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      人體組織工程皮膚的制備方法

      文檔序號:971636閱讀:222來源:國知局
      專利名稱:人體組織工程皮膚的制備方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種人體組織工程皮膚的制備方法,它是由具生物活性的人體表皮角元細(xì)胞及真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)而成的,具有與人體皮膚十分類似的組織結(jié)構(gòu)??稍谂R床上應(yīng)用于治療難愈性糖尿病性足底潰爛,靜脈性潰瘍以及燒傷,燙傷等皮膚創(chuàng)傷。
      背景技術(shù)
      根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會糖尿病病分會的最新流行病學(xué)調(diào)查資料,我國有近4000萬糖尿病患者,其常見慢性并發(fā)癥之一是糖尿病性足底潰爛,應(yīng)用常規(guī)的清創(chuàng)和鹽水敷裹治療,傷口愈合緩慢,愈合率低。而應(yīng)用清創(chuàng)及該發(fā)明的人工皮膚移植治療,傷口愈合時間明顯縮短,愈合率明顯提高。此外,我國燒傷病人的數(shù)目也十分驚人,達(dá)數(shù)十萬之多。深度燒傷創(chuàng)面的修復(fù)往往需要植皮。目前,對小面積深度燒傷多采用自體皮膚移植,然而,大面積深度燒傷時,自體供皮困難,采用結(jié)構(gòu)與功能和人體皮膚十分相似的人工皮膚移植,是最優(yōu)選擇。與自體皮膚移植一樣,人體組織工程皮膚移植可促進(jìn)創(chuàng)面的愈合,減少體液丟失,減少疤痕的形成,避免感染,減輕痛苦,并使創(chuàng)面皮膚得以早期修復(fù)。在過去的十年里,人工皮膚的研究和制備技術(shù)不斷深入和提高。雖有與本發(fā)明比較接近的現(xiàn)有技術(shù)專利,但其人體復(fù)合皮膚由培養(yǎng)的角元細(xì)胞表皮層及成分多元的基質(zhì)凝膠和培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞形成的真皮層組成。這種復(fù)合皮膚有其優(yōu)點(diǎn)。但它存在以下缺點(diǎn)真皮基質(zhì)形成過程中使用的成分多元,包括胃蛋白酶,殼多糖,彈性蛋白,透明質(zhì)酸,硫酸軟骨素,硫酸肝素,以及纖維粘連蛋白等,溶液種類繁多,而且工序十分復(fù)雜,特別是使用人膠原,取材困難,容易引發(fā)免疫疾病,造價昂貴,不利于大量生產(chǎn)及推廣應(yīng)用,至今未見有臨床應(yīng)用報導(dǎo)。另有專利文獻(xiàn)JP97,173,362,于1997年7月8日公開的日本專利。其基質(zhì)材料為膠原,甲殼素,殼多糖,明膠,透明質(zhì)酸,硫酸軟骨素和聚乙醇酸,細(xì)胞源自哺乳動物皮膚,經(jīng)培養(yǎng),凍干后制作的皮膚雖可長期保存,但它存在著以下缺點(diǎn)利用氨氣中和制作的膠原凝膠,不利于細(xì)胞的生長發(fā)育;抵抗膠原酶消化和抗感染能力較差;由於細(xì)胞培養(yǎng)的時間過短,培養(yǎng)出的人工皮膚在其結(jié)構(gòu)上與天然皮膚有較大差距,臨床應(yīng)用效果不佳;且基質(zhì)成分復(fù)雜。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明提供了一種人體組織工程皮膚的制備方法,包括人體表皮角元細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)制備,溶液的配制,基質(zhì)凝膠的形成及復(fù)合皮膚的培養(yǎng)。其基質(zhì)原料和工藝技術(shù)都有別于現(xiàn)有技術(shù),彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的人體組織工程皮膚無論在生物學(xué)及物理學(xué)特征上,還是在組織學(xué)檢查及臨床結(jié)果方面都比現(xiàn)有技術(shù)要好,可大批量生產(chǎn),并可直接應(yīng)用于臨床。
      本發(fā)明是由以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
