專利名稱：環(huán)肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖類化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一類內(nèi)源性Ca2+激動劑環(huán)腺苷二磷酸核糖(cADPR)的類似物，即利用化學方法合成的環(huán)肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖類化合物，及合成方法。
背景技術：
環(huán)腺苷二磷酸核糖是β-NAD+的代謝物，藥理研究表明它不僅具有鈣動員活性，而且還能作為細胞內(nèi)信使傳導細胞外信號。由于cADPR易于水解和酶解，因而在某種程度上限制了對其生理作用和藥理作用的研究，因此目前急需合成穩(wěn)定性好且活性高的cADPR類似物來替代cADPR作為探針進行研究。
目前合成cADPR類似物的方法主要有三種，即酶法合成，仿生法合成和化學法合成。由于前兩種方法對底物有特異性的要求，因而在某種程度上限制了這兩種方法的應用。本發(fā)明采用了化學的方法合成了cADPR的類似物環(huán)肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供如以下結(jié)構(gòu)式(1)所示的cADPR類似物環(huán)肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖及其衍生物
在本發(fā)明的一個特定實施方案中，提供了具有以下通式(2)的化合物，它是結(jié)構(gòu)式1的8-位取代產(chǎn)物 X＝H，O，Cl，N3.NR2，CF3R＝alkyl or aryl其中R各自獨立是烷基(包括取代烷基)或芳基(包括取代芳基)，如取代或非取代C1-C10烷基，取代或非取代C6-C10芳基，取代或非取代芳烷基。取代基可以是烷基、羥基、鹵素、酸基、胺基等。
如附圖2所示，本發(fā)明的再一個目的是提供如以上結(jié)構(gòu)式1所示的化合物及其衍生物的制備方法，包括以5’-O-被保護的2’，3’-O-異亞丙基肌苷為底物，在過量的DBU(1，8-二氮雜二環(huán)[5，4，0]十一-7-烯)的存在下，與2-鹵代甲氧基乙氧基乙酸乙酯發(fā)生親核取代反應，獲得N1位取代產(chǎn)物；N1位取代產(chǎn)物去除5’-保護基，生成的5’羥基與(PhNH)2PCOCl反應得到了磷酰胺基保護的產(chǎn)物；磷酰胺基保護的產(chǎn)物脫乙酰，得到了脫乙酰基的產(chǎn)物，脫乙?；漠a(chǎn)物與PSS反應(例如在TPSCl和1-H四唑的存在下)生成了二磷酸酯產(chǎn)物；二磷酸酯產(chǎn)物連續(xù)脫除二苯氨基和苯硫基，得到分子內(nèi)環(huán)合前體產(chǎn)物；根據(jù)Matsuda的方法進行分子內(nèi)環(huán)合反應，獲得環(huán)化產(chǎn)物；和脫除環(huán)化產(chǎn)物的異丙叉保護基，得到了目標化合物環(huán)肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖，再任選進行取代反應，獲得衍生物。
上述通式2的取代產(chǎn)物的制備方法包括通式1化合物在適宜溶劑中與鹵素反應，可以獲得8位鹵代產(chǎn)物，8-鹵代產(chǎn)物與二甲亞砜反應可以獲得8-疊氮取代產(chǎn)物，8-位疊氮取代產(chǎn)物進行還原，可以獲得8-氨基取代產(chǎn)物，8-氨基取代產(chǎn)物可以與鹵代烴反應生成8-脂族或芳族胺基取代產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一個目的是如以上所述化合物或其衍生物在醫(yī)學中的用途，尤其作為穩(wěn)定性好且活性高的cADPR探針的替代物的用途。
