專利名稱：通過抑制tap活性增強(qiáng)mhcⅰ類分子對(duì)外來表位的展示的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過抑制TAP活性增強(qiáng)MHC I類分子上的外來表位展示的方法。
背景技術(shù)：
MHC(主要組織相容性復(fù)合體)I類分子是由重鏈(HC)和β2-微球蛋白(β2m)組成的異二聚體，它幾乎存在于每一種細(xì)胞的細(xì)胞膜表面。MHC I類分子含有由重鏈形成的溝，溝中可裝載10個(gè)氨基酸左右的肽。所得MHC I類/肽復(fù)合物由在細(xì)胞免疫中起作用的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)上的T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別。因此，將MHC I類分子上展示的肽稱為“表位”(抗原決定簇)。
糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面存在的、被稱作TAP(與抗原加工有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將得自胞質(zhì)中產(chǎn)生的自身抗原、病毒抗原和腫瘤抗原的肽片段運(yùn)送至糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在此它們與MHC I類重鏈和β2m形成穩(wěn)定的MHC I類/肽復(fù)合物。β2-微球蛋白分子所起的作用是維持MHC I類分子三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并將重鏈運(yùn)送至細(xì)胞表面(Tasuku Honjo and Takeshi Watanabe(ed.)，“Immune SystemRecognition，differentiation，and proliferation”，The MolecularBiology Society of Japan(ed.)，Maruzen Co.，Ltd.，Tokyop117-118)。已知未與肽結(jié)合的空MHC I類分子在37℃的培養(yǎng)條件下非常不穩(wěn)定。
表位，即MHC I類分子上展示的肽是很重要的分子，它可引發(fā)針對(duì)某種抗原的特異性細(xì)胞免疫力。表位是開發(fā)肽疫苗所必不可少的組分，所述肽疫苗可用作抗病毒(如HIV)感染或抗癌癥的免疫治療劑。然而，得自很多種病毒抗原和腫瘤抗原的主要表位的肽與MHC I類分子的結(jié)合活性較弱。因此，一般說來，當(dāng)將這些肽單獨(dú)用作疫苗時(shí)，由于它們的穩(wěn)定性較低，預(yù)期不會(huì)有什么效果。迄今為止，已將人工表位有效用于黑素瘤患者的臨床研究，所述表位具有氨基酸取代，籍此增強(qiáng)與MHC I類分子的結(jié)合能力卻不會(huì)失去其抗原性。然而，鑒定和開發(fā)這種穩(wěn)定性和抗原性皆有所改良的表位卻是棘手和困難的，不會(huì)總能得到想要的表位。
另一方面，人們發(fā)現(xiàn)β2m可以增強(qiáng)MHC I類分子上肽的穩(wěn)定性，基于此發(fā)現(xiàn)，開發(fā)出使用β2m的佐劑作用的系統(tǒng)。
最近，人們嘗試表達(dá)MHC I類/肽復(fù)合物，其中表位肽與MHC I類分子和MHC II類分子或β2m融合(Uger，R.A.and Barber，B.H.，J.Immunol.1601598-1605(1998)；White，J.et al.，J.Immunol.1622671-2676(1999)；Kang，X.et al.，Cancer Res.57202-205(1997)；Uger，R.A.et al.，J.Immunol.1626024-6028(1999)；美國專利號(hào)5,869,270)。據(jù)報(bào)道，與單獨(dú)使用的肽，特別是那些使用與MHC I類分子的結(jié)合活性較弱的表位構(gòu)建出的肽相比，通過使用接頭使表位肽序列與β2m的N-末端融合(與表位相連的β2m；e/β2m)，這些復(fù)合物表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性和CTL識(shí)別。
目前，通過在大腸桿菌中分開表達(dá)和純化重鏈(HC)和β2m蛋白，接著在體外使這些分子與合成肽一起折迭，即可制備出含有人MHC I類分子的MHC I類/肽復(fù)合物。與之形成對(duì)照的是，關(guān)于小鼠MHC I類分子，有人報(bào)道過使用桿狀病毒載體構(gòu)建出得自昆蟲細(xì)胞的MHC I類/肽復(fù)合物(White，J.et al.，J.Immunol.1622671-2676(1999))。在此系統(tǒng)中，在用桿狀病毒共感染的細(xì)胞中構(gòu)建出MHC I類/肽復(fù)合物，所述病毒分別表達(dá)MHC I類的重鏈和與表位相連的β2m。由于桿狀病毒載體系統(tǒng)表達(dá)位于昆蟲細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)有效啟動(dòng)子下游的外源基因，因此難以將該系統(tǒng)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞(國際公開號(hào)Hei 6-502990的已
公開日語譯文)。另外，盡管Punnonen等人已公開用于DNA改組的基因疫苗載體(Punnonen，J.et al.，Genetic VaccineVector Engineering，美國專利申請(qǐng)流水號(hào)20010006950)，但與表位融合的MHC I類重鏈或β2m仍未被述及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供通過抑制TAP活性增強(qiáng)MHC I類分子上的外來表位展示的方法。
本發(fā)明人利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建出編碼與表位相連的β2m的基因，以使用感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)與表位相連的β2m分子，并開發(fā)出在這些細(xì)胞中產(chǎn)生MHC I類/肽復(fù)合物的系統(tǒng)。然而，由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面有很多種MHC I類分子，各個(gè)MHC I類分子展示不同種得自細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)的肽，因此，當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)與表位相連的β2m時(shí)，同與表位相連的β2m形成復(fù)合物所必需的MHC I類分子的可利用水平會(huì)隨著肽水平的降低而降低。
本發(fā)明人認(rèn)為增加能展示所需表位的MHC I類分子的出現(xiàn)頻率對(duì)于誘導(dǎo)免疫力非常重要。例如，為了使用MHC I類/肽復(fù)合物量化抗原-特異性CTL的頻率，已開發(fā)出利用“MHC I類/肽四聚體復(fù)合物(四聚體)”的方法(Altman J.D.et al.，Science 27494-96(1996))。通過使用生物素-親和素結(jié)合系統(tǒng)使單體MHC I類/肽復(fù)合物四聚體化，接著加入熒光標(biāo)記，制備出所述四聚體，并將其用于FACS分析。由于該方法可以直接分析分離自個(gè)體的外周血單核細(xì)胞樣品，因此該方法不僅簡單，能直接反映出每個(gè)個(gè)體中的頻率，還具有高敏感性和高特異性(Wilson，J.D.K.et al.，J.Exp.Med.188785-790(1998)；Kuroda，M.J.et al.，J.Exp.Med.1871373-1381(1998))。本發(fā)明人注意到下述細(xì)節(jié)在分析上述MHC I類/肽復(fù)合物時(shí)，盡管因比例為1∶1的單體MHC I類/肽復(fù)合物與TCR的結(jié)合較弱，使原先嘗試的FACS分析未能成功，但單體MHC I類/肽復(fù)合物的四聚體化，即MHC I類/肽復(fù)合物與TCR多重結(jié)合的同時(shí)存在，使得首次分析該復(fù)合物成為可能。
另外，在上述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的與表位相連的β2m表達(dá)系統(tǒng)中，當(dāng)展示多種得自細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的肽時(shí)，附近出現(xiàn)展示所需表位的MHC I類/肽復(fù)合物的可能性也許會(huì)降低。
考慮到上述兩點(diǎn)，本發(fā)明人推測(cè)如果位于細(xì)胞膜表面的MHC I類/肽復(fù)合物上能有效展示一種表位，所述表位也能被TCR有效識(shí)別，即CTL可以被有效激活。例如，迄今為止，據(jù)報(bào)道通過在預(yù)先用酸處理的細(xì)胞表面添加高濃度的單個(gè)合成肽，然后洗滌以除去MHC I類/肽復(fù)合物上展示的肽，即可有效激活CTL(Langlade-Demoyen，P. et al.，Int.Immunol.61759-1766(1994))。然而，盡管該操作實(shí)際上可以在體外進(jìn)行，但不可能在體內(nèi)進(jìn)行。另外，難以將所述操作用于免疫療法，當(dāng)考慮到如上文所述，肽的穩(wěn)定性較低時(shí)，更是如此。
因此，本發(fā)明人想通過使用能抑制TAP-介導(dǎo)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)的分子來抑制源自細(xì)胞的抗原呈遞，從而僅呈遞與β2m融合的所需表位以用作抗原。首先構(gòu)建重組仙臺(tái)病毒(SeV)載體，該載體表達(dá)得自I型單純皰疹病毒(HSV-1)的ICP47(Hill，A.et al.，Nature 375411-415(1995)；Fruh，K.et al.，Nature 375415-418(1995))和得自人巨細(xì)胞病毒(CMV)、已知為TAP-抑制因子的US6(Ahn，K.et al.，Immunity 6613-621(1997)；Hengel，H.et al.，Immunity 6623-632(1997))。將這些載體導(dǎo)入人CD4+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞系H9和MT-2細(xì)胞，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面的MHC I類/肽復(fù)合物。結(jié)果，盡管未在被野生型SeV感染的對(duì)照細(xì)胞中檢測(cè)到MHC I類/肽復(fù)合物水平的顯著變化，但在被表達(dá)TAP-抑制性分子US6的SeV載體感染的細(xì)胞中，MHC I類/肽復(fù)合物水平隨著時(shí)間而降低，這表明新的(從頭開始)MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)受到抑制。
接著，用表達(dá)ICP47或US6的SeV載體感染上述細(xì)胞，然后通過進(jìn)一步用酸處理細(xì)胞，使細(xì)胞表面表達(dá)的表位解離。該處理能有效降低最初存在于細(xì)胞表面的MHC I類/肽復(fù)合物水平。此外，本發(fā)明人進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，想通過在細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)TAP-抑制性分子以及與表位相連的β2m，在細(xì)胞表面高水平地表達(dá)具有單個(gè)表位的MHC I類/肽復(fù)合物。為此，本發(fā)明人構(gòu)建出同時(shí)表達(dá)TAP-抑制性分子(US6)以及與表位相連的β2m的載體。載體表達(dá)的表位與β2m融合，因此所述表位在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的存在與TAP不相關(guān)。使用該載體，通過TAP-抑制性因子的作用降低展示內(nèi)源性蛋白質(zhì)衍生肽的MHC I類/肽復(fù)合物的水平，籍此本發(fā)明人成功地以高頻率表達(dá)出MHC I類/肽復(fù)合物，所述復(fù)合物含有與β2m結(jié)合的所需外來表位。因此，本發(fā)明首次提供了一個(gè)新概念，即將TAP-抑制性分子用于“在細(xì)胞表面高頻率表達(dá)具有單個(gè)肽的MHC I類/肽復(fù)合物的系統(tǒng)”，所述系統(tǒng)有望用作免疫療法所用的疫苗。
本發(fā)明可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以高純度表達(dá)MHC I類/肽復(fù)合物，所述復(fù)合物含有所需的與表位相連的β2m。例如，如實(shí)施例中所示，通過將感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞，其中所述載體表達(dá)與表位結(jié)合的β2m或MHC I類重鏈，并且在TAP抑制劑的存在下表達(dá)所述載體，就可以優(yōu)先在細(xì)胞表面形成含有由導(dǎo)入基因表達(dá)的表位的MHC I類/肽復(fù)合物。
如實(shí)施例中所示，與用得自HIV-1 Nef蛋白的合成表位肽脈沖的細(xì)胞相比，同時(shí)表達(dá)與表位相連的β2m(例如與得自HIV-1 Nef蛋白的表位結(jié)合的β2m)和MHC I類重鏈(HLA-A*2402)的細(xì)胞被抗原-特異性CTL同等或更有效地識(shí)別。另外，通過在靶細(xì)胞的培養(yǎng)物溶液中加入從細(xì)胞(其中已導(dǎo)入表達(dá)與表位相連的β2m的SeV載體)中回收的與表位相連的β2m，與表位相連的β2m能誘導(dǎo)針對(duì)靶細(xì)胞的抗原特異性CTL反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明編碼與表位相連的β2m的載體可用于體內(nèi)或來自體內(nèi)的基因治療，從而誘導(dǎo)抗原-特異性免疫應(yīng)答。在此系統(tǒng)中使用TAP抑制劑使得以較高純度展示所需表位成為可能。通過在TAP-抑制蛋白的存在下，在個(gè)體中產(chǎn)生所需MHC I類/肽復(fù)合物，可以實(shí)現(xiàn)十分有效的免疫療法。
因此，本發(fā)明人建立了通過抑制TAP來抑制內(nèi)源性表位的展示，從而有效展示外來表位的方法。在TAP抑制劑的存在下，體內(nèi)或回體導(dǎo)入載體能夠誘導(dǎo)抗原-特異性細(xì)胞免疫力，其中所述載體表達(dá)與表位融合的MHC I類重鏈或β2m。例如，本發(fā)明的方法可用于誘導(dǎo)針對(duì)病毒或細(xì)菌感染所致傳染性疾病的保護(hù)性免疫力，并可用于抗癌免疫療法。
即，本發(fā)明涉及通過抑制TAP活性增強(qiáng)MHC I類分子上的外來表位展示的方法，更具體地涉及(1)增強(qiáng)MHC I類分子上的外來表位展示的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)抑制細(xì)胞中的TAP活性；和(b)在所述細(xì)胞中表達(dá)與表位融合的MHC I類重鏈或與表位融合的β2m；(2)(1)的方法，其中所述方法還包括酸處理步驟；(3)(1)或(2)的方法，其中所述抑制細(xì)胞中的TAP活性的步驟包括使所述細(xì)胞與具有TAP抑制活性的蛋白質(zhì)接觸的步驟，或?qū)⒕幋a所述蛋白質(zhì)的載體導(dǎo)入所述細(xì)胞的步驟；(4)(3)的方法，其中所述的具有所述TAP抑制活性的蛋白質(zhì)是US6或ICP47；(5)(3)的方法，其中所述載體是感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體；(6)(5)的方法，其中所述載體是仙臺(tái)病毒載體；(7)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中(i)所述細(xì)胞中的TAP基因表達(dá)受到抑制，所述細(xì)胞含有TAP抑制劑，或所述細(xì)胞以可表達(dá)的方式攜有編碼所述TAP抑制劑的基因，其中(ii)所述細(xì)胞以可表達(dá)的方式攜有編碼與表位融合的MHC I類重鏈或與表位融合的β2m的基因；(8)用于展示表位的試劑盒，其含有(i)TAP抑制劑或能表達(dá)所述抑制劑的載體；和(ii)與表位融合的MHC I類重鏈或與表位融合的β2m，或能表達(dá)所述與表位融合的MHC I類重鏈或所述與表位融合的β2m的載體；和