      它包括下述步驟(1)人體表皮角元細(xì)胞的制備將新鮮離體人體皮膚0.8-1.2平方厘米放入磷酸緩沖液中,震蕩2-4分鐘,重復(fù)2-4次,再換到新的磷酸緩沖液內(nèi);然后將組織取出放入培養(yǎng)皿中,加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液,置于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中,培養(yǎng)20-24小時;剪碎至0.05~0.1平方毫米,均勻地將它們分布在培養(yǎng)皿中,讓組織干燥;加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液,置于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中,每2-4天換培養(yǎng)液1次,10-25天后可收集細(xì)胞;(2)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)制備將新鮮離體人體皮膚0.8-1.2平方厘米放入磷酸緩沖液中,震蕩2-4分鐘,重復(fù)2-4次,再換到新的磷酸緩沖液內(nèi);然后將組織取出放入培養(yǎng)皿中,加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液,置于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中,培養(yǎng)24-28小時;剪碎至0.1~0.4平方毫米,均勻地將它們分布在培養(yǎng)皿中,讓組織干燥;加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液;置于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中,8-10天后可長出成纖維細(xì)胞,再8-10天后可進(jìn)行分盤培養(yǎng),共可培養(yǎng)5~6代;(3)溶液的配制表皮細(xì)胞培養(yǎng)液的配制甲液加入0.1-0.5毫克/毫升的表皮細(xì)胞特異生長因子,0.5-2毫克/毫升清蛋白,0.4-0.6毫克/毫升透明質(zhì)酸,0.6-0.9毫克/毫升硫酸軟骨素,0.001-0.01毫克/毫升白細(xì)胞介素,0.001-0.008毫克/毫升干擾素,0.002-0.01毫克/毫升胰島素,0.001-0.005毫克/毫升甲狀腺素,0.002-0.008毫克/毫升霍亂毒素;乙液取8份含15-20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基與2份F12培養(yǎng)基混合;最后取1份甲液與9份乙液混合均勻;成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液的配制丙液加入0.1-0.8毫克/毫升的成纖維細(xì)胞特異生長因子,0.6-6毫克/毫升彈性蛋白,0.4-0.6毫克/毫升透明質(zhì)酸,0.6-0.9毫克/毫升硫酸軟骨素,0.001-0.01毫克/毫升白細(xì)胞介素,0.001-0.008毫克/毫升干擾素,0.002-0.01毫克/毫升胰島素,0.001-0.005毫克/毫升甲狀腺素,0.002-0.008毫克/毫升霍亂毒素;丁液取8份含15-20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液與2份F12培養(yǎng)液混合;最后取1份丙液與9份丁液混合均勻;所述的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液配制的甲液中還可以加入0.1摩爾濃度的N-(2-羥乙基)六氫比秦-N-(2-乙磺酸)和200單位/毫升青,鏈酶素。
      所述的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液配制的丙液中還可以加入0.1摩爾濃度的N-(2-羥乙基)六氫比秦-N-(2-乙磺酸)和200單位/毫升青,鏈酶素。
