本發(fā)明涉及植物線蟲(chóng)標(biāo)本制作技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種植物線蟲(chóng)永久玻片的制作方法。

背景技術(shù)：

植物線蟲(chóng)屬于無(wú)脊椎動(dòng)物中的線蟲(chóng)門(mén)，能寄生于植物根、莖、葉、果實(shí)、種子等部位，其種類(lèi)繁多、危害嚴(yán)重。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界每年因植物線蟲(chóng)造成的農(nóng)林作物經(jīng)濟(jì)損失在數(shù)千億元以上。我國(guó)2007年公布的對(duì)外植物檢疫性有害生物名錄中，有20種(屬)的線蟲(chóng)為檢疫性線蟲(chóng)，其實(shí)際種數(shù)多達(dá)200種以上。

在植物線蟲(chóng)檢測(cè)鑒定研究工作中，一般首先必須制作臨時(shí)玻片，對(duì)線蟲(chóng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步觀察和攝影，并對(duì)各種數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)計(jì)。隨后，需進(jìn)一步將樣品制成永久玻片，作為實(shí)驗(yàn)室的實(shí)物標(biāo)本，可作為檢疫實(shí)驗(yàn)室的截獲證據(jù)，也可供教學(xué)或科研需要，尤其對(duì)鑒定的新種，必須要求有模式標(biāo)本。

一般線蟲(chóng)永久玻片制作過(guò)程較為復(fù)雜，制作步驟多，涉及標(biāo)本的殺死、固定、脫水、制片等步驟。而且需耗時(shí)較長(zhǎng)，一般需要5～6周。公開(kāi)號(hào)為CN102640742A的中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)了一種對(duì)傳統(tǒng)的永久玻片制作方法改進(jìn)的技術(shù)方案，但該方案仍需用2種脫水液，且用時(shí)需20天左右。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供簡(jiǎn)易的線蟲(chóng)永久玻片制作方法，其方法便捷、可操作性強(qiáng)、效果好。

具體的技術(shù)方案如下：

一種植物線蟲(chóng)永久玻片的制作方法，包括以下步驟：

a、將含有線蟲(chóng)的水溶液在55-60℃溫浴2-3min后離心，分離水層得到線蟲(chóng)液，將所述線蟲(chóng)液在固定液中浸泡24h以上；

b、將含有線蟲(chóng)的固定液離心，分離上層固定液得到固定后的線蟲(chóng)，將固定后的線蟲(chóng)與1.5～2.5ml甘油水溶液混合置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，再將所述24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿在35℃～40℃條件下恒溫放置40h～50h，得到完全脫水浸泡于甘油中的線蟲(chóng)；其中，所述甘油水溶液包括體積比為1:15～25的甘油與水；

c、在載玻片上滴加甘油，將所述完全脫水浸泡于甘油中的線蟲(chóng)移至載玻片的甘油滴中，在甘油滴兩邊放蠟塊，加蓋玻片，加熱至蠟塊融化后冷卻。

本發(fā)明中，所述線蟲(chóng)固定液包括體積比為5～15:1～5:65～94的40wt％甲醛、甘油和水。

本發(fā)明步驟a或步驟b中，所述離心的轉(zhuǎn)速獨(dú)立地為2000～4000r/min，離心時(shí)間獨(dú)立地為1～5min。

本發(fā)明步驟c中，移至甘油滴中央的線蟲(chóng)為已完全脫水的雌、雄線蟲(chóng)各若干條，排列均勻。

步驟c中，所述加熱步驟具體為，將含有蠟塊的玻片置于50～70℃的加熱板上加熱，所述加熱的時(shí)間為20～40s。

步驟c中，玻片冷卻后，在所述玻片上貼上標(biāo)簽，所述標(biāo)簽上包括樣品號(hào)、寄主、產(chǎn)地、制作日期。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明簡(jiǎn)化了永久玻片制作的復(fù)雜程序，在脫水過(guò)程中只需要使用一種脫水液，其操作過(guò)程和所需材料比常規(guī)線蟲(chóng)永久玻片制片方法簡(jiǎn)化了許多，降低了制作難度。本發(fā)明植物線蟲(chóng)永久玻片簡(jiǎn)易制作方法，從殺死、固定、脫水和制片的全過(guò)程僅需約3d，操作簡(jiǎn)單、快捷，對(duì)各種常見(jiàn)植物線蟲(chóng)都能獲得較好的永久玻片。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明中的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