本發(fā)明還涉及所述化合物作為內(nèi)源性鈣激動劑的應用。
以下結(jié)合圖2來詳細說明本發(fā)明化合物的合成過程。
在合成的過程中有兩個關鍵的步驟是嘌呤堿基N1位的烷基化和分子內(nèi)的環(huán)磷酸化。以KCO3和NaH作為堿在嘌呤堿基N9位烷基化的傳統(tǒng)方法對于N1位烷基化產(chǎn)物的構(gòu)建是行不通的。因為嘌呤堿基的N1位具有較弱的親核性。本發(fā)明以5’-O-叔丁基二甲基硅基2’，3’-O-異亞丙基肌苷3為底物，在過量的DBU的存在下，與2-氯甲氧基乙氧基乙酸乙酯發(fā)生親核取代反應，成功得到N1位取代產(chǎn)物4，產(chǎn)率為64％。N1位醚鏈取代物4的結(jié)構(gòu)是根據(jù)UV和H1NMR光譜確定的。4的叔丁基二甲氧基硅基保護基用叔丁基銨氟除去后生成的5’羥基與(PhNH)2PCOCl反應得到了磷酰胺基保護的產(chǎn)物6，產(chǎn)率為85％。6在甲醇鈉的作用下得到了脫乙?；漠a(chǎn)物7。在TPSCl和1-H四唑的存在下，7與PSS反應生成了二磷酸酯產(chǎn)物8，兩步產(chǎn)率為81％。8的二苯氨基和苯硫基的連續(xù)脫除是在異戊氰和次磷酸的連續(xù)作用下完成的，得到分子內(nèi)環(huán)合前體產(chǎn)物9，產(chǎn)率為87％。分子內(nèi)環(huán)合反應是根據(jù)Matsuda的方法，在吡啶中，以I2作為促進劑，3分子篩作為除水劑將9用微量注射泵注入反應體系進行反應。經(jīng)過HPLC純化得到了環(huán)化產(chǎn)物10的三乙胺鹽，產(chǎn)率為45％，其結(jié)構(gòu)是根據(jù)HR-FABMS和31PNMR堅定的。最后以60％甲酸水容易脫除環(huán)化產(chǎn)物10的異丙叉保護基，便得到了目標化合物環(huán)肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖2。


圖1是天然產(chǎn)物環(huán)腺苷二磷酸核糖1及由由本發(fā)明獲得的其類似物環(huán)肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖2的結(jié)構(gòu)式。
圖2是環(huán)肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖2的合成路線。
圖中iDBU，ClCH2OCH2CH2OAC，CH2Cl2，室溫；iiTBAF，THF，室溫；iii(PhNH)2POCl，Py，室溫；iv甲醇鈉，甲醇，室溫；vPSS，TPS，1-H四唑，Py，室溫；vi(a)異戊氰，Py/AcOH/Ac2O(2∶1∶1)，室溫；(b)H3PO2，三乙胺.Py，室溫；viiI2，3分子篩，Py，室溫；viii60％甲酸水溶液，室溫。
具體實施例以下通過實施例來說明本發(fā)明，應該理解的是，這些實施例僅用于說明，不限制本發(fā)明的范圍。
在實施例中，使用以下縮寫DBU1，8-二氮雜二環(huán)[5，4，0]十一-7-烯TBAF叔丁基銨氟PSSS，S-二苯基-二硫代磷酰基環(huán)己基銨鹽TEAA三乙胺的醋酸鹽實施例1N1-[(2-乙酰-O-乙氧基)甲基]-5’-O-叔丁基二甲基硅基-2’，3’-O-異亞丙基肌苷4將化合物5’-O-叔丁基二甲基硅基-2’，3’-O-異亞丙基肌苷3(422mg，1mmol)溶于10ml新蒸二氯甲烷，冰浴下加入DBU(0.76g，5mmol)，室溫攪拌，再分次加入氯甲氧基乙酸乙酯(1.52g，10mmol)，室溫反應30分鐘，蒸干溶劑，常壓柱層析得化合物(二氯甲烷-甲醇)4，收率64％。