      (4)基質(zhì)凝膠的形成將濃度為3毫克/毫升的I型豬膠原蛋白8份,10倍濃度F12的培養(yǎng)液1份,0.1摩爾濃度的氫氧化鈉溶液0.5份,在冰浴中混合后,加入0.5份含3×106的成纖維細(xì)胞的F12培養(yǎng)液;然后分別取上述5-6毫升的這一成纖維細(xì)胞和凝膠混合液到100毫米濾膜培養(yǎng)皿中,置于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中,使其凝固;再加DMEM培養(yǎng)液,于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)7-10天;(5)復(fù)合皮膚的培養(yǎng)將培養(yǎng)成熟的表皮角元細(xì)胞接種于已制備好的基質(zhì)凝膠上,加表皮細(xì)胞培養(yǎng)液,放入恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng),每2-4天換培養(yǎng)液1次,7-10天后將濾膜培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液吸干,外周仍用表皮細(xì)胞培養(yǎng)液,再培養(yǎng)10-15天;(6)保存與運(yùn)輸將培養(yǎng)成熟的復(fù)合皮膚置于表皮細(xì)胞培養(yǎng)液的瓊脂固體培養(yǎng)基上,于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳保存箱內(nèi)運(yùn)輸。
      本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有如下特點(diǎn)
      1)培養(yǎng)液的改進(jìn)經(jīng)過一系列的對比試驗(yàn),本發(fā)明專門設(shè)計出FAD-I型和FAD-II型培養(yǎng)液。除了含有基本的營養(yǎng)成分和因子外,F(xiàn)AD-I型培養(yǎng)液含表皮角元細(xì)胞特異生長因子(EKGF),用于表皮角元細(xì)胞的獨(dú)立培養(yǎng);FAD-II型培養(yǎng)液則含有成纖維細(xì)胞特異生長因子(FBGF),用于成纖維細(xì)胞的獨(dú)立培養(yǎng)。FAD-I型和FAD-II型二合一培養(yǎng)液則用于復(fù)合皮膚的培養(yǎng)。運(yùn)用FAD-I型和FAD-II型培養(yǎng)液分別培養(yǎng)表皮角元細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,可使這兩種細(xì)胞的增殖速率顯著高于某些報道所使用的DMEM培養(yǎng)液。
      2)保存和運(yùn)輸本發(fā)明特別設(shè)計的FAD-I型和FAD-II型瓊脂固體培養(yǎng)基能夠保養(yǎng)滋嫩成熟的復(fù)合皮膚達(dá)7至10天仍具有完好的生物學(xué)活性,可成功地用于植皮。早于報道過的5天。
      3)凝膠配制本發(fā)明的凝膠配制使用I型豬膠原蛋白,完全不同于已報道過得人膠原和牛膠原。首先,豬膠原取材極為容易,從而解決了人膠原取材極為不易的難題;豬膠原蛋白的氨基酸組成比例及蛋白質(zhì)構(gòu)象比牛膠原蛋白更接近人膠原蛋白,因此,含豬膠原蛋白的人工皮膚更安全更容易被人體組織所接納,融合。
      按照本發(fā)明所述方法制備的人工皮膚具備良好的生物學(xué),組織學(xué)和物理學(xué)特征,它具有良好的彈性和柔韌性,抗壓力和拉力的能力強(qiáng),其大小和形狀可隨創(chuàng)面而改變,移植手術(shù)簡單;有保護(hù),分泌,和代謝功能,能夠防止微生物的侵襲和感染;移植后換藥次數(shù)減少,術(shù)后護(hù)理也簡單。組織學(xué)檢查顯示,人工皮膚表皮分化良好,層次清楚,有角質(zhì)層,棘層,基底層,真皮層由成纖維細(xì)胞均勻分布于基質(zhì)內(nèi)而成。與真實(shí)皮膚不同是本發(fā)明的人工皮膚不含色素細(xì)胞,郎格罕氏細(xì)胞,巨嗜細(xì)胞,白細(xì)胞,也沒有血管,毛囊,汗腺等結(jié)構(gòu),故免疫排斥反應(yīng)機(jī)率極少。
      臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,移植后的人工皮膚能很快覆蓋創(chuàng)面并與周圍皮膚融合成一體,產(chǎn)生邊緣效應(yīng),漸漸地真皮層中有大量的血管腔形成,膠原排列由紊亂變成規(guī)則的水平排列,表皮分化良好,有表皮釘突形成。
      具體實(shí)施例方式
