專利名稱：促進心臟組織修復的凝血酶衍生肽的制作方法
政府的支持本發(fā)明整體或部分得到了國家健康研究院R43 HL64508項撥款的資助。該政府部門在本發(fā)明中享有一定的權利。
本發(fā)明的背景人體α凝血酶似乎對各種組織的許多種細胞都具有促進生長的活性。舉例而言，在沒有加入血清或其他純化生長因子的情況下，α凝血酶可以和某些倉鼠的纖維原細胞及人類內皮細胞協(xié)同作用以引發(fā)培養(yǎng)基中纖維原細胞的繁殖，從而在哺乳動物晶狀體上皮細胞和脾細胞中引發(fā)細胞的分裂或DNA的合成，并激勵單核細胞和嗜中性粒細胞。然而，凝血酶作為生長因子的用途和它在治療創(chuàng)傷方面的潛在重要性還沒有得到普遍認可。這在一定程度上是因為凝血酶參與凝血過程、血小板活化作用和啟動細胞繁殖的復雜性以及凝血酶和類凝血酶分子受血清蛋白酶抑制劑和細胞釋放蛋白酶連接蛋白的調節(jié)十分復雜的緣故。但是，這一復雜性和高度的生理調節(jié)性卻對這一啟動途徑在創(chuàng)傷愈合方面的潛在重要性構成了支持。
凝血酶在正常的血管再生以及細胞從血液向傷口位置的遷移過程中發(fā)揮著作用。同時也在與腫瘤相關的異常轉移及血管再生方面發(fā)揮著作用。凝血酶提高內皮細胞增生以及改變血管屏障功能的能力也對血管新生以及組織傷口處的感染有幫助作用。
本發(fā)明就凝血酶衍生物肽在治療創(chuàng)傷中的促效和拮抗凝血酶和/或凝血酶受體的活性對這種衍生物進行了說明。美國5,500,412號專利或5,352,664號專利的內容在此通過引證被并入本文。然而，該專利并未指出凝血酶衍生物肽在治療心臟受損組織、血管再生或防止血管閉鎖及血管再狹窄方面的新應用。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及到促進心臟組織修復、促進心肌修復、促進血管再生或防止血管閉鎖或血管再狹窄的方法。該方法包括向心臟組織或血管施用具有療效劑量的血管生長凝血酶衍生物肽。在優(yōu)選的實施方案中，這種肽是美國5,500,412或5,352,664號專利中所說明的肽，這兩項專利的內容在此通過引證被全部并入本文。舉例而言，在優(yōu)選情況下，這種肽含有肽受體結合區(qū)域，結合區(qū)域含有序列Arg-Gly-Asp-Ala(第2號序列標識)；該結合域還具有絲氨酸酯酶保留序列。優(yōu)選的絲氨酸酯酶保留序列為Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val(第2號序列標識)。在另一優(yōu)選實施方案中，凝血酶衍生物肽含有的氨基酸序列 為Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Ary-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val(第3號序列標識)，比如由序列為Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第3號序列標識)的氨基酸構成的肽。
與血管生長凝血酶衍生物肽具有等同生理功能的物質也在本發(fā)明的范圍之內。舉例而言，這些肽的羧基末端可轉化為醯胺，氨基末端可以形成乙?；镔|。在某一實施方案中，第3號序列標識的氨基酸由以下具有同等生理功能的物質表示Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly_asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第四號序列標識)；Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第五號序列標識)或Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第六號序列標識)。(“AC”是CH3-C(O)-)。具有第4號序列標識的肽在本文中也被稱為“TP508”。
肽更適宜在心臟手術過程中或手術后進行使用，例如肽以溶液的形式或以可持續(xù)釋放的方式注射到或通過導管輸送到受損的心臟組織或缺血的心臟組織。
本發(fā)明還與刺激血管再生或血管內皮細胞增生的方法有關；如本文所述，該方法包括向心臟組織施以具有療效劑量的血管生長凝血酶衍生物肽。
本發(fā)明還與防止血管閉鎖或血管再狹窄的方法有關，該方法包括向血管中施放具有療效劑量的血管生長凝血酸受體結合肽，例如通過組織注射的方法將肽釋放到血管中，或者通過導管將肽輸送到受損血管所在地，或者通過將肽附著在金屬絲網(wǎng)管上而送入機體組織。