實施例2N1-[(2-乙酰-O-乙氧基)甲基]-2’，3’-O-異亞丙基肌苷5化合物4(308mg，0.5mmol)溶于2ml四氫呋喃，加入1滴乙酸和1mlTBAF 1M四氫呋喃溶液，室溫攪拌6～8小時；蒸干溶劑，常壓柱層析得189mg化合物5，收率90％。
實施例3N1-[[2-羥基乙氧基]-甲基]-5’-O-(N，N-二苯基)-磷酰基-2’，3’-O-異亞丙基-肌苷6189mg(0.45mmol)化合物28，二苯胺基磷酰氯(18mmol，4.8g)和1H四唑(18mmol，1.26g)溶于10ml無水吡啶，室溫攪拌72小時；減壓蒸干吡啶，以無水乙醇重結(jié)晶，殘余物柱層析(二氯甲烷-甲醇)共得白色固體6，產(chǎn)率85％。
實施例4N1-[[2-羥基乙氧基]-甲基]-5’-O-二苯胺磷?；?2’，3’-O-異亞丙基肌苷7化合物6(248，0.38mmol)溶于2.5ml甲醇，加入10mg甲醇鈉，攪拌過夜，減壓蒸干溶劑，硅膠柱層析(二氯甲烷-甲醇)得7，產(chǎn)率95％。
實施例5N1-[[[2-(二苯基硫代)磷?；鵠O-乙氧基]-甲基]-5’-O-二苯胺磷?；?2’，3’-O-異亞丙基肌苷8將7(221mg，0.36mmol)溶于3ml無水吡啶，加入三異丙基磺酰氯(218mg，0.72mmol)、PSS(262mg，0.72mmol)和四氮唑(50mg，0.72mmol)，室溫攪拌24小時，蒸干溶劑常壓柱層析得化合物8，產(chǎn)率85.6％。
實施例6N-1-[[[2-(苯基硫代)磷?；鵠-O-乙氧基]-甲基]-5’-O-磷?；?2’，3’-O-異亞丙基肌苷9化合物8(120mg，0.132mmol)溶于3.5ml吡啶-乙酸-乙酸酐(2∶1∶1)混合溶劑，加入異戊腈(266ul，1.98mmol)室溫攪拌10小時；減壓蒸干溶劑，加入用吡啶帶干的次亞磷酸(128ul)和三乙胺(1mmol，183ul)，室溫攪拌15小時。減壓蒸干溶劑后以5ml氯仿溶解，水洗(4×3)，合并水洗水相加入5ml吡啶，減壓蒸干溶劑，用0.5ml 0.1M TEAA(PH＝7)緩沖液溶解，反向C-18柱HPLC分離，梯度0～40％乙腈，0.1M TEAA，流速3ml/min，檢測波長260nm，收集18min主峰。濃縮后用反向C-18柱脫氧，梯度洗脫0～20％乙腈，水。冷凍干燥的淺黃色固體9，收率87％。
實施例7環(huán)2’，3’-O-異亞丙基-肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖10稱取干燥后的分子篩1.5g置于100ml三口瓶中，反復充氬氣，冷至室溫，加入升華碘和30ml新蒸吡啶，閉光。取環(huán)合前體9(26mg，38.9μmol)溶于12ml新蒸吡啶，用注射泵在24小時注入到上述吡啶溶液。加完后繼續(xù)在室溫下反應3小時。用帶硅藻土墊層的砂芯漏斗過濾，水洗，減壓蒸干，加入5ml氯仿溶解，水洗三次，合并水相再以乙醚洗滌(2×5)，濃縮，以0.1M TEAA(PH＝7)溶解，反向C-18梯度淋洗0～40乙腈，0.1MTEAA，收集所要組分，濃縮后在以C-18脫鹽0～20％A(乙腈)B(H2O)，冷凍干燥得固體10，收率45.5％。
實施例8環(huán)肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖2將環(huán)合產(chǎn)物10(12mg，)溶于3ml 60％甲酸，室溫攪拌反應5小時，減壓蒸干溶劑。再以0.1M TEAA溶解，反相C-18分離，0～40％A梯度洗脫A乙腈，B20％乙腈0.1M TEAA溶液，收集所要主峰，濃縮后脫鹽，梯度0～10％A(乙腈)B(H2O)，冷凍干燥的固體2，收率44.6％。
實施例98位鹵代產(chǎn)物的合成將實施例8的產(chǎn)物溶于醋酸醋酸鈉的緩沖溶液，加入溴或氯水，室溫攪拌過夜，過濾得粗品，用乙醇重結(jié)晶。