      實(shí)施例1(A)將新鮮離體人體皮膚(保存于0.1摩爾濃度的磷酸緩沖液(PBS),pH7.4,4度,少于24小時)0.8平方厘米從磷酸緩沖液管轉(zhuǎn)入含10單位青霉素和鏈霉素/毫升的磷酸緩沖液管(20毫升)。震蕩2分鐘,重復(fù)2次,再換到新的只含20毫升磷酸緩沖液管內(nèi)。然后將組織取出放入培養(yǎng)皿中,去掉多余的皮下組織,轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)皿,加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-I),置于37度溫箱,培養(yǎng)20小時。之后,轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中,剪碎至0.05平方毫米,均勻地將它們分布在培養(yǎng)皿中,放在通風(fēng)箱中1小時,讓組織干燥,粘附于培養(yǎng)皿底部。輕輕地加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-I),放入37度溫箱培養(yǎng),每2天換培養(yǎng)液1次,2天后角元細(xì)胞長出,10天后可收集角元細(xì)胞。(B)將新鮮離體人體皮膚(保存于0.1摩爾濃度的磷酸緩沖液(PBS),pH7.4,4度,少于24小時)0.8平方厘米從磷酸緩沖液管轉(zhuǎn)入含10單位青霉素和鏈霉素/毫升的磷酸緩沖液管(20毫升)。震蕩2分鐘,重復(fù)2次,再換到新的只含30毫升磷酸緩沖液管內(nèi)。然后將組織取出放入培養(yǎng)皿中,去掉多余的皮下組織,轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)皿,加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-II),置于37度溫箱,培養(yǎng)24小時。之后,轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中,剪碎至0.1平方毫米大小,均勻地將它們分布在培養(yǎng)皿中,放在通風(fēng)箱中2小時,讓組織干燥,粘附于培養(yǎng)皿底部。最后加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-II)。在37度溫箱內(nèi)培養(yǎng)8天后可長出成纖維細(xì)胞,再8天后可進(jìn)行分盤培養(yǎng),共可培養(yǎng)5代。(C)將濃度為3毫克/毫升的高度純化的I型豬膠原蛋白8毫升加入10倍濃度F12的培養(yǎng)液1毫升,再加入0.1摩爾濃度的氫氧化鈉(NaOH)溶液0.5毫升,在冰浴中(1-4度)混合后(pH7.4),加入3×106的成纖維細(xì)胞。然后分別取5毫升的這一成纖維細(xì)胞和凝膠混合液到100毫米濾膜培養(yǎng)皿中,置37度溫箱內(nèi)1小時使其凝固。再加DMEM培養(yǎng)液,37度溫箱內(nèi)培養(yǎng)7天。(D)將培養(yǎng)成熟的表皮角元細(xì)胞接種于已制備好的基質(zhì)凝膠上,加FAD-I培養(yǎng)液,放入37度溫箱培養(yǎng),7天后將濾膜培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液吸干,外周仍用FAD-I培養(yǎng)液,再培養(yǎng)10天。
      所述的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-I)的配制是在無菌條件下配制如下溶液甲液在0.1摩爾濃度的N-(2-羥乙基)六氫比秦-N-(2-乙磺酸,PH7.4,)(HEPES)中,加入0.1毫克/毫升的表皮細(xì)胞特異生長因子(EFC),0.5毫克/毫升清蛋白,200單位/毫升青,鏈酶素,0.4毫克/毫升透明質(zhì)酸,0.6毫克/毫升硫酸軟骨素,0.001毫克/毫升白細(xì)胞介素,0.001毫克/毫升干擾素,0.002毫克/毫升胰島素,0.001毫克/毫升甲狀腺素,0.002毫克/毫升霍亂毒素;乙液取8份含15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基與2份F12培養(yǎng)基混合;最后取1份甲液與9份乙液混合均勻。
      所述的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-II)的配制是在無菌條件下配制如下溶液丙液在0.1摩爾濃度的N-(2-羥乙基)六氫比秦-N-(2-乙磺酸,PH7.4,)(HEPES)中,加入0.1毫克/毫升的成纖維細(xì)胞特異生長因子(FBGF),0.6毫克/毫升彈性蛋白,200單位/毫升青,鏈酶素,0.4毫克/毫升透明質(zhì)酸,0.6毫克/毫升硫酸軟骨素,0.001毫克/毫升白細(xì)胞介素,0.001毫克/毫升干擾素,0.002毫克/毫升胰島素,0.001毫克/毫升甲狀腺素,0.002毫克/毫升霍亂毒素;丁液取8份含15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液與2份F12培養(yǎng)液混合;最后取1份丙液與9份丁液混合均勻。