圖示簡介

圖1表明，提高TP508(具有第4號氨基酸序列標識的肽)的濃度可以刺激人類微血管內皮細胞在試管中的增殖。圖1表明了在加入不同濃度的TP508(濃度以μg/ml表示)48小時后細胞的數(shù)量。
圖2表明了提高TP508的濃度可促進微血管內皮細胞的遷移。該圖表明了在施用不同濃度的TP508后細胞所遷移的距離。
圖3表明了用TP508治療后心臟功能的變化情況以及心臟缺血實驗豬的心臟功能變化情況。
本發(fā)明的詳細說明心血管疾病的基本特征是心臟供血或其他目標器官的供血出現(xiàn)障礙。心肌梗死是由心臟內冠狀動脈的變窄或閉鎖造成的，心肌梗死會切斷心臟所需的養(yǎng)份和氧氣供應。當心臟的供血受到威脅時，細胞的反應是產(chǎn)生可以促使新血管生長的化合物，從而增加對心臟的供血。這些新血管被稱為旁系血管。這種誘導現(xiàn)有脈管系統(tǒng)生成出新生血管的過程被稱為血管創(chuàng)生，細胞所產(chǎn)生的誘導血管創(chuàng)生的物質是血管生長因子。
當心肌由于血管閉鎖而失去氧氣和養(yǎng)分時，心肌組織就會缺血，并喪失收縮能力和功能。來自缺血心肌的自然信號可恢復喪失的功能，這種信號通過旁系血管的生長來誘導血管的再生，旁系血管在閉鎖血管旁邊建立了旁路血管。這種血管再生或血管創(chuàng)生過程包括對內皮細胞增殖的刺激以及新生血管的萌發(fā)及遷移。然而，在許多情況下，這種自然信號不足以引發(fā)旁系血管的生長。缺血組織可能會出現(xiàn)纖維化及壞死。如果這種纖維化及壞死過程沒能通過疏通閉鎖的血管或進一步建立旁系血管所逆轉，則心臟可能會完全喪失功能，結果是需要進行心臟移殖。
本文中所述的肽可用來誘導血管的再長以及促進血管內皮細胞的遷移，從而形成新的毛細血管及旁系血管；這樣可有助于恢復受損或缺血心臟組織的功能。再適宜的方法是，在開胸進行搭橋手術或植入血管輔助裝置時直接將肽注射到或施用到心臟組織中，或者將肽以溶液的形式或可持續(xù)釋放的方式通過導管輸送到心臟。
內皮細胞的增殖，例如在血管新生過程出現(xiàn)的細胞增殖同樣也有助于避免或抑制血管擴張手術后的血管再狹窄現(xiàn)象。血管小球擴張手術過程通常會損傷到襯套在血管內壁上的內皮細胞，并且會損傷到血管壁的完整。平滑肌細胞和炎癥細胞通常會滲入到受傷的血管中，從而引起二次阻塞，這一過程被稱為“再狹窄”。對位于因植入小球而受損區(qū)域附近的內皮細胞進行刺激，使其發(fā)生增殖和遷移，這樣可使一層新的內皮細胞覆蓋住血管的內表面，從而幫助血管恢復原有的結構。
在優(yōu)選情況下，內皮生長包括血管整形手術后為抑制、防止或減小血管再狹窄而出現(xiàn)的內皮再生。本領域的技術人員將認識到，用本發(fā)明方法進行治療的患者可以用金屬絲網(wǎng)管進行治療，也可以不用金屬絲網(wǎng)管進行治療。
為了將肽輸送到預定的動脈中，可以使用帶有膨脹小球的導管，小球或導管外表涂有肽，這種導管可直接將肽注射到血管的內皮中。
血管小球整形術是治療缺血性心臟病的普通療法，在該療法中，為了疏通閉鎖的血管，一個小氣球將在阻塞的血管中膨脹。但不幸的是，這種療法會損傷襯在血管內壁上的內皮細胞，其結果通常是再狹窄。為了使新的單層內皮細胞覆蓋住血管的內腔表面，本文所述的肽可用來誘導氣球所損傷區(qū)域附近的內皮細胞進行增殖和遷移，這一做法希望可以恢復血管的原有結構。冠狀動脈整形術通常伴隨有在血管內展開金屬絲網(wǎng)管，從而幫助維持血管的功能，并且防止再狹窄。金屬絲網(wǎng)管上涂有肝素，這樣是為了在金屬絲網(wǎng)管所形成的新通道開始出現(xiàn)內皮細胞生長前防止發(fā)生凝血。使用本領域技術人員已知的多種方法可將本文所述的肽直接施加到金屬絲網(wǎng)管上。為了增強血管或血管壁的內皮細胞增長和/或調節(jié)其他抑制或減少凝血及再狹窄的生理過程，這些肽可以局部使用或全身給藥。
在優(yōu)選情況下，本發(fā)明使用合成或天然衍生出的多肽促效劑，這種促效劑對凝血酶受體有中和作用。這二類物質具有凝血酶受體結合區(qū)，其中包括能夠與高親和力凝血酶受體進行有選擇性結合的一段多肽。這一段多肽具有的氨基酸序列與纖維結合素的三肽細胞結合區(qū)的氨基酸序列同源。
除凝血酶受體結合區(qū)外，激發(fā)性(促效性)多肽具有一套氨基酸序列；其中氨基酸所具有的序列是從十二肽的N-未端氨基酸衍生出來的序列，這種十二肽以往在絲氨酸蛋白酶中是非常穩(wěn)定的。然而，抑制性多肽不含有這些對絲氨酸蛋白酶不敏感的序列。
