專利名稱：一種得自海洋無脊椎動物的天然無毒多色熒光蛋白染料和含有所述染料的組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從海洋無脊椎動物，明玉參(Holothuria scabra)的卵巢組織中提取的天然無毒多色熒光蛋白染料。本發(fā)明還提供了一種提取、部分純化和鑒定此新天然染料的方法。還報告了海洋動物無毒、細(xì)胞膜滲透的、外源凝集素類膠結(jié)的、易于授精和受精的性能。提及的海洋無脊椎動物尤其是海參。海參是棘皮動物，屬于棘皮動物類群的成員，棘皮動物也包括海星和海膽?？茖W(xué)上稱謂的海參具有伸長的管狀身體，其具有彈性并且沒有骨質(zhì)骨架。它們具有以下分類學(xué)位置。
背景技術(shù)：
所述海參具有以下分類學(xué)位置亞界后生動物門棘皮動物門亞門游移棘皮動物綱海參綱亞綱盾手亞綱(Aspidochirotacea)枝手亞綱(Dendrochirotacea)無足亞綱(Apodacea)目枝手目(Dendrochirota)盾手目(Aspidochirota)板足海參目(Elasipoda)芋海參目(Molpadonia)無足目(Apoda)在這些目中，海參明玉參屬于目盾手目(Aspidochirota)科海參科屬海參屬種Scabra棘皮動物是腔腸無脊椎動物，僅產(chǎn)于海中，從未有陸生，成年的形態(tài)是未分節(jié)的，呈五基數(shù)的放射狀輻射對稱，沒有頭或腦，與所有其它動物的區(qū)別在于骨骼和體腔的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。海參綱有身體兩側(cè)對稱的動物，通常沿口面-遠(yuǎn)口面的軸延長，在一端或接近一端的地方有口，在另一端或接近另一端的地方有肛門。其體表是粗糙的，內(nèi)骨骼縮小成細(xì)的針狀或片狀，深入體表中，附著于水的維管系統(tǒng)的一副觸須環(huán)繞口周圍；通常有吸足或管狀足并且是運(yùn)動的；消化道為長的并是盤繞的，并且泄殖腔通常有呼吸樹；性別通常是分開的，并且生殖腺為單一或成對叢生的細(xì)管。它們是定棲型，通過前端或后端的放射突出體或者附著于硬的基層上，或者穴居于軟的沉積物內(nèi)。存在超過1000種的holothuroids。其長度從2cm到2米。其中還存在其棲息地不受海洋深度限制的動物。據(jù)報道一些物種50％的生活方式在4000m，90％的生活方式在8000m深度。也有人將明玉參這一種稱為糙海參(Metriatyla scabra Jaegea)，它廣泛分布于東非、紅海、孟加拉灣、東印度、澳大利亞、日本、南太平洋、菲律賓、印度洋和其它印度洋-太平洋區(qū)域。在沙巴洲、馬來西亞和印度尼西亞和其它印度洋-太平洋國家它被用作人/動物的消費(fèi)品(consumption)。
色素屬于無機(jī)和有機(jī)類。前者是用于各種裝飾和繪畫等目的的無機(jī)化合物。有機(jī)色素如有機(jī)染料要追溯到古代。即使是在圣經(jīng)時代(Biblicaltimes)之前，近東和遠(yuǎn)東國家報道了由植物如巴西木(Brazil wood)、log-wood、波斯?jié){果靛藍(lán)(Persian berry indigo)和茜草得到的染料的用途(George L.Clark，1966，《化學(xué)百科全書》(“Encyclopaedia ofchemistry”)，第2版，833-835頁)。Debra K.Hobson和David S.Wales描述了“綠色染料”，它是作為一些活的生物體如真菌、藍(lán)綠藻類、海膽、海星類節(jié)肢動物和珊瑚礁類腔腸動物的第二代新產(chǎn)物而產(chǎn)生的(Journalof the Society of Dyers and Colourists(JSDC)，114，42-44，1998)。這些是蒽醌化合物，歷史上它們在染料工業(yè)中非常重要。著色劑檔案-染料A卷(Stainsfile-Dyes A)給出了264種染料的染料索引(Dye Index)。它們之中僅6種是從所有種類的生物體得到的天然染料。Http//members.pgonline.com/-bryand/dyes/dyts.htm非常需要細(xì)胞滲透的熒光染料用于活細(xì)胞功能、藥物傳遞的研究和各種細(xì)胞器官的研究。真核細(xì)胞可以具有幾個由薄膜隔開的層，然而細(xì)菌細(xì)胞可以由單層組成。滲透性是細(xì)胞膜的特征。好的染料可以在一個激發(fā)和不同激發(fā)以不同的顏色顯示細(xì)胞的不同部分。附著于各種蛋白的熒光基團(tuán)已經(jīng)合成并公開在Richard P.Haughland的《熒光探測器和化學(xué)研究手冊》(Handbook of fluorescent probes and Research chemicals)中，1996.第126-128頁。闡述了包括藍(lán)色熒光Cascade blue和新式的AMCA-S染料到紅的熒光Texas Red染料和藻膽蛋白。其包括高亮度Oregon綠共軛物、Rhodol綠共軛物；bodipy共軛物；稱為Eosin的中級試劑；Red熒光Rhodamine Rd-X和Texas Red-X共軛物；藻膽蛋白共軛物；Cascade藍(lán)和AMCA-S共軛物。
所有這些染料是合成物質(zhì)并且它們中的一個發(fā)出特定的光譜范圍。綜合2-3種染料然后進(jìn)行多色染色實(shí)驗(yàn)。
相同的染料還產(chǎn)生jasplakinolide，由細(xì)胞滲透F-肌動蛋白探針從海綿Jaspis johnstoni中析出的大環(huán)肽。然而它有毒并顯示出殺菌、殺蟲、抗增殖活性。
市場上目前使用的大部分染料都是合成物質(zhì)。著色劑檔案-染料A卷給出了264種染料的染料索引。其中258種染料是合成物質(zhì)，僅僅6種為天然染料(http//members.pgonline.com/-bryand/dyes/dyes)。合成染料的生產(chǎn)通常需要在高溫下使用強(qiáng)酸、堿金屬和貴金屬作為催化劑。這使得該方法和排出的廢液引起環(huán)境退化。對于現(xiàn)有的染料，染料工業(yè)不斷地在尋求便宜和對環(huán)境無害的生產(chǎn)路線。(Hobson和Wales，1998。綠色染料，Journal of the Society of Dyers and colourists(JSDC)，1998，114，42-44)。
然而所有這些染料并不是熒光性的。Bitplane產(chǎn)物已經(jīng)顯示出市場上123種熒光色素的目錄及其激勵和發(fā)射光譜(http//www.bitplane.ch/public/support/standard/fluorochrome.htm)。
熒光染料廣泛地用于分子探針的標(biāo)記，通過熒光顯微術(shù)用于定位生物學(xué)結(jié)構(gòu)，例如用于免疫測定、原位雜交研究中標(biāo)記核苷酸和低聚核苷酸，粘合在聚合微球和影像研究中的細(xì)胞染色。染料還用于例如光動力學(xué)治療方法中細(xì)胞的選擇性破壞。(Haughland，R.P和Kang，H.C.，US4,774,339；1988年9月27日；Haughland，R.P和Kang，H.C.，US5,248,782；1993年9月28日)。
熒光是原子或分子在由較高電子態(tài)轉(zhuǎn)變到較低電子態(tài)發(fā)出輻射線的現(xiàn)象。其遵循斯托克定律，根據(jù)該定律熒光輻射的波長總是比激勵輻射的波長要長。熒光過程與磷光和生物熒光相當(dāng)不同。術(shù)語熒光在激勵和輻射發(fā)射之間的間隔很小(10-8-10-3秒)的時候使用。磷光現(xiàn)象中吸收與輻射之間的時間間隔可以為10-3秒至幾小時(R.Norman Jones，1966，《化學(xué)百科全書》，第2版，1966，第435-436頁)。術(shù)語生物熒光用于生物機(jī)體中特定細(xì)胞在特定時間化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光線。
Richard P.Haughland的《熒光探測器和化學(xué)研究手冊》(第6版，美國1996年印刷)中報導(dǎo)了很多種熒光染料。在該書中第1-6頁，Ian D.Johnson(1996)詳細(xì)描述了在特定的稱為熒光團(tuán)或熒光染料(通常為多芳香烴或雜環(huán))的分子中發(fā)熒光的方法以及檢測方法。目前最常用的熒光染料為熒光素和基于熒光素的和BODIPY染料及其衍生物。作者已經(jīng)提及了所有這些染料的缺陷，并公開了染料特征的選擇。許多熒光染料的衍生物及其合成已經(jīng)公開在美國專利中(Haughland，R.P和Kang，H.C.US4,774,339，1988年9月27日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US5,248,782，1993年9月28日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US5,187,288，1993年2月16日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US5,274,113，1993年12月28日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US5,433,896，1995年7月18日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US5,451,663，1995年9月19日出版)。
Rosenblum Barnett B，Spurgeon S，Lee Linda G，Benson Scott C和Graham Ronald J在WO0058406(
公開日2000年10月5日)報導(dǎo)了可以作為分子探針的4，7-二氯若丹明染料。Collin，P.D.在其1998年6月23日、1999年3月2日和1999年11月16日的美國專利US 5,770,205，US 5,876,762和US5,985,330中已經(jīng)公開了海參各個身體部分的治療學(xué)特性。
R.Norman Jones在The encycopaedia of chemistry，1996年第2版的第435-436頁中已經(jīng)公開了良好的熒光特性。根據(jù)該文所述，熒光分子必須具有良好的發(fā)色系以吸收激發(fā)能，并且在熒光遲延作用之前具有屏蔽機(jī)制以避免激發(fā)能快速消散為振動移動。他還指出，雖然分子結(jié)構(gòu)與化合物的熒光之間的關(guān)系還沒有為人們透徹的理解，但是其中存在著與熒光作用有關(guān)的某些基團(tuán)。例如，有機(jī)分子中存在的酞和芳族結(jié)構(gòu)例如蒽和萘并萘尤其與明亮的熒光作用有關(guān)。少數(shù)無機(jī)化合物在液態(tài)或固態(tài)較強(qiáng)的發(fā)熒光，熒光作用常常通過微量雜質(zhì)的存在而改性。
各種類胡蘿卜素色素?fù)?jù)報道得自生產(chǎn)類胡蘿卜素的細(xì)菌種(美國專利US 5,935,808，1999年8月10日公開，發(fā)明人Hirschberg等和US5.858,761，1999年1月12日公開，發(fā)明人Tsubokura等)。Collin；PeterDonald在其2000年5月2日公開的美國專利US 6,055,936中公開了海參類胡蘿卜素脂類級分及其方法。Bandaranayake，W.M.和Des Rocher，A 1999(海洋生物學(xué)133；163-169)中描述了得自澳大利亞的Holothuiria atra體壁、卵巢和內(nèi)臟的類胡蘿卜素色素。
很少報道有用的熒光天然染料。Shimomura，O，Johnson，F(xiàn).H.和Saiga，Y在《細(xì)胞和比較生理學(xué)雜志》，59，223-239，1962，Chalfie M在1Photochem Photobiol 1995年10月62(4)651-6《未淬火的熒光蛋白》中描述了從太平洋海蜇Aequora aequora中得到的綠色熒光蛋白GFP；Youvan DC，Michel-Beyerie ME在國家生物工藝學(xué)1996年10月14(10)1219-20《GFP的結(jié)構(gòu)和熒光作用機(jī)制》，Chalfie M，Yuan Tu，GhiaEuskirchen，William W.Ward，Douglas C Prasher在《科學(xué)》263(1994)802-805報道了純化的GFP為238胺酸蛋白。純化的GFP在395nm吸收最大并在470nm有一個次級峰的藍(lán)光，并在509nm的發(fā)射峰發(fā)出綠光并在540納米具有肩峰。這些熒光非常穩(wěn)定并且?guī)缀鯖]有觀察到光致漂白。
在紅和黃范圍內(nèi)的其它波長具有熒光作用的GFP公開自非生物熒光的珊瑚蟲，尤其Discosoma珊瑚。Gurskaya NG，fradkov聲頻，terskikh一個，matz MV，labas YA，Martynov VI，Yanushevich YG，Lukyanov KA，Lukyanov SA在1FEBS Lett 2001年10月19日；507(1)16-20中公開了作為遠(yuǎn)紅外熒光蛋白來源的GFP類色蛋白。Wachter RM，Elsliger MA，KallioK，Hanson GT，Remington SJ.在1Structure 1998年10月15日；6(10)1267-77中公開了“綠色熒光蛋白發(fā)黃光變體中結(jié)構(gòu)堿的譜移”。Fradkov AF，Chen Y，Ding L，Barsova EV，Matz MV，Lukyanov SA“得自Discosoma珊瑚的新型熒光蛋白及其具有均勻遠(yuǎn)紅外熒光作用的突變種”。在1FEBS Lett 2000年8月18日479(3)127-30。其中描述了一種新基因，用于改進(jìn)在593納米具有發(fā)射極點(diǎn)的紅外移動蛋白，該新基因由discosoma珊瑚克隆。名為dsFP593的蛋白與最近公開的GFP類蛋白drFP583非常相同，在583納米具有發(fā)射極點(diǎn)。它們開發(fā)了這些基因的各種突變種。雜化突變種變體產(chǎn)生在616納米具有唯一再移動發(fā)射極點(diǎn)的突變種變體。Matz MV，F(xiàn)radkov AF，Labas YA，Savitsky AP，Zaraisky AG，MarkelovML，Lukyanov SA.1Nat Biotechnolo 1999年12月17(10)969-73。
在東南和南大平洋國家，海參綱在保健食品和藥物工業(yè)作為食品或各種藥物組合物的組分，尤其是關(guān)節(jié)炎、挫傷及其他治療劑的應(yīng)用中是為大家所熟知的。一些美國和國際專利已經(jīng)記載并篩選出來。(Fan Hui-Zeng，Yu Song，Yamanaka E，Numata K，Oka T，Suzuki N，muranaka Y在US 5519010