      實(shí)施例2(A)將新鮮離體人體皮膚1平方厘米從磷酸緩沖液管轉(zhuǎn)入含10單位青霉素和鏈霉素/毫升的磷酸緩沖液管。震蕩3分鐘,重復(fù)3次,再換到新的只含20毫升磷酸緩沖液管內(nèi)。然后將組織取出放入培養(yǎng)皿中,去掉多余的皮下組織,轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)皿,加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-I),置于37度溫箱,培養(yǎng)22小時。之后,轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中,剪碎至0.08平方毫米大小,均勻地將它們分布在培養(yǎng)皿中,放在通風(fēng)箱中1小時,讓組織干燥,粘附于培養(yǎng)皿底部。輕輕地加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液,放入37度溫箱培養(yǎng),每2天換培養(yǎng)液1次,約2天后角元細(xì)胞長出,約12天后可收集角元細(xì)胞。(B)將新鮮離體人體皮膚1平方厘米從磷酸緩沖液管轉(zhuǎn)入含10單位青霉素和鏈霉素/毫升的磷酸緩沖液管。震蕩3分鐘,重復(fù)3次,再換到新的只含30毫升磷酸緩沖液管內(nèi)。然后將組織取出放入培養(yǎng)皿中,去掉多余的皮下組織,轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)皿,加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-II),置于37度溫箱,培養(yǎng)26小時。之后,轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中,剪碎至0.3平方毫米,均勻地將它們分布在培養(yǎng)皿中,放在通風(fēng)箱中2小時,讓組織干燥,粘附于培養(yǎng)皿底部。最后加入的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液。在37度溫箱內(nèi)培養(yǎng)約9天后可長出成纖維細(xì)胞,再9天后可進(jìn)行分盤培養(yǎng),共可培養(yǎng)6代。(C)將濃度為3毫克/毫升的高度純化的I型豬膠原蛋白8毫升加入F12/10倍濃度的培養(yǎng)液1毫升,再加入0.1摩爾濃度的氫氧化鈉溶液0.5毫升,在冰浴中混合后(pH7.4),加入3×106的成纖維細(xì)胞。然后分別取5毫升的這一成纖維細(xì)胞和凝膠混合液到100毫米濾膜培養(yǎng)皿中,置37度溫箱內(nèi)1小時使其凝固。再加DMEM培養(yǎng)液,37度溫箱內(nèi)培養(yǎng)7天。(D)將培養(yǎng)成熟的表皮角元細(xì)胞接種于已制備好的基質(zhì)凝膠上,加FAD-I培養(yǎng)液,放入37度溫箱培養(yǎng),7天后將濾膜培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液吸干,外周仍用FAD-I培養(yǎng)液,再培養(yǎng)10天。
      所述的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-I)的配制是在無菌條件下配制如下溶液甲液在0.1摩爾濃度的N-(2-羥乙基)六氫比秦-N-(2-乙磺酸,PH7.4,)(HEPES)中,加入0.25毫克/毫升的表皮細(xì)胞特異生長因子(EFC),1毫克/毫升清蛋白,200單位/毫升青,鏈酶素,0.5毫克/毫升透明質(zhì)酸,0.7毫克/毫升硫酸軟骨素,0.005毫克/毫升白細(xì)胞介素,0.005毫克/毫升干擾素,0.006毫克/毫升胰島素,0.002毫克/毫升甲狀腺素,0.005毫克/毫升霍亂毒素;乙液取8份含18%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基與2份F12培養(yǎng)基混合;最后取1份甲液與9份乙液混合均勻。