實施例108位疊氮取代產(chǎn)物的合成將由實施例9獲得的8位溴代的底物溶于二甲基亞砜中，室溫攪拌24小時，蒸干溶劑，用甲苯重結(jié)晶。
實施例118位氨基取代產(chǎn)物的合成將由實施例10獲得的8位疊氮取代的底物溶于乙醇，加入催化劑量的鈀碳，加氫還原3小時，過濾除去鈀碳，蒸干溶劑。
實施例128位脂族胺取代產(chǎn)物的合成將實施例11獲得的8-氨基取代產(chǎn)物與溴乙烷在適量碳酸鉀的存在下反應，獲得了8-二乙氨基取代產(chǎn)物。
實施例138位芳族胺取代產(chǎn)物的合成將實施例11獲得的8-氨基取代產(chǎn)物與芐溴在適量碳酸鉀的存在下反應，獲得了8-二芐氨基取代產(chǎn)物。
權利要求
1.如以下結(jié)構(gòu)式(1)所示的cADPR類似物環(huán)肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖或其衍生物
2.具有以下通式(2)的化合物，它屬于權利要求1的結(jié)構(gòu)式1化合物的8-位取代產(chǎn)物 X＝H，Br，Cl，N3.NR2，CF3R＝alkyl or aryl其中R各自獨立是烷基(包括取代烷基)或芳基(包括取代芳基)，如取代或非取代C1-C10烷基，取代或非取代C6-C10芳基，取代或非取代芳烷基。
3.如以上結(jié)構(gòu)式1所示的化合物或其衍生物的制備方法，包括以5’-O-被保護的2’，3’-O-異亞丙基肌苷為底物，在過量的DBU(1，8-二氮雜二環(huán)[5，4，0]十一-7-烯)的存在下，與2-鹵代甲氧基乙氧基乙酸乙酯發(fā)生親核取代反應，獲得N1位取代產(chǎn)物；N1位取代產(chǎn)物去除5’-保護基，生成的5’羥基與(PhNH)2PCOCl反應得到了磷酰胺基保護的產(chǎn)物；磷酰胺基保護的產(chǎn)物脫乙酰，得到了脫乙?；漠a(chǎn)物，脫乙?；漠a(chǎn)物與PSS反應(例如在TPSCl和1-H四唑的存在下)生成了二磷酸酯產(chǎn)物；二磷酸酯產(chǎn)物連續(xù)脫除二苯氨基和苯硫基，得到分子內(nèi)環(huán)合前體產(chǎn)物；根據(jù)Matsuda的方法進行分子內(nèi)環(huán)合反應，獲得環(huán)化產(chǎn)物；和脫除環(huán)化產(chǎn)物的異丙叉保護基，得到了目標化合物環(huán)肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖，再任選進行取代反應，獲得衍生物。
4.權利要求1的化合物或其衍生物在醫(yī)學中的用途。
5.權利要求1的化合物或其衍生物作為穩(wěn)定性好且活性高的cADPR探針的替代物的用途。
6.權利要求2的化合物在醫(yī)學中的用途。
7.權利要求2的化合物作為穩(wěn)定性好且活性高的cADPR探針的替代物的用途。
8.權利要求1的化合物或其衍生物作為內(nèi)源性Ca2+激動劑的應用。
9.權利要求2的化合物作為內(nèi)源性Ca2+激動劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及如說明書中結(jié)構(gòu)式(1)所示的cADPR類似物環(huán)肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖或其衍生物，及其制備方法和作為cADPR探針的用途。
文檔編號A61P43/00GK1535978SQ0310919
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月4日 優(yōu)先權日2003年4月4日
發(fā)明者張禮和, 黃力軍, 古險峰, 張亮仁 申請人:張禮和