公開日1996年5月21日公開；Weiman，Bernard等的US 5,888,514，1999年3月30日公開；Katsukura，Kitazato，Kenji Yamazaki，Yasundo的US5,993,797，1999年11月30日公開；Henderson，R.W；Henderson，T和Hammd，T的US6255295，2001年7月3日公開；Shinya的US6203827，2001年3月20日公開；Collin Peter Donald的US 5770205，1998年6月23日公開和2000年1月13日公開的WO 0001399；Kovalev V G，Sementsov V K，Slutskaja tn，Akulin V N，Timchishina G N的RU 2147239，2000年4月10日公開；李兆明、朱蓓薇的CN 1286926，2001年3月14日公開；Qu Jianhong，SongXiuqin，Zheng Fuqiang的CN1223131，1999年7月21日公開；曲建紅、宋秀芹、鄭富強(qiáng)的CN 1142365，1997年2月12日公開；方華的CN 1312031，2001年9月12日公開和丁存義的CN1173290，1998年2月18日公開；Collin PeterDonald的WO9937314，1999年7月29日公開。)已經(jīng)公開了得自海參的組分在抗HIV藥物中的應(yīng)用(Hoshino Hiroo的EP410002，公布日1991年1月30日和Hoshino Hiroo EP495116，公布日1992年7月22日)?？紤]到其重要性，這些動物被嘗試著人工培養(yǎng)(Annie Mercier，S C Battaglene和Jean-Francois Hamel在Journal of experimental Marine Biology and Ecology，第249卷，第1期，89-110，2000年“熱帶海參明玉參的繁殖區(qū)選擇和初期移棲”)。周瑋、王樹海、顧在時發(fā)表的“刺參生態(tài)增殖方法”，專利號為CN1179261，
公開日1998年4月22日。
但是所有這些專利沒有與本專利的主題直接相關(guān)，所以我們沒有將它們包括在給出的參考中。
Goswami，Usha和Ganguly，Anutosh已經(jīng)申請了有關(guān)得自海洋無脊椎動物的天然熒光染料的專利(CSIR，NF-140，2001年3月30號提交的美國專利申請09/820,654)。其涉及到得自明玉參的粗提物，當(dāng)其在光譜不同的紫外區(qū)和可見區(qū)激發(fā)時具有三種不同波長的熒光品質(zhì)。本發(fā)明還提供了一種新型染料的萃取、純化及其表征的方法，該染料為得自海參的部分純化的天然染料。除了該染料作為藥物的性質(zhì)之外，還公開了該染料作為外部熒光(epifluorescent)著色劑和非放射性熒光染料用于原位雜交研究中分子探針標(biāo)記的用途。在這些專利現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)詳述了得自陸生植物和微生物的色素、合成染料和天然染料。(1984年6月5日公開的US 4,452,822，發(fā)明人Shrikhande，Anil J；1994年6月14日公開的US 5,321,268，發(fā)明人Crosby David A和Ekstrom Philip A；1995年4月11日公開的US5,405,416，作者Swinton；Robert J；1999年1月12日公開的US 5,858,761，發(fā)明人Tsubokura等；1999年5月11日公開的US 5,902,749，發(fā)明人Lichtwardt等；1999年6月1日公開的US 5,908,650，發(fā)明人Lenoble等；1999年7月6日公開的US 5,920,429發(fā)明人Burns等；1999年8月9日公開的US5,935,808，發(fā)明人Hirschberg等；1999年11月23日公開的US 5,989,135，發(fā)明人Welch，David Emanuel；2000年5月2日公開的US 6,055,936，發(fā)明人collin，Peter Donald；2000年5月2日公開的US 6,056,162，發(fā)明人Leighley，Kenneth C；2000年8月15日公開的US 6,103,006，發(fā)明人DiPietro，Thomas C.；2000年8月29日公開的US 6,110,566，發(fā)明人White等；2000年10月31日公開的US 6,140,041，發(fā)明人LaClai r，James J；2000年12月26日公開的US 6,165,384，發(fā)明人Cooper等；2001年1月30日公開的US 6,180,154，發(fā)明人Wrolstad等；1986年12月30日公開的EPO206718，發(fā)明人Cramer Randall J；1991年1月30日公開的IE901379，發(fā)明人LeeLinda G，Mize Patrick D；1990年7月7日公開的WO9010044，發(fā)明人RobertJ；1997年10月7日公開的AU704112，發(fā)明人Burns David M，Pavelka Lee A；1999年6月24日公開的DE19755642，發(fā)明人weimer Thomas DR；1999年9月28日公開的WO9938919，發(fā)明人Laclair James J；2000年10月5日RosenblumBarnett B等公開的WO0058406；2000年8月15日DiPietro，Thomas C公開的WO993891615；2000年8月29日Pavelka Lee等公開的WO9920688；2000年8月29日White等公開的WO9920688。)還公開了熒光染料在分子生物學(xué)研究、工業(yè)應(yīng)用和救生裝置等中的多種應(yīng)用。
Collin，P.D在其1998年6月23日、1999年3月2日和1999年11月16日公開的美國專利5,770,205、5,876,762和5,985,330中已經(jīng)公開了海參各個身體部分的治療學(xué)特性。所有這些參考文獻(xiàn)也屬于本專利。
在另一專利Goswami，Usha和Anutosh Ganguly(申請?zhí)?中已經(jīng)公開了一種新型的有機(jī)硅Si-O-R型化合物和由海洋無脊椎動物明玉參的體壁萃取液純化得到的多色熒光天然染料。該化合物為具有酚熒光團(tuán)部分并通過硫酸酯鍵連接到硅母體的多糖熒色物。該硅部分是核心分子的主要部分并參與動物的新陳代謝。該化合物中富含硫。該發(fā)明還提供了一種用于該新化合物萃取、純化及其表征的方法，以及得自海洋生物尤其是海參的多色熒光染料。該專利還首次公開了新熒光化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中硅成為有機(jī)分子和熒光基團(tuán)酚類的主要部分。該專利此外提供該化合物的不平常特性和染料的特征，并公開了其優(yōu)點(diǎn)。染料的一些衍生物具有高或低的分子量和用于熒光探測器中所期望的單色和多色染色應(yīng)用的理想特性。此外該化合物可以作為染料工業(yè)、化妝品工業(yè)和藥物工業(yè)組合物中的易混合組分。
Richard P.Haughland的《熒光探測器和化學(xué)研究手冊》(美國第6版印刷，1996)中提到的熒光染料有關(guān)的許多文獻(xiàn)合并到該專利。在美國專利和國際專利中已經(jīng)公開了許多該熒光染料衍生物及其合成。(Haughland，R.P和Kang，H.C.1988年9月27日公開的US4,774,339；Haughland，R.P和Kang，H.C.1993年9月28日公開的US5,248,782；Haughland，R.P和Kang，H.C.1993年2月16日公開的US5,187,288；Haughland，R.P和Kang，H.C.1993年12月28日公開的US5,274,113和Haughland，R.P和Kang，H.C.1995年7月18日公開的US 5,433,896；Haughland，R.P和Kang，H.C.1995年9月19日公開的US 5,451,663；Rosenblum Barnett B，Spurgeon S，Lee Linda G，Benson Scott C和GrahamRonald J在2000年10月5日公開的國際申請WO0058406中報道了一種可用作分子探針的4，7-二氯若丹明染料。)所有這些參考文獻(xiàn)也屬于本發(fā)明。
通過其早期專利和其他人的報道，申請人已經(jīng)采用了不同的方法。在我們的早期專利中報導(dǎo)的染料是天然染料，但是其是有毒的。不同激發(fā)波長的光的光譜范圍也是不同的。該染料是非蛋白質(zhì)的液體并且不能有效地用于活體細(xì)胞的原位研究。其在生物醫(yī)學(xué)和工程科學(xué)中的應(yīng)用和使用也是不同的。
當(dāng)前報道的染料雖然也是天然染料，但是其為直接從非生物熒光無脊椎動物的卵巢細(xì)胞中提取的無毒多色熒光蛋白質(zhì)。海產(chǎn)動物來源于海參屬，稱為明玉參的海參是無毒熒光蛋白染料的一個新的來源。不同于合成染料，在其制造中不需要使用強(qiáng)酸和堿金屬的步驟。不同于早期公開的得自海參卵巢的類胡蘿卜素色素，這些染料并非類胡蘿卜素色素。而是熒光蛋白。當(dāng)前染料中的熒光蛋白也不同于來自Jellyfish Aequorea aequorea的發(fā)出淡色綠光的綠色熒光蛋白(GFP)。雖然具有紅色或黃色范圍轉(zhuǎn)變的各種不同GFPs已經(jīng)公開得自其它動物。我們的方法不同于那些GFPs。我們具有在不同紫外線和可見光頻譜波長激發(fā)時發(fā)出淺和深藍(lán)色、綠色、黃色、橙色和紅色范圍內(nèi)熒光的淡色熒光蛋白染料。
與大多數(shù)合成熒光染料最為不同的是，為以不同波長得到不同熒光色調(diào)，我們的染料無須與另一種染料混合。它在三種不同激發(fā)波長發(fā)出6種不同顏色的熒光，可以具有多重用途。當(dāng)僅僅存在染液時，細(xì)胞成分顯示與基底不同的對比染色。在我們的染料中，熒光基團(tuán)連在蛋白上并產(chǎn)生熒光，其此外也不同于通過成環(huán)作用由第一氨基酸序列得到的GFPs載色體。在我們的染料中，當(dāng)單獨(dú)的熒光基團(tuán)和連在蛋白的熒光基團(tuán)受到紫外線、藍(lán)色波長和綠色波長激發(fā)時，遵循斯托克定律發(fā)出三種不同顏色的光。
本發(fā)明的染料還是細(xì)胞滲入的并滲透入內(nèi)部細(xì)胞成分的各種細(xì)胞膜中。
只要該染料附著在細(xì)胞膜中，其在室溫下可以穩(wěn)定幾個月并且不會在微生物的作用下光退色和污染。不同于某些藻類和發(fā)光生物的萃取液，其熒光沒有在高溫和低溫下變質(zhì)。
該染料對大腸桿菌和性細(xì)胞以及河口和海洋動物的幼蟲是無毒的。所以其廢液不會殺死海洋和河口動物的幼蟲。其為無毒性和生態(tài)友好的染料。
本染料的另一個重要方面是其僅僅在活的和固定組織中顯示熒光性。死的個體不會被染色。本染料的一個重要方面是制備用于分子探針的非放射就地標(biāo)記和復(fù)染色的組合物和試劑盒。在不同波長的激發(fā)給出等同于DAPI、FITC和PI以及其它市場熒光探測器的顏色效果。該染料為天然多色熒光染料。實(shí)際上，此單一的染料包括市場上已知的123種熒光染料的波譜的顏色(參見因特網(wǎng)上的Bitplane產(chǎn)品(熒光染料)(http//www.bitplane.ch/public/standard/fluorochrome.htm))。
然而，本發(fā)明的另一方面是具有膠結(jié)性質(zhì)的染料。
然而，本發(fā)明的另一方面是提高牡蠣精子授精和卵受精比例的染料。
然而另一方面是其在外部熒光顯微鏡檢查法(epiflourescencemicroscopy)中作為無毒熒色物著色劑的應(yīng)用。染料為天然染料并非合成物質(zhì)，其通過各種膜滲入并將其區(qū)別著色。本申請?zhí)峁┝撕唵味焖俚臋z查用于多種用途-如用于熒光的原位雜交技術(shù)的分子診斷，組織培養(yǎng)物的生物污染的快速診斷、食品工業(yè)和工業(yè)制劑中的生物，流式細(xì)胞計等的方法。
然而染料的另一方面是它作為非放射性標(biāo)記試劑盒的組分，用于先進(jìn)的分子生物學(xué)用途，其中蛋白質(zhì)染料用于活體細(xì)胞功能的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種得自海洋棘皮動物卵巢提取物的熒光顏料的萃取、提純以及表征的方法。該顏料是一種天然染料并且是帶負(fù)電的熒光蛋白，其連有非極性熒光基團(tuán)。該染料在紫外線和可見光的多種熒光激勵范圍放出熒光。本發(fā)明還公開了該染料的化學(xué)、物理、光譜、外部熒光細(xì)微性質(zhì)。測試無毒性、細(xì)胞膜可透性和膠結(jié)品質(zhì)。
本發(fā)明的主要目的是提供一種天然無毒環(huán)境友好的多色熒光蛋白染料，該蛋白染料得自海參明玉參的卵巢組織。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種得自海洋動物明玉參(其為一種非生物發(fā)光海洋動物)的所述熒光蛋白的萃取、部分純化以及表征的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種染料，其為細(xì)胞膜可滲透的、為細(xì)胞部分提供區(qū)分，并在紫外線和可見光頻譜波長范圍的單色和多色輻射下具有視覺效果。
本發(fā)明的另一目的是提供一種較長時間不感光的染料。
本發(fā)明的另一目的是利用該染料檢查幸存者以及真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的生長。
本發(fā)明的另一目的是使用該染料提高養(yǎng)殖業(yè)和生態(tài)學(xué)上重要的動物例如牡蠣的增殖能力和細(xì)胞增殖率。
本發(fā)明的又一目的是提供使用從明玉參組織中得到的染料的組合物。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種染料，其在具有三種波長的特定激發(fā)發(fā)射在紫外光譜和可見光譜的6個不同波長范圍的熒光。
本發(fā)明的另一目的是觀察熒光和可見光譜分析和發(fā)射波長的范圍。
本發(fā)明的另一目的是觀察染料在外部熒光顯微鏡立方晶格的紫外和可見光范圍的3種不同的熒光色發(fā)射。
本發(fā)明的另一目的是觀察用本發(fā)明的染料對篩選染色體、細(xì)胞和組織使用的細(xì)胞遺傳載物片的熒光染色效果。
本發(fā)明的另一目的是觀察染料的燒結(jié)性。
本發(fā)明的又一目的是查看染液中是否存在糖蛋白。
本發(fā)明的又一目的是通過用細(xì)菌和真核下頜角細(xì)胞和幼蟲進(jìn)行試驗(yàn)查看其無毒性質(zhì)。
本發(fā)明的又一目的是其在食品工業(yè)檢查細(xì)菌污染的應(yīng)用。
本發(fā)明的又一目的是觀察熒光和可見光光譜分析及其發(fā)射波長的范圍。
本發(fā)明的又一目的在于該染料可以用作熒光分子探針的非放射性標(biāo)簽。
本發(fā)明的另一目的在于染料在激發(fā)光下沒有得到快速滅弧，并且由于篩選載物片的存在沒有發(fā)生光致退色。
本發(fā)明的又一目的是觀察熒光和可見光光譜分析及其發(fā)射波長的范圍。
本發(fā)明的又一目的在于該染料可以用作熒光分子探針的非放射性標(biāo)簽。