(9)能表達(dá)(i)和(ii)的載體(i)TAP抑制劑；和(ii)與表位融合的MHC I類重鏈或與表位融合的β2m。
本發(fā)明提供了通過抑制TAP活性增強(qiáng)MHC I類分子上的外來表位展示的方法。具體地，本發(fā)明的方法包括下述步驟(a)抑制細(xì)胞的TAP活性，和(b)在細(xì)胞中表達(dá)與表位融合的MHC I類重鏈或與表位融合的β2m。對(duì)步驟(a)和(b)的次序沒有限制，上述方法實(shí)際包括的次序?yàn)橄冗M(jìn)行步驟(a)再進(jìn)行步驟(b)，先進(jìn)行步驟(b)再進(jìn)行步驟(a)，同時(shí)進(jìn)行步驟(a)和(b)。TAP是屬于ATP-結(jié)合盒家族的分子，它包括兩種，即TAP-1和TAP-2。
人TAP-1基因描述于例如登錄號(hào)NM 000593(SEQ ID NO47)(蛋白質(zhì)ID NP_000584(SEQ ID NO48))(Garbi，N.et al.，Eur.J.Immunol.33264-273(2003)；Heintke，S.et al.，F(xiàn)EBS Lett.53342-46(2003)；Ozbas-Gerceker，F(xiàn).etal.，Turk J Pediatr 4491-97(2002)；Seliger，B.et al.，Int.J.Oncol.20349-353(2002)；Saveanu，L.and Van Endert，P.M.，Adv.Exp.Med.Biol.49579-82(2001)；Chen，H.L.et al.，Nat.Genet.13210-213(1996)；Beck，S.et al.，J.Mol.Biol.2551-13(1996)；Jackson，D.G.and Capra，J.D.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9011079-11083(1993)；Glynne，R.et al.，Eur.J.Immunol.23860-866(1993)；Beck，S.et al.，J.Mol.Biol.228433-441(1992)；Bodmer，J.G.et al.，Tissue Antigens 39161-173(1992)；Bahram，S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8810094-10098(1991)；Spies，T.et al.，Nature 348744-747(1990)；Trowsdale，J.et al.，Nature 348(6303)741-744(1990)).TAP-1也被稱為APT1，PSF1，ABC 17，ABCB2，RING4或D6S114E。另外，大鼠TAP-1基因描述于例如登錄號(hào)NM_032055(蛋白質(zhì)ID NP_114444)(Rudolph，M.G.et al.，J.Mol.Biol.324975-990(2002)；Daumke，O.and Knittler，M.R.，Eur.J.Biochem.2684776-4786(2001)；Deverson，E.V.et al.，Nature 348738-741(1990)).小鼠TAP-1基因描述于登錄號(hào)NM_013683(蛋白質(zhì)ID NP_038711)(Garbi，N.et al.，Eur.J.Immunol.33264-273(2003)；Ruedl，C.et al.，Eur.J.Immunol.32818-825(2002)；Neveu，R.et al.，Mol.Immunol.38661-667(2002)；Marusina，K.et al.，J.Immunol.1585251-5256(1997)；Van Kaer，L.etal.，Cell 711205-1214(1992)；Hanson，I.M.and Trowsdale，J.，Immunogenetics345-11(1991)；Cho，S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.885197-5201(1991)；Monaco，J.J.et al.，Science 250(4988)1723-1726(1990))。
人TAP-2基因描述于例如登錄號(hào)NM_000544(SEQ ID NO49)(蛋白質(zhì)ID NP_000535(SEQ ID NO50)(Garbi，N.et al.，Eur.J.Immunol.33264-273(2003)；Heintke，S.et al.，F(xiàn)EBS Lett.53342-46(2003)；Ozbas-Gerceker，F(xiàn).etal.，Turk J Pediatr 4491-97(2002)；Penfomis，A.et al.，Hum.Immunol.6361-70(2002)；Saveanu，L.and Van Endert，P.M.，Adv.Exp.Med.Biol.49579-82(2001)；Yan，G.et al.，J.Immunol.162852-859(1999)；Cesari，M.M.etal.，Immunogenetics 45280-281(1997)；Pattanakitsakul，S.et al.，TissueAntigens 47353-355(1996)；Beck，S.et al.，J.Mol.Biol.2551-13(1996)；Cano，P.and Baxter-Lowe，L.A.，Tissue Antigens 45139-142(1995)；de la Salle，H.et al.，Science 265237-241(1994)；Glynne，R.et al.，Eur.J.Immunol.23860-866(1993)；Powis，S.H.et al.，Immunogenetics 37373-380(1993)；Beck，S.et al.，J.Mol.Biol.228433-441(1992)；Bodmer，J.G.et al.，Tissue Antigens 39161-173(1992)；Powis，S.H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.891463-1467(1992)；Kelly，A.et al.，Nature 355641-644(1992)；Bahram，S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8810094-10098(1991)；Trowsdale，J.et al.，Nature 348(6303)741-744(1990)).TAP-2也被稱為APT2，PSF2，ABC18，ABCB3，RING11或D6S217E。另外，小鼠TAP-1基因描述于例如登錄號(hào)NM_011530(蛋白質(zhì)ID NP_035660，P36371)(Garbi，N.et al.，Eur.J.Immunol.33264-273(2003)；Marusina，K.et al.，J.Immunol.1585251-5256(1997)；Yang，Y.et al.，J.Biol.Chem.26711669-11672(1992)；Attaya，M.et al.，Nature 355647-649(1992)；Monaco，J.J.et al.，Science 2501723-1726(1990))。大鼠TAP-1基因描述于例如登錄號(hào)NM_032056(蛋白質(zhì)ID NP_114445)(Powis，S.J.et al.，Nature 354528-531(1991))。牛TAP-1基因描述于例如登錄號(hào)NM_174222(蛋白質(zhì)ID NP_776647)(Ambagala，A.P.et al.，Immunogenetics 5430-38(2002))。
TAP-1和TAP-2基因表現(xiàn)出多態(tài)性。在本發(fā)明中，提及TAP-1和TAP-2基因時(shí)，包括它們各自所有類型的多態(tài)性。具體地說，在本發(fā)明中，TAP-1和TAP-2基因分別包括編碼蛋白質(zhì)的核酸，所述蛋白質(zhì)含有與上述哺乳動(dòng)物TAP-1(如NP_000584，NP_114444或NP_038711)和TAP-2(如NP_000535，NP_035660，P36371，NP_114445或NP_776647)蛋白具有68％或更高，優(yōu)選70％或更高，更優(yōu)選75％或更高，更優(yōu)選80％或更高，更優(yōu)選85％或更高，更優(yōu)選90％或更高，更優(yōu)選95％或更高同一性的氨基酸序列。這些蛋白質(zhì)參與加工表位。
使用例如BLASTP程序(Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990))可測(cè)定氨基酸序列同一性。例如，在NCBI(國立生物技術(shù)信息中心)的BLAST網(wǎng)頁，使用默認(rèn)值為參數(shù)，不使用任何包括低復(fù)雜度的過濾器，即可進(jìn)行檢索(Altschul，S.F.et al.，Nature Genet.3266-272(1993)；Madden，T.L.et al.，Meth.Enzymol.266131-141(1996)；Altschul，S.F.et al.，NucleicAcids Res.253389-3402(1997)；Zhang，J.& Madden，T.L.，Genome Res.7649-656(1997))。例如，使用blast2sequences程序(Tatiana A et al.，F(xiàn)EMSMicrobiol Lett.174247-250(1999))比較兩個(gè)序列，比對(duì)這兩個(gè)序列以測(cè)定序列同一性。例如，通過使缺口與錯(cuò)配相等即可計(jì)算出哺乳動(dòng)物TAP-1(如NP_000584，NP_114444或NP_038711)和TAP-2(如NP_000535，NP_035660，P36371，NP_114445或NP_776647)蛋白整個(gè)氨基酸序列的同一性數(shù)值。
另外，在本發(fā)明中，TAP-1和TAP-2基因分別包括在嚴(yán)緊條件下可與上述哺乳動(dòng)物TAP-1(如NM_000593，NM_032055或NM_013683)和TAP-2(如NM_000544，NM_011530，NM_032056或NM_174222)基因中的30或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選50或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選100或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選150或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選全長蛋白質(zhì)-編碼序列雜交的核酸。在雜交中，這種核酸可通過由含有哺乳動(dòng)物TAP-1或TAP-2基因編碼序列的核酸或者雜交靶核酸制備探針，然后檢測(cè)與相應(yīng)核酸雜交的探針來鑒定。嚴(yán)緊雜交條件包括例如于48℃，優(yōu)選50℃，更優(yōu)選55℃，更優(yōu)選60℃，在含有5×SSC(1×SSC含有150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉)，7％(w/v)SDS(十二烷基硫酸鈉)，100μg/ml變性鮭精DNA，5×Denhardt’s溶液(1×Denhardt’s溶液含有0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％牛血清白蛋白和0.2％Ficoll)的溶液中雜交，接著在與雜交溫度相同的溫度下，在含有2×SSC和0.1％(w/v)SDS，優(yōu)選1×SSC和0.1％(w/v)SDS，更優(yōu)選0.5×SSC和0.1％(w/v)SDS，更優(yōu)選0.1×SSC和0.1％(w/v)SDS中振蕩洗滌2小時(shí)。
TAP-1和TAP-2都具有跨膜結(jié)構(gòu)域，并通過在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上形成異二聚體而起到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用。兩者中缺乏任一個(gè)都無法在MHC I類分子上進(jìn)行抗原呈遞。TAP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以依賴于ATP的方式將胞質(zhì)中加工的肽轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，所述肽在此與MHC I類分子結(jié)合。在本發(fā)明中，TAP包括TAP-1和TAP-2。另外，抑制TAP活性包括抑制TAP-1活性和/或TAP-2活性?？梢灾苯踊蜷g接抑制TAP活性。例如，抑制TAP活性包括通過使用直接作用于TAP的抑制劑直接抑制TAP活性，以及通過抑制TAP表達(dá)(轉(zhuǎn)錄或翻譯)間接抑制TAP活性。通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TAP基因的反義核酸，或通過表達(dá)能在細(xì)胞內(nèi)切割TAP基因轉(zhuǎn)錄物的核酶，即可抑制TAP的表達(dá)。通過使用具有雙鏈RNA部分的核酸進(jìn)行RNA干擾，也可抑制TAP基因的表達(dá)，其中所述RNA部分含有TAP基因轉(zhuǎn)錄物的一部分的互補(bǔ)序列。所有這些都可用作本發(fā)明的TAP抑制劑。
一般說來，RNAi表示一種現(xiàn)象，即通過將RNA導(dǎo)入細(xì)胞或在細(xì)胞中表達(dá)所述RNA，即可通過誘導(dǎo)mRNA破壞靶基因來抑制靶基因表達(dá)，其中所述RNA含有有義RNA和反義RNA，前者具有與靶基因mRNA序列的一部分同源的序列，后者具有與有義RNA互補(bǔ)的序列(Genes Dev.15188-200(2001)；Elbashir，SM et al.，Nature 411494-498(2001))。當(dāng)將具有RNAi作用的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，被稱為DICER的酶(RNase III核酶家族的成員)將與雙鏈RNA接觸，雙鏈RNA會(huì)降解成被稱為小的干擾RNA(siRNA)的小片段。在本發(fā)明中，除了細(xì)胞內(nèi)加工所產(chǎn)生的這種RNA外，也將人工合成或表達(dá)的、用于通過RNAi抑制靶基因表達(dá)的RNA分子統(tǒng)稱為siRNA。在本發(fā)明中，具有RNAi作用的RNA包括這些siRNA。在體內(nèi)通過siRNA可抑制靶基因的表達(dá)(Anton P.et al.，Nature Vol.41838-39(2002)；David L.etal.，Nature genetics Vol.32107-108(2002))。
一般說來，siRNA是含有核苷酸序列及其互補(bǔ)序列的RNA，所述核苷酸序列具有某個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄序列(mRNA序列)的15或更多個(gè)鄰接的核苷酸(更優(yōu)選16或更多個(gè)核苷酸，17或更多個(gè)核苷酸，18或更多個(gè)核苷酸，或19或更多個(gè)核苷酸)，通過雜交，所述核苷酸序列與其互補(bǔ)序列彼此形成雙鏈RNA。優(yōu)選siRNA在一條鏈上包括19至30個(gè)鄰接核苷酸，更優(yōu)選20至25個(gè)鄰接核苷酸，更優(yōu)選21至23個(gè)鄰接核苷酸的序列或其互補(bǔ)序列，而在相反鏈上含有能與之形成互補(bǔ)對(duì)的序列。然而，對(duì)RNA的長度沒有限制，因?yàn)榧幢闶蔷哂休^長序列的RNA，也有望被內(nèi)源性降解為具有RNAi作用的siRNA。另外，也可以事先使用例如DICER，從靶基因上切割對(duì)應(yīng)于完整或幾乎完整的mRNA區(qū)域的長鏈雙鏈RNA，并將降解產(chǎn)物用作siRNA。該降解產(chǎn)物有望包括具有RNAi作用的RNA分子(siRNA)。根據(jù)此方法，沒必要選擇預(yù)期具有RNAi作用的mRNA區(qū)域。即并非總需準(zhǔn)確定義對(duì)靶基因而言具有RNAi作用的序列。
