專利名稱：作為降低眼內(nèi)壓和治療青光眼性視網(wǎng)膜病變 /眼神經(jīng)病的獨(dú)特手段的調(diào)控、抑制或調(diào)節(jié) ...的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及的領(lǐng)域是包括神經(jīng)變性和/或眼內(nèi)壓升高在內(nèi)的眼部病癥。更具體而言，本發(fā)明提供了降低眼內(nèi)壓并提供眼部神經(jīng)保護(hù)的組合物。
相關(guān)領(lǐng)域描述有許多眼部病癥由視神經(jīng)乳頭(optic nerve head)損傷、眼組織變性和/或眼內(nèi)壓升高引起或惡化。例如，“青光眼”是一類衰弱性眼病，其是美國(guó)和其它發(fā)達(dá)國(guó)家中導(dǎo)致不可逆性失明的最主要原因。原發(fā)性開角型青光眼(“POAG”)是青光眼的最常見形式。該疾病的特征是小梁網(wǎng)變性，導(dǎo)致房水的正常功能受阻而使得眼在虹膜和角膜之間的空間(例如，“夾角”)無(wú)法閉合(Vaughan，D.等(1992))。在該疾病中，所述受阻的一個(gè)特征是眼內(nèi)壓(“IOP”)增加，如果治療不當(dāng)和治療不及時(shí)會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性視力損失和失明。據(jù)估計(jì)，在40歲以上的所有成年人中0.4％至3.3％的人被該疾病侵襲(Leske，M.C.等(1986)；Bengtsson，B.(1989)；Strong，N.P.(1992))。此外，該疾病的患病數(shù)隨著年齡增長(zhǎng)而上升，在75歲或以上的人中患病數(shù)超過6％(Strong，N.P.，(1992))。
青光眼侵襲眼的三個(gè)獨(dú)立的組織。與POAG相關(guān)的IOP升高是由于小梁網(wǎng)(TM)的形態(tài)學(xué)和生化學(xué)改變所致，小梁網(wǎng)是位于角膜和虹膜之間的夾角處的組織。大部分營(yíng)養(yǎng)房水通過TM存在于眼的前部。在青光眼眼睛的TM中，TM細(xì)胞的不斷損失和胞外碎片的集結(jié)導(dǎo)致房水外流的阻力增加，從而使IOP升高。IOP升高以及其它因素如局部缺血導(dǎo)致視神經(jīng)乳頭(ONH)的變性改變，引起ONH的進(jìn)行性“杯狀陷凹形成”和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及軸突的損失。造成TM、ONH和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的青光眼性損傷的詳細(xì)分子機(jī)理尚不清楚。
20年前，作為導(dǎo)致青光眼視野缺損發(fā)展的主要因素，曾激烈地討論過高眼壓癥、局部缺血和視神經(jīng)乳頭機(jī)械變形的相互作用。此后，在變性疾病過程中還涉及到其它因素，包括興奮毒性、氧化一氮、缺乏重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)/神經(jīng)元相互作用異常以及基因組學(xué)(genomics)。在其可最終確定細(xì)胞死亡機(jī)理并提供對(duì)青光眼的各種形式的區(qū)分方面，對(duì)基因組學(xué)的考慮值得討論。在過去8年中，已經(jīng)對(duì)超過15種的不同青光眼基因進(jìn)行了繪圖并對(duì)7種青光眼基因進(jìn)行了鑒定。這包括原發(fā)性開角型青光眼的6種已繪圖的基因(GLC1A-GLC1F)和2種已鑒定的基因(MYOC和OPTN)、先天性青光眼的2種已繪圖的基因(GLC3A-GLC3B)和1種已鑒定的基因(CYP1B1)、色素分散型(pigmentary dispersion)/色素性青光眼的2種已繪圖的基因，以及發(fā)育性或綜合征性(syndromic)青光眼的許多基因(FOXC1、PITX2、LMX1B、PAX6)。
因此，青光眼的每種形式可能具有獨(dú)特的病理學(xué)，相應(yīng)地，控制所述疾病可能需要不同的治療方法。例如，作用于降解視神經(jīng)乳頭胞外基質(zhì)的酶表達(dá)的藥物不可能預(yù)防興奮毒性或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子不足導(dǎo)致的RGC死亡。在青光眼中，一種稱為凋亡(程序性細(xì)胞死亡)的過程導(dǎo)致RGC死亡。據(jù)推測(cè)可導(dǎo)致死亡的不同類型的損傷可通過集中于某些共同途徑而導(dǎo)致死亡。可能拓寬藥物效用和增加其在控制疾病的不同形式中具有效用的可能性的一種策略是以共同途徑下游為靶標(biāo)。然而，作用于多個(gè)代謝途徑的藥物更可能產(chǎn)生不需要的副作用。隨著用于鑒定青光眼的具體形式的基于基因的診斷試劑盒的出現(xiàn)，可以試驗(yàn)選擇性神經(jīng)保護(hù)劑以期減少所測(cè)量的反應(yīng)的偏差程度。