本發(fā)明的又一目的是，雖然染料本質(zhì)上是含水蛋白液體，但是其一旦附著于細(xì)胞膜上在室溫下仍然非常穩(wěn)定。
本發(fā)明還有一個目的是，其甚至在極高或極低的溫度下熒光質(zhì)量也沒有惡化。
本發(fā)明的另一目的是制備用于分子探針的非放射標(biāo)記和復(fù)染色的組合物和試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是該化合物用于合成流式細(xì)胞計、微序列(microarrays)、免疫測定和其它分子應(yīng)用中使用的熒光染料衍生物中的工業(yè)用途。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有作為原位雜交非放射標(biāo)簽的試劑盒的熒光材料，作為分子探針。
相應(yīng)的，本發(fā)明提供了一種得自稱為海參明玉參的非生物發(fā)光的海洋生物卵巢提取物的新的無毒、細(xì)胞滲透性天然多色熒光蛋白染料。本發(fā)明也提供了提取、分離和鑒定所述蛋白染料的方法。另外，本發(fā)明也公開了所述以溶液形式存在的染料中至少四種化合物的存在。所述染料中的熒光基團(tuán)與帶負(fù)電的蛋白有關(guān)。染料的溶液中還至少存在一種糖蛋白。該糖蛋白顯示出外原凝集素類凝集性質(zhì)。測試的染料由于凝集素的存在，受精率提高并且在真核和原核活體細(xì)胞中無毒。該染料組合物將在活體細(xì)胞中或細(xì)胞間作為原位目視跟蹤中發(fā)熒光的外部熒光精微著色劑。
因此，本發(fā)明提供了一種生物活性部分提純的提取物，其中含有得自雌性性腺(亦即海洋生物明玉參的卵巢組織，存在于潮水之間、水中、淺水和深水中，通常大量存在于陰暗區(qū)域，如洞中凹處、縫隙、暗礁、突出物、巖石沙質(zhì)聚集處、具有暗色到良色有或沒有外部和橋骨骼、固著的、固定漂流物，具有各種浮游內(nèi)功率通常夜間活動的浮游生物，易于活躍地捕食，具有或沒有熒光、具有體外受精的卵和發(fā)出UVB、UVA、可見光和紅外光部分至所有發(fā)光的熒光染料)的無毒蛋白熒光染料。
經(jīng)過許多研究以后，本申請已經(jīng)鑒定出一種從海洋生物，特別是從無脊椎生物，尤其是從海參明玉參得到的新的無毒熒光蛋白染料。
亞界后生動物門棘皮動物門亞門游移棘皮動物綱海參綱亞綱盾手亞綱(Aspidochirotacea)目盾手目(Aspidochirota)科海參科屬海參屬種Scabra本發(fā)明還提供了一種得自動物卵巢的天然細(xì)胞穿透性的多色熒光蛋白染料，并且其對活體細(xì)胞是無毒的。本發(fā)明還描述了此染料的物理和化學(xué)性質(zhì)及其在直射光、高和低溫下的穩(wěn)定性。該染料在紫外和可見光譜的3個不同激發(fā)波長處有3種顏色的熒光發(fā)射。本發(fā)明也涉及在熒光顯微鏡下篩選細(xì)胞以快速檢查污物、殘余的細(xì)胞和存在或不存在凝集作用。本發(fā)明也涉及到使用本染料作為蛋白、DNA和RNA分子探針的非放射性標(biāo)記，用于先進(jìn)的分子診斷及染色體、細(xì)胞和組織的單和雙著色的外部熒光顯微鏡法，用于熒光外部雜交應(yīng)用、檢查生物污染、在水產(chǎn)養(yǎng)殖和生物醫(yī)學(xué)中用于受精能力的增強(qiáng)，作為研究活體細(xì)胞所需要的試劑盒組分、新的遙感裝置、水下探測器、救生設(shè)備及標(biāo)記墜毀飛機(jī)、救生筏和軍事裝備如火箭，還有在低于0℃溫度的條件下熒光的應(yīng)用以及許多更多的應(yīng)用。該染料環(huán)境友好，其不殺死河口和海洋生物的幼蟲。本發(fā)明描述了從海洋動物得到的熒光染料，它們吸收陽光完成生理功能或暴露于陽光下更長的時間并顯示有不同波長處的熒光進(jìn)化的機(jī)制。如浮游植物、浮游微生物和光合細(xì)菌吸收陽光以完成其光合功能，在化學(xué)途徑中使用光譜的必須波長，而額外光的發(fā)射遵循斯托克定律。
無脊椎動物沒有另外的外甲，如殼和顯著的防衛(wèi)器官，它有硬和多刺的皮膚，有由小骨形成的強(qiáng)的內(nèi)骨骼，它們是定棲的或緩慢移動，長時間暴露于直射陽光下，生活在沙中或裂縫中，可以顯現(xiàn)熒光。本發(fā)明通過提供高效和高選擇性的提取、純化和鑒定由海產(chǎn)無脊椎動物得到的染料的方法，及其在制備使用非放射性標(biāo)記的分子診斷的試劑盒、分子標(biāo)記、外部熒光顯微鏡法、光化學(xué)療法、新的土地測試設(shè)備和水下探測器的組成部分、化妝品工業(yè)、食品工業(yè)和軍隊(duì)等方面的多種用途，以克服在先技術(shù)的缺點(diǎn)。
所述的海洋無脊椎動物是棘皮動物，分類學(xué)上稱為明玉參，屬于海參綱。本發(fā)明的產(chǎn)品是一種首次報道的新的無毒多色熒光蛋白染料。在落潮時從印度西海岸中部收集動物，帶到實(shí)驗(yàn)室并保存在有海水的玻璃缸中，海水的鹽度為30-32％/par。動物為成年動物并處于性成熟期。如上所述確定分類學(xué)位置。
實(shí)際上，大多數(shù)可得到的染料實(shí)質(zhì)上是合成的。僅有6類天然染料。包括從所有活的生物體得到的染料。本發(fā)明報道的熒光染料是特征為多色熒光無毒和活細(xì)胞膜可透過物中僅有的，其從海參卵巢組織中提取。
此處所用的術(shù)語染料用于指不被還原劑退色的色素。所述的染料使纖維、纖維素等染色。它稱為天然染料，因?yàn)閬碓从谕ǔ０l(fā)現(xiàn)在自然界中沿著地球的海岸、淺水和深水分布的海洋動物，而不是合成色素。熒光染料在從高到低電子狀態(tài)的非常短時間內(nèi)的躍遷過程中，在特定波長激發(fā)從而發(fā)光。
多色熒光意味著當(dāng)在不同波長范圍內(nèi)被激發(fā)時發(fā)出不同顏色的光。它在通過紫外和可見光的不同光譜激發(fā)時，發(fā)射藍(lán)、黃綠色和橙紅色的熒光色彩。
細(xì)胞膜滲透性指的是染料通過活細(xì)胞的微孔和細(xì)胞的核膜，并根據(jù)UV、藍(lán)色和綠色波長激發(fā)使其發(fā)出青白色、黃色和橙色的陰影的多色熒光。
對活細(xì)胞無毒指的是對真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的活細(xì)胞測試時，這些細(xì)胞沒有死亡。
附著于細(xì)胞膜后染料的光穩(wěn)定性指的是用所述染料對活細(xì)胞和固定細(xì)胞染色后發(fā)出熒光的連續(xù)性。
此處使用的分子診斷指的是使用染料作為用于分子探針的非放射性標(biāo)記，用于分子細(xì)胞遺傳學(xué)中的熒光原位雜交應(yīng)用，并作為微陣列的標(biāo)記物和用于分子生物學(xué)研究中。此處的外部熒光顯微鏡法屬于對細(xì)胞遺傳標(biāo)本的載物片進(jìn)行顯微研究，通過用本發(fā)明的染料作為著色劑，并在用于已知熒光染料激發(fā)而發(fā)射特定顏色的發(fā)射光的不同立體構(gòu)型下觀察時，記錄不同顏色的熒光。
熒光染料立方晶格WUB、WB、WG是用于不同波長的Olympus EX-FLA反射光熒光附件指定的濾光器立方晶格構(gòu)型。對于各自的立方晶格通過顯微鏡其記錄為WU、WB、WG和BF，此后相同的縮寫用于整個專利中。
市場上已經(jīng)存在的各種染料的名稱以其根據(jù)Stains File染色指標(biāo)、Bitplarne產(chǎn)品和Molecular探針給出的商品名而提及。這些公司的參考已經(jīng)在先有技術(shù)中提到。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種天然無毒細(xì)胞膜可穿透的多色熒光染料的提取、部分純化以及鑒定的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了染料導(dǎo)致凝集、提高牡蠣下頜細(xì)胞授精受精率，并不殺死真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的組合物，其中包括i.從野外采集材料并保存在實(shí)驗(yàn)室條件下，ii.從棘皮動物海參明玉參的皮膚中提取色素，和iii.部分純化此染料iv.測試生物活性從海產(chǎn)的海參明玉參的卵巢組織中提取得到本發(fā)明的生物活性提取物。此提取物作為天然熒光染料并具有以下特征i.不被還原劑脫色ii.不是合成化合物iii.染料的粗提物是黃橙色的iv.部分純化的染料濾液保持相同的顏色v.染料為溶液形式vi.酒精提取物保持在4℃vii.在管燈下發(fā)出各種顏色的可見光譜viii.色素不直接溶于水ix.純色素溶于70％的乙醇x.根據(jù)其應(yīng)用可以用超高純/海水進(jìn)一步稀釋xi.帶負(fù)電荷xii.pH值為6.8-7.5xiii.沒有醌型的環(huán)xiv.性質(zhì)上是蛋白質(zhì)的xv.如HPLC數(shù)據(jù)所示，染料的溶液中含有至少一種糖蛋白xvi.染料溶液中至少存在4種化合物xvii.通過HPLC證實(shí)含有碳水化合物和蛋白質(zhì)xviii.熒光基團(tuán)與蛋白質(zhì)有關(guān)xix.熒光光譜分析顯示激發(fā)的最大波長在351nm、580nm和720nm
xx.熒光發(fā)射光譜分析顯示在450nm和550nm的兩個峰值最大發(fā)射xxi.根據(jù)其是否為單獨(dú)的燃料溶液或其附著的細(xì)胞，溶液中的染料在外部熒光顯微鏡熒光立方晶格的UV和可見區(qū)的3種不同波長發(fā)射6種不同顏色的熒光xxii.當(dāng)在超紫外線立方晶格WU-330-385nm的激發(fā)范圍激發(fā)時，在450nm-470nm范圍發(fā)出藍(lán)色熒光xxiii.當(dāng)在450-480nm激發(fā)范圍的WB立方晶格激發(fā)時，在510-570nm范圍發(fā)射黃綠色熒光xxiv.當(dāng)在510-550nm激發(fā)范圍的WG立方晶格激發(fā)時，在610-650nm范圍發(fā)射橙色熒光xxv.當(dāng)在100倍的油鏡下觀察時，在通常的外部熒光顯微鏡的透射光燈泡下，染料發(fā)射黃灰色色調(diào)xxvi.甚至在稀釋范圍為1∶20000倍時，這些染料仍發(fā)射這些熒光顏色xxvii.甚至在4℃放置至少一年后，提取物的熒光仍然存在xxviii.染料的熒光是非常光穩(wěn)定性的，并且一旦細(xì)胞被著色甚至是在室溫下長時間暴露于直射光下也不會被破壞xxix.即使是在-20℃冷凍，染料的熒光也不會改變，在此溫度下分子不可能象在從發(fā)光生物體得到的提取物中那樣獲得活化所必須的能量xxx.染料對于真核生物的活細(xì)胞是無毒的xxxi.染料對原核生物(E.coli)的活細(xì)胞也是無毒的xxxii.染料在細(xì)菌中導(dǎo)致外原凝集素類凝集xxxiii.染料在牡蠣的精液中導(dǎo)致外原凝集素類凝集xxxiv.染料在更短的周期促進(jìn)精液的授精和受精，然后控制xxxv.染料是細(xì)胞膜透過的xxxvi.染料對于死真核細(xì)胞是細(xì)胞膜透過的xxxvii.染料對于死原核細(xì)胞是細(xì)胞膜透過的xxxviii.一旦染料染色了細(xì)胞部分，其是不可降解的。
以下列步驟評價染料的物理和其它特性i.染料的結(jié)構(gòu)分析ii.無毒性測試iii.凝集試驗(yàn)iv.細(xì)胞膜選擇染色測試v.染料的可見光譜vi.染料的熒光光譜vii.在UV透照器260-280nm范圍進(jìn)行發(fā)射的物理檢查
viii.具有活牡蠣卵和精液的載物片的制備ix.活細(xì)菌載物片的制備x.用風(fēng)干法制備固定細(xì)胞載物片xi.用染料使載物片著色xii.無需加入染料對每個試驗(yàn)保持控制xiii.在熒光立方晶格WU、WB、WG和Bright范圍內(nèi)，用外部熒光顯微鏡法篩選活真核細(xì)胞載物片xiv.在熒光立方晶格WU、WB、WG和Bright范圍內(nèi)，用外部熒光顯微鏡法篩選固定真核細(xì)胞xv.在熒光立方晶格WU、WB、WG和Bright范圍內(nèi)，用外部熒光顯微鏡法篩選死真核細(xì)胞xvi.在熒光立方晶格WU、WB、WG和Bright范圍內(nèi)，用外部熒光顯微鏡法篩選活細(xì)菌細(xì)胞xvii.在熒光立方晶格WU、WB、WG和Bright范圍內(nèi)，用外部熒光顯微鏡法篩選死細(xì)菌細(xì)胞xviii.在熒光立方晶格WU、WB、WG和Bright范圍內(nèi)，不使用染料用外部熒光顯微鏡法篩選活控制單元xix.在沒有任何細(xì)胞的載物片區(qū)域內(nèi)對發(fā)射的熒光進(jìn)行顯微照相xx.在熒光立方晶格WU、WB、WG和Bright范圍內(nèi)對細(xì)胞生成載物片發(fā)射的熒光進(jìn)行顯微照相，和xxi.使用染料檢查發(fā)射的熒光色彩的波長范圍和熒光染料立方晶格的激發(fā)范圍的波長范圍xxii.使用染料著色的細(xì)胞檢查發(fā)射的熒光色彩的波長范圍和熒光染料立方晶格的激發(fā)范圍的波長范圍xxiii.檢查質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、核膜、核質(zhì)和染色體的細(xì)胞膜滲透性因此本發(fā)明提供來源于海產(chǎn)動物的天然熒光染料，當(dāng)用外部熒光顯微鏡的紫外和可見光譜立方晶格的3種不同范圍的波長激發(fā)時，它發(fā)射藍(lán)、黃和橙紅6種不同顏色的熒光。染液的發(fā)射范圍和用該染料著色的細(xì)胞的發(fā)射范圍不同。本發(fā)明還涉及此染料作為外部熒光顯微鏡法的著色劑，在原核和真核活、固定和死細(xì)胞制劑的外部熒光顯微鏡法。染料可以用于制備非放射性標(biāo)記試劑盒，在各種分子、生物醫(yī)學(xué)和工程科學(xué)中通過熒光原位雜交用于分子診斷。
在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，染料的來源是無脊椎海產(chǎn)動物，屬于后生動物亞界、棘皮動物門、Eleutherozoa亞門，海參綱，名稱為明玉參。
在另一實(shí)施例中，明玉參選自海參并廣泛分布于全世界特別是印度洋太平洋的海濱、淺水、深水域。已知與海參有最接近的親緣關(guān)系的是海膽和海星。
在另一實(shí)施例中，明玉參被解剖，分離其卵巢并稱重。向1克(濕重)卵巢組織中加入3ml 70％的酒精。
在另一實(shí)施方案中，提取物通過Whattman No.1濾紙過濾。
在另一實(shí)施方案中，具有螺旋蓋的管形瓶儲存被稱為“染液”的染料溶液，并且于4℃在低溫室中儲存直到進(jìn)一步應(yīng)用。
在另一實(shí)施方案中，染液的顏色用肉眼和管燈記錄。
在另一實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)染液可溶于70％的乙醇。為了試驗(yàn)可以在水中進(jìn)一步稀釋。
在另一實(shí)施方案中，記錄了染料室溫下在溶液中和在著色細(xì)胞上的耐光性。顯示其一旦附著在細(xì)胞膜上該染料是不可降解的。
在另一實(shí)施方案中，通過電泳進(jìn)行了該染料的電荷測試。觀察到黃色斑點(diǎn)到正極接線柱的漂流。這表明含有有色化合物的染料是帶負(fù)電荷的。
在另一實(shí)施方案中，顏料為使濾紙產(chǎn)生顏色的染料。在另一個實(shí)施方案中該染料pH為6.8-7.5。