一種植物線蟲(chóng)永久玻片的制作方法，包括以下步驟：

線蟲(chóng)的殺死與固定：將含有線蟲(chóng)的水溶液溫浴后離心，分離水層得到微量線蟲(chóng)液，在線蟲(chóng)液中加入固定液浸泡，殺死和固定線蟲(chóng)。

本發(fā)明中目標(biāo)線蟲(chóng)需是活的，最好是剛從土壤或植物組織中分離出的，若分離出的目標(biāo)線蟲(chóng)放置過(guò)久而沒(méi)有固定或固定時(shí)間短，會(huì)使線蟲(chóng)變形。將含有線蟲(chóng)的水溶液溫浴以殺死線蟲(chóng)。溫浴溫度優(yōu)選為55-60℃，進(jìn)一步為56-58℃，溫浴時(shí)間優(yōu)選為2-3min。將溫浴后的含有線蟲(chóng)的水溶液離心，使線蟲(chóng)和水分離。所述離心的轉(zhuǎn)速為2000～4000r/min，優(yōu)選為2500～3500r/min，進(jìn)一步為3000r/min；離心時(shí)間為1～5min，優(yōu)選為2～4min，更優(yōu)選為3min。

去除分離的水層，向存留的少量線蟲(chóng)液中加入線蟲(chóng)固定液。所述線蟲(chóng)固定液加入的體積以能沒(méi)過(guò)所述線蟲(chóng)液為基礎(chǔ)，優(yōu)選所述線蟲(chóng)液與所述固定液的體積比為1：10～30，進(jìn)一步優(yōu)選為1：15～25，具體為1:20。其中，線蟲(chóng)固定液可以采用本領(lǐng)域中常用的固定液對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行固定。在本發(fā)明中優(yōu)選采用40wt％甲醛、甘油和水混合形成的固定液。其中，40wt％甲醛、甘油和水的體積比為5～15:1～5:65～94，優(yōu)選為8～12:2～4:80～90，進(jìn)一步優(yōu)選為10:2:88。本發(fā)明中對(duì)固定液的溫度沒(méi)有特殊的限定，采用室溫下的線蟲(chóng)固定液即可。線蟲(chóng)液與固定液混合后，在室溫下浸泡24小時(shí)以上，優(yōu)選為36小時(shí)以上，進(jìn)一步為久于48小時(shí)進(jìn)行固定。

固定之后，將含有線蟲(chóng)的固定液離心。所述離心的轉(zhuǎn)速為2000～4000r/min，優(yōu)選為2500～3500r/min，進(jìn)一步為3000r/min；離心時(shí)間為1～5min，優(yōu)選為2～4min，更優(yōu)選為3min。

離心后，固定液位于上層。分離上層固定液得到固定后的線蟲(chóng)，將固定后的線蟲(chóng)與甘油水溶液混合。具體為吸出上層固定液，將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至容器中，并在所述容器中加入甘油水溶液脫水浸泡。所述容器優(yōu)選用24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿。所述甘油水溶液為含有甘油與水的混合溶液，甘油與水的體積比為1:10～30，優(yōu)選為1:15～25，具體為1:20。本發(fā)明甘油水溶液的體積為1.5～2.5mL，進(jìn)一步為2mL。

將含有線蟲(chóng)-甘油水溶液的容器在35℃～40℃條件下恒溫放置40h～50h。具體為，將含有甘油水溶液和線蟲(chóng)的24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中放置，待甘油水溶液中的水完全蒸發(fā)，線蟲(chóng)浸泡于甘油中，得到完全脫水的線蟲(chóng)，用于制作線蟲(chóng)永久玻片。其中，恒溫培養(yǎng)箱的溫度設(shè)置為35℃～40℃，進(jìn)一步為37℃～38℃；線蟲(chóng)在恒溫培養(yǎng)箱中放置的時(shí)間為40h～50h，進(jìn)一步優(yōu)選為43～47小時(shí)。此時(shí)容器中蒸餾水已全部蒸發(fā)，線蟲(chóng)浸泡于甘油中，用于制作線蟲(chóng)永久玻片。

