBMC/孔)轉(zhuǎn)移入含有肽的各個孔中。對于每一種肽濃度檢測三份平行孔培養(yǎng)物。平板在潮濕的5％CO2空氣中37℃孵育7天。在收獲至濾墊上之前用1μCi3H-Thy/孔脈沖細(xì)胞18-21個小時。用Wallac小平板β頂平板計數(shù)器(Perkin Elmer)測定CPM值。結(jié)果表示為刺激指數(shù)，通過用測試肽的CPM值除以未處理孔中的CPM值而計算得到。刺激指數(shù)大于2被認(rèn)為是陽性增殖。
權(quán)利要求
1.與未修飾的人因子VIII相比包含特異改變的氨基酸殘基、在體內(nèi)使用時基本上無免疫原性或免疫原性較未修飾親本分子低且具有基本上相同的生物學(xué)特異性和活性的經(jīng)修飾人因子VIII分子，其中所述已改變的氨基酸殘基引起一個或多個在親本未修飾分子中擔(dān)當(dāng)II型MHC結(jié)合配體并刺激T細(xì)胞的T細(xì)胞表位的減少或消除。
2.依照權(quán)利要求1的經(jīng)修飾因子VIII分子，其中所述改變是在表1所描述的親本分子中存在的一個或多個連續(xù)氨基酸殘基序列內(nèi)的一個或多個位置進(jìn)行的。
3.依照權(quán)利要求2的經(jīng)修飾因子VIII分子，其中所述改變是在表2所描述的親本分子中存在的一個或多個連續(xù)氨基酸殘基序列內(nèi)的一個或多個位置進(jìn)行的。
4.依照權(quán)利要求1-3之任一項的經(jīng)修飾因子VIII分子，其中所述改變是1-9個氨基酸殘基的替代。
5.依照權(quán)利要求4的經(jīng)修飾因子VIII分子，其中表1所描述的序列中的下列位置的一個、多個或所有氨基酸殘基已經(jīng)被替代197、198、199、201、202、407、411、412、419、515、517、613、617、636、637、638、639、823、1011、1013、1208、1209、1210、1254、1255、1257、1262、1264、1268、1119、1120、1121、1122、1123。
6.依照權(quán)利要求3的經(jīng)修飾因子VIII分子，其中在表2的肽P10中進(jìn)行了下列氨基酸殘基替代的一個、多個或所有I1208A、I1208T、I1208N；I1209C；M1210K、M1210N。
7.依照權(quán)利要求3的經(jīng)修飾因子VIII分子，其中在表2的肽P8中進(jìn)行了下列氨基酸殘基替代的一個、多個或所有M1013K；I1011A、I1011C、I1011D、I1011E、I1011G、I1011H、I1011K、I1011P、I1011Q、I1011R、I1011S、I1011T。
8.依照權(quán)利要求3的經(jīng)修飾因子VIII分子，其中在表2的肽P7中進(jìn)行了下列氨基酸殘基替代的一個、多個或所有V823A、V823D、V823E、V823G、V823H、V823N、V823P、V823S、V823T。
9.依照權(quán)利要求1-8之任一項的經(jīng)修飾因子VIII分子，其中當(dāng)作為完整蛋白質(zhì)在人T細(xì)胞的經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖生物學(xué)測定中被測試時其展示的刺激指數(shù)(SI)小于使用來自相同供體的細(xì)胞平行測試的親本分子且小于2，其中所述指數(shù)為用蛋白質(zhì)刺激后評價的細(xì)胞增殖值除以未接受蛋白質(zhì)的對照細(xì)胞中評價的細(xì)胞增殖值，并且其中細(xì)胞增殖是通過任何適宜方法測量的。
10.編碼權(quán)利要求1-9之任一項所定義的因子VIII分子的DNA序列。
11.包含上述權(quán)利要求之任一項的經(jīng)修飾因子VIII分子的藥物組合物，其任選還包含藥學(xué)可接受載體、稀釋劑或賦形劑。
12.由表1選擇的、由未修飾人因子VIII的一級序列生成且具有潛在II型MHC結(jié)合活性的肽分子，其中所述肽分子在細(xì)胞增殖生物學(xué)測定中具有大于1.8的刺激指數(shù)，其中所述指數(shù)為用肽刺激后評價的細(xì)胞增殖值除以未接受肽的對照細(xì)胞中評價的細(xì)胞增殖值，并且其中細(xì)胞增殖是通過任何適宜方法測量的。
13.通過氨基酸替代由權(quán)利要求12的肽分子衍生的經(jīng)修飾肽分子，其缺少或具有降低的潛在II型MHC結(jié)合活性，表現(xiàn)為刺激指數(shù)低于2，其中所述指數(shù)為用肽刺激后評價的細(xì)胞增殖值除以未接受肽的對照細(xì)胞中評價的細(xì)胞增殖值，并且其中細(xì)胞增殖是通過任何適宜方法測量的。
14.編碼權(quán)利要求12或13的肽的DNA序列。
15.依照權(quán)利要求13的肽在制造權(quán)利要求1所定義的經(jīng)修飾因子VIII分子中的用途。
16.依照權(quán)利要求12的肽在制造用于降低因子VIII在患者體內(nèi)的免疫原性的疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及對人因子VIII(FVIII)進(jìn)行修飾，從而導(dǎo)致當(dāng)用于體內(nèi)時與任何未修飾的親代抗體相比基本無免疫原性或具低的免疫原性的FV VIII蛋白質(zhì)。本發(fā)明也涉及來源于所述未經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的T－細(xì)胞表位肽，通過該肽可以構(gòu)建具有降低的免疫原性的修飾的FVIII變體。
文檔編號A61K38/36GK1646564SQ03808701
公開日2005年7月27日 申請日期2003年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月18日
發(fā)明者T·瓊斯, M·貝克爾, F·J·卡爾 申請人:默克專利有限公司