已知末端具有幾個(gè)核苷酸的突出端的雙鏈RNA一般具有較高RNAi作用。本發(fā)明中使用的siRNA需要，但不是必需在末端(優(yōu)選在3’末端)具有幾個(gè)核苷酸的突出端。盡管對(duì)形成突出端的核苷酸序列的長度沒有限制，但優(yōu)選2個(gè)核苷酸的突出端。例如，在本發(fā)明中，可以適當(dāng)使用具有TT(兩個(gè)胸腺嘧啶)，UU(兩個(gè)尿嘧啶)或其它核苷酸的突出端的雙鏈RNA(最優(yōu)選分子具有19個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA部分和2個(gè)核苷酸(TT)的突出端部分)。在本發(fā)明中，siRNA包括具有形成突出端的DNA的分子。
另外，可用間隔序列連接在siRNA內(nèi)形成堿基對(duì)的兩條鏈。即也可適當(dāng)使用通過由間隔序列形成環(huán)，環(huán)上下的其余兩個(gè)序列彼此退火所產(chǎn)生的雙鏈RNA。盡管對(duì)間隔序列的長度沒有限制，但其長度可以是例如3至23個(gè)核苷酸。
另外，本發(fā)明也可使用能表達(dá)上述siRNA的載體。即本發(fā)明涉及使用能表達(dá)具有RNAi作用的RNA的載體。例如，上述載體可以是核酸，其中雙鏈siRNA的一條鏈和另一條鏈分別與不同的啟動(dòng)子連接，以分開表達(dá)每一條鏈。任選地，可使用可變剪接由一個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄兩種RNA。任選地，載體可表達(dá)單鏈RNA，其中有義鏈和反義鏈由間隔序列(形成環(huán))來連接。由所述載體表達(dá)的RNA通過形成具有RNAi作用的RNA莖來抑制靶基因表達(dá)。莖的長度與上述siRNA的類似，可以是例如19至29個(gè)核苷酸。盡管對(duì)間隔序列的長度沒有限制，但其長度可以是例如3至23個(gè)核苷酸。莖的5’和/或3’末端可具有幾個(gè)核苷酸的突出端，也可不具有該突出端。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的基因工程技術(shù)可以容易地制備這些載體(Brummelkamp，T.R.et al.，Science 296550-553(2002)；Lee，N.S.et al.，NatureBiotechnology 19500-505(2001)；Miyagishi，M.，and Taira，K.，NatureBiotechnology 19497-500(2002)；Paddison，P.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 991443-1448(2002)；Paul，C.P.et al.，Nature Biotechnology 19505-508(2002)；Sui，G.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 99(8)5515-5520(2002)；ProcNatl Acad Sci USA 9914943-14945(2002)；Paddison，P.J.et al.，Genes Dev.16948-958(2002))。更具體地，通過將編碼靶RNA序列的DNA適當(dāng)插入多種已知的表達(dá)載體，就可以構(gòu)建出重組載體。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括RNA聚合酶III啟動(dòng)子。具體地，可使用例如U6Pol III啟動(dòng)子，H1 RNA啟動(dòng)子(H1RNA是一種構(gòu)成RNase P的成分)等。
下文描述了一個(gè)優(yōu)選的siRNA實(shí)例；然而，本發(fā)明可使用的siRNA并不局限于此。首先，選擇位于靶基因起始密碼子下游至少50個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少70個(gè)核苷酸處的轉(zhuǎn)錄區(qū)。優(yōu)選此處存在AA序列。然后選擇AA序列之后的17至20個(gè)核苷酸(例如AA之后的19個(gè)核苷酸)。對(duì)AA的下一個(gè)核苷酸沒有限制，但優(yōu)選G或C。這里所選擇序列的GC含量優(yōu)選為20至80％，更優(yōu)選為30至70％，更優(yōu)選為35至65％。另外，在施用siRNA的組織所表達(dá)的基因中，優(yōu)選所選擇的序列特異于靶基因。例如，優(yōu)選地，通過使用選擇出的序列作為詢問項(xiàng)檢索基因序列公共數(shù)據(jù)庫，確證在存在于施用siRNA的個(gè)體內(nèi)的基因中，除了靶基因外，沒有任何基因具有相同的轉(zhuǎn)錄序列。另外，優(yōu)選從靶基因的蛋白質(zhì)編碼序列(CDS)中選擇序列。適當(dāng)?shù)膕iRNA包括具有這些選定序列，但不含開頭的AA的序列(優(yōu)選在3’末端添加UU或TT)及其互補(bǔ)序列(優(yōu)選在3’末端添加UU或TT)。按照與上述內(nèi)容類似的方式，不是檢索AA序列之后的序列，而是檢索CA序列之后的序列?；蛘撸部梢詸z索除AA或CA以外的其它序列。也可以從如此制備的多種siRNA中適當(dāng)選擇具有最適RNAi作用的RNA。
本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)靶基因的核苷酸序列可以適當(dāng)制備出具有RNAi作用的RNA。通過使用已知的TAP基因作為探針篩選哺乳動(dòng)物cDNA文庫，或者通過RT-PCR，可以容易地從上述公共基因數(shù)據(jù)庫中獲得靶TAP基因的核苷酸序列。根據(jù)所獲得的基因的核苷酸序列，根據(jù)上文的描述即可設(shè)計(jì)出siRNA。
不總是必需知道靶基因的完整核苷酸序列。只需知道可被選作siRNA的鄰接RNA區(qū)(例如20至30個(gè)核苷酸)即可。因此，甚至可以由基因片段，如EST(已表達(dá)序列標(biāo)志)制備siRNA，雖然由所述基因片段無法獲知完整的核苷酸序列，但根據(jù)基因片段的核苷酸序列可知道部分mRNA序列。當(dāng)在臨床上使用合成的siRNA時(shí)，可對(duì)其進(jìn)行修飾。
另一方面，當(dāng)使用反義核酸抑制基因表達(dá)時(shí)，它們可含有針對(duì)靶TAP基因轉(zhuǎn)錄序列內(nèi)的13或更多個(gè)鄰接核苷酸，優(yōu)選14或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選15或更多個(gè)核苷酸(18或更多個(gè)核苷酸，20或更多個(gè)核苷酸，或25或更多個(gè)核苷酸)的反義序列。例如，優(yōu)選的反義核酸包括針對(duì)下述區(qū)域的反義序列早期轉(zhuǎn)錄序列內(nèi)的外顯子-內(nèi)含子邊界，內(nèi)含子-外顯子邊界，含有翻譯起始密碼子的區(qū)域，5’末端周圍的非翻譯區(qū)，成熟mRNA的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)內(nèi)13或更多個(gè)鄰接核苷酸，優(yōu)選14或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選15或更多個(gè)核苷酸的核苷酸序列。另外，當(dāng)在臨床上使用反義核酸時(shí)，它們一般含有合成的寡聚體。反義核酸可以是DNA，它們可以被修飾。例如，通常已知將S oligo(硫代磷酸型寡核苷酸)用作反義核酸，其中磷酸二酯鍵的O(氧)原子被S(硫)原子所取代，從而降低了對(duì)核酶消化的敏感性，同時(shí)仍能保持活性。目前，正在進(jìn)行將S oligo作為反義藥物直接注射至染病區(qū)域的臨床研究。S oligo也適用于本發(fā)明。盡管優(yōu)選反義核酸序列與靶基因或其部分互補(bǔ)，但不必完全互補(bǔ)，只要它能有效抑制基因表達(dá)即可。優(yōu)選轉(zhuǎn)錄的RNA與靶基因轉(zhuǎn)錄物90％或90％以上互補(bǔ)，最優(yōu)選95％或95％以上互補(bǔ)。為了有效抑制靶基因表達(dá)，優(yōu)選反義核酸的鏈長度為17或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選20或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選25或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選30或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選40或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選50或更多個(gè)核苷酸，最優(yōu)選100或更多個(gè)核苷酸。也可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)反義RNA。通過在能在靶細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子的下游連接編碼所需RNA的核酸以構(gòu)建載體，然后將載體導(dǎo)入細(xì)胞，即可達(dá)到此目的。
至于載體，可使用病毒載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺-伴隨病毒載體、負(fù)鏈RNA病毒載體，以及非病毒載體，包括脂質(zhì)體。使用這些載體系統(tǒng)或載體來進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，通過使用來自體內(nèi)的方法，體內(nèi)方法等將所述載體施用于患者，即可進(jìn)行基因治療。
或者，可使用核酶或編碼核酶的載體來抑制TAP基因表達(dá)。術(shù)語“核酶”指的是具有催化活性的RNA分子。由于有多種具有不同活性的核酶，也可以設(shè)計(jì)能位點(diǎn)-特異性地切割RNA的核酶。盡管核酶包括長度為400或更多個(gè)核苷酸的核酶，如I組內(nèi)含子型RNA和RNase P中所含的M1RNA，那些具有長度約為40個(gè)核苷酸的活性結(jié)構(gòu)域，被稱為錘頭型核酶(Rossi et al.，Pharmac.Ther.50245-254(1991))或發(fā)夾型核酶(Hampel et al.，Nucl.Acids Res.18299-304(1990)，and U.S.Pat.No.5,254,678)的核酶也是已知的(Makoto Koizumi and Eiko Ohtsuka，Protein，Nucleic acid and Enzyme352191(1990))。
例如，盡管錘頭型核酶的自切割結(jié)構(gòu)域切割序列G13U14C15內(nèi)C15的3’方向，據(jù)認(rèn)為U14和A9之間堿基對(duì)的形成對(duì)于活性而言至關(guān)重要，已證實(shí)切割也發(fā)生在A15或U15而不是C15的3’方向(Koizumi，M.et al.，F(xiàn)EBSLett.228228(1988))。當(dāng)以底物-結(jié)合位點(diǎn)與靶位點(diǎn)附近的RNA序列互補(bǔ)的方式設(shè)計(jì)核酶時(shí)，可以構(gòu)建能識(shí)別靶RNA內(nèi)的UC、UU或UA序列的限制性酶-樣RNA-切割核酶(Koizumi，M.et al.，F(xiàn)EBS Lett.239285(1988)；Makoto Koizumi and Eiko Ohtsuka，Protein，Nucleic acid and Enzyme 352191(1990)；Koizumi，M.et al.，Nucl.Acids Res.177059(1989))。
另外，發(fā)夾型核酶也可用于本發(fā)明的目的。例如，在煙草環(huán)斑病毒衛(wèi)星RNA的負(fù)鏈中可發(fā)現(xiàn)此類核酶(Buzayan，JM.，Nature 323349(1986))。已證實(shí)也可由發(fā)夾型核酶構(gòu)建靶-特異性RNA切割核酶(Kikuchi，Y.& Sasaki，N.，Nucl Acids Res.196751(1991)；Kikuchi，Y.，Kagaku to Seibutu 30112(1992))。因此，通過使用核酶特異性切割靶基因的轉(zhuǎn)錄物，即可抑制靶基因表達(dá)。
或者，為了抑制TAP活性，可在TAP基因中導(dǎo)入突變，或者通過基因靶向技術(shù)缺失TAP基因。在本發(fā)明中，“抑制TAP活性”也包括提供或制備TAP基因表達(dá)有缺陷的細(xì)胞。在本發(fā)明中，TAP抑制劑包括能直接或間接抑制TAP活性的化合物。即TAP抑制劑包括這些反義核酸、核酶、siRNA，還包括能抑制TAP基因表達(dá)的因子。對(duì)TAP抑制劑沒有限制，只要其具有TAP-抑制活性即可；TAP抑制劑包括蛋白質(zhì)、肽化合物、非-肽化合物、核酸、核酸類似物和小分子化合物。
當(dāng)TAP抑制劑由核酸編碼時(shí)，通過將表達(dá)核酸的載體導(dǎo)入細(xì)胞即可表達(dá)所述抑制劑。TAP-抑制蛋白的例子包括得自單純皰疹病毒的ICP47(Hill，A.et al.，Nature 375411-415(1995)；Fruh，K.et al.，Nature 375415-418(1995))和得自巨細(xì)胞病毒的US6(Ahn，K.et al.，Immunity 6613-621(1997)；Hengel，H.et al.，Immunity 6623-632(1997))。
具體地，得自人I型皰疹病毒的ICP47描述于登錄號(hào)NC_001806(145311-145577的互補(bǔ)鏈)(SEQ ID NO51)(蛋白質(zhì)ID NP_044675，P03170(SEQ ID NO52))(Dolan，A.et al.，J.Gen.Virol.73(Pt 4)971-973(1992)；Perry，L.J.and McGeoch，D.J.；J.Gen.Virol.69(Pt 11)2831-2846(1988)；McGeoch，D.J.et al.，J.Gen.Virol.69(Pt 7)1531-1574(1988)；McGeoch，D.J.et al.，Nucleic Acids Res.14(4)1727-1745(1986)；McGeoch，D.J.et al.，J.Mol.Biol.181(1)1-13(1985))。另外，得自人2型皰疹病毒的ICP47描述于登錄號(hào)NC_001798(147775-148035的互補(bǔ)鏈)(蛋白質(zhì)ID NP_044543)(Barnett，B.C.et al.，J.Gen.Virol.73(Pt 8)2167-2171(1992)；McGeoch，D.J.et al.，J.Gen.Virol.72(Pt 12)3057-3075(1991)；Everett，R.D.and Fenwick，M.L.，J.Gen.Virol.71(Pt 6)1387-1390(1990)；McGeoch，D.J.et al.，J.Gen.Virol.68(Pt 1)19-38(1987))。
關(guān)于得自巨細(xì)胞病毒的US6，例如，得自人CMV的US6描述于登錄號(hào)AY072775(SEQ ID NO53)(蛋白質(zhì)ID AAL67143(SEQ ID NO54)，NP_040091)，而得自黑猩猩CMV的US6描述于登錄號(hào)NC_003521(蛋白質(zhì)ID NP_612779)(Davison，A.J.et al.，J.Gen.Virol.84(Pt 1)17-28(2003))。