在另一實(shí)施方案中，取1ml該乙醇卵巢提取物的染液并加入0.2克二硫代丁四醇。該溶液沒有脫色。這表明該熒光化合物的顏色部分是不可還原的，其中不存在任何可還原的環(huán)狀醌。這個試驗(yàn)的結(jié)果表明該有色化合物為不可還原染料。
在另一實(shí)施方案中，5ml提取物在100℃的水浴中加熱。觀察到了凝聚。這證實(shí)了該染料的酒精提取物中蛋白質(zhì)的存在。
在另一實(shí)施方案中，染色部分通過凝聚和僅僅在非極性溶劑的醚中解聚而與蛋白質(zhì)分離。當(dāng)進(jìn)行紙上電泳時，該染色溶液不向任一電極移動。這表明該熒光染料的非極性特性。
在另一實(shí)施方案中，該染料通過使用4ml硫酸和蒽酮測糖試劑進(jìn)行蒽酮測試(Ref)。1ml水、4ml濃硫酸和蒽酮測糖試劑作為空白組。5分鐘后空白組為輕微綠色，然而5分鐘后該提取物變成鮮綠色。該試驗(yàn)證明染液中存在碳水化合物。
在另一實(shí)施方案中，使用硅膠-G板對所述染料(5微升)進(jìn)行薄層色層分析。使用的溶劑為2∶2∶1的正丁醇、乙酸和水。TLC后，硅膠-G板在容器中用碘蒸汽染色。發(fā)現(xiàn)4個斑點(diǎn)。該試驗(yàn)表明粗提物中至少含有4種不同的化合物。斑點(diǎn)及其各自的Rf值如表1所示。
在另一實(shí)施方案中，純化合物的熒光特性通過熒光分光光度法觀察。該化合物(凝膠過濾后凍干)溶于水(濃度為0.001克/毫升)并進(jìn)行熒光分光光度法。其首先進(jìn)行激發(fā)掃描，然后在351nm、580nm和720nm發(fā)現(xiàn)該化合物被激發(fā)。
在另一實(shí)施方案中，所述染料然后進(jìn)行熒光發(fā)射分光光度分析。當(dāng)在351nm激發(fā)時，發(fā)射處于400-600。在450nm和550nm波長發(fā)射有兩個峰值。(圖2和3)。
在另一實(shí)施方案中，進(jìn)行HPLC分析以檢測蛋白質(zhì)和碳水化合物的存在。
在另一實(shí)施方案中，通過等濃度模式的反向HPLC用80％乙酰和20％水在C18反向柱中進(jìn)行染液的HPLC。
在另一實(shí)施方案中，UV檢測器在280nm和205nm的波長檢測到蛋白質(zhì)的存在。圖17和表2顯示出通過在280nm的UV檢測器蛋白質(zhì)存在的結(jié)果?？梢钥闯?種蛋白質(zhì)的停留時間在2.1-8.8分鐘之間變化。覆蓋的面積為535-116103之間。峰1的最大百分?jǐn)?shù)面積具有2.1分鐘的保留時間。由此可見樣品中蛋白質(zhì)在峰1的量最多。
在另一實(shí)施方案中，UV檢測器在205nm的波長檢測到縮氨酸的存在。圖18和表3通過UV檢測器在205nm顯示出10種縮氨酸的存在。停留時間在2.1-14.8分鐘之間變化。覆蓋的面積為63482-3218965。并且縮氨酸在峰3的最大百分?jǐn)?shù)面積具有3.9分鐘的停留時間。
在另一實(shí)施方案中，折光檢測器檢測到碳水化合物的存在。使用的標(biāo)準(zhǔn)為葡萄糖、蔗糖和果糖。結(jié)果如圖19、22和表4所示。
在另一實(shí)施方案中，根據(jù)HPLC數(shù)據(jù)分析和電泳表明了熒光基團(tuán)與蛋白質(zhì)的結(jié)合。由于熒光基團(tuán)是非極性的，在乙醇的卵巢提取物中看來好像可以與帶負(fù)電的組分結(jié)合。因?yàn)槠湓陔娪镜臅r候向正極移動。并且如表1、2、3和4的HPLC數(shù)據(jù)所示，僅僅檢測出蛋白質(zhì)和碳水化合物。其要求染色熒光fluoropore與某些帶負(fù)電的蛋白質(zhì)相結(jié)合?？梢哉f，染液的熒光活性應(yīng)歸于含有附著于帶負(fù)電蛋白質(zhì)上的非極性熒光基團(tuán)的組分，當(dāng)該蛋白質(zhì)凝聚時，該熒光基團(tuán)容易分離。
在另一實(shí)施方案中，進(jìn)行凝聚測試以證實(shí)糖蛋白的存在。由于提取物中至少一種糖蛋白指標(biāo)的存在，由于凝集的存在進(jìn)行生物測定。
在另一實(shí)施方案中，染料的凝集生物活性測試通過進(jìn)行兩組試驗(yàn)在革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸桿菌)進(jìn)行。在試驗(yàn)1中，50微升所述染料加入到100ml的Muller Hilton′s培養(yǎng)基流體(culture broth)中。產(chǎn)生沒有海產(chǎn)動物提取物的空白組。0.1ml的新鮮大腸桿菌inauculum加入到該培養(yǎng)基流體中。培養(yǎng)基流體在自轉(zhuǎn)為150rpm的定軌振蕩器中孵化。8小時后在兩個培養(yǎng)基流體中都發(fā)現(xiàn)混濁。然而含有提取物(染液)的培養(yǎng)基流體顯示出叢生生長。細(xì)胞形成凝集。沒有染料的正向空白組顯示出正常生長。
在另一實(shí)施方案，在第二組試驗(yàn)中，一圈活大腸桿菌載玻片上的25微升水中并混合。再向其中加入2微升(2μl)染液。通過將載物片放置在臺階上30秒使酒精揮發(fā)。然后一個蓋片放于細(xì)菌制劑上并密封。同樣制備沒有任何染料的對照細(xì)菌制劑。
在另一實(shí)施方案中，兩個載物片在外部熒光顯微鏡(100倍物鏡，10倍目鏡)的油浸物鏡下篩選，以檢查凝集生物活性和熒光。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用染料處理的載物片上的細(xì)菌形成叢生，然而對照組中沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象。這證明該染料具有引起凝集的生物活性。還注意到細(xì)菌以特定的叢生形狀凝集。叢生中的細(xì)菌自始至終都是活的。它們僅僅在載物片變干時死亡(圖4和5)。
在另一實(shí)施方案中，在染液的存在下細(xì)胞形成凝聚的趨向表明其中含有外原凝集素類糖蛋白。這也進(jìn)一步支持了我們關(guān)于HPLC數(shù)據(jù)的解釋，亦即海參卵巢粗提物中至少存在一種糖蛋白。
在另一實(shí)施方案中，對真核生物精液進(jìn)行的凝集試驗(yàn)。1毫升牡蠣精液溶液置于用于浮游植物計數(shù)的sedgewick計數(shù)器的空腔中。加入5微升(5μl)酒精提取物。載物片在40倍物鏡和10倍目鏡的顯微鏡下篩選?？梢钥闯鼍盒纬杉象w、粘附并形成叢生。沒有聚集的特定形式。這種特性在對照實(shí)驗(yàn)中沒有出現(xiàn)。
在另一實(shí)施方案中，顯現(xiàn)了牡蠣精液和卵的授精和受精率的增加。牡蠣的優(yōu)質(zhì)精液和卵以10∶1的固定比率加入到用于浮游植物計數(shù)的sedgewick計數(shù)器的空腔中。加入5微升(5μl)酒精提取物。然后載物片立即在顯微鏡下篩選并觀察黏附到卵膜、受精和不受精卵的精液。進(jìn)行沒有提取物的對照組。圖6顯示出幾秒內(nèi)和以綠色激發(fā)濾光器(WG)觀察到的極體擠出。
在另一實(shí)施方案中，產(chǎn)生了在測試組和對照組之間授精和受精率之間的百分比差異?？梢钥闯?0秒后，處理的細(xì)胞有80％的卵受精，然而在對照組中僅僅有40％的細(xì)胞受精。我們注意到大量的精液黏著到卵膜。在我們的早期試驗(yàn)中我們注意到，這些卵受精作用通常的實(shí)際時間約為10-15分鐘。第一個極體的形成發(fā)生在增加染料的1分鐘之內(nèi)(圖6)。當(dāng)前的染液看來具有一些因素，其促進(jìn)精液通過卵膜的授精，并最終在更短的時間間隔內(nèi)增加受精率。
在另一實(shí)施方案中，進(jìn)行了染料對真核細(xì)胞村活的無毒測試。
染料測試了對牡蠣精液的細(xì)胞毒性。試驗(yàn)中精液的存活率被認(rèn)為顯示無毒的參數(shù)。牡蠣的雄性生殖腺被除去并且精液釋放在100％的海水中。
其通過muscline布過濾以除去所有有機(jī)物殘?jiān)?。?毫升(ml)精液溶液并加入不同濃度(1μl、2μl、3μl、4μl和5μl)的染液。每半小時通過顯微鏡觀測精液的存活率。試驗(yàn)進(jìn)行24小時。不加入染料進(jìn)行對照組。發(fā)現(xiàn)加入染料對精液的存活率沒有任何影響。這表明該染料無毒特性。
在另一實(shí)施方案中，通過原核生物的存活率進(jìn)行染料的無毒測試。通過觀察其存活率或者死亡量測試了提取物對革蘭氏陰性大腸桿菌的細(xì)胞毒性。一滴水(25μl)中的活大腸桿菌置于載玻片上。向其加入2μl酒精提出物。暫時封閉該載物片以防止蒸發(fā)。在顯微鏡下晝夜觀察到直到，細(xì)菌保持在溶液中能存活24小時。如果溶液蒸干，它們死亡。進(jìn)行對照試驗(yàn)。證明染料對原核生物也是無毒的。
申請人研究了染料的性質(zhì)并發(fā)現(xiàn)在不同激發(fā)波長產(chǎn)生多種顏色的發(fā)射，它能夠與已進(jìn)入市場的熒光染料顯微著色劑相比。本染料的藍(lán)色熒光可以與DAPI熒光染料在同樣激發(fā)波長發(fā)射的同樣顏色相比，后者作為生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記試劑盒的組分。
本染料在可見范圍的黃色熒光可以與FITC的同樣顏色的發(fā)射相比，后者作為生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑的組分。
橙色熒光發(fā)射可以與碘化甲錠(Propidium Iodide)熒光染料的橙色熒光色相比，后者可以用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和探測試劑盒的組分。橙色發(fā)光的發(fā)射能夠與TRITC熒光染料的橙色熒光顏色相比，后者作為生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和探測試劑盒的組分。該染料在室溫是穩(wěn)定的，并有長的擱置壽命。本染料的分子和放射性試劑盒可以在室溫下出口。該染料有至少123種市場已有的不同熒光染料的特性，這些市售(位面產(chǎn)品)熒光染料確切地DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、吖啶橙、金胺、若丹明、TRITC和碘化甲錠。染料在顯微鏡的通常光下，灰色的色彩產(chǎn)生相差效果，這對快速篩選細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)和組織化學(xué)載物片是有用的，并可以節(jié)省額外的補(bǔ)充顯微鏡相位差的成分的費(fèi)用。熒光顏色的發(fā)射服從熒光的斯托克定律。
在另一實(shí)施方案中，用此染料的1∶20000的稀釋液作為著色劑進(jìn)行外部熒光顯微鏡法研究，并記錄用不同立方晶格激發(fā)時光的發(fā)射，并與已知熒光染料比較顏色色調(diào)(圖7-10)。
在另一實(shí)施方案中，載物片的篩選使用Olympus顯微鏡BX-60的olympusbx-FLA反射熒光附加器在WU、WB、WG和BF熒光染料立方晶格使用紫外線和可見光進(jìn)行。
在另一實(shí)施方案中，WU立方晶格的波長范圍是330nm-385nm。
在另一實(shí)施方案中，WB立方晶格的波長范圍是450nm-480nm。
在另一實(shí)施方案中，WG立方晶格的波長范圍是510nm-550nm。
在另一實(shí)施方案中，BF用于亮視野，其中普通的鎢燈泡發(fā)光。
在另一實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)了染料在不同激發(fā)范圍的發(fā)射范圍。外部熒光顯微鏡法中卵的背景顯示了染料的發(fā)色。
在另一實(shí)施方案中，WU 330nm-385nm范圍的激光發(fā)射的熒光在450nm-470nm范圍。
在另一實(shí)施方案中，用光譜范圍為450nm-480nm的WB濾光器激發(fā)發(fā)射的熒光在510nm-570nm范圍。
在另一實(shí)施方案中，用光譜范圍為510nm-550nm的WG濾光器激發(fā)發(fā)射的熒光在610nm-650nm范圍。
在另一個使用BF的實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)黃灰色半點(diǎn)斑點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)染料對細(xì)胞膜染色后不同激發(fā)范圍的發(fā)射范圍。
在另一實(shí)施方案中，染料用作牡蠣死、活和固定卵的熒光性微小著色劑。載物片在外部熒光顯微鏡下篩選。我們注意到死細(xì)胞沒有接受染料并且沒有顯示熒光(圖11和12)。
在另一實(shí)施方案中，染料用作牡蠣活卵的熒光性微小著色劑。載物片在外部熒光顯微鏡下篩選。我們注意到活細(xì)胞顯示熒光。激發(fā)光譜范圍和放射熒光嚴(yán)格地遵循斯托克定律。這些范圍與表示熒光細(xì)胞背景的染料發(fā)射范圍不同(圖4-16)。
在另一實(shí)施方案中，染料在3∶1的乙醇和乙酸固定劑中用作牡蠣固定卵的熒光性微小著色劑。載物片在外部熒光顯微鏡下篩選。我們注意到固定細(xì)胞顯示熒光。激發(fā)光譜范圍和放射熒光嚴(yán)格地遵循斯托克定律。這些范圍與表示熒光細(xì)胞背景的染料發(fā)射范圍不同(圖4a-16a)。
在另一實(shí)施方案中，用WU 330nm-385nm范圍激發(fā)，在細(xì)胞中以470nm-500nm范圍發(fā)射熒光。
在另一實(shí)施方案中，用光譜范圍為450nm-480nm的WB濾光器激發(fā)，發(fā)射的熒光在570nm-610nm范圍。
在另一實(shí)施方案中，用光譜范圍為510nm-550nm的WG濾光器激發(fā)，發(fā)射的熒光在610nm-650nm范圍。
在另一個實(shí)施方案中，以可見光的整個白光范圍并根據(jù)細(xì)胞組分的密度，在亮視野發(fā)射光外部熒光顯微鏡法微小篩選死卵，產(chǎn)生淡黃灰色類相差效果的色彩。
在另一個實(shí)施方案中，以可見光的整個白光范圍并根據(jù)細(xì)胞組分的密度，在亮視野發(fā)射光外部熒光顯微鏡法微小篩選活卵，產(chǎn)生淡黃灰色類相差效果的色彩。
在另一個實(shí)施方案中，以可見光的整個白光范圍并根據(jù)細(xì)胞組分的密度，在亮視野發(fā)射光外部熒光顯微鏡法微小篩選固定卵(3∶1的乙醇∶乙酸固定液)，產(chǎn)生淡黃灰色類相差效果的色彩。
在另一個實(shí)施方案中，染料用作大腸桿菌的顯微著色劑。一圈活大腸桿菌載玻片上的25微升水中并混合。再向其中加入2微升(2μl)染液。通過將載物片放置在臺階上10-15秒使提取物中的酒精揮發(fā)。然后一個蓋片放于水中的細(xì)菌懸浮液上并密封。同樣制備沒有任何染料的對照細(xì)菌制劑。
在另一個實(shí)施方案中，兩個載物片在外部熒光顯微鏡(100倍物鏡，10倍目鏡)的油浸物鏡下篩選，以檢查熒光。我們注意到死細(xì)胞沒有吸收染料并且沒有顯示熒光(圖11-12)。
在另一個實(shí)施方案中活細(xì)菌細(xì)胞顯示熒光(圖4-5)。激發(fā)光譜范圍和發(fā)射熒光波長嚴(yán)格地遵循斯托克定律。這與染液不同，給出如下在另一個實(shí)施方案中，以WU 330nm-385nm范圍激發(fā)，在470nm-500nm范圍發(fā)出熒光。
