專利名稱：重組幽門螺桿菌粘附素保守區(qū)的制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組幽門螺桿菌粘附素保守區(qū)的制備及用途。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，與胃腺癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴樣組織(MALT)惡性淋巴瘤的發(fā)生亦密切相關(guān)。此外，血清流行病學(xué)研究表明Hp感染與循環(huán)、呼吸、胃十二指腸外消化系統(tǒng)疾病以及自身免疫疾病的發(fā)生也有關(guān)。隨著Hp病因地位的上升，對其致病機制的研究亦趨深入，Hp的致病機制包括諸多環(huán)節(jié)，但尤以其黏附機制最為關(guān)鍵，因為Hp必須首先定植于人胃黏膜才能進一步發(fā)揮其致病作用，而黏附又是Hp定植在胃黏膜表面的前提。
既然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胃十二指腸潰瘍是傳染病，治療目的之一就是用抗生素消除病原體。然而，用各種抗生素(阿莫西林、硝基呋喃、furazolidin紅霉素a.o)進行單獨治療已被證實并不令人滿意，因為甚至在這種情況下僅有0-15％病例會根除細菌。目前，把酸阻斷劑(Ompeprazol)和抗生素(阿莫西林)結(jié)合使用達到最成功的治療效果，這種療法使清除率達80％(Malfertheiner，1994)。但用抗生素治療消除幽門螺桿菌并不是有前途的長期治療方案，因為細菌會迅速產(chǎn)生對抗生素的耐性。
迄至已描述了幾種有潛力的幽門螺桿菌粘附素，并克隆了編碼所謂N-乙酰神經(jīng)氨基乳粘-結(jié)合血凝集素的一種基因(hpaA)并進行測序(Evans等，1993)。它是一種應(yīng)能識別上皮細胞上含唾液酸的受體的蛋白質(zhì)。
在Hp疫苗的研制過程中，發(fā)現(xiàn)目前采用的基因重組抗原尿素酶、細胞空泡毒素、過氧化氫酶等，基本上著眼于阻斷Hp的毒力因素，而與Hp定植密切相關(guān)的黏附素評價較少。目前文獻報道的Hp黏附素較多，其中已經(jīng)證實的有四種，包括迄今為止唯一明確受體的Hp黏附素BabA，和經(jīng)體外黏附及其相應(yīng)抗體的抑制實驗證明的黏附素AlpA、AlpB和HopZ；然而這四種黏附素并不是存在于所有菌株中，如BabA存在于CagA致病島陽性的菌株中，而且它們在不同的菌株中存在一定程度的變異。Harry等早在1998就提出作為Hp疫苗的抗原成分應(yīng)是保守的，即不是特異的存在與某些菌株中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種運用PCR技術(shù)克隆幽門螺桿菌粘附素基因，并構(gòu)建載體對其進行序列分析和蛋白表達分析，提高抗血清可阻止幽門螺桿菌粘附于胃粘膜上皮細胞的基因重組幽門螺桿菌粘附素保守區(qū)的制備及用途。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；和(a)它編碼一種能粘附人細胞的多肽，(b)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(c)細胞被載體所轉(zhuǎn)化；及(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人細胞。
除了序列號1所示核苷酸序列和在遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)與該序列相應(yīng)的核苷酸序列之外，本發(fā)明還包括在嚴格條件下與這些序列之一雜交的DNA序列。本發(fā)明包括在些洗滌條件下與序列號1所示核苷酸序列之一雜交或與在遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)的相應(yīng)核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明的DNA分子最好編碼能粘附到人細胞上、特別是人胃上皮細胞上的多肽。此外，本發(fā)明的DNA分子最好在核苷酸水平上與序列號1所示核苷酸序列有至少70％、特別優(yōu)選至少90％的同源性。而且，該DNA分子的長度最好至少為45個核苷酸，優(yōu)選至少50個核苷酸。
本發(fā)明的又一個目的是含本發(fā)明DNA分子的至少一個拷貝的載體。該載體可以是最好在表達信號(啟動子、操縱基因、增強子等)控制下本發(fā)明DNA分子位于其上的任何原核或真核載體。原核體的例子有象噬菌體(例如λ噬菌體)這樣的染色體載體以及象質(zhì)粒這樣的染色體外載體，而環(huán)狀質(zhì)粒載體是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的載體也可以是真核載體例如酵母載體或者是適于高等細胞的載體(例如，質(zhì)粒載體、病毒載體、植物載體)。