ICP47分子通過與TAP分子的肽-結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合來抑制TAP-介導(dǎo)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)(Tomazin，R.et al.，EMBO J.153256-3266(1996))。另一方面，US6分子抑制ATP與TAP-1的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)肽轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用(Hewitt，E.et al.，EMBO J.20387-396(2001))。在本發(fā)明中，這兩種分子都可用于抑制TAP活性。上述病毒包括多個(gè)亞種和毒株，優(yōu)選將它們用于本發(fā)明，只要由相應(yīng)基因編碼的蛋白質(zhì)具有TAP-抑制活性即可。另外，這些蛋白質(zhì)不僅包括野生型蛋白質(zhì)，還包括經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)，只要它們能保持TAP-抑制活性即可。例如，可使用具有TAP抑制活性的部分肽。另外，還可添加其它肽，如標(biāo)記。例如，可使用具有His標(biāo)記的蛋白質(zhì)(參見實(shí)施例)。
具體地，在本發(fā)明中，ICP47和US6蛋白包括這樣一些蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)分別含有與上述ICP47蛋白(如NP_044675，P03170(SEQ ID NO52)或NP_044543)和US6蛋白(如AAL67143(SEQ ID NO54)，NP_040091或NP_612779)的氨基酸序列具有68％或更高，優(yōu)選70％或更高，更優(yōu)選75％或更高，更優(yōu)選80％或更高，更優(yōu)選85％或更高，更優(yōu)選90％或更高，更優(yōu)選95％或更高同一性的氨基酸序列。根據(jù)本說明書中提及的方法可計(jì)算出氨基酸序列的同一性。例如，可計(jì)算出與ICP47蛋白(如NP_044675，P03170(SEQ ID NO52)或NP_044543)或US6蛋白(如AAL67143(SEQ IDNO54)，NP_040091或NP_612779)的完整氨基酸序列的同一性評(píng)分。
另外，在本發(fā)明中，ICP47和US6蛋白包括由核酸編碼的蛋白質(zhì)，在嚴(yán)緊條件下，所述核酸分別能與上述ICP47蛋白(如NC_001806的145311-145577或NC_001798的147775-148035)和US6蛋白(如AY072775或NC_003521)的蛋白質(zhì)編碼序列內(nèi)的30或更多個(gè)核苷酸，優(yōu)選50或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選100或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選150或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選整個(gè)序列雜交。嚴(yán)緊雜交條件包括上文所述的條件。
盡管可使用任何合乎需要的表達(dá)載體來表達(dá)TAP抑制蛋白，但優(yōu)選使用感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體。構(gòu)建載體，使其除了能表達(dá)TAP抑制劑外，還能同時(shí)表達(dá)與表位融合的MHC I類重鏈或與表位融合的β2m，此部分內(nèi)容將在下文描述。
盡管對(duì)TAP活性的抑制可以是瞬時(shí)的，但優(yōu)選持續(xù)的時(shí)間足以使與表位融合的MHC I類重鏈或β2m得以表達(dá)(例如3小時(shí)或更長時(shí)間，優(yōu)選為6，18，24或30小時(shí)或更長時(shí)間)。例如，當(dāng)進(jìn)行在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與表位融合的MHC I類重鏈或β2m這一步驟時(shí)，可持續(xù)抑制TAP活性直至外來表位被顯著展示為止。
更優(yōu)選本發(fā)明的方法中除了有抑制TAP活性的步驟外，還包括酸處理的步驟，以表現(xiàn)出外來表位展示的增強(qiáng)。對(duì)酸處理的次序沒有限制?？稍谝种芓AP活性或在細(xì)胞中表達(dá)與表位融合的蛋白質(zhì)的步驟之前，之后或與之同時(shí)進(jìn)行酸處理。例如，使用表達(dá)載體同時(shí)表達(dá)TAP抑制劑和與表位融合的蛋白質(zhì)時(shí)，一種具體的酸處理方法包括下述步驟(i)在細(xì)胞中表達(dá)TAP抑制蛋白和與表位融合的MHC I類重鏈或β2m；和(ii)用酸處理細(xì)胞。盡管抑制TAP活性的步驟會(huì)中止內(nèi)源性抗原加工，但用酸處理細(xì)胞會(huì)解離細(xì)胞表面已展示的表位肽。在本文中，酸處理表示將細(xì)胞暴露于酸性環(huán)境，使得細(xì)胞表面展示的表位肽被顯著解離。例如，通過于4℃，用肽-剝離緩沖液(0.13M檸檬酸(pH3)，66mM Na2HPO4，150mM NaCl和17μg/ml酚紅)處理細(xì)胞1分鐘，接著使用足夠量的培養(yǎng)基(例如RPMI1640)進(jìn)行中和，即可進(jìn)行酸處理。本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過其它可獲得類似效果的方法進(jìn)行酸處理。
可以使用任何合乎需要的表位與MHC I類重鏈或β2m結(jié)合。本文所用術(shù)語“表位”指的是能被免疫細(xì)胞識(shí)別的肽。所述免疫細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞。在本發(fā)明中，優(yōu)選的表位包括能被T細(xì)胞識(shí)別的表位。表位不僅包括抗原呈遞細(xì)胞上展示的表位，還包括任何合乎需要的肽，只要它能被免疫細(xì)胞識(shí)別即可。例如，具有人工制備的氨基酸序列的肽也可用作表位。更優(yōu)選表位是抗原呈遞細(xì)胞(APC)上展示的肽或含有所述肽的一部分的肽。在本發(fā)明中，用作表位的蛋白質(zhì)或肽的“一部分”一般含有8或更多個(gè)，優(yōu)選9或更多個(gè)，更優(yōu)選10或更多個(gè)，12或更多個(gè)，或15或更多個(gè)鄰接的氨基酸。另外，在本發(fā)明中，將通過細(xì)胞內(nèi)抗原加工所展示的表位肽稱為內(nèi)源性展示表位，而將其它表位稱為“外來表位”。例如，即使表位的氨基酸序列與內(nèi)源性展示表位的氨基酸序列相同，本發(fā)明的外來表位仍包括外源性添加的表位或未經(jīng)內(nèi)源性抗原加工而展示的表位。另外，本發(fā)明的外來表位還包括以融合蛋白的形式與構(gòu)成MHC，包括MHC I類重鏈和β2m的蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的表位肽。使用TAP抑制劑的本發(fā)明方法通過抑制細(xì)胞內(nèi)的抗原加工，能在細(xì)胞上高頻率展示外來表位。
外來表位可與MHC I類重鏈或β2m結(jié)合。對(duì)本發(fā)明所用的表位沒有限制，可以使用多種對(duì)例如腫瘤、感染和其它一般性疾病有治療作用的合乎需要的表位。用作表位的肽的鏈長度可以適當(dāng)?shù)馗淖?，但一般?或更多個(gè)氨基酸的肽，例如，優(yōu)選使用約10個(gè)氨基酸的肽。當(dāng)表位與β2m結(jié)合時(shí)，表位可與β2m的任何位點(diǎn)相連接，但優(yōu)選例如使表位與分泌的β2m分子的N-末端相連接。為此，表位在緊接β2m分泌信號(hào)的下方與之結(jié)合，然后，必要時(shí)經(jīng)由間隔區(qū)與β2m蛋白連接，以產(chǎn)生所需融合蛋白。或者，無需間隔區(qū)直接將表位與β2m連接。對(duì)間隔區(qū)的氨基酸序列沒有任何限制；然而，用作間隔區(qū)的肽優(yōu)選包括含有例如氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO1)或其重復(fù)序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n的肽。對(duì)重復(fù)次數(shù)(n)沒有限制，它可以是例如1至5(1，2，3，4或5)。當(dāng)使用間隔區(qū)時(shí)，優(yōu)選使用長度達(dá)16個(gè)氨基酸，例如4，8或16個(gè)氨基酸的間隔區(qū)。任何合乎需要的哺乳動(dòng)物β2m分子都可不加限制地用作β2m。當(dāng)用于人時(shí)，優(yōu)選使用人β2m。例如，可根據(jù)下文實(shí)施例中所述的方法分離人β2m基因。另外，β2m可以是野生型蛋白質(zhì)或具有改變的氨基酸序列的突變型蛋白質(zhì)。
當(dāng)表位與MHC I類重鏈結(jié)合時(shí)，表位可與MHC I類重鏈任何合乎需要的位點(diǎn)結(jié)合，但優(yōu)選與分泌后能將表位置于MHC I類分子N-末端的位點(diǎn)結(jié)合。為此，表位在緊接MHC I類重鏈分泌信號(hào)序列的下方與之結(jié)合，然后，必要時(shí)經(jīng)由間隔區(qū)與MHC I類重鏈連接，以產(chǎn)生所需融合蛋白。或者，無需間隔區(qū)直接將表位與MHC I類重鏈連接。
對(duì)間隔區(qū)的氨基酸序列沒有任何限制；然而，用作間隔區(qū)的肽優(yōu)選包括含有例如氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO2)或其重復(fù)序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n的肽。對(duì)重復(fù)次數(shù)(n)沒有限制，它可以是例如1至5。根據(jù)使用小鼠MHC I類分子H2-Kd的報(bào)道，當(dāng)比較10個(gè)氨基酸的間隔區(qū)GGPGGGSGGG(SEQ ID NO3)，20個(gè)氨基酸的間隔區(qū)GGP(GGGGS)2GGGSGGG(SEQ ID NO4)和30個(gè)氨基酸的間隔區(qū)GGP(GGGGS)4GGG SGGG(SEQ ID NO5)的間隔序列時(shí)，10個(gè)氨基酸的間隔序列能被最有效地識(shí)別(Mottez，E.et al.，J.Exp.Med.181493-502(1995))。另外，根據(jù)使用人MHC I類分子HLA-A2的報(bào)道，使用10個(gè)氨基酸的間隔序列(GGSGGGASGG)(SEQ ID NO6)能有效展示黑素瘤抗原表位(Kang，X.et al.，Cancer Res.57202-205(1997))。因此，優(yōu)選經(jīng)由這些間隔序列與表位結(jié)合。
對(duì)MHC I類重鏈的來源沒有特別的限制。優(yōu)選將人MHC I類分子(HLA)用于人。人MHC I類分子被稱為人白細(xì)胞抗原(HLA)，其種類十分豐富。這些分子中的任一種都可用作本發(fā)明的HLA。例如，本發(fā)明可應(yīng)用于任何類型的HLA，已在感染和癌癥中鑒定出所述HLA的靶表位，所述HLA可用作定制或特制的試劑或藥物。
特別地，HLA-A24(約60-70％)，HLA-A2(約40％)和HLA-A26(約20％)是日本較常見的HLA類型，接下來是HLA-A11(20％)，HLA-A31(將近20％)和HLA-A33(將近20％)。當(dāng)將本發(fā)明應(yīng)用于日本受試者時(shí)，特別優(yōu)選這些HLA類型。
為了開發(fā)在某種程度上可應(yīng)用于例如日本受試者中的很多非特定個(gè)體的試劑或藥物，優(yōu)選在日本人種群中具有5％或更高等位基因頻率的HLA類型(即日本人中10％或更高HLA類型頻率)。所述HLA類型包括A基因座 B基因座A*0201 B*0702
A*0206 B*1501A*1101 B*3501A*2601 B*4001A*31012B*4002A*3303 B*44031B*4601B*52011B*5401在實(shí)施例中，本發(fā)明人將A24-限制性HLA I類重鏈用作MHC I類分子，將A24-限制性HLA I類分子上展示的得自HIV-1的表位用作表位。約60-70％的日本人種群具有HLA-A*2402基因型。因此，A24-限制性HLA I類重鏈，特別是A*2402(Litte，A.-M.，Immunogenetics 3541-45(1992))適用于日本人種群。MHC I類重鏈可以是野生型蛋白質(zhì)或具有經(jīng)改變的氨基酸序列的突變型蛋白質(zhì)。
可使用公知的重組基因技術(shù)(J.Sambrook and D.W.Russell eds.，″Molecular cloninga laboratory manual″，3rd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001))，將與表位融合的MHC I類重鏈或β2m以及TAP抑制蛋白制備成重組蛋白質(zhì)?？梢圆患酉拗频貙⑷魏魏虾跣枰谋磉_(dá)系統(tǒng)，包括質(zhì)粒載體和病毒載體用作表達(dá)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。已知多種用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)載體-宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可使用任何合乎需要的宿主細(xì)胞，例如細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。使用已知的蛋白質(zhì)純化方法可以將所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)純化為基本上純的形式。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與表位融合的MHC I類重鏈或β2m。由于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)能夠用糖鏈等對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正常修飾，因此，與在大腸桿菌中表達(dá)相比，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)可增強(qiáng)給免疫細(xì)胞呈遞抗原的效率?？稍诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載體不僅可用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，還可以將其導(dǎo)入細(xì)胞并在靶細(xì)胞表面展示外源性抗原。優(yōu)選通過將能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)與表位融合的MHC I類重鏈或β2m以及TAP抑制蛋白。
可將編碼與表位相連的β2m和MHC I類重鏈的膜結(jié)合形式的基因?qū)爰?xì)胞，以大量表達(dá)將在細(xì)胞表面展示特定表位的MHC I類/肽復(fù)合物。這些細(xì)胞對(duì)表位特異性CTL有極佳的抗原呈遞能力。
即，本發(fā)明提供了(1)產(chǎn)生與表位融合的MHC I類重鏈或與所述表位融合的β2m的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)抑制細(xì)胞中的TAP活性；和(b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述的與所述表位融合的MHC I類重鏈或所述的與所述表位融合的β2m。
(2)(1)的方法，其中所述方法還包括酸處理步驟。
(3)(1)或(2)的方法，其中所述抑制細(xì)胞中的TAP活性的步驟是使具有TAP抑制活性的蛋白質(zhì)與所述細(xì)胞接觸，或?qū)⒕幋a所述蛋白質(zhì)的載體導(dǎo)入所述細(xì)胞的步驟。
(4)(3)的方法，其中所述具有TAP抑制活性的蛋白質(zhì)是US6或ICP47。
(5)(3)的方法，其中所述載體是能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體。
(6)(5)的方法，其中所述載體是仙臺(tái)病毒載體。