在另一個實(shí)施方案中，以波長范圍為450nm-480nm的WB濾光器激發(fā)，在570nm-610nm范圍發(fā)出熒光。
在另一個實(shí)施方案中，以波長范圍為510nm-550nm的WG濾光器激發(fā)，在610nm-650nm范圍發(fā)出熒光。
在另一個實(shí)施方案中，沒有任何染料的對照大腸桿菌也沒有顯示熒光。
在另一個實(shí)施方案中，對具有用于外部熒光顯微鏡法著色劑染料的載物片進(jìn)行縮微照相。
在另一個實(shí)施方案中，用曝光時間變化為50-60秒的400ASA速柯達(dá)膠片，在WU330nm-385nm范圍內(nèi)，在具有細(xì)胞的載物片區(qū)域和僅僅表現(xiàn)染料發(fā)色的圍繞背景區(qū)域進(jìn)行發(fā)射熒光的顯微照相。
在另一個實(shí)施方案中，用曝光時間變化為50-60秒的400ASA速柯達(dá)膠片，在WB 450nm-480nm范圍內(nèi)，在具有細(xì)胞的載物片區(qū)域和僅僅表現(xiàn)染料發(fā)色的圍繞背景區(qū)域進(jìn)行發(fā)射熒光的顯微照相。
在另一個實(shí)施方案中，用曝光時間變化為50-60秒的400ASA速柯達(dá)膠片，在WB 510nm-550nm范圍內(nèi)，在具有細(xì)胞的載物片區(qū)域和僅僅表現(xiàn)染料發(fā)色的圍繞背景區(qū)域進(jìn)行發(fā)射熒光的顯微照相。
在另一個實(shí)施方案中，用曝光時間變化為50-60秒的400ASA速柯達(dá)膠片，在亮視野，在具有細(xì)胞的載物片區(qū)域和僅僅表現(xiàn)染料發(fā)色的圍繞背景區(qū)域進(jìn)行發(fā)射熒光的顯微照相。
在另一個實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)了染料在細(xì)胞膜的透過。牡蠣的未受精、受精卵和幼體用染料染色，卵懸浮比為1∶50微升，并且在熒光顯微鏡下篩選(圖7-10，7a-10a；14-16，14a-16a)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜、核膜和染色質(zhì)中的熒光是顯著的。雖然發(fā)射的波長范圍相同并且顏色為相同色調(diào)的彩色，在細(xì)胞的這些部分之間存在顯著的界限(圖7-10，7a-10a)。這證明染料能夠透過卵質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、核膜、核質(zhì)和染色質(zhì)的活細(xì)胞和固定細(xì)胞膜。
在另一個實(shí)施方案中，死細(xì)胞中細(xì)胞部分不存在熒光表明染料沒有穿透死細(xì)胞的膜(圖11-12，11a-12a)。
不同的著色劑用于熒光顯微鏡的不同的激發(fā)立方晶格。例如在330nm-385nm激發(fā)立方晶格的激發(fā)下看DAPI(DNA染色，發(fā)射藍(lán)色)、熒光-dUTP、Hoechest 33258、33342；在用450nm-480nm激發(fā)立方晶格時看FITC、吖啶橙(用于DNA、RNA發(fā)色綠色/黃色色彩)、金胺；在用510nm-550nm激發(fā)立方晶格時看若丹明、TRITC和碘化甲錠(DNA、發(fā)射橙色色彩)。
在一個篩選細(xì)胞載物片的外部熒光顯微法的實(shí)施方案中，篩選是在載物片上滴一滴稀釋的提取物，用光譜范圍為330nm-385nm波長的WU濾光器激發(fā)。
在一個篩選細(xì)胞載物片的外部熒光顯微法的實(shí)施方案中，篩選是在載物片上滴一滴稀釋的提取物，用光譜范圍為450nm-480nm波長的WB濾光器激發(fā)。
在一個篩選細(xì)胞載物片的外部熒光顯微法的實(shí)施方案中，篩選是在載物片上滴一滴稀釋的提取物，用光譜范圍為510nm-550nm波長的WG濾光器激發(fā)。
在另一個篩選細(xì)胞載物片的外部熒光顯微法的實(shí)施方案中，使用此染料，在亮視野物鏡下通過透射光觀察。
在另一個篩選此染料著色的細(xì)胞載物片的外部熒光顯微法的實(shí)施方案中，觀察各自的激發(fā)所發(fā)射的熒光顏色的色彩。
在另一個實(shí)施方案中，WU 330nm-385nm范圍的激光發(fā)射的熒光在470nm-500nm范圍。
在另一個實(shí)施方案中，用光譜范圍為450nm-480nm的WB濾光器激發(fā)發(fā)射的熒光在570nm-610nm范圍。
在另一個實(shí)施方案中，用光譜范圍為510nm-550nm的WG濾光器激發(fā)發(fā)射的熒光在610nm-650nm范圍。
在另一個在亮視野下篩選細(xì)胞載物片的外部熒光顯微鏡法的實(shí)施方案中，使用透射光，這種透射光根據(jù)細(xì)胞成分的密度所發(fā)射的光在可見光譜的整個白光范圍內(nèi)，從而產(chǎn)生相差結(jié)果。
在本發(fā)明的另一方面，在70％的乙醇中制備1∶400000倍及以上稀釋的染料，并作為著色劑，在外部熒光顯微鏡法的紫外和可見區(qū)域發(fā)生有色的熒光發(fā)射。
在另一個實(shí)施方案中，染料在70％的乙醇中以1∶9000倍稀釋，然后在水中以1∶50倍稀釋，其意味著總共稀釋1∶450000倍，這使熒光在三種不同的波長產(chǎn)生三色的熒光。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生物活性組合物，其含有得自海參明玉參的提取物，在超純水中的比例為1∶40000倍得到的提取物，從而得到在3個不同波長產(chǎn)生三色熒光，和在透射光下的相差效果。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用于制備涂料組合物和墨水。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用于泄漏的檢測。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用于水下探測器。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用于分子診斷中所用的原位雜交試劑盒中的熒光探針。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用于免測熒光檢測。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用于DIG-標(biāo)記的低聚核苷酸探針和抗DIG Fab-片斷的復(fù)染劑。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，在流動血細(xì)胞計數(shù)中用于單一和多細(xì)胞熒光定量。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用作外部熒光顯微鏡法的熒光著色劑。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用于在健康食品工業(yè)、化妝品工業(yè)、藥物和化學(xué)工業(yè)中快速檢查生物污染。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用于快速估計實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)下的生物污染物。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用于快速測定田間條件下的生物污染物。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用于細(xì)菌引發(fā)的試劑盒。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有從海參明玉參中得到的生物活性提取物以及常規(guī)的添加劑，用作天然著色劑。
表格說明表1由薄層色層分析法(TLC)檢測得到的染料四個部分遷移距離和Rf值的表列數(shù)據(jù)。
表2由UV檢測器在280nm顯示染料中蛋白質(zhì)的存在的分析模式HPLC數(shù)據(jù)。按照色譜(圖17)蛋白質(zhì)的停留時間、面積和面積百分?jǐn)?shù)如表所示。
表3由UV檢測器在205nm顯示染料中縮氨酸的存在的分析模式HPLC數(shù)據(jù)。按照色譜(圖18)縮氨酸的停留時間、面積和面積百分?jǐn)?shù)如表所示。
表4通過折光檢測器顯示染料中碳水化合物的存在的表格。給出了樣品碳水化合物的停留時間和標(biāo)準(zhǔn)。
表5當(dāng)以具有染液的Olympus外部熒光顯微鏡的不同波長熒光濾光器立方晶格激發(fā)，并且當(dāng)附著于原核細(xì)胞的細(xì)胞膜時，熒光染料不同顏色熒光的發(fā)射。
表6當(dāng)以具有染液的Olympus外部熒光顯微鏡的不同波長熒光濾光器立方晶格激發(fā)，并且當(dāng)附著于真核細(xì)胞的細(xì)胞膜時，熒光染料不同顏色熒光的發(fā)射。
表7本申請與申請人早期提交的待審的美國專利申請US09/820,654各種特征的比較表格。


圖1多色熒光染料提取、純化和表征的流程圖。
圖2熒光分光光度法顯示激發(fā)波長在351nm、580nm、720nm發(fā)現(xiàn)最大值。
圖3熒光分光光度法顯示發(fā)射波長在400-600發(fā)現(xiàn)。
圖4當(dāng)染料以具有450-480nm激發(fā)范圍的olympus BX-60顯微鏡的WB濾光器立方晶格激發(fā)時，染料綠色熒光發(fā)射和細(xì)菌細(xì)胞(其中附著有染料(箭頭))黃色發(fā)射的外部熒光顯微鏡法結(jié)果的黑和白圖形。也觀察到了染料在細(xì)菌上使其叢生的凝集特性。
圖4a圖4的有色照片。
圖5當(dāng)染料以具有510-550nm激發(fā)范圍的olympus BX-60顯微鏡的WG濾光器立方晶格激發(fā)時，染料暗紅色熒光發(fā)射和細(xì)菌細(xì)胞(其中附著有染料(箭頭))橙色發(fā)射的外部熒光顯微鏡法結(jié)果的黑和白圖形。也觀察到了染料在細(xì)菌上使其叢生的凝集特性。
圖5a圖5的有色照片。
圖6當(dāng)染料以具有510-550nm激發(fā)范圍的olympus BX-60顯微鏡的WG濾光器立方晶格激發(fā)時，染料暗紅色熒光發(fā)射和牡蠣卵細(xì)胞(其中附著有染料)橙色發(fā)射的外部熒光顯微鏡法結(jié)果的黑和白圖形。箭頭表示極體擠出。
圖6a圖6的有色照片。
圖7當(dāng)染料以具有450-480nm激發(fā)范圍的olympus BX-60顯微鏡的WB濾光器立方晶格激發(fā)時，染料綠色熒光發(fā)射和活卵細(xì)胞(其中染料已經(jīng)滲透(箭頭))黃色發(fā)射的外部熒光顯微鏡法結(jié)果的黑和白圖形。染料的細(xì)胞滲透特性顯示染色的卵膜和核膜以及細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)。
圖7a圖7的有色照片。也觀察到精核的染色質(zhì)。
圖8當(dāng)染料以具有330-385nm激發(fā)范圍的olympus BX-60顯微鏡的WU濾光器立方晶格激發(fā)時，染料暗藍(lán)綠色熒光發(fā)射和活卵細(xì)胞(其中染料已經(jīng)滲透(箭頭))藍(lán)色發(fā)射的外部熒光顯微鏡法結(jié)果的黑和白圖形。染料的細(xì)胞滲透特性顯示染色的卵膜和核膜以及細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)。
圖8a圖7的有色照片。也觀察到精核的染色質(zhì)。
圖9當(dāng)染料以具有510-550nm激發(fā)范圍的olympus BX-60顯微鏡的WG濾光器立方晶格激發(fā)時，染料暗紅色熒光發(fā)射和牡蠣卵細(xì)胞(其中染料已經(jīng)附著)橙色發(fā)射的外部熒光顯微鏡法結(jié)果的黑和白圖形。
圖9a圖6的有色照片。
圖10在亮視野下染料熒光發(fā)射的外部熒光顯微鏡法結(jié)果的黑和白圖形。
圖10a圖10的有色照片。
圖11當(dāng)以BX-60 Olympus顯微鏡的WG濾光器激發(fā)時死牡蠣卵細(xì)胞表明沒有熒光。
圖11a圖11的有色照片。
圖12當(dāng)以BX-60 Olympus顯微鏡的亮視野激發(fā)時死牡蠣卵細(xì)胞表明沒有熒光。
圖12a圖12的有色照片。
圖13當(dāng)染料以具有510-550nm激發(fā)范圍的olympus BX-60顯微鏡的WG濾光器立方晶格激發(fā)時，染料暗紅色熒光發(fā)射和大腸桿菌的無熒光性的外部熒光顯微鏡法結(jié)果的黑和白圖形。
圖13a圖13的有色照片。
圖14當(dāng)染料以具有330-385nm激發(fā)范圍的olympus BX-60顯微鏡的WU濾光器立方晶格激發(fā)時，染料暗藍(lán)綠色熒光發(fā)射和活牡蠣胚胎細(xì)胞(其中染料已經(jīng)滲透(箭頭))的藍(lán)色發(fā)射的外部熒光顯微鏡法結(jié)果的黑和白圖形。染料的細(xì)胞滲透特性顯示染色的卵膜、極體細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)和染色質(zhì)。
圖14a圖14的有色照片。也觀察到原子核內(nèi)部的染色質(zhì)。
圖15當(dāng)染料以具有450-480nm激發(fā)范圍的olympus BX-60顯微鏡的WB濾光器立方晶格激發(fā)時，染料暗藍(lán)綠色熒光發(fā)射和活牡蠣胚胎細(xì)胞(其中染料已經(jīng)滲透(箭頭))的藍(lán)色發(fā)射的外部熒光顯微鏡法結(jié)果的黑和白圖形。染料的細(xì)胞滲透特性顯示染色的卵膜、極體細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)和染色質(zhì)。
圖15a圖15的有色照片。也觀察到極體內(nèi)部的染色質(zhì)。
圖16當(dāng)染料以具有510-550nm激發(fā)范圍的olympus BX-60顯微鏡的WG濾光器立方晶格激發(fā)時，染料暗橙色熒光發(fā)射和活牡蠣胚胎細(xì)胞(其中染料已經(jīng)滲透(箭頭))的亮橙色發(fā)射的外部熒光顯微鏡法結(jié)果的黑和白圖形。染料的細(xì)胞滲透特性顯示染色的卵膜、極體細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)和染色質(zhì)。
圖16a圖16的有色照片。也觀察到極體內(nèi)部的染色質(zhì)。
圖17染料在280nm UV檢測器得到的色譜圖。
圖18染料在205nm UV檢測器得到的色譜圖。
圖19蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。
圖20葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。
圖21果糖的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。
圖22在折光檢測器中顯示染料中存在碳水化合物的色譜圖。
本發(fā)明涉及提取、部分純化和鑒定一種新的色素的方法，該色素是世界上沿著印度和印度洋-太平洋區(qū)域的中西海岸分布的棘皮動物(海參綱∶明玉參)得到的天然無毒熒光蛋白染料。