本發(fā)明的又一目的是用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的細胞。在一優(yōu)選實施方案中，該細胞是原核細胞、優(yōu)選革蘭氏陰性的原核細胞、特別優(yōu)選大腸桿菌細胞。不過，另一方面，本發(fā)明的細胞也可以是真核細胞，例如真菌細胞(如酵母)、動物或植物細胞。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明DNA分子編碼的多肽。該多肽最好能粘附人細胞，并且包括(a)序列號1所示氨基酸序列，或(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽最好與序列號1所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
本發(fā)明的多肽最好通過下述方法生產(chǎn)用本發(fā)明的DNA分子或載體轉(zhuǎn)化一種細胞，在多肽能得以表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞，從細胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離多肽。該方法中可獲得融合多肽以及非融合多肽形式的本發(fā)明多肽。
本發(fā)明的多肽也可用作免疫原來產(chǎn)生抗體。因此，本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明多肽的抗體。
本發(fā)明另一方面涉及一種藥用組合物，它包含作為活性物質(zhì)的本發(fā)明的DNA分子、本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的抗體，選擇性地含有常見藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體。
一方面，本發(fā)明的藥用組合物可用于診斷幽門螺桿菌感染。
另一方面，該藥用組合物也可用于防止或治療幽門螺桿菌感染。對治療應(yīng)用而言，將多肽或其片斷用于產(chǎn)生主動疫苗，或?qū)⒖贵w用于產(chǎn)生被動疫苗。
本發(fā)明具有運用PCR技術(shù)克隆幽門螺桿菌粘附素基因，并構(gòu)建載體對其進行序列分析和蛋白表達分析，提高抗血清可阻止幽門螺桿菌粘附于胃粘膜上皮細胞和提高免疫原性及活性高和粘附功能高等優(yōu)點。
設(shè)計CB特異引物，通過DNA重組技術(shù)獲得四種(BabA)、AlpA、AlpB和HopZ的蛋白序列，黏附素保守區(qū)的結(jié)構(gòu)基因，并對其進行生物信息學(xué)分析，進一步表達保守區(qū)基因。構(gòu)建了四種黏附素共同保守區(qū)的重組質(zhì)粒，測序顯示CB基因長588bp；該基因編碼195個氨基酸，與四種黏附素保守區(qū)的同源性均達50％以上，蛋白質(zhì)分子量約為22.5KD，顯示出了良好的抗原性和疏水性。分析了836767個序列，與其同源性達40％的均勻為Hp序列。蛋白電泳分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后高效表達相對分子量為22 500的蛋白，與預(yù)期分子量大小一致，凝膠自動掃描分析，其重組黏附素保守區(qū)蛋白占菌體總蛋白的29.6％，其中可溶性表達占上清的21.9％，包涵體占沉淀的72.6％。
體外及動物實驗表明幽門螺桿菌四種黏附素保守區(qū)CB是安全的，無或較少有導(dǎo)致人外周血T淋巴細胞凋亡作用；具有生物活性，能促進幽門螺桿菌感染患者外周血淋巴細胞增殖，白細胞介素4水平的升高，從而提高患者清除幽門螺桿菌的免疫能力；具有免疫原性，可使小鼠產(chǎn)生相應(yīng)抗體(包括IgA和IgG)，其抗血清可阻止幽門螺桿菌對于人胃黏膜上皮細胞的黏附，可用于預(yù)防和治療幽門螺桿菌感染。表達幽門螺桿菌CB的減毒鼠傷寒沙門氏菌口服疫苗的免疫治療作用的小鼠實驗表明其可顯著提高小鼠脾臟淋巴細胞CD4/CD8的比值，小腸液中可檢測大量分泌性特特異抗CB-IgA抗體，其4周根除率為53.3％，且無毒、副作用。


圖1是本發(fā)明的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖2是本發(fā)明的重阻質(zhì)粒PET-226(+)/CB的雙酶鑒定圖譜，圖3是本發(fā)明的CB重組蛋白的SDS-PAGE分析圖，圖4是序列表。
具體實施例方式
下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的作進一步的詳述如圖1～3所示，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；在核酸水平上它與序列號1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性；它的長度至少為45個核苷酸；(a)它編碼一種能粘附人細胞的多肽，(b)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(c)細胞被載體所轉(zhuǎn)化；多肽，它由DNA分子所編碼，它包括(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人細胞。產(chǎn)生多肽的方法，載體轉(zhuǎn)化一種細胞，在多肽得以表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞，并從細胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離出多肽。多肽作為免疫原產(chǎn)生抗體的應(yīng)用和多肽的抗體。藥用組合物，(a)它包含作為活性物質(zhì)的DNA分子、多肽或者抗體，選擇性地包含常見藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來診斷幽門螺桿菌感染的應(yīng)用，(c)藥用組合物用于生產(chǎn)防止或治療幽門螺桿菌感染用的藥劑的應(yīng)用。