舉例而言。本發(fā)明提供多種有助于促進心臟組織修復的多肽。在這一方面，本發(fā)明提供凝血酶的多肽衍生物(或與這種衍生物具有等同生理功能的物質)，這種衍生物含有凝血酶受體結合區(qū)以及至少由12個氨基酸構成的序列區(qū)，這一序列區(qū)對絲氨酸酯酶不敏感。本發(fā)明還提供某種至少由23個L-氨基酸構成的多肽化合物，這種多肽化合物即含有凝血酶受體結合區(qū)，也含有對絲氨酸酯酶不敏感的氨基酸序列區(qū)。本文所述方法所使用的肽化合物通常帶有12-33個氨基酸，更適宜的是帶有12-23個氨基酸。
在某一實施方案中，本發(fā)明提供了數(shù)種含有特定氨基酸序列的多肽物質，比如某種多肽化合物，其中凝血酸受體結合區(qū)含有L-氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala(第1號序列標識)，同時還含有對絲氨酸酯酶不敏感的氨基酸序列Asp-Ala-Cys-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第2號序列標識)。在優(yōu)選實施方案中，該多肽化合物包括L-氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Ary-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第3號序列標識)。
與血管生長凝血酶衍生肽具有等同生理功能的物質也在本發(fā)明的范圍之內。舉例而言，這些肽化合物的羧基未端轉化成醯胺，氨基未端可形成乙?；镔|。在某一具體實施方案中，第3號氨酸序列由下列具有等同生理功能的物質代表Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly_asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第四號序列標識)；Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第五號序列標識)或Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第六號序列標識)。(“AC”是CH3-C(O)-)。具有第4號序列標識的肽在本文中也被稱為“TP508”。
本發(fā)明還提供促進組織修復的藥物成份，這種藥物成份含有前面所述的具有有效治療濃度的任何化合物以及藥理學上可接受的賦形劑。一般而言，這些藥物成份包括足夠濃度的多肽，正如本文所闡明的，這樣可以對凝血酶受體產(chǎn)生有效的刺激作用。因此，這些藥物成份通常應達到足夠的濃度，以便多肽在預定組織部位能夠達到與其在試管中刺激受體的相同水平。當內源性二級信號被認為不夠時，可以使用這些藥物成份，這些藥物成份中還進一步添加了具有有效治療濃度的VEGF、α凝血酶、γ凝血酶和其他生長因子。這些成份組合在一起可以起到附加的或協(xié)同的作用。如果組織損傷十分嚴重，以至于能對多肽做出響應的細胞數(shù)量不足，在這種情況下，為了提供有效治療的組合方法，則應同時向受損組織注入有響應能力的細胞。
合適的載體會對預定目標釋放出活性組份，更適宜的情況是在一段時間內緩慢地持續(xù)地釋放出活性組份。許多合成的并且是可生物降解的聚合物可以作為具有持續(xù)釋放特性的載體。具體的聚合物包括如聚乳酸/聚乙醇酸均聚物和共聚物這樣的聚α羥基酯、聚磷腈、聚酸酐和聚(丙烯反丁烯二酸酯)。
在本技術領域內，聚乳酸/聚乙醇酸均聚物和其聚物是眾所周知的具有可持續(xù)釋放特征的載體。技術人員通過改變聚乳酸與聚乙醇酸的比例以及聚合物的分子量來調節(jié)釋放的速度(參見Anderson等人在Adv.Drug Deliv.Rev.上的文章，285(1997)，該文獻的全文在此通過引證被并入本文)。在這種聚合物中加入聚(乙二醇)可以形成微粒載體，這種微粒載體可進一步延長活性組織的釋放時間(參見Cleek等人在J.Control Release上的文章，48259(1997)，該文獻的全文在通過引證被并入本文)。聚乳酸/聚乙醇酸微粒載體通常與聚合凝膠或膠原混合使用，以此來防止微粒的集結，并使微粒適于直接注射。
聚磷腈含有交替的氮和磷，但在該聚合物的主鏈中沒有碳，其結構如下式(I)所示
通過適當改變聚合物主鏈兩側所結合的基團R的R’，可以調整該聚合物的特性。舉例而言，通過改變易于水解的側面基團的量可以控制聚磷腈的降解以及對藥物成份的釋放速度。在加入更多咪唑或乙基酐氨酸取代的聚磷腈后，降解的速度提高了(參見Laurencin等人在J Biomed Mater.Res.上所著的文章，27963(1993)，該文獻的全文在此通過引證被并入本文)，因此提高了藥物釋放的速度。