目前的青光眼治療主要是降低IOP，其是青光眼發(fā)展和惡化的主要危險(xiǎn)因素。這些治療雖然可降低IOP，但是它們并不直接針對(duì)發(fā)病機(jī)制，并且疾病繼續(xù)惡化。因此，所需要的是通過發(fā)病途徑降低IOP和/或?qū)σ暽窠?jīng)乳頭和/或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞提供神經(jīng)保護(hù)的治療方法。
發(fā)明概述本發(fā)明通過為有需要的患者提供一種降低眼內(nèi)壓并提供神經(jīng)保護(hù)的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的這些及其它缺點(diǎn)，所述方法通過施用治療有效量的包含至少一種抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)的非核苷酸或非蛋白藥物和可藥用載體的組合物來實(shí)現(xiàn)。另一方面，本發(fā)明提供了通過向患者施用治療有效量的抑制CTGF表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)的藥物而降低眼內(nèi)壓的方法。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的方法的組合物可降低由CTGF或CTGF信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá)增加引起的眼內(nèi)壓升高。
在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可通過局部應(yīng)用、眼房?jī)?nèi)(intracamerally)或通過植入物施用。典型地，本發(fā)明的組合物中CTGF抑制劑的總濃度為0.01％至2％。通常，本發(fā)明的治療方法對(duì)患有青光眼例如正常眼壓性青光眼或高眼壓癥的患者最有用。
本發(fā)明還提供了預(yù)防與POAG相關(guān)的視野缺損的方法，所述方法通過向有需要的患者施用包含調(diào)節(jié)CTGF表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)的非核苷酸或非蛋白藥物的組合物以便控制眼內(nèi)壓并對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或視神經(jīng)乳頭提供保護(hù)來實(shí)現(xiàn)。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在有需要的患者中降低眼內(nèi)壓并提供神經(jīng)保護(hù)的組合物。通常，本發(fā)明的組合物包含至少一種抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)的藥物和可藥用載體。本發(fā)明的組合物中CTGF的總濃度優(yōu)選為0.01％至2％。
附圖簡(jiǎn)要說明以下附圖形成本說明書的一部分并包括在本說明書中以進(jìn)一步闡明本發(fā)明的某些方面。通過參考這些附圖中的一幅或多幅以及在此給出的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述可以更好地理解本發(fā)明。


圖1.CTGF基因在青光眼TM組織中相對(duì)于在正常TM組織中表達(dá)升高。為了證實(shí)微陣列和cDNA差減的結(jié)果，通過正常相對(duì)于青光眼TM組織cDNA的QPCR分析測(cè)定了CTGF mRNA表達(dá)。每個(gè)樣品下面的數(shù)字表示分配給每個(gè)樣品的cDNA標(biāo)識(shí)號(hào)。如(Wang等，2001)所述的那樣獲得人供體組織和總RNA?！捌骄贝碚；蚯喙庋跿M水平的平均值。
圖2.CTGF基因在青光眼TM細(xì)胞系中相對(duì)于在正常TM細(xì)胞系中表達(dá)升高。為了證實(shí)微陣列和cDNA差減的結(jié)果，通過正常相對(duì)于青光眼TM細(xì)胞系cDNA的QPCR分析測(cè)定了CTGF mRNA表達(dá)。每個(gè)樣品下面的數(shù)字表示細(xì)胞系標(biāo)識(shí)號(hào)。如(Shepard等，2001)所述的那樣獲得人TM細(xì)胞系和總RNA?！癗TM庫(kù)”和“GTM庫(kù)”是指從合并的NTM或GTMcDNA得到的擴(kuò)增水平。
圖3.GSK-3抑制對(duì)青光眼TM細(xì)胞中CTGF基因表達(dá)的影響。為了測(cè)定GSK-3抑制對(duì)CTGF基因表達(dá)的影響，我們使用QPCR分析測(cè)定了已知的GSK-3抑制劑SB-216763(Coghlan等，2000)對(duì)青光眼TM細(xì)胞系(SGTM2697)中基礎(chǔ)和TGFβ2-刺激的CTGF mRNA表達(dá)的影響。