      所述的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-II)的配制是在無菌條件下配制如下溶液丙液在0.1摩爾濃度的N-(2-羥乙基)六氫比秦-N-(2-乙磺酸,PH7.4,)(HEPES)中,加入0.5毫克/毫升的成纖維細(xì)胞特異生長因子(FBGF),3毫克/毫升彈性蛋白,200單位/毫升青,鏈酶素,0.5毫克/毫升透明質(zhì)酸,0.8毫克/毫升硫酸軟骨素,0.005毫克/毫升白細(xì)胞介素,0.005毫克/毫升干擾素,0.006毫克/毫升胰島素,0.003毫克/毫升甲狀腺素,0.005毫克/毫升霍亂毒素;丁液取8份含18%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液與2份F12培養(yǎng)液混合;最后取1份丙液與9份丁液混合均勻。
      實(shí)施例3(A)將新鮮離體人體皮膚1.2平方厘米從磷酸緩沖液管轉(zhuǎn)入含10單位青霉素和鏈霉素/毫升的磷酸緩沖液管。震蕩4分鐘,重復(fù)4次,再換到新的只含20毫升磷酸緩沖液管內(nèi)。然后將組織取出放入培養(yǎng)皿中,加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-I),置于37度溫箱,培養(yǎng)24小時。之后,轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中,剪碎至0.1平方毫米,均勻地將它們分布在培養(yǎng)皿中,組織經(jīng)干燥后,粘附于培養(yǎng)皿底部。加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-I),放入37度溫箱培養(yǎng),每2天換培養(yǎng)液1次,3天后角元細(xì)胞長出,15天后可收集角元細(xì)胞。(B)將新鮮離體人體皮膚1.2平方厘米從磷酸緩沖液管轉(zhuǎn)入含10單位青霉素和鏈霉素/毫升的磷酸緩沖液管。震蕩4分鐘,重復(fù)4次,再換到新的只含30毫升磷酸緩沖液管內(nèi)。然后將組織取出放入培養(yǎng)皿中,加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-II),置于37度溫箱,培養(yǎng)28小時。之后,轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中,剪碎至0.4平方毫米,均勻地將它們分布在培養(yǎng)皿中,組織經(jīng)干燥后,粘附于培養(yǎng)皿底部。最后加入的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-II)。在37度溫箱內(nèi)培養(yǎng)10天后可長出成纖維細(xì)胞,再10天后可進(jìn)行分盤培養(yǎng),共可培養(yǎng)6代。(C)將濃度為3毫克/毫升的高度純化的I型豬膠原蛋白8毫升加入10倍濃度F12的培養(yǎng)液1毫升,再加入0.1摩爾濃度的氫氧化鈉溶液0.5毫升,在冰浴中混合后(pH7.4),加入3×106的成纖維細(xì)胞。然后分別取6毫升的這一成纖維細(xì)胞和凝膠混合液到100毫米濾膜培養(yǎng)皿中,置37度溫箱內(nèi)1小時使其凝固。再加DMEM培養(yǎng)液,37度溫箱內(nèi)培養(yǎng)7天。(D)將培養(yǎng)成熟的表皮角元細(xì)胞接種于已制備好的基質(zhì)凝膠上,加FAD-I培養(yǎng)液,放入37度溫箱培養(yǎng),7天后將濾膜培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液吸干,外周仍用FAD-I培養(yǎng)液,再培養(yǎng)10天。
      所述的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-I)的配制是在無菌條件下配制如下溶液甲液在0.1摩爾濃度的N-(2-羥乙基)六氫比秦-N-(2-乙磺酸),PH7.4,(HEPES)中,加入0.5毫克/毫升的表皮細(xì)胞特異生長因子(EFC),2毫克/毫升清蛋白,200單位/毫升青,鏈酶素,0.6毫克/毫升透明質(zhì)酸,0.9毫克/毫升硫酸軟骨素,0.01毫克/毫升白細(xì)胞介素,0.008毫克/毫升干擾素,0.01毫克/毫升胰島素,0.005毫克/毫升甲狀腺素,0.008毫克/毫升霍亂毒素;乙液取8份含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基與2份F12培養(yǎng)基混合;最后取1份甲液與9份乙液混合均勻。