結構式(II)所表明的聚酸酐具有明確的降解和釋放特性，通過改變如葵二酸和1.3-二(對羥基苯氧基)丙烷這些疏水性或親水性單體的量可以控制聚酸酐的降解及釋放特性(參見Leong等人在J.Biomed.Mater.Res.上的文章，19941(1985)，該文章的全文在此通過引證被并入本文)。
聚(丙烯反丁烯二酸酯)是一種生物兼容性很高的可植入載體，因為這些物質是可注射的、可原地聚合的并且是可生物降解的材料。“可注射的”意味著這種材料可使用注射器通過注射漿體或膠體所用的標準針頭進行注射。聚(丙烯反丁烯二酸酯)與乙烯基單體(N-乙烯基吡咯烷酮)和引發(fā)劑(苯?；^氧化物)共同形成了一種可原地聚合的可注射溶液(參見Suggs等人在Macromolecules上的文章，304318(1997)，參見Peter等人在J.Biomater.Sci.Poly，.Eng.上的文章，10363(1999)，參見Yaszemski等人在Tissue Eng上的文章，141(1995)，這些文章的全文在此通過引證被并入本文)。
如本文所用，“具有治療效果的濃度”被定義為特定藥劑的濃度，這種藥劑可令人滿意地提高組織修復或血管再生的速度，或者這種藥劑可令人滿意地降低或抑制血管狹窄或血管閉鎖的程度。再者，這些濃度被認為是達到了足以在試管中對高親和性凝血酶受體進行刺激的水平。然而，當刺激性(促效性)多肽的濃度在0.1μm～10μm之間時，這些藥劑組份被認為是效力最高的。
就本發(fā)明目的而言，無論是在活的有機體內生成的還是在試管是合成的，凝血酶衍生物被定義為任何一種帶有氨基酸序列的分子，其中氨基酸的序列至少有部分是從凝血酶的序列衍生出來的。因此，正如本文所指的，凝血酶衍生物是指比凝血酶含有更少氨基酸的多肽分子。
與凝血酶衍生肽具有同等生理功能的物質包括那些在特性上不同于凝血酶衍生肽的分子；這些分子不會影響凝血酶受體結合區(qū)或對絲氨酸酶不敏感的氨基酸序列的功能。這些特性包括穩(wěn)定的氨基酸替換或改性；例如羧基未端的醯胺化，氨基未端的乙?；?；這些特性還包括多肽與生理惰性載體分子結合，或者序列按照對絲氨酸酯酶不敏感的序列而變化；但這些特性并不局限于此。
本領域中任何一種已知的方法都可以實現(xiàn)羧基未端的醯胺化。因此，羧基未端的氨基酸用結構或(III)表示
其中R是氨基酸側鏈，R1和R2分別選自氫、C1-C6的烷基(有支鏈的和直鏈的烷基基因)，R1和R2與它們所結合的氮形成了一個非芳烴雜環(huán)，例如氮雜戊環(huán)/對二氮己環(huán)/嗎啡環(huán)或哌啶環(huán)。在優(yōu)選情況下，R1和R2是氫。
本領域中任何一種已知的方法都可以實現(xiàn)氨基末端的乙?；Ｒ虼?，具有氨基末端的氨基酸用結構式(IV)表示R1-C(O)-NH-CHR-C(O)-(IV)其中R是氨基側鏈，R1是C1-C6的烷基(有支鏈的和直鏈的烷基基團)。在優(yōu)選情況下，R是甲基(-CH3)。
凝血酶受體結合區(qū)被定義多肽序列，該多肽序列可直接與凝受體相結合，和/或優(yōu)先抑制高親和力的凝血酶與α凝血酶之間的結合。
具有對絲氨酸酯酶不敏感序列的區(qū)域含有多肽序列，該多肽序列至少含有4-12個十二肽中的N-末端氨基酸，其中十二肽以往在絲氨酸蛋白酶中是高度穩(wěn)定的，(Asp-X1-Cys-X2-Gly-Asp-Ser-gly-Gly-Pro-X3-Val-第7號序列標識)；其中X1為Ala或Ser；X2是Glu或Gln；X3是Phe、Met、Leu、His或Val。
刺激性多肽被定義為凝血酶的多肽衍生物，或具有同等生理功能的物質，這些物質有能力與凝血酶受體結合以及激發(fā)凝血酶受體。因此，刺激性肽將含有二個區(qū)域，一個區(qū)域是凝血酶受體結合區(qū)，另一個是帶有對絲氨酸酯酶不敏感的氨基酸序列的區(qū)域。
本發(fā)明通過下面范例加以說明，這些范例不具任何限制性。
實施例例1TP508在試管中刺激人體內皮細胞的增殖和遷移為了確定TP508是否能夠直接誘發(fā)內皮細胞的增殖，實驗人員從Clonetics購買了人體微血管內皮細胞，這些細胞被涂在24孔培養(yǎng)盤的組織培養(yǎng)級塑料上，并在不加血清的情況下放置24小時。然后使用含有TP508和不含TP508的介質對細胞刺激48小時，然后通過直接計數(shù)細胞的數(shù)量來評估增殖情況。如圖1所示，在只受介質(1.0ug/mlTP508)處理過的微血管內皮細胞中，有30～50％受到TP508刺激后出現(xiàn)了增殖現(xiàn)象。這種效果似乎具有特異性，因為從小鼠動脈分離出來的平滑肌生長不受TP508的影響。