(7)含有與表位融合的MHC I類重鏈或與所述表位融合的β2m的組合物，其中通過(1)至(6)中任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)所述的與所述表位融合的MHC I類重鏈或所述的與所述表位融合的β2m。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)能表達(dá)與表位融合的MHC I類重鏈或β2m的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法。具體地說，該方法包括下述步驟(a)抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的TAP活性；和(b)在細(xì)胞中表達(dá)編碼與表位融合的MHC I類重鏈或β2m的基因。對(duì)步驟(a)和(b)的次序沒有限制?？梢韵冗M(jìn)行其中任一步驟，或者同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)步驟。所獲得的細(xì)胞可用于引發(fā)抗原-特異性的細(xì)胞免疫力。例如，通過使用此方法在源自患者的細(xì)胞(如樹狀細(xì)胞)中高頻率表達(dá)所需外來表位，即可在患者體內(nèi)引發(fā)抗原-特異性的細(xì)胞免疫力。特別優(yōu)選通過將編碼具有TAP抑制活性的蛋白質(zhì)的載體導(dǎo)入細(xì)胞，來進(jìn)行抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的TAP活性的步驟。這會(huì)導(dǎo)致TAP抑制蛋白在細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)同時(shí)進(jìn)行步驟(a)和(b)時(shí)，本發(fā)明還包括在細(xì)胞中同時(shí)導(dǎo)入編碼具有TAP抑制活性的蛋白質(zhì)和與表位融合的MHC I類重鏈或β2m的載體的步驟，以及通過將編碼具有TAP抑制活性的蛋白質(zhì)的基因插入編碼與表位融合的MHC I類重鏈或β2m的載體，而由單個(gè)載體同時(shí)表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的步驟?；蛘?，將步驟(b)用于TAP基因已缺失或TAP表達(dá)已被抑制的細(xì)胞。可從這些細(xì)胞或培養(yǎng)物上清液中回收所生產(chǎn)的與表位融合的MHC I類重鏈或β2m。通過例如已知的基因靶向法，可以制備出TAP基因已缺失的細(xì)胞。使用Cre-loxP系統(tǒng)等也可以對(duì)TAP基因表達(dá)進(jìn)行條件控制。本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中TAP活性受到抑制，但仍以可表達(dá)的方式含有編碼與表位融合的MHCI類重鏈或β2m的基因。另外，本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其含有TAP抑制劑或以可表達(dá)的方式含有編碼TAP抑制劑的基因，還以可表達(dá)的方式含有編碼與表位融合的MHC I類重鏈或β2m的基因。本文中的術(shù)語“細(xì)胞以可表達(dá)的方式含有基因”指的是基因在細(xì)胞中表達(dá)或基因保留在細(xì)胞內(nèi)，使得用藥物等可誘導(dǎo)其表達(dá)。例如，它包括能使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或Cre-loxP系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)基因的細(xì)胞。
即本發(fā)明提供了(1)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(i)其中TAP活性受到抑制，和(ii)以可表達(dá)的方式攜有編碼與表位融合的MHC I類重鏈的基因或編碼與表位融合的β2m的基因。
(2)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(i)其中TAP基因的表達(dá)受到抑制，含有TAP抑制劑，或以可表達(dá)的方式攜有編碼TAP抑制劑的基因，和(ii)以可表達(dá)的方式攜有編碼與表位融合的MHC I類重鏈的基因或編碼與表位融合的β2m的基因。
(3)(2)的方法，其中TAP抑制劑是US6或ICP47。
(4)(1)至(3)中任一項(xiàng)的方法，其中經(jīng)由能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體將編碼TAP抑制劑的基因和/或編碼與表位融合的MHC I類重鏈或與表位融合的β2m的基因?qū)爰?xì)胞。
(5)(4)的方法，其中載體是仙臺(tái)病毒載體。
(6)含有(1)至(5)中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的組合物。
對(duì)能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體沒有限制，當(dāng)使用能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體表達(dá)TAP抑制蛋白和/或與表位相連的β2m或MHC I類重鏈時(shí)，可以使用任何合乎需要的病毒載體。另外，本發(fā)明所用的能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體能感染除哺乳動(dòng)物細(xì)胞以外的細(xì)胞。優(yōu)選載體對(duì)宿主細(xì)胞沒什么毒性，并能獲得高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。適用于本發(fā)明的病毒載體包括例如腺病毒載體、腺-伴隨病毒載體、單純皰疹病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、塞姆利基森林病毒載體、新培斯病毒載體、痘苗病毒載體、禽痘病毒載體和仙臺(tái)病毒載體，但本發(fā)明并不局限于此。使用這些載體系統(tǒng)，可以構(gòu)建出表達(dá)TAP抑制劑，與表位相連的MHC I類重鏈或β2m，或TAP抑制劑和與表位相連的MHC I類重鏈或β2m的重組病毒載體。本文所用術(shù)語“重組病毒載體”指的是通過重組多核苷酸產(chǎn)生的病毒載體。重組多核苷酸被定義為其一端或兩端不象天然狀態(tài)下那樣被結(jié)合的多核苷酸。更具體地，它指人工重組的多核苷酸鏈或新合成的多核苷酸?！爸亟M”病毒載體包括例如通過基因操作構(gòu)建的病毒載體，以及通過基因擴(kuò)增構(gòu)建的載體而制備的病毒載體。通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組病毒cDNA以重建病毒顆粒，即可產(chǎn)生重組病毒載體。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可制備重組病毒載體。例如，根據(jù)Saito等人的方法(Miyake et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-24(1996)；Kanegae et al.，“Biomanual Series 4-Gene Transfer and Expression，Methods ofAnalysis”(in Japanese)，43-58(1994)，Yodosha)，可以構(gòu)建出基因治療最常用的腺病毒載體。例如，用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?例如SwaI)切割42kb的粘粒pAdexlcw(Kanegae et al.，Saiboukougaku，13(8)757-763(1994))，其含有31kb Ad DNA，幾乎是除E1和E3區(qū)外的全長腺病毒(Ad)5型基因組，然后適當(dāng)脫鹽并通過凝膠過濾進(jìn)行純化。隨后使用T4 DNA連接酶，使外源基因的表達(dá)單位與經(jīng)切割的粘粒發(fā)生連接反應(yīng)，通過熱處理使酶失活。通過凝膠過濾使所得連接物脫鹽，然后用SwaI切割。苯酚處理和凝膠過濾之后，再次用SwaI切割經(jīng)切割的產(chǎn)物。使用Gigapack XL(Stratagene，USA)體外包裝部分產(chǎn)物。然后將連接的產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞。由細(xì)胞的一些氨芐青霉素-抗性轉(zhuǎn)化子制備粘粒，通過用限制性酶消化分析其結(jié)構(gòu)，從而分離出以所需方向(與E1A和E1B的轉(zhuǎn)錄方向相反)插入外源性基因表達(dá)單位的重組粘粒。在另一個(gè)系列中，通過Saito等的方法(Kanegae et al.，文獻(xiàn)同上)制備缺乏E1和E3區(qū)域的腺病毒5型(Ad5毒株d1X)的DNA-末端蛋白質(zhì)復(fù)合物(DNA-TPC)。用例如EcoT22I消化該復(fù)合物，然后通過凝膠過濾等進(jìn)行脫鹽和純化。將經(jīng)EcoT22I消化的片段與按上文所述獲得的重組粘?；旌?，然后使用例如Cellphect試劑盒(Pharmacia，Sweden)導(dǎo)入293細(xì)胞。第二天，懸浮被轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞，將懸浮液及其10倍至100倍的稀釋液接種于96-孔培養(yǎng)板上。約2周后，從孔中分離含有死細(xì)胞的培養(yǎng)物溶液，其中可觀察到(通過在293細(xì)胞中重組而產(chǎn)生的)重組腺病毒的增殖。反復(fù)凍融培養(yǎng)物溶液以從細(xì)胞中釋放出腺病毒顆粒。離心后，用上清液(原代病毒溶液)感染鋪于24-孔培養(yǎng)板上的293細(xì)胞。3天后，分離含有死細(xì)胞的培養(yǎng)物溶液。凍融部分溶液，象制備原代病毒溶液那樣離心獲得上清液(繼代病毒溶液)。離心其余溶液以獲得細(xì)胞。由細(xì)胞制備DNA，通過用限制性酶消化分析重組腺病毒DNA的結(jié)構(gòu)，以選擇經(jīng)證實(shí)具有所需DNA結(jié)構(gòu)的克隆。用較大量的繼代病毒溶液感染293細(xì)胞，類似地凍融培養(yǎng)物溶液，離心獲得第三代病毒溶液。根據(jù)Saito等的方法(Kanegae et al.，文獻(xiàn)同上)測(cè)定第三代病毒溶液的滴度之后，即可獲得重組腺病毒載體(Miyake et al.，文獻(xiàn)同上；Kanegae et al.，Acta Paediatr.Jpn，38182-188(1996))。
另外，例如，也可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Wakimoto et al.，Protein NucleicAcid and Enzyme 402508-2513(1995))和腺-伴隨病毒載體(Tamaki et al.，Protein Nucleic Acid and Enzyme 402532-2538(1995))。本領(lǐng)域已知有效產(chǎn)生這些載體的方法。
為了產(chǎn)生其它可用于將基因轉(zhuǎn)移至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的載體，國際公開號(hào)Hei 6-502069的已
公開日語譯文、已審公開的日本專利申請(qǐng)?zhí)?JP-B)Hei6-95937和JP-B Hei 6-71429公開了產(chǎn)生重組痘苗病毒的詳細(xì)方法。另外，JP-B Hei 6-34727和國際公開號(hào)Hei 6-505626的已
公開日語譯文公開了產(chǎn)生重組乳頭瘤病毒的方法。另外，未審公開的日本專利申請(qǐng)?zhí)?JP-A)Hei5-308975公開了產(chǎn)生重組腺-伴隨病毒的方法，國際公開號(hào)Hei 6-508039的已
公開日語譯文公開了產(chǎn)生重組腺病毒的方法。
在本發(fā)明中，特別優(yōu)選的能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體包括副粘病毒載體。本文中的術(shù)語“副粘病毒載體”指的是源自副粘病毒、能將基因轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的載體。最近，屬于副粘病毒科的仙臺(tái)病毒(SeV)被開發(fā)成為一種基因轉(zhuǎn)移載體(Kato，A.et al.，EMBO J.16578-589(1997)；WO97/16538；WO 97/16539)。SeV載體毒性較低，并能由轉(zhuǎn)移基因表達(dá)大量蛋白質(zhì)。此外，由于插入載體的基因未被導(dǎo)入宿主染色體，因此，SeV載體具有安全性高的優(yōu)點(diǎn)。SeV載體具有高基因組穩(wěn)定性，根據(jù)異源基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)，已證實(shí)該載體能長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)插入的異源基因，盡管持續(xù)多次地進(jìn)行傳代，基因的堿基中卻沒出現(xiàn)多少突變(Yu，D.et al.，Genes Cells 2，457-466(1997))。另外，可導(dǎo)入基因的大小以及因缺乏衣殼結(jié)構(gòu)蛋白而導(dǎo)致的包裝柔性是SeV載體的另一個(gè)有利特性。具有復(fù)制能力的SeV載體能導(dǎo)入至少為4kb的外源基因。另外，通過在載體中添加轉(zhuǎn)錄單位，可以同時(shí)表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)基因?；赟eV復(fù)制子由載體復(fù)制的病毒載體重新感染至鄰近的細(xì)胞。然后，在被感染細(xì)胞的胞質(zhì)中復(fù)制的多拷貝RNP在細(xì)胞分裂的過程中分布至子代細(xì)胞，因此，載體有望持續(xù)表達(dá)。另外，SeV載體具有較寬的組織適應(yīng)性。
由于仙臺(tái)病毒載體不是人類的病原體，因此，就安全性而言，優(yōu)選將仙臺(tái)病毒用于人類基因治療的臨床試驗(yàn)。高效基因轉(zhuǎn)移的主要障礙是在大多數(shù)情況下，導(dǎo)入的DNA必須被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中，或者必須清除核膜以經(jīng)由質(zhì)粒DNA等表達(dá)轉(zhuǎn)基因。然而，對(duì)于仙臺(tái)病毒而言，外源基因的表達(dá)由細(xì)胞微管蛋白以及病毒復(fù)制時(shí)胞質(zhì)中的RNA聚合酶(L蛋白)共同驅(qū)動(dòng)。這表明仙臺(tái)病毒不與宿主細(xì)胞的染色體相互作用，這就避免了細(xì)胞癌化和無限增殖化的危險(xiǎn)。另外，已知仙臺(tái)病毒對(duì)于嚙齒類動(dòng)物而言是導(dǎo)致肺炎的病原體，但它不是人類的病原體，這一點(diǎn)得到有關(guān)研究結(jié)果的支持，所述研究證實(shí)鼻內(nèi)施用野生型仙臺(tái)病毒對(duì)非人靈長類動(dòng)物不會(huì)造成傷害(Hurwitz，J.L.et al.，Vaccine，15533-540(1997))。這些特征表明仙臺(tái)病毒載體可用于人類治療，并且進(jìn)一步支持了仙臺(tái)病毒載體是體內(nèi)或來自體內(nèi)的基因治療的理想工具之一這一觀點(diǎn)。
本文所用術(shù)語“副粘病毒”被定義為副粘病毒科的病毒或其衍生物。本發(fā)明中所用的副粘病毒包括例如屬于副粘病毒科的病毒，如仙臺(tái)病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒、distemper病毒、猴副流感病毒(SV5)、以及I，II和III型人副流感病毒。在本發(fā)明中，優(yōu)選的副粘病毒包括屬于副粘病毒亞科(包括呼吸病毒屬、風(fēng)疹病毒屬和麻疹病毒屬)的病毒，更優(yōu)選呼吸病毒屬(也稱為副粘病毒屬)或其衍生物?？捎糜诒景l(fā)明的呼吸病毒包括例如I型人副流感病毒(HPIV-1)，III型人副流感病毒(HPIV-3)，III型牛副流感病毒(BPIV-3)，仙臺(tái)病毒(也稱為I型小鼠副流感病毒)和X型猴副流感病毒(SPIV-10)。在本發(fā)明中，最優(yōu)選副粘病毒是仙臺(tái)病毒。這些病毒可以是天然的、野生型的、突變的、實(shí)驗(yàn)室-傳代的、人工構(gòu)建的毒株等。不完整的病毒，如DI顆粒(Willenbrink，W.and Neubert，W.J.，J.Virol.688413-8417(1994))以及合成的寡核苷酸可用作生產(chǎn)病毒載體的原料。