      所述的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液(FAD-II)的配制丙液在0.1摩爾濃度的N-(2-羥乙基)六氫比秦-N-(2-乙磺酸,PH7.4,)(HEPES)中,加入0.8毫克/毫升的成纖維細(xì)胞特異生長因子(FBGF),6毫克/毫升彈性蛋白,200單位/毫升青,鏈酶素,0.6毫克/毫升透明質(zhì)酸,0.9毫克/毫升硫酸軟骨素,0.01毫克/毫升白細(xì)胞介素,0.008毫克/毫升干擾素,0.01毫克/毫升胰島素,0.005毫克/毫升甲狀腺素,0.008毫克/毫升霍亂毒素;丁液取8份含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液與2份F12培養(yǎng)液混合;最后取1份丙液與9份丁液混合均勻。
      所述的人體皮膚可以采用死亡的新生兒包皮或新生兒包皮,早產(chǎn)兒包皮或早產(chǎn)兒皮膚,成人包皮等。
      實(shí)施例4裸鼠皮膚移植實(shí)驗(yàn)用本發(fā)明的人工組織工程皮膚對背部皮膚缺失的裸鼠進(jìn)行皮膚移植試驗(yàn)。移植第5天起,人工皮膚已與周圍正常組織迅速融合,應(yīng)用組織學(xué)方法已可觀察到微血管開始向人工皮膚的真皮成纖維細(xì)胞層內(nèi)生長。隨著時間的推移,微血管越來越豐富,成纖維細(xì)胞增殖顯著,細(xì)胞外基質(zhì)分泌豐富。表皮角元細(xì)胞生長分化狀況良好,層次分明。術(shù)后二周,創(chuàng)面愈合良好。
      權(quán)利要求
      1.一種人體組織工程皮膚的制備方法,其特征在于它包括下述步驟(1)人體表皮角元細(xì)胞的制備將新鮮離體人體皮膚0.8-1.2平方厘米放入磷酸緩沖液中,震蕩2-4分鐘,重復(fù)2-4次,再換到新的磷酸緩沖液內(nèi);然后將組織取出放入培養(yǎng)皿中,加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液,置于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中,培養(yǎng)20-24小時;剪碎至0.05~0.1平方毫米,均勻地將它們分布在培養(yǎng)皿中,讓組織干燥;加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液,置于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中,每2-4天換培養(yǎng)液1次,10-25天后可收集細(xì)胞;(2)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)制備將新鮮離體人體皮膚0.8-1.2平方厘米放入磷酸緩沖液中,震蕩2-4分鐘,重復(fù)2-4次,再換到新的磷酸緩沖液內(nèi);然后將組織取出放入培養(yǎng)皿中,加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液,置于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中,培養(yǎng)24-28小時;剪碎至0.1~0.4平方毫米,均勻地將它們分布在培養(yǎng)皿中,讓組織干燥;加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液;置于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中,8-10天后可長出成纖維細(xì)胞,再8-10天后可進(jìn)行分盤培養(yǎng),共可培養(yǎng)5~6代;(3)溶液的配制表皮細(xì)胞培養(yǎng)液的配制甲液加入0.1-0.5毫克/毫升的表皮細(xì)胞特異生長因子,0.5-2毫克/毫升清蛋白,0.4-0.6毫克/毫升透明質(zhì)酸,0.6-0.9毫克/毫升硫酸軟骨素,0.001-0.01毫克/毫升白細(xì)胞介素,0.001-0.008毫克/毫升干擾素,0.002-0.01毫克/毫升胰島素,0.001-0.005毫克/毫升甲狀腺素,0.002-0.008毫克/毫升霍亂毒素;乙液取8份含15-20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基與2份F12培養(yǎng)基混合;最后取1份甲液與9份乙液混合均勻;成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液的配制丙液加入0