制作線蟲(chóng)永久玻片：在載玻片上滴加甘油，將上述浸泡于甘油中的線蟲(chóng)移至載玻片的甘油滴中?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)選擇滴加甘油的量，在本發(fā)明中，優(yōu)選在載玻片上滴加2～4微升甘油。每個(gè)玻片中可放置雌、雄線蟲(chóng)各若干條，均勻排列在載破片上。在甘油滴兩邊放蠟塊，加蓋玻片，加熱至蠟塊融化后自然冷卻，貼上標(biāo)簽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用常規(guī)的加熱方式，如酒精燈加熱，也可以采用加熱板加熱。在本發(fā)明實(shí)施例中，加熱具體為將含有蠟塊的玻片置于加熱板上加熱。加熱溫度為50～70℃，優(yōu)選為55～65℃，具體為64℃。待蠟塊融化后，停止加熱。優(yōu)選加熱時(shí)間為20～40s，進(jìn)一步為30s。自然冷卻后貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽上包括樣品號(hào)、寄主、產(chǎn)地、制作日期等信息，完成線蟲(chóng)永久玻片的制作。將制作好的線蟲(chóng)標(biāo)本放入標(biāo)本盒中保存。保存時(shí)注意保持玻片水平，以防線蟲(chóng)滑動(dòng)。

實(shí)施例1：

松材線蟲(chóng)簡(jiǎn)易永久玻片制作步驟：

a、清洗載玻片和蓋玻片；

b、松材線蟲(chóng)的殺死與固定：在解剖鏡下，用移液器反復(fù)從培養(yǎng)皿中吸取線蟲(chóng)，轉(zhuǎn)移到500μL塑料管中，將塑料管在57℃下溫浴2min后取出，以2500r/min離心3min，使線蟲(chóng)沉降到塑料管底部。用移液器慢慢將塑料管上層的水吸出，使管中僅留少量的線蟲(chóng)液(約10μL)，然后向管中加入線蟲(chóng)固定液(40％甲醛：甘油：蒸餾水＝10:2:88)，使線蟲(chóng)在固定液中浸泡24h以上，同時(shí)殺死和固定線蟲(chóng)。

c、將塑料管2000r/min離心3min，使線蟲(chóng)沉于管底。吸去上層線蟲(chóng)固定液后，用移液器將線蟲(chóng)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中(為防止線蟲(chóng)粘附于管壁，可用移液器吸取甘油水溶液反復(fù)吸取)，加入甘油水溶液(甘油：蒸餾水＝1:20)2mL，再將皿置于38℃恒溫培養(yǎng)箱中放置45h。此時(shí)皿中蒸餾水已全部蒸發(fā)，線蟲(chóng)已浸泡于甘油中，可用于制作線蟲(chóng)永久玻片。

d、取一干凈載玻片，在中間滴加2微升甘油，在解剖鏡下用挑針將已完全脫水的雌、雄線蟲(chóng)各數(shù)條移至甘油滴的中央，排列均勻。

e、在甘油滴兩邊對(duì)稱(chēng)放兩塊小蠟塊，加蓋玻片，置于64℃的加熱板上加熱，30s后待蠟塊融化后自然冷卻。

f、加貼標(biāo)簽，寫(xiě)明樣品號(hào)、寄主、產(chǎn)地、制作日期等，線蟲(chóng)永久玻片制作完成。

實(shí)施例2：

花生根結(jié)線蟲(chóng)簡(jiǎn)易永久玻片制作步驟：

a、清洗載玻片和蓋玻片；

b、花生根結(jié)線蟲(chóng)的殺死與固定：在解剖鏡下，用移液器反復(fù)從培養(yǎng)皿中吸取線蟲(chóng)，轉(zhuǎn)移到500μL塑料管中，將塑料管在60℃下溫浴2min后取出，以3000r/min離心1min，使線蟲(chóng)沉降到塑料管底部。用移液器慢慢將塑料管上層的水吸出，使管中僅留少量的線蟲(chóng)液(約10μL)，然后向管中加入線蟲(chóng)固定液(40％甲醛：甘油：蒸餾水＝15:5:94)，使線蟲(chóng)在固定液中浸泡36h以上，同時(shí)殺死和固定線蟲(chóng)。