本發(fā)明還提供了從動物的卵巢組織得到的一種新的熒光蛋白染料，通過在-4℃存儲在70％的乙醇的條件下，可以從同一個樣品中重復(fù)提取3-4次，因而避免了對自然資源的過渡開采。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，此染料在紫外和可見光譜范圍的3個不同的激發(fā)波長下，有6種不同顏色的熒光發(fā)射，等同于當(dāng)前用于多色熒光檢測的6種不同的熒光染料(DAPI、FITC和PI)和pycobiliproteins和若丹明產(chǎn)生的發(fā)射。該染料覆蓋當(dāng)前市售的用于熒光顯微探針的約123種熒光染料發(fā)射光譜的波長。著色的細(xì)胞在相同的激發(fā)顯示不同顏色的發(fā)射，但是嚴(yán)格遵守斯托克定律。這樣，在olympus BX 60顯微鏡濾光器相同的激發(fā)下該染料總共發(fā)射6種顏色。該染料對活大腸桿菌和真核細(xì)胞是無毒的。該染料滲入各種細(xì)胞組分膜并將其熒光染色。一旦其通過著色附著于細(xì)胞膜，該染料是不可降解的。
該染料是熒光蛋白，其具有附著于蛋白質(zhì)的熒光基團(tuán)。
該染料具有凝集特性，由于其在活有機(jī)體的篩選作用，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖和組織培養(yǎng)中可用于人工授精和受精。
凝集的細(xì)胞保持熒光性，因而該染料可被用于活細(xì)胞功能研究。
因而，該染料可以在商業(yè)上作為外部熒光顯微鏡法的天然無毒細(xì)胞滲透的多色熒光蛋白染料，按簡單程序用于染色體、細(xì)胞和組織的單重、雙重和三重染色。
本發(fā)明也涉及染料在非放射性標(biāo)記蛋白、DNA和RNA探針方面的用途，用于分子生物學(xué)的熒光原位雜交應(yīng)用中。
因此在用途的優(yōu)選方式中，該染料可以是分子標(biāo)記和檢測試劑盒的一種組分，它們多數(shù)是進(jìn)口的并且售價很高。
曾廣泛探尋這些標(biāo)記試劑盒，用于采用快速分子細(xì)胞遺傳和微觀分析技術(shù)的分子診斷中。
然而，該染料的另一優(yōu)勢是即使在非常稀(1∶200000-400000)或更濃的溶液中其熒光也是可見的。
染料的這種特性以及無毒環(huán)境友好特性可以用于救生設(shè)備中作為救生夾克的一個組分，和標(biāo)記墜毀的飛機(jī)、救生筏和軍事裝備如火箭的位置，還可以用于工業(yè)泄漏檢查。
本發(fā)明對于單和多細(xì)胞所用的流動血細(xì)胞計數(shù)器的熒光定量測定將是有用的。
本發(fā)明在快速測定自然和控制環(huán)境中，例如組織培養(yǎng)物中、污染物中，以及衛(wèi)生、食品和化妝品工業(yè)的工業(yè)污染物中的生物污染方面具有優(yōu)勢。
在另一用途的優(yōu)選方式中，經(jīng)用熒光顯微鏡分析法檢查，一旦細(xì)胞被染色該染料在室溫具有長的擱置壽命。
本熒光染料的另一用途是作為新的遠(yuǎn)程測向裝置和水下探測器的組成部分，其中要求了以光波長靈敏度為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)。
具體實(shí)施例方式
用以下實(shí)施例說明本發(fā)明，但在任何方式上不能理解為是對本發(fā)明范圍的限制。
以下公開了提取、部分純化、鑒定染料的方法，和用分光鏡分析法和外部熒光顯微鏡法檢查染料的無毒性、細(xì)胞滲透性、凝集和多色熒光特性而進(jìn)行的試驗(yàn)的細(xì)節(jié)。
實(shí)施例1采集原料本專利中的材料是海參，并具有下列分類學(xué)細(xì)節(jié)亞界后生動物門棘皮動物門亞門游移棘皮動物綱海參綱亞綱盾手亞綱(Aspidochirotacea)目盾手目(Aspidochirota)屬海參屬種Scabra材料采集自落潮時的印度中西海岸。將其帶到實(shí)驗(yàn)室并在使用前放在裝有鹽度為30-32/par(30‰)海水的玻璃缸中。
實(shí)施例2從雌性生殖腺中分離染料動物首先用自來水洗，然后用超純水洗。用快剪切開動物體，并且分揀雄/雌動物。找出雌性生殖腺并從內(nèi)臟中小心除去。根據(jù)卵巢細(xì)胞的成熟或半成熟，卵巢的顏色在黃色到橙色之間變化。稱重卵巢組織并放在玻璃燒杯中。以1∶3的比例(重量體積比)加入70％的乙醇。淡黃橙色的顏料出現(xiàn)。有色溶液轉(zhuǎn)移到其它容器中。向剩余的組織再次加入70％的乙醇并除去有色溶液。這些步驟重復(fù)三次以萃取色素，而沒有使卵巢組織勻化。染料的部分純化提取物通過用whattman No.1濾紙過濾而部分純化。裝有染料溶液的具有螺旋蓋的管形瓶標(biāo)記為“原染料溶液”，并且在4℃的低溫下儲存直到進(jìn)一步應(yīng)用。帶有來自于卵巢組織的淡黃和橙色色素的提取物通過以下方法鑒定。發(fā)現(xiàn)特征相同。
1mg卵巢提取物3ml 70％的乙醇(3次)，亦即1mg提取物在9ml 70％的乙醇，為9000微升(μl)70％的乙醇中。
實(shí)施例3染料顏色和溶解性的物理性質(zhì)所述染液用肉眼觀察是淡黃橙色。在日光/管燈下其產(chǎn)生變化的顏色發(fā)射。染料不溶于水而溶于醇。
實(shí)施例4光穩(wěn)定性染料的醇提取物在4℃是穩(wěn)定的。一旦細(xì)胞用該染料標(biāo)記，熒光性可以在室溫下保持幾個月。
實(shí)施例5根據(jù)卵巢中成熟卵和未成熟卵的數(shù)量，染料具有6.8-7.5的pH值。成熟的卵越多pH越接近7.5，成熟的卵越少pH越接近6.8。
實(shí)施例6通過紙電泳法測試染料的電荷所述染料提取物進(jìn)行紙上電泳測試。Whattman No.1濾紙吸收pH為7的磷酸鹽緩沖液(0.1M)，然后放入電泳槽。兩個電極浸入磷酸鹽緩沖液。用5微升(μl)卵巢提取物形成一個斑點(diǎn)并在40伏進(jìn)行紙上電泳測試。觀察到黃色斑點(diǎn)向正極接線柱的遷移。這證明含有有色化合物(色素)的提取物帶有負(fù)電荷。提取物是在濾紙上得到顏色的染料。
實(shí)施例7染料的化學(xué)特性取1ml卵巢的乙醇提取物染液并加入0.2克二硫代丁四醇。溶液沒有退色。這表示在熒光染料的顏色基中不存在可還原基團(tuán)。
實(shí)施例8測試蛋白質(zhì)存在5ml提取物在100℃的水浴中加熱。觀察到凝聚。這表明在染料的酒精提取物中蛋白質(zhì)的存在。
實(shí)施例9測試碳水化合物的存在使用4ml硫酸和蒽酮測糖試劑將該提取物進(jìn)行蒽酮測試(Ref)。1ml水、4ml濃硫酸和蒽酮測糖試劑形成空白組。5分鐘后空白組為輕微綠色，然而5分鐘后該提取物變成鮮綠色。該試驗(yàn)證明提取物中存在碳水化合物實(shí)施例10提取物中組分的分離使用硅膠-G板對所述提取物(5微升)進(jìn)行薄層色層分析。使用的溶劑為2∶2∶1的正丁醇、乙酸和水。TLC后，硅膠-G板在容器中用碘蒸汽染色。發(fā)現(xiàn)4個斑點(diǎn)。該試驗(yàn)表明粗提物中至少含有4種不同的化合物。
斑點(diǎn)及其各自的Rf值如表1所示。
實(shí)施例11熒光光譜分析所述提取物進(jìn)行熒光光譜分析。在351nm、580nm和720nm發(fā)現(xiàn)最大激發(fā)波長。
所述染液然后進(jìn)行熒光發(fā)射分光光度分析。當(dāng)在351nm激發(fā)時，發(fā)射處于400-600。在450nm和550nm波長發(fā)射有兩個峰值。(圖2和3)實(shí)施例12HPLC分析模式以檢查蛋白質(zhì)和碳水化合物的存在染料溶液的HPLC用逆HPLC的平均方式完成，使用的溶劑為在C18逆相柱中的80％乙腈，和20％水。UV檢測器在波長280nm和205nm檢測出蛋白的存在。圖17和表2顯示出通過在280nm的UV檢測器蛋白質(zhì)存在的結(jié)果?？梢钥闯?種蛋白質(zhì)的停留時間在2.1-8.8分鐘之間變化。覆蓋的面積為535-116103之間。峰值1的最大百分?jǐn)?shù)面積具有2.1分鐘的保留時間。由此可見樣品中蛋白質(zhì)在峰值1的量最多。圖18和表3通過UV檢測器在205nm顯示出10種縮氨酸的存在。停留時間在2.1-14.8分鐘之間變化。覆蓋的面積為63482-3218965。并且縮氨酸在峰值3的最大百分?jǐn)?shù)面積具有3.9分鐘的停留時間。折光檢測器檢測到碳水化合物的存在。使用的標(biāo)準(zhǔn)為葡萄糖、蔗糖和果糖。結(jié)果如圖19-22和表4所示。280nm和205nm的第七峰值以及碳水化合物的第五峰值分別具有8.8和8.939分鐘的停留時間。
實(shí)施例13熒光基團(tuán)和蛋白質(zhì)結(jié)合的測試如實(shí)施例8所示，蛋白質(zhì)提取物在加熱時凝聚。此刻如果加入乙醚溶劑，顏色部分分解。當(dāng)進(jìn)行如實(shí)施例6所述的步驟時，染色溶液的紙電泳中色斑沒有向任何電極移動，這表明色素不帶電荷。其僅僅在非極性溶劑中分解。因此可以說染料的染色部分是非極性的。
然而，在實(shí)施例6中使用染料的酒精提出物時，色斑向正極移動，這表明其帶有負(fù)電荷?？磥砗孟裨摲菢O性色素可以與某些帶負(fù)電的組分結(jié)合。如實(shí)施例12中HPLC數(shù)據(jù)所示，其中僅僅檢測到蛋白質(zhì)和碳水化合物，這表明染色fluoropore與帶負(fù)電的某些蛋白質(zhì)結(jié)合?？梢哉f，染液的熒光作用是由于含有附著于帶負(fù)電的蛋白質(zhì)的非極性熒光團(tuán)的組分，當(dāng)染料加熱和蛋白質(zhì)凝聚時其分離。
實(shí)施例14在原核和真核生物系統(tǒng)進(jìn)行凝集生物活性生物測定染料在革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸桿菌)的凝集生物活性測試兩個分離試驗(yàn)進(jìn)行如下1)50微升所述提取物加入到100ml的Muller Hilton′s培養(yǎng)基流體(culture broth)中。產(chǎn)生沒有海產(chǎn)動物提取物的空白組。0.1ml的新鮮大腸桿菌inauculum加入到該培養(yǎng)基流體中。培養(yǎng)基流體在自轉(zhuǎn)為150rpm的定軌振蕩器中孵化。8小時后在兩個培養(yǎng)基流體中都發(fā)現(xiàn)混濁。然而含有提取物(染液)的培養(yǎng)基流體顯示出叢生生長。細(xì)胞形成凝集。沒有海洋提取物的正向空白組顯示出正常生長。
2)一圈活大腸桿菌置于顯微鏡載玻片上的50微升水中并混合。再向其中加入2微升(2μl)染液。通過將載物片放置在臺階上15-30秒使酒精揮發(fā)。然后一個蓋片放于細(xì)菌制劑上并密封。同樣制備沒有任何染料的對照細(xì)菌制劑。兩個載物片在外部熒光顯微鏡(100倍物鏡，10倍目鏡)的油浸物鏡下篩選，以檢查凝集生物活性，并且在WU、WB、WG和BF下檢查熒光。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用染料處理的載物片上的細(xì)菌形成叢生(圖4，6和4a，5a)，然而對照組中沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象。
這證明該染料具有引起凝集的生物活性。還注意到細(xì)菌以特定的叢生形狀凝集。叢生中的細(xì)菌自始至終都是活的。它們僅僅在載物片變干時死亡，死細(xì)菌不染色。
在染液的存在下細(xì)胞形成凝聚的趨向表明其中含有外原凝集素類糖蛋白。HPLC證實(shí)在染料溶液中存在蛋白質(zhì)和碳水化合物。
實(shí)施例15真核精液的凝聚生物活性測試1毫升牡蠣精液溶液置于用于浮游植物計數(shù)的sedgewick計數(shù)器的空腔中。加入5微升(5μl)酒精提取物。載物片在40倍物鏡和10倍目鏡的顯微鏡下篩選?？梢钥闯鼍盒纬杉象w、粘附并形成叢生。沒有聚集的特定形式。這種特性在對照實(shí)驗(yàn)中沒有出現(xiàn)。
實(shí)施例16牡蠣卵授精和受精率的增加牡蠣的優(yōu)質(zhì)精液和卵以10∶1的固定比率加入到用于浮游植物計數(shù)的sedgewick計數(shù)器的空腔中。加入5微升(5μl)酒精提取物。然后載物片立即在顯微鏡下篩選并觀察黏附到卵膜、受精和不受精卵的精液。進(jìn)行沒有提取物的對照組。圖6和圖6a顯示出幾分鐘內(nèi)和以綠色激發(fā)濾光器(WG)觀察到的極體擠出。
可以看出30秒后，處理的細(xì)胞有80％的卵受精，然而在對照組中僅僅有40％的細(xì)胞受精。我們注意到大量的精液黏著到卵膜。在我們的早期試驗(yàn)中我們注意到，這些卵受精作用通常的實(shí)際時間約為10-15分鐘。第一個極體的形成發(fā)生在增加染料的1分鐘之內(nèi)(圖6和圖6a)。
當(dāng)前的染液看來具有一些因素，其促進(jìn)精液授精速率，并最終在更短的時間間隔內(nèi)增加受精率。
實(shí)施例17染料在真核細(xì)胞的無毒測試通過牡蠣精液對提取液進(jìn)行細(xì)胞毒性測試。精液的存活率一般為一個參數(shù)以顯示毒性。牡蠣除去雄性生殖腺，并且精液釋放在100％的海水中。通過muscline布過濾以除去所有有機(jī)物殘?jiān)Ｈ?毫升(ml)精液溶液并加入不同濃度(1μl、2μl、3μl、4μl和5μl)的染液。每半小時通過顯微鏡觀測精液的存活率。試驗(yàn)24小時進(jìn)行。不加入染料進(jìn)行對照組。發(fā)現(xiàn)加入染料對精液的存活率沒有任何影響。這表明該染料無毒特性。
實(shí)施例18染料在原核生物的無毒測試通過觀察其存活率或者死亡量測試了提取物對革蘭氏陰性大腸桿菌的細(xì)胞毒性。一滴水中的活大腸桿菌(25μl)置于載玻片上。向其加入2μl酒精提出物。暫時封閉該載物片以防止蒸發(fā)。在顯微鏡下晝夜觀察剩余的活細(xì)菌，直到其保持在溶液中。如果溶液蒸干，它們死亡。進(jìn)行對照試驗(yàn)。證明染料對原核生物也是無毒的。
實(shí)施例19染料的外部熒光顯微鏡法外部熒光顯微鏡研究通過使用該染料的1∶100稀釋液作為著色劑，并記錄用不同的立方晶格激發(fā)時產(chǎn)生的光線發(fā)射，與已知熒光染料的色調(diào)進(jìn)行比較(圖7和圖7a-圖10和10a)。用Olympus反射光的WU、WB、WG和BF立方晶格發(fā)出的紫外線和可見光譜的激發(fā)進(jìn)行掃描。立方晶格的細(xì)節(jié)如下WU立方晶格的波長范圍為330nm-385nm。
WB立方晶格的波長范圍為450nm-480nm。
WG立方晶格的波長范圍為510nm-550nm。
亮視野的BF，其中普通的鎢燈發(fā)光。
實(shí)施例20找出染料在不同激發(fā)范圍的發(fā)射范圍。外部熒光顯微鏡法照片中卵的背景顯示染料的發(fā)光顏色?？吹絎U 330nm-385nm范圍的激發(fā)發(fā)射在450nm-470nm，用光譜范圍為450nm-480nm的WB濾光片產(chǎn)生的激發(fā)發(fā)射510nm-570nm范圍的熒光，用光譜范圍為510nm-550nm的WB濾光片產(chǎn)生的激發(fā)發(fā)射610nm-650nm范圍的熒光，使用BF看到淡黃灰色的色調(diào)。