TP508對人體內皮細胞遷移的影響是通過試管單層創(chuàng)傷實驗加以評估的。在該實驗中，內皮細胞被涂在35mm的培養(yǎng)盤上，并使其生長3天，達到接近融合的程度，此時，用橡皮劃過培養(yǎng)盤的中心，除去一條細胞，從而使單層細胞受到“創(chuàng)傷”。在經(jīng)過拍照后，使用單一的無鹽介質或含有不同濃度TP508的介質對細胞進行處理，并使細胞生長48小時。然后再對細胞進行拍照，并對內皮細胞在創(chuàng)傷區(qū)域所遷移的距離進行測量。如圖2所示，即使細胞只在塑料上進行培養(yǎng)，TP508也激發(fā)了內皮細胞的遷移。
這些研究表明，TP508對人體內皮細胞有促其生成血管的直接作用，TP508在試管中引發(fā)了細胞更多的增殖和遷移。其他的研究表明，TP508對內皮細胞有保護作用，TP508可防止因暴露在氧化劑下而導致的細胞死亡。這種保護作用也對內皮再生和血管生成過程有促進作用。
例2TP508在試管中刺激尿囊絨膜中的血管生成對實驗鼠背部的所有皮科手術切口及開放性傷口的研究表明，局部單獨使用TP508會刺激血管再生以及穿越手術切口血管的開放。實驗人員在實驗鼠的背部做出兩個手術切口。一個切口只用TP508(0.1μg)處理，另一個切口則不進行處理。結果是血管被引到了處理過的切口上，而不是引到了對比切口上。
在置于小雞胚胎尿囊絨膜上的瓊脂盤中加入TP508會導致血管向外生長。在TP508的刺激下，血管長到了含有TP508的瓊脂盤中。TP508同樣也可使血管阻塞處的血管末梢出現(xiàn)旁系血管加速外生的現(xiàn)象，這種外生現(xiàn)象與使用其他血管生長因子所得的現(xiàn)象是相似的。
例3TP508可有效治療實驗豬的心肌缺血實驗人員在Yucatan小型豬的左彎動脈附近放置了環(huán)形ameroid閉鎖器。ameroid在經(jīng)過一段時間的吸水后，造成了血管的變窄。在植入閉鎖器4星期后，血管造影的結果顯示血管出現(xiàn)了閉鎖。此時，再打開實驗豬的胸腔，然后向缺血部位注入可以緩慢釋放的TP508，例如向胸腔中注入懸浮于聚丙二醇/環(huán)氧乙烷加聚物凝膠中并且含有TP508的聚乳酸/聚乙醇酸微粒。聚乳酸/聚乙醇酸微粒的制備如例6所述，這種微粒初期的藥物釋放量很大(24小時釋放出50％的藥量)，然后在此后的3～4天以有控制的方式釋放藥物，此時已有80％的藥量被釋放了出去。所使用的凝膠是在0.9％鹽水中加入30％W/V聚丙二醇/環(huán)氧乙烷加聚物F68所得的液體。每毫升凝膠都放置在冰上以降低凝膠的粘度。在臨注射前，向凝膠中加入3.3毫克的聚乳酸/聚乙醇酸微粒。這樣得到的TP508濃度為100毫克/毫升凝膠，藥物被注射到缺血區(qū)域的10處位置(每個位置注射100微升)。對比試樣則注射不含TP508的聚乳酸/聚乙醇酸微粒。該實驗得到了基準線及后處理過的血管造影和超聲波心動圖。
心肌厚度及心臟供血比例指數(shù)表明，經(jīng)TP508處理過的實驗動物在耐受多巴胺誘發(fā)的刺激方面要好于對比實驗動物。3個星期后，這些動物用對照強化超聲波心動圖進行評估。這一數(shù)量有限的動物實驗的初步結果表明，經(jīng)TP508處理過的動物在多巴胺刺激下心臟的射血量增長程度稍高一些，與對照實驗動物相比，經(jīng)TP508處理過的動物能保持更好的壁厚。因此，使用TP508進行處理似乎有助于恢復缺血心肌的功能。
例4使用TP508刺激兔子心肌的血管再生該實驗中，TP508加入到具有可持續(xù)釋放特性的聚乳酸/聚乙醇酸微粒中，TP508被注射到兔子的缺血心肌中。正如Operschall等人在J.Appl.Physiol.中的文章所述，一個ameroid閉鎖器被放置到兩只兔子左邊主冠狀動脈的側支上，放置位置正好位于A-V溝槽的下方。在放入閉鎖器二星期后，兔子的胸部被再次打開。在一只兔子的閉鎖血管供血區(qū)域內或周圍，任意選擇8個位置，然后將TP508的凝膠微粒(如例3中所述的)注射到這8個位置上。另一只兔子則作為不加任何處理的對比動物。在注射TP508后約4個星期，將實驗兔解剖，并將兔子的心臟在10％的富爾馬林緩沖溶液中放置24小時。然后切開所要研究的心臟部位，并使用蘇木精署紅進行染色，同時用Von Willebrand內皮細胞標志因子進行免疫標記。
從組織結構的觀察得出結論，在對比實驗兔體內，閉鎖器所作用的區(qū)域出現(xiàn)了嚴重的纖維化。另一方面，經(jīng)TP508治療過的心臟卻具有健康的心肌，心肌上帶有更多的功能性毛細血管，毛細血管上帶有明顯的血紅細胞。