c、將塑料管2500r/min離心4min，使線蟲(chóng)沉于管底。吸去上層線蟲(chóng)固定液后，用移液器將線蟲(chóng)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中(為防止線蟲(chóng)粘附于管壁，可用移液器吸取甘油水溶液反復(fù)吸取)，加入甘油水溶液(甘油：蒸餾水＝1:30)1.5mL，再將皿置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中放置40h。此時(shí)皿中蒸餾水已全部蒸發(fā)，線蟲(chóng)已浸泡于甘油中，可用于制作線蟲(chóng)永久玻片。

d、取一干凈載玻片，在中間滴加3微升甘油，在解剖鏡下用挑針將已完全脫水的雌、雄線蟲(chóng)各數(shù)條移至甘油滴的中央，排列均勻。

e、在甘油滴兩邊對(duì)稱(chēng)放兩塊小蠟塊，加蓋玻片，置于54℃的加熱板上加熱，38s后待蠟塊融化后自然冷卻。

f、加貼標(biāo)簽，寫(xiě)明樣品號(hào)、寄主、產(chǎn)地、制作日期等，線蟲(chóng)永久玻片制作完成。

實(shí)施例3：

燕麥真滑刃線蟲(chóng)簡(jiǎn)易永久玻片制作步驟：

a、清洗載玻片和蓋玻片；

b、燕麥真滑刃線蟲(chóng)的殺死與固定：在解剖鏡下，用移液器反復(fù)從培養(yǎng)皿中吸取線蟲(chóng)，轉(zhuǎn)移到500μL塑料管中，將塑料管在55℃下溫浴3min后取出，以2000r/min離心5min，使線蟲(chóng)沉降到塑料管底部。用移液器慢慢將塑料管上層的水吸出，使管中僅留少量的線蟲(chóng)液(約10μL)，然后向管中加入線蟲(chóng)固定液(40％甲醛：甘油：蒸餾水＝7:1:75)，同時(shí)殺死和固定線蟲(chóng)。使線蟲(chóng)在固定液中浸泡48h以上；

c、將塑料管3500r/min離心4min，使線蟲(chóng)沉于管底。吸去上層線蟲(chóng)固定液后，用移液器將線蟲(chóng)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中(為防止線蟲(chóng)粘附于管壁，可用移液器吸取甘油水溶液反復(fù)吸取)，加入甘油水溶液(甘油：蒸餾水＝1:10)2.5mL，再將皿置于40℃恒溫培養(yǎng)箱中放置40h。此時(shí)皿中蒸餾水已全部蒸發(fā)，線蟲(chóng)已浸泡于甘油中，可用于制作線蟲(chóng)永久玻片。

d、取一干凈載玻片，在中間滴加4微升甘油，在解剖鏡下用挑針將已完全脫水的雌、雄線蟲(chóng)各數(shù)條移至甘油滴的中央，排列均勻。

e、在甘油滴兩邊對(duì)稱(chēng)放兩塊小蠟塊，加蓋玻片，置于70℃的加熱板上加熱，24s后待蠟塊融化后自然冷卻。

f、加貼標(biāo)簽，寫(xiě)明樣品號(hào)、寄主、產(chǎn)地、制作日期等，線蟲(chóng)永久玻片制作完成。

其它線蟲(chóng)種類(lèi)都同該實(shí)施例，也能取得本發(fā)明所述的效果。

上述植物線蟲(chóng)永久玻片簡(jiǎn)易制作方法，從殺死、固定、脫水和制片的全過(guò)程僅需約3d，操作簡(jiǎn)單、快捷，對(duì)各種常見(jiàn)植物線蟲(chóng)都能獲得較好的永久玻片。

上述實(shí)施方式旨在舉例說(shuō)明本發(fā)明可為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)或使用，對(duì)上述實(shí)施方式進(jìn)行修改對(duì)本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的，故本發(fā)明包括但不限于上述實(shí)施方式，任何符合本權(quán)利要求書(shū)或說(shuō)明書(shū)描述，符合與本文所公開(kāi)的原理和新穎性、創(chuàng)造性特點(diǎn)的方法、工藝、產(chǎn)品，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。