.1-0.8毫克/毫升的成纖維細(xì)胞特異生長因子,0.6-6毫克/毫升彈性蛋白,0.4-0.6毫克/毫升透明質(zhì)酸,0.6-0.9毫克/毫升硫酸軟骨素,0.001-0.01毫克/毫升白細(xì)胞介素,0.001-0.008毫克/毫升干擾素,0.002-0.01毫克/毫升胰島素,0.001-0.005毫克/毫升甲狀腺素,0.002-0.008毫克/毫升霍亂毒素;丁液取8份含15-20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液與2份F12培養(yǎng)液混合;最后取1份丙液與9份丁液混合均勻;(4)基質(zhì)凝膠的形成將濃度為3毫克/毫升的I型豬膠原蛋白8份,10倍濃度F12的培養(yǎng)液1份,0.1摩爾濃度的氫氧化鈉溶液0.5份,在冰浴中混合后,加入0.5份含3×106的成纖維細(xì)胞的F12培養(yǎng)液;然后分別取上述5-6毫升的這一成纖維細(xì)胞和凝膠混合液到100毫米濾膜培養(yǎng)皿中,置于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中,使其凝固;再加DMEM培養(yǎng)液,于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)7-10天;(5)復(fù)合皮膚的培養(yǎng)將培養(yǎng)成熟的表皮角元細(xì)胞接種于已制備好的基質(zhì)凝膠上,加表皮細(xì)胞培養(yǎng)液,放入恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng),每2-4天換培養(yǎng)液1次,7-10天后將濾膜培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液吸干,外周仍用表皮細(xì)胞培養(yǎng)液,再培養(yǎng)10-15天;(6)保存與運(yùn)輸將培養(yǎng)成熟的復(fù)合皮膚置于表皮細(xì)胞培養(yǎng)液的瓊脂固體培養(yǎng)基上,于恒定37℃,95%氧氣和5%二氧化碳保存箱內(nèi)運(yùn)輸。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體組織工程皮膚的制備方法,其特征在于所述的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液配制的甲液中還可以加入0.1摩爾濃度的N-(2-羥乙基)六氫比秦-N-(2-乙磺酸)和200單位/毫升青,鏈酶素。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體組織工程皮膚的制備方法,其特征在于所述的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液配制的丙液中還可以加入0.1摩爾濃度的N-(2-羥乙基)六氫比秦-N-(2-乙磺酸)和200單位/毫升青,鏈酶素。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種人體組織工程皮膚的制備方法,包括下述步驟(1)人體表皮角元細(xì)胞的制備;(2)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)制備;(3)表皮細(xì)胞培養(yǎng)液的配制和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液的配制;(4)基質(zhì)凝膠的形成;(5)復(fù)合皮膚的培養(yǎng);(6)保存與運(yùn)輸。其基質(zhì)原料和工藝技術(shù)都有別于現(xiàn)有技術(shù),彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的人體組織工程皮膚無論在生物學(xué)及物理學(xué)特征上,還是在組織學(xué)檢查及臨床結(jié)果方面都比現(xiàn)有技術(shù)要好,可大批量生產(chǎn),并可直接應(yīng)用于臨床。
      文檔編號A61L27/60GK1607012SQ200310104830
      公開日2005年4月20日 申請日期2003年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月13日
      發(fā)明者劉凱 申請人:劉凱
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