例5使用TP508抑制膽固醇水平過高的兔子出現(xiàn)血管再狹窄這一實驗的目的在于為測定試驗樣品的功效提供一個系統(tǒng)，其中的試驗樣品被用來抑制膽固醇水平過高的新西蘭白兔在經(jīng)過血管整形術后可能出現(xiàn)的新內膜形成以及血管的閉鎖。這些白兔在3個星期中被喂以含0.5％膽固醇和2.0％花生油的高脂肪食物。正如本文所述的，血管小球整形手術損傷了兔子的回腸動脈，術后的兔子用TP508治療7天；在手術前24小時，兔子接受預處理程序。在此后的4星期中，繼續(xù)用高脂肪食物喂養(yǎng)兔子。在進行血管小球整形術前和實驗結束時對兔子的血管進行造影。將受傷和未受傷的回腸動脈收集起來，以備組織結構觀察之用。對腹腔、新內膜(如果存在)以及膜介質進行形態(tài)測定。
TP508的試驗樣品被溶解在無菌、無熱原質的鹽水中，并稀釋到所要求的濃度，并在手術的前一天和手術當天以及術后的連續(xù)6天內以0.2毫升的量對實驗動物進行靜脈注射。
在兔子的頸部做5cm的中線切口，使右頸動脈暴露出來，在對頸動脈進行綁扎后將動脈切開。然后在動脈中插入4Fr Berman氣球血管造影導管。5Fr套管通過4Fr Berman氣球血管造影導管被引入到動脈中。抽取3毫升血液進行膽固醇測定。然后對兔子注射肝素和更多的麻醉劑(如果必要)。為了對回腸動脈進行觀察，6毫升76％的Hypaque以及4毫升無菌鹽水的混合液通過導管被注射到兔子體內。對兔子回腸動脈進行成象(圖象用格柵加以標記，剪切標記在右側)。然后將4Fr Berman氣球血管造影導管從套管中抽出。然后再將一根0.014″/3.0mm×20.0mm/120cm的氣球導管經(jīng)套管插入到兔子的動脈中，并且插入到回腸動脈處。氣球在10ATM下膨脹3次，每次持續(xù)30秒，兩次膨脹間隔1分鐘。然后將導管和套管取出。使用3.0的絲線將右頸動脈綁扎起來。使用PDS閉合頸部的切口，并將皮膚縫合，同時涂上抗生素油膏。
然后，將測試樣品或對比樣品施加給兔子。測試樣品按以下方式進行稀釋用23G1針頭將0.3毫升鹽水抽入到期1.0毫升的注射器中。然后將這些鹽水注射到TP508中。待TP508溶解后，取溶液0.25毫升對兔子進行給藥。然后用鹽水對套管進行沖洗。如果兔子是參照對象，則給該兔子注射0.2毫升的鹽水，并再用鹽水進行沖洗。兔子還通過皮下注射的方式接受0.3毫升的Buprenorphine。
在手術后，將兔子放在熱墊上，使其恢復警覺。然后將兔子送回籠中，并隨意喂以食物和水。這些兔子再喂養(yǎng)4星期后進行解剖。
4星期后，兩只兔子的回腸動脈原位復原，解剖后將回腸動脈收集起來，以制備組織結構樣本。然后，對間隔約為1毫米的組織切片進行數(shù)字成像，并對損傷區(qū)域的腹腔、新內膜(如果存在)和膜介質進行形態(tài)測定。
組織結構總結研究人員使用Image-Pro plus及Excel軟件對19個樣品進行了形態(tài)組織結構分析。在19個樣品中，2個樣品具有外側彈性層受損。還有一樣品需要進行再切片處理。因此，對照比較了16個樣品，其中7個樣品是經(jīng)過TP508處理的，另外9個樣品為鹽水處理對照樣品。
通過數(shù)字分析測定新內膜的面積可以確定再狹窄病灶的厚度。血管的膜介質也使用類似的方法進行測定。然后將這兩個面積加在一起，并除以同一組織切片系列中正常(未受損)介質的面積，將所得到的數(shù)據(jù)進行歸一化處理。
當藥物處理過的動物與對照動物進行比較時，研究人員使用3種不同的方法對再狹窄的程度進行分析；這3種方法是“單一最大值”法；“平均損傷厚度”法和“所有切片平均值”法?！皢我蛔畲笾怠狈▽邮苁中g血管的最大再狹窄值進行比較?！捌骄鶕p傷厚度”法對接受手術血管間被明確定為損傷區(qū)域內所有非正常點的平均值進行比較。最后，“所有切片平均值”法對所有被測定樣品的平均厚度進行比較，不管這些樣品是否有部分損傷。研究人員通過Student’s T-test對這些結果的平均值進行統(tǒng)計顯著性測試。
數(shù)據(jù)匯總所有的數(shù)據(jù)分析都是使用雙尾t測試法進行的，該測試法假定偏差是不相等的。α值是0.05，平均差值被假設為0。在每項數(shù)據(jù)分析中，n＝7用于經(jīng)藥物處理后的動物，n＝9用于鹽水對照動物。數(shù)據(jù)分析結果匯總在下面的表1中。表中所示的“差值”是經(jīng)藥物處理過的樣品與相應的對照樣品間的差別百分數(shù)，帶有星號的數(shù)值具有統(tǒng)計意義。