實施例1利用PCR技術(shù)擴增黏附素共同保守區(qū)(命名為CB)基因，將其定向插入pET-22b(+)載體，在BL21(DE3)大腸桿菌中表達；表達產(chǎn)物經(jīng)免疫印跡鑒定。
1.1、材料取菌株BL21(DE3)及質(zhì)粒pET-22b(+)(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供)；幽門螺桿菌SS1為第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院全軍消化研究所保存；限制性內(nèi)切酶NotI、NocI及T4DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶購自New England Biolabs公司，TaqDNA聚合酶、DNA分子量標準λDNA/EcoR I+Hind III購自華美生物工程公司，瓊脂糖、dNTPs、DNA快速純化試劑盒購自Promega公司，測序質(zhì)粒純化試劑盒購自德國Qiagen公司，AlpA兔抗血清由Odenbreit S制備，Hp感染患者血清來自解放軍301醫(yī)院，其它試劑為國產(chǎn)分析純。
1.2、黏附素保守區(qū)DNA序列的確定利用ANTHEPROT V4.3c軟件分析已證實的Hp黏附素babA2的DNA序列，發(fā)現(xiàn)黏附素的babA2的C-端氨基酸存在保守區(qū)，選取AlpA的C-端結(jié)構(gòu)基因序列作為模板(命名為CB)。
1.3、Hp染色體DNA的提取固體培養(yǎng)基上刮取生長良好的Hp菌落，按基因組DNA小量制備法制備，詳見參考文獻[1]。
1.4、質(zhì)粒的提取及純化質(zhì)粒的快速抽提及大量制備均采用堿變性法，詳見參考文獻[2]。
1.5、目的基因的PCR擴增根據(jù)保守區(qū)基因序列設(shè)計引物，在其5’端加上合適的限制性酶切位點，由上海博亞公司合成。序列如下保守區(qū)15’-TG GCC ATG GAT AAC GCG CTC AAC AAT CAG-3’NcoI保守區(qū)25’-AG TGC GGC CGC GAA TGA ATA CCC ATA AGA-3’NotI熱啟動法進行PCR，95°變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)后再延伸10min。0.8％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結(jié)果。
1.6、DNA片段的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和陽性克隆的鑒定詳見參考文獻[2]。質(zhì)粒和目的基因DNA經(jīng)NotI和NocI雙酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4連接酶作用下16℃連接12h，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，雙酶切鑒定篩選出陽性克隆。
1.7、序列測定及分析堿裂解法大量抽提經(jīng)雙酶切鑒定的重組克隆質(zhì)粒，用自動測序儀進行序列測定。
1.8、誘導(dǎo)表達和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳CB陽性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，參照文獻[1]進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
1.9、免疫印跡分析參照文獻[1]2.1、保守區(qū)基因的擴增PCR結(jié)果電泳分析發(fā)現(xiàn)在588bp左右有一條帶，大小與預(yù)計相符，見圖1。
2.2、重組質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切鑒定將PCR產(chǎn)物經(jīng)NotI和NocI雙酶切后，定向插入經(jīng)同樣雙酶切的pET-22b(+)載體中，獲得重組質(zhì)粒命名為pET-22b(+)/AB。重組質(zhì)粒經(jīng)NotI和NocI雙酶切后電泳初步鑒定結(jié)果見圖2。