圖4.CDK2抑制對(duì)青光眼TM細(xì)胞中CTGF基因表達(dá)的影響。為了測(cè)定CDK抑制對(duì)CTGF基因表達(dá)的影響，我們使用QPCR分析測(cè)定了已知的CDK-2抑制劑GW-8510(Davis等，2001)對(duì)青光眼TM細(xì)胞系(SGTM2697)中基礎(chǔ)和TGFβ2-刺激的CTGF mRNA表達(dá)的影響。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述青光眼是一類多樣的具有某些共同臨床特征的視神經(jīng)病。青光眼的視力損失是由于神經(jīng)視網(wǎng)膜中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的選擇性死亡所致，該選擇性死亡在臨床上通過視野的特征性改變、神經(jīng)纖維層缺損和ONH的進(jìn)行性杯狀陷凹形成來診斷。青光眼發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素之一是存在高眼壓癥(眼內(nèi)壓IOP升高)。在患者具有通常所認(rèn)為的正常IOP的正常眼壓性青光眼的發(fā)病機(jī)制中似乎也涉及IOP。與青光眼相關(guān)的IOP升高是由于小梁網(wǎng)(TM)中房水外流的阻力升高所致，小梁網(wǎng)是位于眼前房的虹膜-角膜夾角處的一種小的特殊組織。TM的青光眼性改變包括TM細(xì)胞損失和包括斑塊樣物質(zhì)在內(nèi)的胞外碎片的沉積和積聚。另外，青光眼的視神經(jīng)乳頭也發(fā)生改變。在青光眼眼睛中，ONH神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有形態(tài)學(xué)和可動(dòng)性改變。在對(duì)IOP升高和/或短暫性局部缺血損傷的反應(yīng)中，ONH胞外基質(zhì)的組成有改變并且神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的形態(tài)也有改變。
TM的青光眼性改變與纖維變性不同，纖維變性與傷口愈合反應(yīng)有關(guān)并且通常涉及炎癥以及隨后的肌成纖維細(xì)胞增殖。組織損傷可被炎癥系統(tǒng)識(shí)別，該系統(tǒng)通過刺激成纖維細(xì)胞和血管生成啟動(dòng)傷口修復(fù)過程。死亡或?qū)⑺赖慕M織/細(xì)胞被最初由纖維蛋白組成的瘢痕組織代替，之后被過量的胞外基質(zhì)物質(zhì)、尤其是膠原蛋白所代替。
CTGF是分泌的細(xì)胞因子，已知其主要通過增加I型膠原蛋白和纖連蛋白的沉積來增加胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生。以前認(rèn)為CTGF的過量表達(dá)是如硬皮病、纖維增生性疾病、瘢痕形成等其中存在ECM成分過量積累的病癥的主要成因。小梁網(wǎng)(TM)區(qū)域中胞外基質(zhì)物質(zhì)的過量積累也是許多形式的青光眼的標(biāo)志；認(rèn)為這種增加導(dǎo)致房水外流的阻力增加，從而導(dǎo)致眼內(nèi)壓升高。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在分離的組織和由人TM建立的細(xì)胞系中存在CTGF基因產(chǎn)物。因此，認(rèn)為CTGF在TM的ECM產(chǎn)生中發(fā)揮作用。下調(diào)CTGF基因表達(dá)、蛋白產(chǎn)生或CTGF活化的下游作用的藥物代表降低IOP的新手段。
CTGF表達(dá)可被多種因素誘導(dǎo)，包括TGF-β、VEGF、凝血酶、高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGE)、機(jī)械應(yīng)激和溶血磷脂酸(LPA)等。CTGF的具體誘導(dǎo)物和信號(hào)途徑可因所刺激的具體細(xì)胞類型而異。有報(bào)導(dǎo)稱在一些細(xì)胞類型中TGF-β對(duì)CTGF的誘導(dǎo)涉及Smads、PLC、PKC和酪氨酸激酶，而在其它細(xì)胞類型中似乎涉及RhoA、PKA和細(xì)胞骨架。成纖維細(xì)胞的機(jī)械應(yīng)激通過蛋白激酶和酪氨酸磷酸酶的參與誘導(dǎo)CTGF表達(dá)。
CTGF的作用機(jī)理尚不十分清楚。CTGF似乎與PDGF受體、整聯(lián)蛋白以及LDL受體相關(guān)的蛋白(LRP)結(jié)合，它們中的每一種均可以作為CTGF的信號(hào)細(xì)胞表面受體發(fā)揮作用。在一些細(xì)胞類型中，通過PDGF受體的CTGF信號(hào)傳導(dǎo)似乎涉及MAPK和PI3K。軟骨細(xì)胞中的CTGF信號(hào)傳導(dǎo)涉及引起細(xì)胞增殖的ERK信號(hào)傳導(dǎo)和引起細(xì)胞分化的p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)。CTGF所用的具體的細(xì)胞表面受體和信號(hào)途徑似乎取決于所研究的具體細(xì)胞類型。