結論數(shù)據(jù)顯示，TP508可顯著抑制膽固醇水平過高的兔子出現(xiàn)血管再狹窄和血管閉鎖。這一結果是可靠的，因為該結果與對結果進行定量分析所選的技術無關。
表1

例6制備TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物微粒雙重乳化技術被用來制備含有TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物。簡單地說，基質組分溶解在二氯甲烷中，TP508溶解在水中。當攪拌時，這兩種液體逐漸混合在一起，形成油包水的乳液。在進一步攪拌的同時，向乳液中加聚乙烯醇(0.3％的水溶液)，從而形成第二種乳液(水包油)，這樣就形成了雙重乳化一種是由聚乳酸/聚乙醇酸小滴組成的水包油乳液，在這些小滴內，第二分散相由溶于水中的TP508組成。根據(jù)相分離原理，聚乳酸/聚乙醇液滴形成離散的微粒，這些微粒含有腔體，腔體中容納著TP508。為了造成微粒的相分離，在乳液中加入2％的異丙醇溶液。乳液中的顆粒通過離心方式加以收集，然后再經(jīng)冷凍除去殘留的水分，改變基質的組份可以形成具有不同釋放動力學特性的微粒(表2)。
表2不同微粒配方的組成

微粒的直徑用Coulter計數(shù)器進行測定。將稱重后的微粒溶解于二氯甲烷并將釋放出的藥物萃取到水中后，使用波長為276nm的光譜分析儀來測定藥物的夾帶效率。(表3)表3配方直徑和藥物效率

為了測定TP508從不同聚乳酸/聚乙醇酸基質上釋放的情況，20毫克的微粒被放入盛有1.0毫升PBS的1.5毫升聚丙烯微型離心管中。管子在37℃下進行培養(yǎng)，并以每分鐘60圈的速度進行搖動。在不同的時間下，管子進行離心運動，含有釋放出來的TP508的上層液體被取出，并經(jīng)冷凍后進行分析。新的PBS被加到微粒中，培養(yǎng)過程仍然繼續(xù)。上層液體中的TP508通過對波長為276nm光波的吸收情況加以測定。對于每種配方而言，釋放情況測定要重復4次。配方B和配方D在37℃下培養(yǎng)28天期間沒有測到有藥物釋放出來。其余的所有配方都釋放出了可檢測到的TP508，雖然所有的配方在3-4天內所釋放出來的藥量均低于檢測底限(＜1μg/mg基質)。配方A和配方C的TP508釋放量最大，在3-4天的時間內釋放出了所夾帶藥物的60～80％。配方C的釋放動力學特性最快，這一配方被選來在例3和例4所述的活體研究中做進一步的測試。
雖然本發(fā)明是根據(jù)本文中的優(yōu)選實施方案進行具體說明和描述的，但本領域技術人員應該理解的是，在不脫離本文所附權利要求所限定的本發(fā)明范圍的情況下，可以對本發(fā)明的形式及細節(jié)做出各種各樣的修改。
權利要求
1.一種促進心臟組織修復的方法，該方法包括對心臟組織施用具有療效劑量的藥劑；該藥劑與血管生成凝血酶衍生肽具有等同的生理功能。
2.如權利要求1所述的方法，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物含有凝血酶受體結合區(qū)和絲氨酸酯酶保留序列，其中凝血酶受體結合區(qū)含有序列Arg-Gly-Asp-Ala(第一號序列標識)。
3.如權利要求2所述的方法，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物含有氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第三號序列標識)。
4.如權利要求1所述的方法，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物由以下氨基酸序列組成Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第四號序列標識)。
5.如權利要求1所述的方法，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物由以下氨基酸序列組成Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第五號序列標識)。
6.如權利要求1所述的方法，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物由以下氨基酸序列組成Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第六號序列標識)。
7.如權利要求1所述的方法，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物是在心臟手術過程中或術后進行給藥的。