2.3、保守區(qū)基因片段的序列分析直接以重組質(zhì)粒pET-22b(+)/AB為模板進行測序，得到了克隆片段的DNA序列，經(jīng)ANTHEPROT V4.3c軟件分析，與alpA的C-端結(jié)構(gòu)基因序列一致，與其它三種黏附素babA、alpB和hopZ的同源性分別為53％、75％和59％。
2.4、cb基因在大腸桿菌中的表達將CB陽性克隆株在LB培養(yǎng)液(含100ug/ml氨芐青霉素)中37℃培養(yǎng)過夜，然后按1％轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至D值為0.6-0.8，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)表達3h，離心收集菌體，取其周質(zhì)的滲透休克液和菌體超聲后的沉淀和上清以及純化的CB進行10％SDS-PAGE電泳分析(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后高效表達相對分子量為22500的蛋白，與預(yù)期分子量大小一致，凝膠自動掃描分析，CB占菌體總蛋白29.6％，其中可溶性表達占上清的21.9％，包涵體占沉淀的72.6％。
2.5、cb表達蛋白的免疫印跡分析用兔抗Hp黏附素之一的AlpA作一抗，在M，約22500處出現(xiàn)條陽性反應(yīng)帶，而對照組免疫前兔血清無。用Hp陽性患者血清作為一抗，正常人血清作為對照，也在同一位置處出現(xiàn)反應(yīng)帶；而正常人血清對照未見任何條帶。
實施例2構(gòu)建質(zhì)粒型載體用PCR擴增技術(shù)克隆幽門螺桿菌粘附素保守區(qū)，將其插入裸體質(zhì)粒中，并在大腸桿菌中表達。
實施例3載體表達的蛋白制備用于治療幽門螺桿菌相關(guān)性疾病的免疫原性、生物活性用途。
參考文獻[1]Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.Molecular cloninga laboratory manual[M]。
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Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，et al.顏子穎，王海林澤。精編分子生物學(xué)指南[M]。
北京科學(xué)出版社，199839。
權(quán)利要求
1.DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1的DNA分子，其特征在于在核酸水平上它與序列號1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
3.權(quán)利要求1或2的DNA分子，其特征在于它的長度至少為45個核苷酸。
4.權(quán)利要求1～3之一的DNA分子，其特征在于(a)它編碼一種能粘附人細胞的多肽，(b)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(c)細胞被載體所轉(zhuǎn)化。
5.多肽，其特征在于它由權(quán)利要求1～4之一的DNA分子所編碼。
6.權(quán)利要求5的多肽，其特征在于它包括(a)序列號1所示的核苷酸序列，或(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人細胞。
7.產(chǎn)生權(quán)利要求5～6之一的多肽的方法，其特征在于用權(quán)利要求1～3之一的DNA分子或權(quán)利要求4的載體轉(zhuǎn)化一種細胞，在多肽得以表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞，并從細胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離出多肽。
8.權(quán)利要求5～6之一的多肽作為免疫原產(chǎn)生抗體的應(yīng)用和多肽的抗體。
9.藥用組合物，其特征在于(a)它包含作為活性物質(zhì)的權(quán)利要求1～3之一的DNA分子、權(quán)利要求5～6之一的多肽或者權(quán)利要求8或9的抗體，選擇性地包含常見藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來診斷幽門螺桿菌感染的應(yīng)用，(c)藥用組合物用于生產(chǎn)防止或治療幽門螺桿菌感染用的藥劑的應(yīng)用。
全文摘要
重組幽門螺桿菌粘附素保守區(qū)的制備及用途，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明具有運用PCR技術(shù)克隆幽門螺桿菌粘附素基因，并構(gòu)建載體對其進行序列分析和蛋白表達分析，提高抗血清可阻止幽門螺桿菌粘附于胃粘膜上皮細胞的優(yōu)點。
文檔編號A61K39/395GK1654475SQ0310989
公開日2005年8月17日 申請日期2003年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月17日
發(fā)明者白楊, 張亞歷, 王繼德, 張振書, 周殿元 申請人:南方醫(yī)院