美國(guó)專利No.5,585,270描述了編碼CTGF的多核苷酸。據(jù)說CTGF具有促有絲分裂活性，即刺激靶細(xì)胞增殖的功能。據(jù)說CTGF還具有趨化活性，即通過與特定分子相互作用導(dǎo)致化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。該蛋白被認(rèn)為在人組織的正常發(fā)育、生長(zhǎng)和修復(fù)中發(fā)揮作用。該專利還描述了通過對(duì)傷口應(yīng)用有效量的含有純化CTGF的組合物加速患者傷口愈合的方法。據(jù)說該多肽可用于皮膚傷口愈合不良的情況或者需要增強(qiáng)正常愈合機(jī)制的情況，例如燒傷。該專利沒有對(duì)青光眼或眼部病癥進(jìn)行討論。
美國(guó)專利No.6,069,006的說明書是上述美國(guó)專利No.5,585,270的部分延續(xù)，其描述了CTGF調(diào)節(jié)性核酸序列。該專利還描述了治療纖維變性疾病的方法和鑒別用于治療纖維變性疾病的藥物的方法。除了CTGF核酸序列或多肽外，沒有描述其它具體的藥物。沒有描述眼組織的神經(jīng)保護(hù)。
美國(guó)專利No.6,358,741描述了衍生自CTGF的許多核酸序列，據(jù)說這些核酸序列可用于抑制細(xì)胞中的CTGF表達(dá)。該專利沒有討論青光眼、眼組織的神經(jīng)保護(hù)或抑制CTGF表達(dá)的非核酸或非多肽序列。
CTGF似乎在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中以高濃度產(chǎn)生。CTGF被認(rèn)為是造成與反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生如神經(jīng)膠質(zhì)增生(神經(jīng)膠質(zhì)過度生長(zhǎng))以及神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成相關(guān)的機(jī)制、即已知阻礙神經(jīng)修復(fù)和生長(zhǎng)的過程的成因(Schwab等，2000；Schwab等，2001)。據(jù)信，所述過程還參與與青光眼相關(guān)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元損失和/或視神經(jīng)軸突修復(fù)不能。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)下調(diào)CTGF提供了保護(hù)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)/神經(jīng)乳頭的方法。
因此，一方面，本發(fā)明提供了通過施用包含非核苷酸或非肽CTGF抑制劑的組合物降低IOP并對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞提供神經(jīng)保護(hù)的方法。進(jìn)一步的構(gòu)思是該組合物可包含抑制上調(diào)CTGF的藥物的化合物。例如，已證明過氧化氫(H2O2)是CTGF基因表達(dá)的誘導(dǎo)物。還發(fā)現(xiàn)TGF-β、地塞米松和5-羥色胺也誘導(dǎo)CTGF表達(dá)(Park等，2001)。
治療青光眼的治療劑優(yōu)選為藥物樣小分子，其影響CTGF途徑的一個(gè)或多個(gè)方面。優(yōu)選的治療劑為以下的這些(1)CTGF的抑制劑；(2)在CTGF作用的下游發(fā)揮作用的物質(zhì)的抑制劑(即CTGF信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑)和/或(3)上調(diào)CTGF基因或蛋白表達(dá)的物質(zhì)的抑制劑。
本發(fā)明人已經(jīng)用CTGF QPCR分析試驗(yàn)了數(shù)種不同化合物種類對(duì)培養(yǎng)的人正常或青光眼TM細(xì)胞中基礎(chǔ)和TGFβ2誘導(dǎo)的CTGF基因表達(dá)的抑制作用。小分子抑制劑的靶標(biāo)是抑制GSK-3、CDK、NAALADase、蛋白激酶C、MEK、p38MAPK、ROCK、VEGF、牻牛兒基牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶和AGE。還試驗(yàn)了PPAR、5-HT和P2X7的小分子激動(dòng)劑的活性。以胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1或2(ERK1或ERK2)為靶標(biāo)的化合物也可以在基礎(chǔ)或TGFβ2-誘導(dǎo)的CTGF基因表達(dá)中發(fā)揮作用。許多GSK-3和CDK抑制劑之間存在明顯的交叉反應(yīng)性，因此抑制其它靶標(biāo)如ERK、蛋白激酶C或STAT家族的化合物可能會(huì)被證明在抑制TM細(xì)胞中基礎(chǔ)或TGFβ2-刺激的CTGF表達(dá)中有價(jià)值。