通過構(gòu)建與適當(dāng)啟動(dòng)子相連的、含有編碼病毒基因組的DNA的重組DNA，在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄構(gòu)建體，在副粘病毒L、P和NP蛋白的存在下重建RNP，并形成含有RNP的病毒顆粒，即可產(chǎn)生重組副粘病毒載體。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，即可由載體DNA重建病毒(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820(1997)；Kato，A.et al.，EMBO J.16578-587(1997)；Yu，D.et al.，Genes Cells 2457-466(1997)；WO 97/16539；WO97/16538；Durbin，A.P.et al.，Virol.235323-332(1997)；Whelan，S.P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392(1995)；Schnell，M.J.et al.，EMBO J.134195-4203(1994)；Radecke，F(xiàn).et al.，EMBO J.145773-5784(1995)；Lawson，N.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481(1995)；Garcin，D.et al.，EMBO J.146087-6094(1995)；Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579(1996)；Baron，M.D.and Barrett，T.，J.Virology 711265-1271(1997)；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9315400-15404(1996))。這些方法能由DNA重建出合乎需要的副粘病毒載體，包括副流感病毒、水泡性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒和仙臺(tái)病毒載體，以及其它(-)鏈RNA病毒載體。一般通過下述步驟制備副粘病毒載體(a)在表達(dá)NP，P和L蛋白的細(xì)胞(輔助細(xì)胞)中轉(zhuǎn)錄得自副粘病毒、編碼負(fù)單鏈RNA或其互補(bǔ)鏈(正鏈)的載體DNA；(b)培養(yǎng)細(xì)胞并由培養(yǎng)物上清液回收病毒顆粒。由載體DNA轉(zhuǎn)錄的RNA與NP，L和P蛋白形成RNP復(fù)合物，導(dǎo)致產(chǎn)生由含包膜蛋白的外部包膜包裹的病毒顆粒。
本發(fā)明的其它病毒載體包括病毒基因有缺失的病毒載體。例如，可使用病毒復(fù)制的必需基因已缺失的復(fù)制缺陷型病毒載體。當(dāng)副粘病毒載體DNA中的F基因和/或HN基因等缺失時(shí)，病毒自身不會(huì)形成感染性的病毒顆粒。通過將這些缺失的基因和/或編碼另一種病毒的包膜蛋白的基因?qū)氩《旧a(chǎn)細(xì)胞，并分開表達(dá)它們，即可裝配出感染性的病毒顆粒。根據(jù)或基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(WO 00/70055和WO 00/70070)，也可以產(chǎn)生這些缺失型病毒載體。通過例如添加至基因上游的轉(zhuǎn)錄起始序列的類型即可控制載體的外源基因表達(dá)水平(WO 01/18223)。另外，病毒載體還包括含有其它病毒的包膜蛋白的假型病毒載體。所述包膜蛋白可以是例如VSV-G(WO 00/70055和WO 00/70070)。
可將收集到的動(dòng)物細(xì)胞-感染性病毒載體純化至基本上純。通過已知的純化/分離方法，包括過濾、離心和柱純化或其組合即可進(jìn)行純化。術(shù)語“基本上純”指的是在病毒載體作為組分存在于其中的樣品中，病毒載體是樣品的主要部分。一般說來，當(dāng)?shù)米圆《据d體的蛋白質(zhì)占樣品中總蛋白質(zhì)(除去作為載體或穩(wěn)定劑添加于其中的蛋白質(zhì))的10％或以上，優(yōu)選20％或以上，更優(yōu)選50％或以上，更優(yōu)選70％或以上，更優(yōu)選80％或以上，甚至更優(yōu)選90％或以上時(shí)，可以證實(shí)樣品是基本上純的病毒載體。副粘病毒純化方法的具體例子包括使用纖維素硫酸酯或交聯(lián)多糖硫酸酯的方法(JP-B Sho62-30752；JP-B Sho 62-33879；和JP-B Sho 62-30753)，以及用含有巖藻糖硫酸的多糖和/或其降解產(chǎn)物吸附病毒的方法(WO 97/32010)。
通過將以可表達(dá)的方式編碼TAP抑制蛋白以及與表位相連的β2m或MHC I類重鏈的、能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，即可在細(xì)胞內(nèi)高頻率表達(dá)所需表位。本發(fā)明提供了生產(chǎn)與表位相連的β2m或與表位相連的MHC I類重鏈的方法，所述方法包括將(一種或多種)能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的步驟，所述病毒載體以可表達(dá)的方式編碼(i)TAP抑制蛋白；和(ii)與表位相連的β2m或與表位相連的MHC I類重鏈。在本發(fā)明中，編碼(i)和(ii)的、能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體可以是不同的或相同的。
另外，本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中已導(dǎo)入(一種或多種)能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體，所述病毒載體以可表達(dá)的方式編碼(i)TAP抑制蛋白；和(ii)與表位相連的β2m或與表位相連的MHC I類重鏈。在本發(fā)明中，編碼(i)和(ii)的、能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體可以是不同的或相同的。另外，本發(fā)明提供了上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中當(dāng)表位與β2m相連時(shí)，進(jìn)一步導(dǎo)入以可表達(dá)的方式編碼不含表位的MHC I類重鏈的、能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體，或者當(dāng)表位與MHC I類重鏈相連時(shí)，進(jìn)一步導(dǎo)入以可表達(dá)的方式編碼不含表位的β2m的、能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體。這些載體可以與編碼TAP抑制蛋白和與表位相連的蛋白質(zhì)的載體相同或不同。TAP抑制蛋白的具體例子是US6和ICP47。另外，特別優(yōu)選將副粘病毒載體用作能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體。
通過本發(fā)明的方法表達(dá)的與表位相連的β2m可用于體外CTL試驗(yàn)。CTL試驗(yàn)的靶細(xì)胞一般包括得自與CTL相同之個(gè)體的細(xì)胞系。例如，可將用合成肽脈沖的、被EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系(自身-類淋巴母細(xì)胞系，自身-LCL)的細(xì)胞用作靶細(xì)胞?；蛘?，不使用合成肽，而是添加通過本發(fā)明方法制備的與表位相連的β2m，或者將表達(dá)例如TAP抑制蛋白和與表位相連的β2m的病毒載體感染至自身-LCL。通過共-感染分別表達(dá)例如TAP抑制蛋白、所需的MHC I類重鏈(膜-結(jié)合形式)、以及將要展示于MHC I類重鏈上的與表位相連的β2m的病毒載體，可以類似地使用人細(xì)胞系的細(xì)胞。
另外，可使用通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的與表位相連的β2m來建立表位-特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)。通過體外特異性的單次或多次刺激，可以建立這種表位-特異性CTL。例如，通過使用經(jīng)HIV Nef138-10肽脈沖的經(jīng)照射自身PBMC刺激感染了HIV的個(gè)體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)，然后在IL-2的存在下共培養(yǎng)，即可建立HIV Nef138-10-特異性CTL。本文通常使用合成肽，但被表達(dá)與表位相連的β2m的病毒載體感染的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液(游離形式的與表位相連的β2m)顯示出類似的作用。也可通過將表達(dá)例如TAP抑制蛋白和與表位相連的β2m的病毒載體感染至刺激細(xì)胞來建立表位-特異性CTL。
可使用通過本發(fā)明方法獲得的與表位相連的β2m來誘導(dǎo)抗原-特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。即，得自本發(fā)明的與表位相連的β2m可用作抗原-特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)物。根據(jù)本發(fā)明獲得的與表位相連的β2m可用于誘導(dǎo)抗原-特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。
另外，經(jīng)由SeV表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的與表位相連的β2m與細(xì)胞表面作為分泌蛋白的HLA-A*2402分子結(jié)合，可以有效地將抗原呈遞至CTL。通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的與表位相連的β2m可用作蛋白質(zhì)制品。即通過純化與表位相連的β2m并從中除去污染的病毒，即可獲得可用于臨床的抗原-特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)物。通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的與表位相連的β2m可用作藥物組合物的成分。
例如，通過包括使與表位相連的β2m與(表位-特異性)CD8+T細(xì)胞接觸之步驟的方法，可以特異性地使用與表位相連的β2m誘導(dǎo)抗原-特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。
例如，與表位相連的β2m可用于在體外建立表位-特異性CTL細(xì)胞系。通過體外的一至幾輪特異性刺激，可以建立表位-特異性CTL細(xì)胞系。例如，為了建立HIV Nef138-10-特異性CTL細(xì)胞系，可使用經(jīng)HIV Neff38-10肽脈沖的經(jīng)照射自身PBMC刺激感染了HIV-1的個(gè)體的PBMC，然后在IL-2的存在下共培養(yǎng)。本文通常使用合成肽進(jìn)行刺激；然而通過加入根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的與表位相連的β2m也能獲得類似效果。
另外，在體外的CTL試驗(yàn)中，與表位相連的β2m可用于脈沖靶細(xì)胞。可用根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的與表位相連的β2m，而不是用合成肽來脈沖CTL試驗(yàn)中的靶細(xì)胞，所得結(jié)果與使用合成肽的相同。一般說來，細(xì)胞表面已表達(dá)了MHC I類重鏈(膜-結(jié)合形式)+β2m+肽的復(fù)合物。用肽脈沖欲用脈沖肽替代復(fù)合物的肽部分。當(dāng)用與表位相連的β2m脈沖時(shí)，β2m和復(fù)合物的肽部分會(huì)發(fā)生有效交換。通過酸處理可除去預(yù)先存在的表位肽。
與表位相連的β2m也可用于脈沖來自患者體內(nèi)的樹狀細(xì)胞。從患者體內(nèi)分離外周血單核細(xì)胞，然后通過標(biāo)準(zhǔn)方法誘導(dǎo)其分化成樹狀細(xì)胞。例如，給患者皮下施用樹狀細(xì)胞，所述細(xì)胞中已導(dǎo)入表達(dá)與表位相連的β2m和TAP抑制蛋白的病毒載體。結(jié)果，與體外實(shí)驗(yàn)中類似，由于與表位相連的β2m在細(xì)胞表面被表達(dá)成MHC I類重鏈和與表位相連的β2m的復(fù)合物，因此有望誘導(dǎo)表位-特異性CTL。由于與被肽脈沖的細(xì)胞相比，用與表位相連的β2m脈沖的樹狀細(xì)胞有望以較高密度在MHC I類重鏈上穩(wěn)定而長期地表達(dá)表位，因此，所述樹狀細(xì)胞可用作細(xì)胞疫苗(治療性疫苗)。
以可表達(dá)的方式編碼與表位相連的β2m或MHC I類重鏈的、能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體可與能表達(dá)TAP抑制劑或TAP抑制蛋白的載體聯(lián)合用于誘導(dǎo)抗原-特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明涉及一種組合物，其含有(i)TAP抑制劑或以可表達(dá)的方式編碼TAP抑制劑的載體；和(ii)(a)與表位相連的β2m或與表位相連的MHC I類重鏈，或(b)以可表達(dá)的方式編碼與表位相連的β2m或與表位相連的MHC I類重鏈的載體。載體可適當(dāng)懸浮于藥物可接受的溶液中。例如，載體可包含在生理鹽水、培養(yǎng)液或血清中。所述組合物可用作在MHC I類上展示外來表位的增強(qiáng)劑。所述組合物也可用作抗原-特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)物。編碼TAP抑制蛋白的載體可以不同于編碼與表位相連的β2m或編碼MHC I類重鏈的載體，或者，單個(gè)載體可編碼這些蛋白質(zhì)。即，本發(fā)明還包括以可表達(dá)的方式編碼TAP抑制劑以及與表位相連的β2m或MHC I類重鏈中的任一種的載體。另外，本發(fā)明涉及(i)TAP抑制劑或以可表達(dá)的方式編碼TAP抑制劑的載體；和(ii)與表位相連的β2m或MHC I類重鏈，或以可表達(dá)的方式編碼與表位相連的β2m或MHCI類重鏈的載體在提高M(jìn)HC I類上展示的外來表位水平和誘導(dǎo)抗原-特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答中的用途。這些病毒載體可用于基因治療。本發(fā)明提供了藥物組合物，其含有(i)TAP抑制劑或以可表達(dá)的方式編碼TAP抑制劑的載體；和(ii)與表位相連的β2m或MHC I類重鏈，或以可表達(dá)的方式編碼與表位相連的β2m或MHC I類重鏈的載體。另外，本發(fā)明涉及用于展示表位的試劑盒，其含有(i)TAP抑制劑或能表達(dá)TAP抑制劑的載體；和(ii)與表位融合的MHC I類重鏈或β2m，或能表達(dá)與表位融合的MHC I類重鏈或β2m的載體。如果可能的話，將(i)和(ii)分開，也可以將它們混合。所述試劑盒可包括多種TAP抑制劑或能表達(dá)它們的載體，也可包括多種MHC I類重鏈或β2m，或能表達(dá)多種MHC I類重鏈或β2m的載體。它們可適當(dāng)溶解或懸浮于藥物可接受的溶液中。特別優(yōu)選載體是能感染動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體。由于本發(fā)明的含有載體的組合物以及試劑盒能夠誘導(dǎo)抗原-特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此它們可用于誘導(dǎo)針對(duì)感染、癌癥等的抗原-特異性免疫應(yīng)答。通過直接(體內(nèi))施用或間接(回體)施用所述組合物或試劑盒而進(jìn)行的基因表達(dá)，即可在基因治療中使用本發(fā)明的組合物或試劑盒。
例如，在體外建立表位-特異性CTL細(xì)胞系的過程中，通過使用上述組合物或試劑盒而不是使用合成肽即可獲得刺激細(xì)胞的刺激作用。