8.如權利要求1所述的方法，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物是通過注射對心臟組織給藥的。
9.如權利要求1所述的方法，其中含有與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物的可持續(xù)釋放配方被施用于心臟組織。
10.如權利要求9所述的方法，其中可持續(xù)釋放的配方是含有與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能藥物的聚乳酸/聚乙醇酸微粒。
11.一種刺激血管再生的方法，該方法包括對心臟組織施用具有療效劑量的藥劑；該藥劑與血管生成凝血酶衍生肽具有等同的生理功能。
12.一種在需要這類治療的患者中刺激血管內皮增殖的方法，該方法包括對患者給予有療效劑量的藥劑，該藥劑與血管生成凝血酶衍生肽具有等同的生理功能。
13.一種在血管小球整形術后抑制再狹窄的方法，所述的方法包括對患者給予有療效劑量的藥劑，該藥劑與血管生成凝血酶衍生肽具有等同的生理功能。
14.如權利要求13所述的方法，其中的肽涂在血管小球整形導管上。
15.如權利要求13所述的方法，其中的肽是進行全身給藥。
16.如權利要求13所述的方法，其中的肽是對氣球造成的血管損傷區(qū)域進行局部給藥。
17.如權利要求13所述的方法，其中涂有血管生成凝血酶衍生物肽的金屬絲網(wǎng)管插入到氣球所損傷區(qū)域的血管中。
18.如權利要求13所述的方法，其中的肽含有凝血酶受體結合區(qū)和絲氨酸酯酶保留序列，其中凝血酶受體結合區(qū)含有序列Arg-Gly-Asp-Ala(第一號序列標識)。
19.如權利要求18所述的方法，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物含有氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第三號序列標識)。
20.如權利要求13所述的方法，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物由以下氨基酸序列組成Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第四號序列標識)。
21.如權利要求13所述的方法，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物由以下氨基酸序列組成Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第五號序列標識)。
22.如權利要求13所述的方法，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物由以下氨基酸序列組成Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第六號序列標識)。
23.一種涂有與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能藥物的金屬絲網(wǎng)管。
24.如權利要求23所述的金屬絲網(wǎng)管，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物是Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第四號序列標識)。
25.一種抑制患者發(fā)生血管閉鎖的方法，所述的方法包括對患者施用具有療效劑量的藥劑；該藥劑與血管生成凝血酶衍生肽具有等同的生理功能。
26.如權利要求25所述的方法，其中與血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的藥物是Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第四號序列標識)。
全文摘要
本發(fā)明涉及促進心臟組織修復的方法，該方法包括對心臟組織施放具有療效劑量的血管生長凝血酶衍生肽和/或抑制或降低血管的閉塞或再狹窄。本發(fā)明還與刺激血管新生的方法有關。在另一個實施方案中，在制造本文所述方法所用藥物的過程中，本發(fā)明還涉及凝血酶衍生肽的使用。
文檔編號A61K9/16GK1622827SQ02828569
公開日2005年6月1日 申請日期2002年1月16日 優(yōu)先權日2002年1月16日
發(fā)明者達芮爾·H·卡尼 申請人:德克薩斯系統(tǒng)大學董事會