已發(fā)現(xiàn)兩大類化合物可抑制人TM細(xì)胞中基礎(chǔ)和TGFβ2誘導(dǎo)的CTGF表達(dá)GSK-3和CDK抑制劑。糖原合酶激酶(GSK-3)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其以衍生自兩種基因的兩種細(xì)胞形式存在，即GSK-3α和GSK-3β。GSK-3α和GSK-3β95％相同，并且不能容易地區(qū)分小分子拮抗劑對(duì)它們的差別抑制。GSK-3是糖原合成中的限速酶，但具有許多磷酸化細(xì)胞靶標(biāo)，包括糖原合酶、β-連環(huán)蛋白、eIF2B和tau(在(Cohen和Frame2001)和(Woodgett 2001)中有評(píng)述)。在該文獻(xiàn)中沒有給出GSK-3直接參與CTGF表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)的實(shí)例。
依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶(CDK)具有多種細(xì)胞功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期、凋亡、轉(zhuǎn)錄、神經(jīng)元功能和分化。已經(jīng)鑒定了數(shù)種已知的CDK的ATP-競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(Knockaert，Greengard等，2002)。人們一直在致力于將CDK抑制用于治療癌癥、阿爾茨海默病、ALS、中風(fēng)、心血管疾病等。已證明CTGF是成纖維細(xì)胞增殖中TGFβ的下游介導(dǎo)物，其上調(diào)細(xì)胞周期蛋白A-cdk2(Kothapalli和Grotendorst，2000)。
在GSK-3類化合物中，發(fā)現(xiàn)一種化合物即SB-216763(Coghlan，Culbert等，2000)抑制正常和青光眼(圖3)人TM細(xì)胞中基礎(chǔ)和TGFβ2誘導(dǎo)的CTGF水平。SB-216763是一種馬來酰亞胺衍生物，其在0.01mM ATP存在下對(duì)GSK-3α和GSK-3β的IC50為34nM，Ki為9nM(Coghlan，Culbert等，2000)。受試并發(fā)現(xiàn)可抑制TM細(xì)胞中基礎(chǔ)和某些情況下的TGFβ2誘導(dǎo)的CTGF基因表達(dá)的GSK-3類抑制劑中的其它化合物包括帕羅酮類(paullones)，如阿司特帕羅酮(alsterpaullone)、9-氰基帕羅酮和坎帕羅酮(kenpaullone)(Zaharevitz，Gussio等，1999；Leost，Schultz等，2000；Bain，McLauchlan等，2003)。
在CDK類化合物中，發(fā)現(xiàn)一種具有相對(duì)選擇性的CDK2抑制劑即GW-8510(Davis，Benson等，2001)抑制正常和青光眼(圖4)人TM細(xì)胞中基礎(chǔ)和TGFβ2-誘導(dǎo)的CTGF水平。GW-8510是強(qiáng)效且具有相對(duì)選擇性的CDK2抑制劑，其IC50為10nM。GW-8510還抑制CDK1和CDK4，但I(xiàn)C50值較低(110和130nM)(Davis，Benson等，2001)。受試并證明具有抑制活性的其它CDK類抑制劑包括purvalanol A和roscovitine(Hardcastle，Golding等，2002)。
在CTGF QPCR分析中受試并發(fā)現(xiàn)可抑制TM細(xì)胞中基礎(chǔ)和一些情況下的TGFβ2誘導(dǎo)的CTGF基因表達(dá)的其它類化合物包括PPAR激動(dòng)劑如曲格列酮、環(huán)格列酮(Willson，Brown等，2000)和15(S)HETE。
可將本發(fā)明的藥物摻入用于(例如局部、眼房?jī)?nèi)或通過植入物)遞送至眼的各種類型的眼用制劑中。優(yōu)選將所述藥物摻入用于遞送至眼的局部眼用制劑中。所述藥物可以與眼科可接受的防腐劑、表面活性劑、粘度增強(qiáng)劑、滲透促進(jìn)劑、緩沖劑、氯化鈉以及水混合以形成水性、無(wú)菌的眼用混懸液或溶液。眼用溶液制劑可以通過將藥物溶解在生理學(xué)可接受的等張水性緩沖液中來制備。此外，眼用溶液還可以包含眼科可接受的表面活性劑以幫助溶解藥物。另外，眼用溶液還可以含有增加粘度的物質(zhì)，如羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，以增強(qiáng)制劑在結(jié)膜囊中的保持力。也可以使用膠凝劑，包括但不限于結(jié)冷膠(gellan)和黃原膠。為了制備無(wú)菌眼用軟膏制劑，將活性成分與防腐劑在適合的賦形劑如礦物油、液體羊毛脂或白凡士林中混合。根據(jù)公開的類似眼用制劑的配方，可以通過將藥物混懸于由例如卡波普-974等的組合物制備的親水性基質(zhì)中制備無(wú)菌眼用凝膠制劑；可以摻入防腐劑和張力劑。
優(yōu)選將藥物配制成pH約4至8的局部眼用混懸劑或溶液劑。為每個(gè)個(gè)體建立特定的劑量方案由臨床醫(yī)生決定。通常這些制劑中包含的藥物量為以重量計(jì)0.01％至5％，但優(yōu)選為以重量計(jì)0.05％至2％，最優(yōu)選為以重量計(jì)0.1至1.0％。劑型可以是溶液劑、混懸微乳劑。因此，對(duì)于局部給藥，根據(jù)熟練臨床醫(yī)生的判斷，可將這些制劑的1至2滴遞送至眼表面，每天1至4次。