本發(fā)明的組合物和試劑盒也可用于在體外CTL試驗(yàn)中脈沖靶細(xì)胞。在TAP受抑制的條件下用表達(dá)與表位相連的β2m的病毒載體感染，而不是使用合成肽脈沖的自身-LCL細(xì)胞可用作靶細(xì)胞來檢測(cè)細(xì)胞毒活性。另外，為了將人細(xì)胞系用作靶細(xì)胞，可用表達(dá)所需MHC I類重鏈(膜-結(jié)合形式)的病毒載體，以及表達(dá)通過MHC I類重鏈呈遞的與表位相連的β2m和TAP抑制蛋白的病毒載體共感染所述細(xì)胞。
另外，本發(fā)明的組合物和試劑盒可用于在患者的樹狀細(xì)胞中回體表達(dá)表位。從患者體內(nèi)分離外周血單核細(xì)胞，通過標(biāo)準(zhǔn)方法誘導(dǎo)其分化至樹狀細(xì)胞。將本發(fā)明的組合物施用于樹狀細(xì)胞，然后將細(xì)胞接種于患者皮下。特別適合使用病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。重點(diǎn)是在經(jīng)脈沖的樹狀細(xì)胞表面，脈沖肽或與表位相連的β2m蛋白的表達(dá)能持續(xù)多久。實(shí)際上，當(dāng)用肽脈沖細(xì)胞時(shí)，樹狀細(xì)胞表面的表位表達(dá)在短期內(nèi)消失。與之形成對(duì)照的是，通過使用能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與表位相連的β2m的病毒載體感染樹狀細(xì)胞，即可長期表達(dá)與表位相連的β2m。另外，本發(fā)明的組合物和試劑盒也可用于體內(nèi)基因治療，其中通過體內(nèi)施用所述組合物和試劑盒，可誘導(dǎo)表位-特異性的CTL。
用于表達(dá)外來表位的基因轉(zhuǎn)移靶細(xì)胞優(yōu)選包括具有抗原呈遞能力的細(xì)胞。所述細(xì)胞特別地包括樹狀細(xì)胞(DC)。例如，通過使用本發(fā)明的方法，將表達(dá)與外來表位相連的β2m或MHC I類重鏈的載體導(dǎo)入來自體內(nèi)的樹狀細(xì)胞，即可在樹狀細(xì)胞中以高頻率形成所需的MHC I類/肽復(fù)合物。所得細(xì)胞可用于激活抗原-特異性T細(xì)胞。本發(fā)明包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中已外源性導(dǎo)入編碼與表位相連的β2m或MHC I類重鏈的基因，而且TAP活性受到抑制。具有抗原-呈遞能力的合乎需要的分離細(xì)胞可用作哺乳動(dòng)物細(xì)胞。特別地，也可將編碼不與表位相連的MHC I類/肽復(fù)合物亞單位的外源基因?qū)爰?xì)胞，以形成大量MHC I類/肽復(fù)合物。轉(zhuǎn)基因可由染色體外部的表達(dá)載體編碼，或整合至細(xì)胞染色體內(nèi)。當(dāng)表達(dá)膜-結(jié)合形式的MHC I類重鏈時(shí)，與膜結(jié)合的MHC I類/肽復(fù)合物在細(xì)胞表面表達(dá)。所述細(xì)胞對(duì)表位-特異性CTL有極好的抗原-呈遞能力。上文所述的其中已導(dǎo)入編碼與表位相連的β2m或與表位相連的MHC I類重鏈的外源基因，而且TAP活性受到抑制的哺乳動(dòng)物細(xì)胞也可用作藥物組合物的成分。
必要時(shí)，本發(fā)明的組合物可與合乎需要的藥物可接受載體混合。本文中的術(shù)語“藥物可接受的載體”表示能給細(xì)胞施用，且不會(huì)顯著抑制活性成分的活性的物質(zhì)。例如，本發(fā)明的組合物可包括生理鹽水，磷酸緩沖鹽水(PBS)等。當(dāng)在雞蛋中增殖副粘病毒載體時(shí)，含有載體的組合物可含有尿囊酸。另外，含有細(xì)胞的組合物可懸浮于生理鹽水、PBS、培養(yǎng)液等中。另外，本發(fā)明的組合物可含有載體，如去離子水和5％葡萄糖溶液。另外，組合物還可含有其它成分，包括植物油、懸浮劑、去污劑、穩(wěn)定劑和抗生素。另外，還可加入防腐劑和其它添加劑。本發(fā)明的組合物可用作試劑和藥物。組合物還可用作疫苗。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的組合物用作試劑、藥物或疫苗的用途。為了增強(qiáng)免疫原性，疫苗組合物也可含有免疫促進(jìn)劑，包括細(xì)胞因子、霍亂毒素和沙門氏菌毒素。另外，疫苗可與佐劑混合，佐劑包括明礬、不完全弗氏佐劑、MF59(油乳劑)、MTP-PE(得自分枝桿菌細(xì)胞壁的胞壁酰三肽)和QS-21(得自皂樹Quilaja saponaria)。
另外，可有效地與細(xì)胞因子組合以增強(qiáng)施用本發(fā)明的藥物組合物的佐劑作用。所述組合包括i)IL-2與單鏈IL-12的組合(Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(15)8591-8596(1999))，ii)IL-2與γ-干擾素的組合(美國專利號(hào)5,798,100)，iii)僅用GM-CSF，和iv)用于治療腦瘤的GM-CSF與IL-4的組合(J.Neurosurgery 90(6)1115-1124(1999))。
本發(fā)明的疫苗可用于例如腫瘤、感染和其它一般性疾病。例如，為了治療感染，需分析傳染性微生物抗原蛋白質(zhì)的表位，然后產(chǎn)生與表位融合的β2m或MHC I類重鏈?？乖鞍踪|(zhì)包括例如針對(duì)流感的強(qiáng)毒株型H5N1的包膜；針對(duì)日本腦炎的包膜蛋白(Vaccine 17(15-16)1869-1882(1999))；針對(duì)AIDS的HIV gag或SIV gag蛋白(J.Immunology 1644968-4978(2000))，HIV包膜蛋白，Nef蛋白和其它病毒蛋白質(zhì)；霍亂抗原，例如霍亂毒素B亞單位(CTB)(Arakawa，T.et al.，Nature Biotechnology，16(10)934-8(1998)；Arakawa，T.et al.，Nature Biotechnology，16(3)292-7(1998))；狂犬病抗原，例如狂犬病毒的糖蛋白(Lodmell，D.L.et al.，Nature Medicine 4(8)949-52(1998))；和宮頸癌抗原，例如人乳頭瘤病毒6型的衣殼蛋白L1(J.Med.Virol60200-204(2000))。另外，本發(fā)明還可應(yīng)用于十分需要使用疫苗的致病性副粘病毒，如麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒。另外，也可使用抗原蛋白質(zhì)的表位，所述抗原蛋白質(zhì)包括日本腦炎病毒的JE-E抗原蛋白質(zhì)(JP-A Sho64-74948，JP-A Hei 1-285498)，人單純皰疹病毒的gD2蛋白(JP-A Hei5-252965)，得自丙型肝炎病毒的肽(JP-AHei 5-192160)和得自假狂犬病毒的多肽(國際公開號(hào)7-502173的已
公開日文譯文)。例如，分析被這些病原體微生物感染的患者的細(xì)胞，以鑒定抗原呈遞細(xì)胞(APC)上呈遞的抗原蛋白質(zhì)的表位。通過選擇適當(dāng)?shù)腍LA類型即可鑒定出針對(duì)所需HLA類型的表位。
治療腫瘤時(shí)，在臨床上至關(guān)重要的是針對(duì)腫瘤-特異性抗原開發(fā)出不同的和新穎的治療策略和方法。例如，在腫瘤療法中，可在抗原-呈遞細(xì)胞(APC)，如腫瘤細(xì)胞或DC細(xì)胞中表達(dá)與表位相連的β2m或MHC I類重鏈，或者也可以施用蛋白質(zhì)產(chǎn)物，如與表位相連的β2m和MHC I類/肽復(fù)合物。
開發(fā)疫苗療法的一般方法包括使用DC細(xì)胞，已知DC細(xì)胞具有為輔助T細(xì)胞(Th)呈遞抗原的能力，并具有經(jīng)由MHC I類分子將抗原高效呈遞給CTL的能力(Mayordomo，J.I.et al.，Nature Med.1(12)1279-1302(1995))。作為腫瘤免疫療法的一個(gè)例子，Yasushi Fuji等(National Hospital Kyushu CancerCenter)正在進(jìn)行一項(xiàng)研究，旨在建立一種利用經(jīng)證實(shí)能在多種惡性腫瘤中表達(dá)的MAGE抗原作為靶標(biāo)的腫瘤疫苗療法。對(duì)7個(gè)病例使用了該方法，包括6例復(fù)發(fā)的胃腫瘤和1例復(fù)發(fā)的食道腫瘤。結(jié)果，在復(fù)發(fā)的食道腫瘤病例中觀察到轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)縮小，腫瘤標(biāo)記物的減少以及臨床癥狀(嘶啞)的改善。在6例胃腫瘤的4例中觀察到腫瘤標(biāo)記物的減少。未觀察到副作用，暗示出腫瘤免疫療法的安全性。另外，在很多病例中觀察到臨床癥狀的改善和腫瘤標(biāo)記物的減少，這表明通過選擇給藥途徑、適用的病例等，免疫療法有可能用作有效的治療方法。在實(shí)踐中，已開始對(duì)使用MAGE-3肽的DC疫苗療法進(jìn)行臨床研究，已證實(shí)所述療法是針對(duì)進(jìn)行性復(fù)發(fā)消化器官癌癥病例的安全的腫瘤-特異性免疫療法。然而，為了給很多患者預(yù)防性地施用這種疫苗，尋找給每個(gè)患者施用作為“天然佐劑”的樹狀細(xì)胞的最佳狀況顯然是困難的和不現(xiàn)實(shí)的。因此，本領(lǐng)域需要有效的方法(Yamagishi，H.etal.，Oral presentation in the General meeting of Japan society of Cancer TherapyOctober 12(1999)，Gifu City)。將本發(fā)明應(yīng)用于這種腫瘤疫苗療法將會(huì)十分有效。
通過使用病毒疫苗防止感染即可預(yù)防由病毒引起的腫瘤發(fā)生。因此，與由其它因素導(dǎo)致的腫瘤相比，病毒導(dǎo)致的腫瘤實(shí)際上可以被更好地預(yù)防。例如，與肝腫瘤有關(guān)的丙型肝炎病毒(HCV)、與子宮癌有關(guān)的人乳頭瘤病毒(HPV)和與成人T細(xì)胞白血病有關(guān)的HTLV-1是旨在預(yù)防和治療感染的候選疫苗。肝腫瘤在日本人的腫瘤中占較大比例。丙型肝炎病毒感染不是在口腔中發(fā)生的，其中的大部分會(huì)變成慢性，甚至在具有正常免疫能力的健康成人中也是如此。約20％被感染的個(gè)體預(yù)計(jì)會(huì)患有慢性肝炎或肝硬化。另外，很多肝硬化患者會(huì)得肝細(xì)胞癌。盡管用干擾素治療丙型肝炎可以治愈部分患者，但其效力并不能如最初預(yù)期的那樣，直至目前，對(duì)超過一半的患者仍沒有有效的療法。一般說來，通過免疫接種誘導(dǎo)中和抗體就可以預(yù)防病毒感染。然而，丙型肝炎病毒很容易突變，迄今為止尚未證實(shí)能中斷其感染的中和抗體的存在。已知除了誘導(dǎo)中和抗體外，誘導(dǎo)CTL也可預(yù)防病毒感染。本發(fā)明有望在病毒感染的過程中誘導(dǎo)CTL激活。
Moriyama，T等(Jichi Medical School)正在研究一種誘導(dǎo)CTL的新方法，該方法使用編碼病原體抗原的基因本身作為疫苗(DNA疫苗)。正如他們的論文中所述，該方法也存在問題，例如表達(dá)不充分和給藥位點(diǎn)局限于肌肉(Kurane，I.“DNA vaccine，present situation and new findings”，CurrentConcepts in Infectious Diseases 19(3)6-9(2000))。另一篇論文描述了利用HER2的癌癥疫苗，HER2是在乳腺癌中過表達(dá)的具有酪氨酸激酶活性的膜型糖蛋白(Kageyama，S.，Watanabe，M.，Hiasa，A.，and Suku，K.，“Cancer andimmunity，cancer-specific immune therapy，vaccine therapy against breast cancerusing a HER-derived peptide”，New Horizon for Medicine 32(5)1167-1172(2000))。例如，使用本發(fā)明的病毒載體產(chǎn)生的癌癥疫苗有望發(fā)揮比這些DNA疫苗更高的作用。通過使用在哺乳動(dòng)物組織中具有較寬表達(dá)范圍的病毒載體(腺病毒載體、腺-伴隨病毒載體、單純皰疹病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、塞姆利基森林病毒載體、新培斯病毒載體、痘苗病毒載體、仙臺(tái)病毒載體等)來構(gòu)建載體，即可提供高效疫苗。
盡管子宮癌是雌性-特異性腫瘤，但開發(fā)預(yù)防和治療HPV感染的疫苗的重要性與其它腫瘤相同。HTLV-1的主要感染途徑是母嬰傳播。然而，也有其它途徑。盡管最近發(fā)現(xiàn)的HGV的病原性仍不清楚，但它象HCV一樣在社會(huì)上廣泛傳播，這表明從公共衛(wèi)生的角度考慮，需要預(yù)防這種病毒。因此，該病毒也是本發(fā)明作用的靶標(biāo)。
有關(guān)抗原呈遞細(xì)胞的應(yīng)用和給藥途徑的研究也是至關(guān)重要的。研究得最深入的疫苗療法給藥途徑包括下述步驟(1)在體外將外周血中所含的單核細(xì)胞分化成DC；和(2)經(jīng)由靜脈內(nèi)注射將它們返回至患者體內(nèi)。該方法利用了DC細(xì)胞經(jīng)由MHC I類分子將抗原呈遞至CTL的能力。該系統(tǒng)需要良好的設(shè)備和培養(yǎng)時(shí)間。最近，有人描述了利用皮膚的疫苗療法。有關(guān)抗病毒疫苗療法和癌癥疫苗療法的研究引起人們的注意，所述療法利用了樹狀細(xì)胞，包括朗氏細(xì)胞(LC)，最近已發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞能經(jīng)由細(xì)胞表面的MHC I類分子將內(nèi)源性抗原，如病毒抗原和癌癥抗原有效呈遞給CTL。由于很多LC細(xì)胞位于皮膚表皮，通過在皮膚上使用病毒肽或編碼抗原的基因，即可開發(fā)出有效的DNA疫苗療法。然而，正常皮膚中的LC細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，對(duì)Th和CTL具有較低的抗原呈遞能力，遷移至淋巴結(jié)的能力較差。因此，使用正常皮膚難以實(shí)現(xiàn)病毒疫苗療法或癌癥疫苗療法。為了解決這些問題，Naohiro Seo和Masahiro Takigawa(Hamamatsu Univ.School of Medicine)及其同事證實(shí)通過8至15次重復(fù)用紗帶摩擦(TS)以破壞最外面的皮膚層，即角質(zhì)層屏障，皮膚上的LC細(xì)胞被激活，然后遷移至淋巴結(jié)并將抗原有效呈遞至Th細(xì)胞(日本專利申請(qǐng)?zhí)朒ei 10-316585，“Percutaneous peptideimmunization via comeum barrier-disrupted murine skin for experimental tumorimmunoprophylaxis″；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97371-376(2000))。該方法因能將病毒肽、癌癥肽或抗原DNA應(yīng)用于屏障受損的皮膚而擴(kuò)展了病毒疫苗和癌癥療法的可能性。這些給藥方法可應(yīng)用于本發(fā)明。
為了完成更加大膽的臨床應(yīng)用，重要的是構(gòu)建人HLA-局限型癌癥-特異性CTL細(xì)胞系，并且克隆編碼癌癥-反應(yīng)性CTL-誘導(dǎo)抗原的基因，所述抗原被所述細(xì)胞系識(shí)別，從而開發(fā)出在臨床上可用于針對(duì)癌癥患者的腫瘤-特異性免疫療法的靶分子。通過鑒定與患者的HLA類型相同的HLA所呈遞的表位，并使用鑒定出的表位產(chǎn)生疫苗載體或肽疫苗，有望更加有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
日本人種群中多發(fā)的癌癥包括例如肺癌、消化道癌(食道、胃和結(jié)腸癌)、肝癌、頭頸癌、乳腺癌、子宮癌、惡性卵巢瘤、腎瘤和白血病。在這些癌癥中，臨床上選擇鱗狀細(xì)胞癌和腺癌的組織類型作為治療靶是有用的，因?yàn)樗鼈冋既毡救巳喊┌Y中的大多數(shù)。表皮癌不僅占日本成人惡性腫瘤中的大多數(shù)，在世界范圍內(nèi)也是最多發(fā)的癌癥。因此，表皮癌細(xì)胞-特異性抗原的表位適用于本發(fā)明。另外，關(guān)于HLA，鑒定出HLA-A24(約60％癌癥患者)，HLA-A2(約40％)和HLA-A26(約20％)-局限型CTL-識(shí)別的癌癥-消退抗原特別重要，因?yàn)檫@些HLA類型在日本也占據(jù)優(yōu)勢(shì)。根據(jù)這些類型，鑒定出預(yù)期為HLA-A11(20％)，HLA-A31(達(dá)20％)和HLA-33(達(dá)20％)的抗原也是至關(guān)重要的。95％或更多的日本人種群具有HLA-A24，-A2，-A26，-A31和-A33中的至少一種。另外，這些HLA等位基因在不同種族中廣泛分布。因此，優(yōu)選從具有這些HLA類型的細(xì)胞中鑒定出編碼癌癥-反應(yīng)性CTL-誘導(dǎo)抗原的基因，并將它們用于本發(fā)明。