實(shí)施例21牡蠣細(xì)胞的熒光發(fā)射染料用作牡蠣死、活和固定卵的熒光性微小著色劑。載物片在外部熒光顯微鏡下篩選。我們注意到死細(xì)胞沒有接受染料并且沒有顯示熒光(圖11、11a和12、12a)?；罴?xì)胞和固定細(xì)胞都顯示熒光。激發(fā)光譜范圍和放射熒光嚴(yán)格地遵循斯托克定律。這些范圍與表示熒光細(xì)胞背景的染料發(fā)射范圍不同。用光譜范圍為330nm-385nm的WU濾光片產(chǎn)生的激發(fā)發(fā)射470nm-500nm范圍的熒光，用光譜范圍為450nm-480nm的WB濾光片產(chǎn)生的激發(fā)發(fā)射570nm-610nm范圍的熒光，用光譜范圍為510nm-550nm的WG濾光片產(chǎn)生的激發(fā)發(fā)射610nm-650nm范圍的熒光。以可見光的整個白光范圍并根據(jù)細(xì)胞組分的密度，在亮視野發(fā)射光外部熒光顯微鏡法微小篩選死、活和固定卵，產(chǎn)生淡黃灰色類相差效果的色彩。
實(shí)施例22大腸桿菌細(xì)胞的熒光發(fā)射染料用作大腸桿菌的顯微著色劑。一圈活大腸桿菌載玻片上的25微升水中并混合。再向其中加入2微升(2μl)染液。通過將載物片放置在臺階上10-15秒使提取物中的酒精揮發(fā)。然后一個蓋片放于在水中的細(xì)菌懸浮液上并密封。同樣制備沒有任何染料的對照細(xì)菌制劑。兩個載物片在外部熒光顯微鏡(100倍物鏡，10倍目鏡)的油浸物鏡下篩選，以檢查熒光。我們注意到死細(xì)胞沒有吸收染料并且沒有顯示熒光(圖13、13a)?；罴?xì)菌細(xì)胞和固定細(xì)菌細(xì)胞顯示熒光。激發(fā)光譜范圍和發(fā)射熒光波長嚴(yán)格遵循斯托克定律。這與如下給出的染液不同以WU 330nm-385nm范圍激發(fā)，在470nm-500nm范圍發(fā)出熒光。以波長范圍為450nm-480nm的WB濾光器激發(fā)，在570nm-610nm范圍發(fā)出熒光。以波長范圍為510nm-550nm的WG濾光器激發(fā)，在610nm-650nm范圍發(fā)出熒光。沒有任何染料的對照大腸桿菌也沒有顯示熒光。
實(shí)施例23用染料作為外部熒光顯微鏡法的著色劑而對載物片進(jìn)行顯微照相用曝光時間變化為50-60秒的400ASA速柯達(dá)膠片，在WU330nm-385nm范圍、WB450nm-480nm范圍、WG510nm-550nm范圍和亮視野，在具有細(xì)胞的載物片區(qū)域和僅僅表現(xiàn)染料發(fā)色的圍繞背景區(qū)域進(jìn)行發(fā)射熒光的顯微照相。
實(shí)施例24染料在細(xì)胞膜的滲透性牡蠣的未受精、受精卵和幼體用染料染色，卵懸浮比為1∶50微升，并且在熒光顯微鏡下篩選(圖4，4a-16，16a)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜、核膜和染色質(zhì)中的熒光是顯著的。雖然發(fā)射的波長范圍相同并且顏色為相同色調(diào)的彩色，在細(xì)胞的這些部分之間存在顯著的界限(圖7，7a-10，10a)。這證明染料能夠透過卵質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、核膜、核質(zhì)和染色質(zhì)的活細(xì)胞和固定細(xì)胞膜。死細(xì)胞中細(xì)胞部分不存在熒光表明染料沒有穿透死細(xì)胞和固定細(xì)胞膜的膜。同樣，僅僅在活大腸桿菌細(xì)胞而非在死細(xì)胞中看到熒光發(fā)射的存在。
實(shí)施例25染料的生物活性提取物裝在microfuge管并保持在-20攝氏度，并且在凍結(jié)狀態(tài)于紫外線下觀察。在另一試驗(yàn)中，蘸有染液的Whatman濾紙保持在-20攝氏度并在紫外線透視鏡下觀察。熒光沒有變質(zhì)。
與市售染料相比的優(yōu)點(diǎn)1.由于其是來源于天然并且非合成的，該染料無毒。
2.該染料對河口、海洋動物和革蘭氏陰性大腸桿菌無毒。
3.該染料是細(xì)胞膜滲透性的，并且其黏附到核膜和染色質(zhì)。
4.該染料對細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)是滲透性的。
5.該染料是得自非生物熒光海洋動物的熒光蛋白染料。
6.染料在其單一模式相當(dāng)于6種合成熒光染料，其覆蓋了紫外線和可見光譜發(fā)射熒光色的絕大部分。
7.該染料可以用于快速顯微著色劑，在沒有增加顯微鏡的相差附件額外開支的情況下產(chǎn)生相差效果，也沒有任何固定和保存樣品的過長規(guī)程，尤其是用于活樣品的當(dāng)場質(zhì)量檢查。
8.在較長時間內(nèi)染色細(xì)胞的熒光品質(zhì)是不可降低的，當(dāng)出口染色載物片時其不需要冷凍。染液可以在4攝氏度銷售。當(dāng)前市場上的熒光染料在相當(dāng)于-20攝氏度的冷凍出口。
9.染料具有6.8-7.5的pH，其接近于中性，所以組合物中產(chǎn)品的pH不會激烈變化。
10.與早期得自海生海蜇的已知綠色熒光蛋白(GFP)不同，我們的染料沒有報告基因。熒光基團(tuán)直接附著于蛋白質(zhì)并且沒有任何氨基酸的環(huán)化步驟而發(fā)出熒光。
11.所述熒光結(jié)果是直的。
12.GFP在395nm吸收藍(lán)光并且在470nm具有較小的峰值，發(fā)出綠光。我們的染料在3種不同熒光波長發(fā)射6種熒光色。
13.染料溶于70％的乙醇。
14.染料帶有負(fù)電荷。
15.部分純化的染液至少含有4種化合物。
16.染料含有碳水化合物和蛋白質(zhì)。
17.熒光基團(tuán)是非極性的但是染料基本上帶負(fù)電。這表明熒光基團(tuán)附著于蛋白質(zhì)。
18.染料包含至少一種糖蛋白并具有外原凝集素類活性。
19.其顯示細(xì)菌的凝集，可以用于除去有害細(xì)菌。
20.凝集的細(xì)菌細(xì)胞仍然具有熒光性。這種特性可以在食品工業(yè)用于細(xì)菌計數(shù)。
21.染料在真核精液和卵細(xì)胞引起凝集，這在非常短的時間提高了授精和受精率并增加增殖能力。該染料可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)并在人類性別細(xì)胞中嘗試。
22.染料實(shí)際上是蛋白質(zhì)，但一旦其附著于細(xì)胞膜，在自然條件不可降解。這對于研究活細(xì)胞功能、細(xì)胞器構(gòu)造、細(xì)胞分選和流式細(xì)胞計具有巨大的價值。
23.染液對于活細(xì)胞和牡蠣精液和卵無毒。
24.染料的無毒特性可以作為進(jìn)行活細(xì)胞分析試劑盒的染料組分。
25.染料的無毒特性可以作為海洋學(xué)中進(jìn)行原位操作研究的試劑盒的染料組分。
26.染料在死細(xì)菌沒有染色并且不顯示熒光。這可以在組織培養(yǎng)中用于檢查活細(xì)胞和死細(xì)胞。
27.對活細(xì)胞是無毒的染料可以用于追蹤細(xì)胞系。
28.染料在活細(xì)胞和固定細(xì)胞是細(xì)胞膜滲透的。其為天然染料，因此由于其將更加環(huán)境友好而比合成染料更具有優(yōu)點(diǎn)。
29.染料在選定的激發(fā)覆蓋更寬范圍的發(fā)射波長。這使其成為當(dāng)前用于加入第三發(fā)色色域的市售雙重發(fā)射染料試劑盒的非?？山邮艿慕M分。
30.一旦染料對載物片上的細(xì)胞染色，其沒有顯示光致退色。這使其可以用于組織化學(xué)研究。
31.染料即使是在1∶200000-1∶400000的稀釋液中也能發(fā)射熒光色。
32.染料在不同激發(fā)波長的多色發(fā)色可以與市場上的早期熒光顯微著色劑相比。
33.本發(fā)明染料的藍(lán)色熒光可以與通過DAPI熒光染料在相同波長激發(fā)的相同顏色的發(fā)射相比，用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和測試試劑盒的組分。
34.本發(fā)明染料的藍(lán)色熒光可以與通過Hoechest 33258的顏色的發(fā)射相比，用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
35.本發(fā)明染料的藍(lán)色熒光可以與通過Hoechest 33342熒光染料在相同波長激發(fā)的顏色的發(fā)射相比，用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
36.所述染料在可見區(qū)的黃色熒光可以與吖啶橙的相同顏色發(fā)射相比，用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
37.所述染料在可見區(qū)的黃色熒光可以與金胺的相同顏色發(fā)射相比，用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
38.所述染料在可見區(qū)的黃色熒光可以與FITC的相同顏色發(fā)射相比，用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
39.橙色熒光發(fā)射可以與碘化甲錠熒光染料的橙色熒光色相比，用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
40.所述染料的橙色熒光發(fā)射可以與甲錠熒光染料的橙色熒光色相比，用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
41.橙色熒光發(fā)射可以與TRITC熒光染料的橙色熒光色相比，用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
42.與用于相同目的的合成直接染料不同，本發(fā)明的染料在室溫下穩(wěn)定并具有較長的儲藏壽命。所述染料的分子非放射性試劑盒可以在室溫下出口。
43.所述單一染料具有當(dāng)前市場上至少123種不同熒光染料(DAPI、Hoechest33258、Hoechest 33342、FITC、吖啶、金胺、若丹明、TRITC、和碘化甲錠)的特征。
44.在顯微鏡的普通光下灰色色彩產(chǎn)生相差效果，其可以用于cytogentical、cytological和組織化學(xué)載物片的快速篩選，并且可以節(jié)省顯微鏡相差附件的額外投資。熒光色發(fā)射遵循熒光的斯托克定律。
45.柯達(dá)膠片顯微照片顯示鄰近色發(fā)射波長的色彩。因此，當(dāng)通過外部熒光顯微鏡看到藍(lán)色熒光時，在顯微照相中也出現(xiàn)綠色色彩。
46.柯達(dá)膠片顯微照片顯示鄰近色發(fā)射波長的色彩。因此，當(dāng)通過外部熒光顯微鏡看到黃色熒光時，在顯微照相中也出現(xiàn)綠色色彩。當(dāng)通過外部熒光顯微鏡看到橙色熒光時，在顯微照相中也出現(xiàn)紅色色彩。
47.當(dāng)背景中沒有樣品而僅僅存在染料時，在所有的熒光下觀察，細(xì)胞遺傳學(xué)載物片產(chǎn)生細(xì)胞的染色效果。
48.染料可以用于各種涂料、油墨、紡織的熒光色。
49.染料可以用于漂白和增亮聚合體的熒光染料組分。
50.染料可以用于全譜熒光染料的泄漏檢查。
51.其也可以用于自動化學(xué)測量系統(tǒng)。其也可以用于標(biāo)記墜毀飛機(jī)、救生艇和軍事裝備如火箭的位置。并且其可以用于海底探測器。
52.染料的無毒和細(xì)胞滲透特性可以用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和探測試劑盒的組分，用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)和酶的標(biāo)記、免疫熒光法探測、DIG-標(biāo)記的低聚核苷酸探針和抗DIGFab-片斷的染色、流動血細(xì)胞計數(shù)中用于單一和多細(xì)胞熒光定量、外部熒光顯微鏡法的熒光著色劑。
53.染料還可以用于在健康食品工業(yè)、化妝品工業(yè)、藥物和化學(xué)工業(yè)中快速檢查生物污染，用于快速判斷實(shí)驗(yàn)室條件下的生物污染物，用于快速測定田間條件下的生物污染物。
54.染料可以用于需要無毒環(huán)境友好特性的組合物。
55.染料可以用于天然著色劑。以1∶20000-1∶40000比例的海生染料的生物活性組合物，在3個不同波長得到6種顏色的熒光，和在透射光下的相差效果。
表1斑點(diǎn)及其各自的Rf值溶解前混合后遷移距離 Rf值12.1cm11.1cm 0.9179.9cm0.8188.0cm0.6615.6cm0.463表2蛋白質(zhì)的停留時間280nm峰停留時間面積 面積百分比1 2.1 11610340.392 2.5 38205 13.293 3.7 7332 2.554 6.1 31924 11.115 6.8 535 0.196 7.6 3684 1.287 8.8 89653 31.19表3蛋白質(zhì)的停留時間205nm峰停留時間面積 面積百分比1 2.1 98175810.442 2.8 8008778.523 3.9 3218965 34.234 4.4 1178821.255 5.1 2404982 25.576 6.1 1067281.137 8.8 1477895 15.718 10.463482 0.679 13.71191131.271014.81135861.21表4折光檢測器以檢測碳水化合物的存在峰停留時間面積 面積百分比1 5.494 5718 19.792 5.973 1707 5.913 6.441 1637 5.664 6.995 3192 11.05
表5當(dāng)以具有染液的Olympus外部熒光顯微鏡的不同波長熒光濾光器立方晶格激發(fā)，以及當(dāng)附著于原核細(xì)胞的細(xì)胞膜時，熒光染料不同顏色熒光的發(fā)射。

表6當(dāng)以具有染液的Olympus外部熒光顯微鏡的不同波長熒光濾光器立方晶格激發(fā)，以及當(dāng)附著于真核細(xì)胞的細(xì)胞膜時，熒光染料不同顏色熒光的發(fā)射。

<p>表1

權(quán)利要求
1.一種生物活性半純化提取液，其中含有得自海洋生物明玉參其的雌性性腺亦即卵巢組織的無毒蛋白熒光染料，所述海洋生物明玉參出現(xiàn)在潮水間、浸沒水中、淺灘處和深水中、通常大量出現(xiàn)在背陰處，例如acloves、裂縫處、暗礁處、懸突處、巖石和多砂的棲息地；具有暗至亮色、有或無外和內(nèi)骨骼，固著的、定棲的漂流物，有各種游動力量的自游生物，通常習(xí)慣于夜間活動，易于活躍地捕食，有或沒有熒光，具有體外受精的卵，并且熒光染料產(chǎn)生UVB、UVA、可見光和紅外光部分至所有波長范圍的發(fā)射。