所述藥物也可以與用于治療青光眼的其它藥物組合使用，所述的其它藥物例如但不限于β-阻斷劑、前列腺素類似物、碳酸酐酶抑制劑、α2激動(dòng)劑、縮瞳藥和神經(jīng)保護(hù)藥。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)將藥物直接遞送至眼(例如局部用滴眼劑或軟膏劑；處于陷凹(cul-de-sac)中或鄰近鞏膜或在眼中的緩釋裝置；眼周、結(jié)膜或眼球筋膜下、眼房?jī)?nèi)或玻璃體內(nèi)注射)或經(jīng)胃腸外遞送至眼(例如經(jīng)口；靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)注射；經(jīng)皮遞送；等)。以下是本發(fā)明具體的可能的制劑實(shí)例(a)局部眼用制劑重量百分比CTGF抑制劑 0.005-5.0四丁酚醛 0.01-0.05HPMC 0.5苯扎氯銨 0.01氯化鈉 0.8乙二胺四乙酸二鈉 0.01NaOH/HCl 適量至pH7.4純化水 適量至100mL進(jìn)一步的構(gòu)思是可將本發(fā)明的化合物配制在眼內(nèi)植入裝置中。
以下實(shí)施例用于闡明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在以下實(shí)施例中所公開的技術(shù)代表發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實(shí)施中可良好發(fā)揮作用的技術(shù)，因此可以認(rèn)為其構(gòu)成了實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本發(fā)明所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對(duì)所公開的具體實(shí)施方案進(jìn)行很多改變并且仍能獲得類似或相似的結(jié)果。
實(shí)施例1青光眼TM相對(duì)于非青光眼TM中的CTGF表達(dá)微陣列篩選通過GeneFilter(Research Genetics)篩選鑒定青光眼TM細(xì)胞中相對(duì)于正常TM細(xì)胞中CTGF的mRNA轉(zhuǎn)錄物升高。
如(Shepard等，IOVS 2001，423173)所述的那樣，由合并的(每種6個(gè))正?；蚯喙庋跿M細(xì)胞系中分離出500ηg總RNA(TRIzol Reagent；Invitrogen)，并于300單位Superscript II核糖核酸酶H-反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)、100μCi[α-33P]dCTP(10mCi/ml，3,000Ci/mmol；Amersham)、0.33mM dATP、dGTP、dCTP(Promega)、3.3mM DTT、1X第一鏈緩沖液(Invitrogen)和2μg oligo-dT存在下、在37℃下分別反轉(zhuǎn)錄90分鐘。然后按照生產(chǎn)商的使用說明用Chroma-Spin 100柱(Clontech)純化放射性標(biāo)記的cDNA。按照生產(chǎn)商的使用說明用點(diǎn)有≈4,000種已知基因的單個(gè)Genefilter(GF211；Research Genetics)與放射性標(biāo)記的探針雜交。通過在0.5％SDS中煮沸5分鐘將膜首先進(jìn)行預(yù)處理。膜的預(yù)雜交在42℃下、于含有5ml MicroHyb(Research Genetics)的轉(zhuǎn)瓶中用5μg poly-dA(ResearchGenetics)和5μg煮沸的Cot1 DNA(Invitrogen)作為封閉試劑進(jìn)行30分鐘。將全部放射性標(biāo)記的探針煮沸并在42℃下加至預(yù)雜交混合物中達(dá)16h。雜交后，將膜在2XSSC/1％SDS中洗滌2次達(dá)20分鐘，然后在0.5XSSC/1％SDS中洗滌1次達(dá)15分鐘。將膜放置于濕Whatmann 3MM紙上并用SaranWrap包裹。在Storm磷光顯像儀(Molecular Dynamics)上用最大分辨率獲得圖像。一旦獲得圖像，就將印跡立即在沸騰的0.5％SDS中除去探針并用相反的探針(例如正常TM之后是青光眼TM)進(jìn)行另一次雜交。使用Pathways(Research Genetics)和MS Excel(Microsoft)軟件分析得自一式兩份探測(cè)的圖像。在GF211 GeneFilter上的4300種基因中，CTGF(GenBank登錄號(hào)#AA598794)是顯示出GTM∶NTM比＞2倍的7種基因之一。
cDNA差減篩選在定制的PCR-SelectTMcDNA差減篩選(Clontech)中獨(dú)立地鑒定CTGF，所述的差減篩選用于篩選在青光眼TM細(xì)胞中相對(duì)于在正常TM細(xì)胞中差異表達(dá)的mRNA轉(zhuǎn)錄物。
如(Shepard等，2001)所述的那樣，由合并的(每種7個(gè))正?；蚯喙庋跿M細(xì)胞系中分離出700μg總RNA(TRIzol Reagent；Invitrogen)。使用Nucleotrap mRNA Midi試劑盒(Clontech)通過在oligo-dT膠乳珠上的兩輪poly A+選擇分離出受試者(青光眼)和驅(qū)動(dòng)者(正常)poly A+RNA。按照Clontech試劑盒(目錄號(hào)#K1804-1)的方法進(jìn)行所有隨后的PCR-SelectTMcDNA差減步驟。
基本按照PCR-SelectTM差異篩選試劑盒(Clontech目錄號(hào)#K1808-1)中的使用說明進(jìn)行得到的cDNA差減文庫(kù)的差異篩選。選擇的數(shù)個(gè)差異表達(dá)的cDNA克隆也通過Northern分析證實(shí)。用差減TM細(xì)胞cDNA文庫(kù)探針鑒定的所有候選差異表達(dá)克隆的列表由Clontech產(chǎn)生。CTGF的轉(zhuǎn)錄物(GenBank登錄號(hào)#XM_037055.1)在該表中并且于青光眼cDNA文庫(kù)中被富集。
實(shí)施例2RNA分離和第一鏈cDNA制備按照生產(chǎn)商的使用說明(Life Technologies)使用Trizol試劑由TM細(xì)胞中分離出總RNA。按照生產(chǎn)商的使用說明(PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)使用隨機(jī)六聚體和TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑由1μg總RNA產(chǎn)生第一鏈cDNA。然后，將100ul反應(yīng)物稀釋20倍以達(dá)到0.5ng/μl的有效cDNA濃度。
定量PCR基本如(Shepard等，IOVS 2001，423173)所述的那樣使用ABI Prism7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems)通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR(QPCR)證實(shí)CTGF的差異表達(dá)。使用Primer Express軟件(Applied Biosystems)設(shè)計(jì)用于CTGF擴(kuò)增的引物，并將該引物退火至Genbank登錄號(hào)為#NM_001901.1的鄰接外顯子(CAGCTCTGACATTCTGATTCGAA，nts1667-1689和TGCCACAAGCTGTCCAGTCT，nts 1723-1742)上，產(chǎn)生76-bp擴(kuò)增子。CTGF的擴(kuò)增使用設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生69-bp擴(kuò)增子的針對(duì)18SrRNA基因(GenBank登錄號(hào)#X03205 GTCCCTGCCCTTTGTACACAC，nts 1680-1700和CGATCCGAGGGCCTCACTA，nts 1730-1749)的引物相對(duì)于18S核糖體RNA表達(dá)進(jìn)行標(biāo)化。使用SYBRGreen I雙鏈DNA結(jié)合染料化學(xué)(Applied Biosystems)擴(kuò)增CTGF或18S cDNA。CTGF和18S引物對(duì)的特異性通過組合使用DNA測(cè)序、瓊脂糖凝膠分析和使用ABIPrism 770 SDS解離曲線軟件(Applied Biosystems)的解離曲線分析由PCR產(chǎn)物評(píng)價(jià)。CTGF或18SrRNA反應(yīng)物由1X SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)、50nM引物和2.5ng cDNA組成，終體積為50μl。熱循環(huán)條件由50℃，2分鐘、95℃，10分鐘，然后40個(gè)95℃15秒及60℃1分鐘的循環(huán)組成。使用PE Biosystems用戶公告#2(http//docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf)中所述的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)RNA濃度的定量。使用SDS軟件版本1.9.1(AppliedBiosystems)和MS Excel 97(Microsoft)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用含有CTGF或18S的靶序列的質(zhì)粒DNA產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。QPCR數(shù)據(jù)以平均值±SD給出。