2.權(quán)利要求1中所述的染料用作天然熒光染料并具有下列特征1.為不可還原的染料，2.不是合成化合物而是天然化合物，3.染料的粗提物是淡黃橙色的，4.裸眼在日光燈下觀察時，部分純化的染料是亮黃色的，5.在管燈下，發(fā)出多色的色彩，6.以液體形式存在，7.溶于70％的乙醇，8.在試驗(yàn)中70％的乙醇可以進(jìn)一步被水稀釋，9.帶負(fù)電荷，10.醇溶液的pH為6.8-7.5，11.不存在還原性熒光基團(tuán)，12.染液實(shí)際上是蛋白質(zhì)，13.染料對大腸桿菌無毒，14.染料對例如牡蠣卵和精子的真核細(xì)胞無毒，15.染料是細(xì)胞膜滲透的，16.可以滲透細(xì)胞核膜，17.染色染色質(zhì)，18.染液的TLC顯示四種化合物具有Rf值0.917、0.818、0.661、0.463，19.HPLC中蛋白質(zhì)的停留時間通過UV檢測器在280nm顯示7個峰值，20.峰1的停留時間為2.1，并且其面積為116103，21.峰2的停留時間為2.5，并且其面積為38205，22.峰3的停留時間為3.7，并且其面積為7332，23.峰4的停留時間為6.1，并且其面積為31924，24.峰5的停留時間為6.8，并且其面積為535，25.峰6的停留時間為7.6，并且其面積為3684，26.峰7的停留時間為8.8，并且其面積為89653，27.縮氨酸的停留時間通過HPLC使用UV檢測器在205nm具有10個峰值，28.其中具有碳水化合物，29.其中具有糖蛋白，30.其導(dǎo)致外源凝集素類凝聚，31.其凝聚大腸桿菌32.凝聚群落不死，并顯示熒光性，33.染料將精子凝聚到牡蠣的卵膜，34.其促進(jìn)精子授精并提高牡蠣卵的受精率，35.染液在4℃儲存，36.一旦其粘附到細(xì)胞膜，其熒光性保持幾天，37.一旦在細(xì)胞著色，其不會發(fā)生光致退色，38.染料不染色原核生物的死細(xì)胞，39.染料不染色牡蠣的死細(xì)胞，40.即便是在-20℃下冷凍，染料的熒光也不會改變，在此溫度下分子不可能象在從發(fā)光生物體得到的提取物中那樣獲得活化所必須的能量，41.色素和染料是在分光光度計不同波長的紫外線和可見光激發(fā)下發(fā)出熒光的熒光染料，42.紫外線、可見光譜激發(fā)的波長在351nm、580nm、720nm有峰值，并且當(dāng)在351nm激發(fā)時，熒光發(fā)射光譜分析為400-600nm，43.發(fā)射在450nm和550nm有兩個峰值，44.蘸有濃度為1∶20000稀釋的染液的Whatman Filter no.1通過具有260-280nm范圍紫外燈泡的紫外透照器和Gel Documentation系下的物理檢查，發(fā)出藍(lán)綠色的熒光，45.在外部熒光顯微鏡熒光立方晶體三種不同波長的紫外線和可見光范圍，染料發(fā)出三種不同顏色的熒光，46.當(dāng)附著于細(xì)胞膜時，在外部熒光顯微鏡熒光立方晶體三種不同波長的紫外線和可見光范圍，染料發(fā)出三種不同顏色的熒光，47.染液在330nm-385nm的UV立方晶格激發(fā)時，在450nm-470nm存在藍(lán)色熒光發(fā)射，48.染液在450nm-480nm的WB立方晶格激發(fā)時，在510nm-570nm存在綠色熒光發(fā)射，49.染液在510nm-550nm的WG立方晶格激發(fā)時，在610nm-650nm存在橙色熒光發(fā)射，50.在外部熒光顯微鏡的通常透射燈泡下以100倍物鏡觀察，染料發(fā)出淡黃灰色色彩，51.當(dāng)染料黏附到細(xì)胞膜時以WU 330nm-385nm激發(fā)范圍的紫外線立方晶格激發(fā)時，產(chǎn)生470nm-500nm范圍的藍(lán)色熒光發(fā)射，52.當(dāng)染料黏附到細(xì)胞膜時以450nm-480nm激發(fā)范圍的WB立方晶格激發(fā)時，產(chǎn)生570nm-610nm范圍的綠色熒光發(fā)射，53.當(dāng)染料黏附到細(xì)胞膜時以510nm-550nm激發(fā)范圍的WG立方晶格激發(fā)時，產(chǎn)生610nm-650nm范圍的橙色熒光發(fā)射，54.當(dāng)染料黏附到細(xì)胞膜時，在外部熒光顯微鏡的通常透射燈泡下以100倍物鏡觀察，黏附到細(xì)胞膜上的染料發(fā)出淡黃灰色色彩，55.甚至在1∶400000倍的稀釋比例染料還發(fā)出熒光色，56.細(xì)胞膜染色后染料的熒光性是非常光穩(wěn)定的，其不能在直射光的長時間照射下變質(zhì)，并且即便是在-20℃下冷凍，染料的熒光也不會改變，在該溫度下分子不可能象在從發(fā)光生物體得到的提取物中那樣獲得活化所必須的能量。
3.權(quán)利要求1所述的染料，其中染料在不同激發(fā)波長處的多色發(fā)射都可以與市場已有的熒光染料顯微著色劑相比。
4.權(quán)利要求1所述的染料，其中當(dāng)前染料的藍(lán)色熒光可以與DAPI熒光染料在同樣激發(fā)波長范圍的同樣顏色相比，后者作為生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記試劑盒的組分。
5.權(quán)利要求1所述的染料，其中所述染料在可見范圍的黃色熒光可以與金胺的同樣顏色發(fā)射顏色相比，后者作為生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
6.權(quán)利要求1所述的染料，其中所述染料在可見范圍的黃色熒光可以與FITC的同樣顏色發(fā)射顏色相比，后者作為生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
7.權(quán)利要求1所述的染料，其中橙色熒光發(fā)色可以與碘化鉀錠熒光染料的橙色熒光相比，后者作為生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
8.權(quán)利要求1所述的染料，其中橙色熒光發(fā)色可以與若丹明熒光染料的橙色熒光相比，后者作為生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
9.權(quán)利要求1所述的染料，其中橙色熒光發(fā)色可以與TRITC熒光染料的橙色熒光相比，后者作為生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
10.權(quán)利要求1所述的染料，其中該染料在室溫穩(wěn)定并具有長的擱置壽命。
11.權(quán)利要求1所述的染料，其中所述染料的分子和放射性試劑盒可以在室溫下出口。
12.權(quán)利要求1所述的染料，其中該單一染料有至少100種不同的市場現(xiàn)有的明確熒光染料(DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、吖啶、金胺、若丹明、TRITC、和碘化甲錠)的特點(diǎn)。
13.權(quán)利要求1所述的染料，其中它可以用在目前所有使用藻膽蛋白的用途中，與其不同的是該染料直到冷凍也不損失熒光。
14.權(quán)利要求1所述的染料，其中在顯微鏡的亮視野下，當(dāng)在10倍物鏡下觀察時，藍(lán)灰色色調(diào)產(chǎn)生相差效果，這對于快速篩選細(xì)胞遺傳、細(xì)胞學(xué)和組織化學(xué)載物片是有用的，并可以節(jié)省在顯微鏡相差附件的額外花費(fèi)。
15.權(quán)利要求1所述的染料，其中在通常的透射光顯微鏡的100倍油鏡下觀察，蛋黃的蛋白質(zhì)、活躍分裂細(xì)胞的核原生質(zhì)和染色質(zhì)顯示著色的不同顏色，前者為棕黃色，后者為黃色，最后的細(xì)胞組分為深藍(lán)色，這對可以在細(xì)胞的各種組織化學(xué)組分上看到的效果進(jìn)行快速生物測定是有用的。
16.權(quán)利要求1所述的染料，其中熒光顏色的發(fā)射服從熒光的斯托克定律。
17.權(quán)利要求1所述的染料，其中用柯達(dá)膠卷的顯微照相顯示相鄰的顏色發(fā)射波長的色調(diào)，如在外部熒光顯微鏡下的藍(lán)色熒光。
18.權(quán)利要求1所述的染料，其中用柯達(dá)膠卷的顯微照相顯示相鄰的顏色發(fā)射波長的色調(diào)，例如通過外部熒光顯微鏡在顯微照相看到黃色熒光時，還出現(xiàn)綠色色調(diào)。
19.權(quán)利要求1所述的染料，其中通過外部熒光顯微鏡在顯微照相看到橙色熒光時，還出現(xiàn)紅色色調(diào)。
20.權(quán)利要求1所述的染料，其中在所有熒光下看到的細(xì)胞遺傳載物片產(chǎn)生細(xì)胞和細(xì)胞組分與并無樣片而僅有染料的背景顏色對比的復(fù)染色效果。
21.權(quán)利要求1所述的染料，其中染料用水稀釋1∶400,000倍以上，可以在不同波長得到6種顏色的熒光。
22.權(quán)利要求1所述的染料，其中染料用水稀釋1∶400,000倍以上，無論是部分純化的染液還是著色的細(xì)胞，都可以在3種不同波長得到6種顏色的熒光。
23.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于制備涂料組合物和油墨。
24.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于泄漏檢查。
25.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于海底探針。
26.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于分子診斷所使用的熒光分子探針原位雜交試劑盒。
27.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒的組分。
28.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于免疫熒光探測中。
29.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于DIG-標(biāo)記的低聚核苷酸探針和抗DIG Fab-片斷的復(fù)染劑。
30.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于單和多色流式細(xì)胞計應(yīng)用中的單或多細(xì)胞熒光定量中。
31.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，可以用在處于0℃以下的田間條件的試驗(yàn)中。
32.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，可以用作外部熒光顯微鏡的熒光染料著色劑。
33.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于快速檢查健康食品工業(yè)、化妝品工業(yè)、制藥工業(yè)和化學(xué)工業(yè)的生物污染物。
34.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于快速測定實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物中的生物污染物。
35.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于在田間條件下快速檢查生物污染物。
36.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于膽堿酯酶的競爭性抑制劑。
37.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于細(xì)胞滲透的染料組合物。
38.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，用于提高受精率。
39.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及1∶20000的合適的添加劑，以得到不同波長下的三色熒光。
40.一種熒光組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的生物活性提取物以及合適的添加劑，以在透射光下使細(xì)胞的不同生物化學(xué)組分得到相位差和組織化學(xué)復(fù)染色效果。
41.一種皮膚護(hù)理組合物，含有生物活性提取物和生理學(xué)和化妝品可接受的賦形劑，例如稀釋劑、分散體或載體。
42.一種含有得自海洋生物卵巢組織的熒光染料的生物活性提取液，用于1.用于各種涂料、油墨、紡織品中的熒光色；2.一種熒光染料組合物，用于漂白和增亮聚合物；3.用于全光譜的熒光染料進(jìn)行泄漏檢測；4.用于自動化學(xué)計量系統(tǒng)中；5.用于標(biāo)記墜毀飛機(jī)、救生船和軍事裝備如火箭的位置；6.海底探測器；7.作為美容霜和洗液中色素細(xì)胞的防曬組分；8.用于分子診斷的熒光原位雜交應(yīng)用試劑盒組分；9.作為標(biāo)記DNA、RNA、蛋白質(zhì)和酶的生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的非放射性標(biāo)記和探測試劑盒的組分；10.免疫熒光檢測；11.DIG-標(biāo)記的低聚核苷酸探針和抗DIG Fab-片斷的復(fù)染劑；12.外部熒光顯微鏡的熒光染料著色劑；13.快速檢查健康食品工業(yè)、化妝品工業(yè)中、藥物和化學(xué)工業(yè)中的生物污染物；14.快速測定實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基中的生物污染物；15.在田間條件下快速檢測生物污染物；16.凝集組合物；17.天然著色劑；18.海生染料在超純水中1∶20000的生物活性組合物，從而在6個不同波長產(chǎn)生三色熒光，和在透射光下的相差效果；19.用于各種在零下溫度范圍進(jìn)行的熒光應(yīng)用的染料；20.在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于提高受精率；21.用于細(xì)胞膜滲透染料組合物；22.用于在組織培養(yǎng)物中辨別死細(xì)胞和活細(xì)胞；23.用于生物探測器染料組合物；和24.用于分子和微生物試劑盒的染料組合物。
43.一種從海參明玉參中提取天然熒光染料的方法，所述方法包括下列步驟a)從海邊采集材料，換海水并保存在實(shí)驗(yàn)室的缸中，不經(jīng)過任何機(jī)械換氣而過夜，b)剖開步驟a)中的動物并除去雌性性腺，c)用70％的乙醇萃取步驟(c)中的性腺至少3次，而沒有勻化組織，d)得到含有熒光染料的溶液并標(biāo)記為“染料的儲備溶液”。
44.權(quán)利要求43所述的方法，其中染料以1∶400,000倍或更高的比例稀釋，其在三個不同波長得到六種顏色的熒光。
45.權(quán)利要求43所述的方法，其中染料的染色部分連接到帶負(fù)電荷的蛋白組分。
46.權(quán)利要求43所述的方法，其中染料用70％的醇稀釋9000倍，并且對于每25-50微升海水另外滴加1微升，海水中以1∶225,000-1∶400000和更高的比例存在卵和細(xì)菌，以在三種不同的激發(fā)波長得到六種顏色的熒光。
47.權(quán)利要求43所述的方法，其中生物檢驗(yàn)通過使用在1∶40000、1∶20000、1∶10000、1∶5000和1∶2500的稀釋度的稀釋液通過真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的存活率評價染料的無毒特性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從非生物熒光海產(chǎn)棘皮動物明玉參中提取、純化和鑒定天然環(huán)境友好無毒細(xì)胞滲透的多色熒光蛋白質(zhì)染料的方法，以及含有此染料的組合物和此染料的各種用途。
文檔編號A61K35/32GK1649968SQ03810116
公開日2005年8月3日 申請日期2003年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月28日
發(fā)明者烏沙·戈斯瓦米, 阿努陶什·甘古利 申請人:科學(xué)和工業(yè)研究委員會