根據(jù)本發(fā)明所公開的內(nèi)容，在此所公開并要求保護(hù)的所有組合物和/或方法均無(wú)需進(jìn)行過多實(shí)驗(yàn)即可進(jìn)行制備和實(shí)施。雖然根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行了描述，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯而易見的是在不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下，可對(duì)在此所述的組合物和/或方法以及所述方法的步驟或步驟的順序進(jìn)行改變。更具體而言，顯而易見的是可以用化學(xué)和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的某些藥物替換在此所述的藥物以得到相似的結(jié)果。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯而易見的是所有這些替換和改變均被認(rèn)為落入所附權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。
參考文獻(xiàn)就其提供的典型性步驟細(xì)節(jié)或作為此處所述內(nèi)容的補(bǔ)充的其它細(xì)節(jié)，在此將以下參考文獻(xiàn)詳細(xì)引入作為參考。
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權(quán)利要求
1.在有需要的患者中降低眼內(nèi)壓并提供神經(jīng)保護(hù)的方法，所述方法包括施用治療有效量的包含至少一種抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)或生物學(xué)功能的非核苷酸或非蛋白藥物和可藥用載體的組合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的施用是通過局部應(yīng)用、眼房?jī)?nèi)或通過植入物施用。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在所述組合物中所述CTGF抑制劑的總濃度為0.01％至2％。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的患者患有青光眼或高眼壓癥。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述的青光眼為正常眼壓性青光眼。
6.在有需要的患者中降低眼內(nèi)壓的方法，所述方法包括施用治療有效量的包含至少一種抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)或生物學(xué)功能的非核苷酸或非蛋白藥物和可藥用載體的組合物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述的施用是通過局部應(yīng)用、眼房?jī)?nèi)或通過植入物施用。
8.權(quán)利要求6的方法，其中在所述組合物中所述CTGF抑制劑的總濃度為0.01％至2％。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述的患者患有青光眼或高眼壓癥。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述的青光眼為正常眼壓性青光眼。
11.預(yù)防與原發(fā)性開角型青光眼(POAG)相關(guān)的視野缺損的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)的非核苷酸或非蛋白藥物的組合物以便控制眼內(nèi)壓并對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或視神經(jīng)乳頭提供保護(hù)。
12.在有需要的患者中降低眼內(nèi)壓并提供神經(jīng)保護(hù)的組合物，所述組合物包含至少一種抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)或生物學(xué)功能的藥物和可藥用載體。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中在所述組合物中所述CTGF抑制劑的總濃度為0.01％至2％。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過施用治療有效量的至少一種抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)的非核苷酸或非蛋白藥物而在有需要的患者中降低眼內(nèi)壓并提供神經(jīng)保護(hù)的方法。
文檔編號(hào)A61K31/519GK1650001SQ03809604
公開日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2003年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月30日
發(fā)明者D·L·弗利納, A·謝潑德, N·雅各布森, 彭玉豪, A·F·克拉克 申請(qǐng)人:愛爾康公司