Kyogo Ito(Medical school of Kurume Univ.)等建立了多種針對(duì)在日本人中多發(fā)的人HLA類-局限型表皮癌(腺癌和鱗狀細(xì)胞癌)的特異性殺傷性T細(xì)胞，并且克隆了編碼抗原的基因，所述抗原由這些細(xì)胞識(shí)別，并能誘導(dǎo)表皮癌-反應(yīng)性CTL。另外，他們還鑒定出由所述基因編碼的癌癥抗原肽，并在體外分析所述抗原肽誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞的能力(Tou，U.，Yamana，H.，Sueyoshi，S.，Shintani，F(xiàn).，Tanaka，T.，Kubota，M.，Mine，T.，Sasahara，H.，and Ito，K.，“Cloning and analysis of an antigen gene from the peripheral bloodlymphocytes after the specific adoptive immunotherapy by a local injection ofCTL from a patient carrying esophagus cancer”，The Japanese Society ofGastroenterological Surgery33(7)1191(2000))。迄今為止，已克隆出分別得自鱗狀細(xì)胞癌和腺癌cDNA文庫的4個(gè)基因(SART-1至SART-4)和3個(gè)基因，并且分析了它們的編碼蛋白質(zhì)。在導(dǎo)入SART-1基因的癌細(xì)胞中誘導(dǎo)選擇性細(xì)胞凋亡。另外，HLA-A24-局限型肽(SART-1 690-698)強(qiáng)烈誘導(dǎo)CTL，HLA-A26-局限型肽(SART-1 736-744)在具有HLA-A2601，-A2602或-A2603的癌癥患者中誘導(dǎo)CTL(Yamana，H.and Ito，K.(Medical School of KurumeUniv.)，“Antigen peptide therapy of tumors；cancer immunotherapy using theSART-1 antigen peptide”，Journal of Clinical and Experimental Medicine 190(2)129-133(1999)；Inoue，K.(Research Institute of National Cancer Center)，Nakao，M.，Matsunaga，K.，Matsuoka-kikuchi，S.，Yamana，H.，and Ito，K.(MedicalSchool of Kurume Univ.)，“Induction of CTL in peripheral blood lymphocytesfrom HLA-A26-positive healthy subjects and cancer patients with different HLAsubtypes，using the SART-1 peptide”，General meeting abstracts of JapaneseCancer Association)。另外還發(fā)現(xiàn)140kD SART-3-反應(yīng)性癌癥-反應(yīng)性CTL-誘導(dǎo)抗原能在增殖細(xì)胞和癌細(xì)胞核中選擇性地表達(dá)，在抗原中鑒定出兩個(gè)九肽，它們對(duì)HLA-A24-+癌癥患者的淋巴細(xì)胞具有CTL-誘導(dǎo)能力(Yamana，H.，Sasatomi，T.，Miyagi，Y.，Tou，U.，Shiromizu，K.，and Ito，K.(Medical Schoolof Kurume Univ.)，Japan Surgical Society(supplement)101417(2000))。為了在多種癌癥中在蛋白質(zhì)水平上表達(dá)這些癌癥-反應(yīng)性CTL-誘導(dǎo)抗原，在60至80％的鱗狀細(xì)胞癌和除乳腺癌外40至50％的腺癌中表達(dá)SART-1抗原；在60％以上的鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)SART-2；在包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌的大多數(shù)惡性腫瘤中表達(dá)SART-3。與之形成對(duì)照的是，這些抗原在除睪丸以外的正常組織中不表達(dá)(Ito，K.，Shichijo，S.，and Yamana，H.(Medical School ofKurume Univ.)，“Tumor immunity 9，Human cancer-specific T cell-recognizedantigen 2，Squamous cell carcinoma-reactive CTL-inducing antigen SART-1 andpeptide vaccines”，Immunology Frontier 9(3)195-204(1999))。HLA-A26和HLA-A*2402分別為22％和約60％的日本人共享。因此，這些肽疫苗有望用于日本的很多鱗狀細(xì)胞癌患者。Kurume大學(xué)計(jì)劃使用上述肽進(jìn)行1期臨床研究(Yamana，H.and Ito，K.(Medical School of Kurume Univ.)，“Anexplanation of guideline to clinical studies”，A proposal regarding the firstclinical studies on tumor peptide vaccines，Cellular Molecular Medicine 1(1)89-95(2000))。本發(fā)明可用于得自這些抗原肽的表位。
通過將編碼上述肽抗原的基因用于本發(fā)明，即可進(jìn)行針對(duì)腫瘤、致病的感染性微生物等的有效免疫療法。除了這些抗原外，表位包括癌癥抗原Muc-1和Muc-1-樣粘蛋白串聯(lián)重復(fù)肽(美國專利號(hào)5,744,144)和黑素瘤gp100抗原。使用這些基因的免疫療法已被用于多種癌癥，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌等。另外還發(fā)現(xiàn)編碼上述腫瘤抗原肽HER2的基因在約20至40％的乳腺癌、惡性卵巢瘤、胃癌和非-小細(xì)胞肺癌中過表達(dá)或擴(kuò)增，顯示出較高的腫瘤特異性傾向。源自HER2的兩個(gè)九肽(HER2p63-71和HER2p 780-788)是本發(fā)明表位的例子，所述肽得自樹狀細(xì)胞，所述樹狀細(xì)胞純化自惡性卵巢瘤患者和正常健康受試者的外周血單核細(xì)胞(Eur.J.Immunol.303338-3346(2000))。另外，本發(fā)明的藥物組合物可用于使用CEA表位肽的、CEA-陽性進(jìn)行性實(shí)體腫瘤的癌癥疫苗療法(Kim，C.et al.，CancerImmunol.Immunother.47W 90-96(1998))。例如，通過有選擇地收集血液成分，可從患者體內(nèi)分離出大量外周血單核細(xì)胞，通過加入IL-4和GM-CSF由單核細(xì)胞組分誘導(dǎo)樹狀細(xì)胞，然后將通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的含有CEA表位肽的β2m或載體自身導(dǎo)入經(jīng)誘導(dǎo)的樹狀細(xì)胞，最后將樹狀細(xì)胞作為“DC疫苗”皮下給藥(Kyoto Prefectural University of Medicine)，“A case of bonemetastatic lung cancer wherein dissociation between serum CEA values andanti-tumor effect was achieved via CEA-specific active immunotherapy”.International Association of Surgeons and Gastoenterologists)。
任選地，本發(fā)明可用于一般性疾病。例如，為了治療糖尿病，對(duì)于I型糖尿病動(dòng)物模型而言，可將胰島素片段肽用作表位(Coon，B.et al.，J.Clin.Invest.104(2)189-194(1999))。
當(dāng)用作疫苗時(shí)，可以足以至少部分誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的量施用本發(fā)明的組合物。然而，蛋白質(zhì)的給藥劑量或基因的表達(dá)水平應(yīng)通過考慮其有效水平和中毒水平來確定。給藥途徑可適當(dāng)選自例如經(jīng)皮、經(jīng)鼻、經(jīng)支氣管、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)和皮下給藥，但并不局限于此?？梢跃植炕蛉硇越o藥。通過例如本發(fā)明所述的CTL試驗(yàn)即可檢測(cè)對(duì)細(xì)胞免疫力的誘導(dǎo)。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以檢測(cè)使用含載體的組合物導(dǎo)入細(xì)胞的基因的表達(dá)水平。通過例如Northern雜交、RT-PCR或RNA保護(hù)試驗(yàn)可以檢測(cè)和/或定量基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。也可原位進(jìn)行通過Northern雜交和RNA保護(hù)試驗(yàn)的檢測(cè)?？墒褂每贵w進(jìn)行Western印跡、免疫沉淀、RIA、ELISA、Pull-down試驗(yàn)等以檢測(cè)翻譯產(chǎn)物。另外，為了較容易地檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，可在欲表達(dá)的蛋白質(zhì)上連接標(biāo)記物，或者將報(bào)道基因插入載體以使它們能被表達(dá)。報(bào)道基因的例子包括-半乳糖苷酶、CAT、堿性磷酸酶和GFP蛋白；然而，并不局限于此。
蛋白質(zhì)組合物，如與表位相連的β2m或MHC I類/肽復(fù)合物的劑量可根據(jù)欲治療的疾病，患者的體重、年齡、性別和癥狀，給藥的目的，施用組合物的類型，給藥途徑等的不同而改變，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)卮_定劑量。蛋白質(zhì)劑量范圍可以是例如10ng/kg至100μg/kg，優(yōu)選為100ng/kg至50μg/kg，更優(yōu)選1μg/kg至5μg/kg。當(dāng)聯(lián)合使用多種表位給藥時(shí)，可以上述劑量施用每一種表位。蛋白質(zhì)組合物，如與表位相連的β2m或MHC I類/肽復(fù)合物可以適當(dāng)?shù)嘏c藥物可接受的載體混合。
載體組合物的劑量可根據(jù)疾病、體重、年齡、性別、癥狀、給藥的目的、轉(zhuǎn)基因等的不同而改變，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)卮_定劑量。優(yōu)選以約105pfu/ml至約1011pfu/ml，更優(yōu)選以約107pfu/ml至約109pfu/ml，最優(yōu)選以約1×108pfu/ml至約5×108pfu/ml的濃度范圍施用處于藥物可接受載體中的副粘病毒載體。劑量優(yōu)選為約105pfu/輪至1011pfu/輪，更優(yōu)選為約107pfu/輪至109pfu/輪，最優(yōu)選為約108pfu/輪至109pfu/輪。當(dāng)聯(lián)合施用不同載體時(shí)，以上述劑量施用每一種載體。
本發(fā)明的組合物可施用給所有的哺乳動(dòng)物，包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、綿羊、牛和狗。
附圖簡述

圖1顯示出構(gòu)建能表達(dá)與表位相連的β2m(e/β2m)的SeV載體所用質(zhì)粒(e/β2m/pSeVb)的結(jié)構(gòu)。(A)顯示出在pSeV18b(+)的NotI位點(diǎn)插入e/β2m的編碼序列所獲得的e/β2m/pSeVb的結(jié)構(gòu)。(B)顯示出β2微球蛋白和由載體編碼的與表位相連的β2微球蛋白的結(jié)構(gòu)。(C)顯示出插入的NotI片段的核苷酸序列。
圖2顯示出構(gòu)建能表達(dá)膜-結(jié)合形式的HLA-A*2402的SeV載體所用質(zhì)粒(A24fu11/pSeVb)的結(jié)構(gòu)。(A)顯示出在pSeV18b(+)的NotI位點(diǎn)插入A24full的編碼序列所獲得的A24full/pSeVb的結(jié)構(gòu)。(B)顯示出插入的NotI片段的核苷酸序列。
圖3顯示出構(gòu)建能表達(dá)TAP抑制因子的SeV載體所用質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。(A)顯示出在pSeV18c(+)的NotI位點(diǎn)(N和P基因之間)分別插入ICP47his和US6hisA24full的編碼序列所獲得的ICP47his/pSeVc和US6his/pSeVc的結(jié)構(gòu)。(B)顯示出插入的NotI片段的核苷酸序列。
圖4顯示出共表達(dá)與表位相連的β2m(e/β2m)和TAP抑制蛋白(ICP47his或US6his)的SeV載體的結(jié)構(gòu)。由e/β2m/pSeVb和ICP47his/pSeVc構(gòu)建<e/β2m+ICP47his>/pSeV，由e/β2m/pSeVb和US6his/pSeVc構(gòu)建<e/β2m+US6his>/pSeV。
圖5顯示出膜表達(dá)形式的MHC I類/肽復(fù)合物的作用。用感染復(fù)數(shù)(m.o.i.)分別為10和2的A24full/SeVb和e/Nef138-β2m/SeVb(圖中表示為“A24full+e/Nef138-β2m”)共感染H9細(xì)胞(HLA-A*2402-人T細(xì)胞系)。將用A24full/SeVb和wt/SeV(而不是e/Nef138-β2m/SeVb)(圖中表示為“A24full+wt”)共感染的H9細(xì)胞用作陰性對(duì)照。另外，用肽脈沖H9細(xì)胞以用作對(duì)比實(shí)驗(yàn)(圖中表示為“A24full+wt肽脈沖(10μl)”)。18小時(shí)之后，用100μCiNa251CrO4標(biāo)記細(xì)胞2小時(shí)，以使用Nef138-10-特異性CTL克隆進(jìn)行51Cr釋放試驗(yàn)。(A)顯示出試驗(yàn)方法，(B)顯示出結(jié)果。
圖6顯示出分泌形式的與表位相連的β2m的作用。以m.o.i.為2的e/Nef138-β2m/SeVb或wt/SeV(用作對(duì)照)感染H9細(xì)胞(HLA-A*2402人T細(xì)胞系)，3天后，收集培養(yǎng)物上清液并使用0.22μm的濾器過濾。
作為靶細(xì)胞，以m.o.i.分別為10和2的A24full/SeVb和wt/SeV共感染H9細(xì)胞(HLA-A*2402人T細(xì)胞系)。感染18小時(shí)之后，用100μCiNa251CrO4標(biāo)記靶細(xì)胞2小時(shí)。然后，用按上文所述制備的含有e/Nef138-β2m的培養(yǎng)物上清液(實(shí)心方塊)脈沖細(xì)胞，將10μM合成的Nef138-10肽(實(shí)心菱形)用作陽性對(duì)照，或?qū)⒈粀t/SeV感染的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液用作陰性對(duì)照(空心圓)。1小時(shí)后，使用Nef138-10-特異性CTL克隆進(jìn)行51Cr釋放試驗(yàn)。作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以m.o.i.分別為10和2的A24full/SeVb和e/Nef138-β2m/SeVb共感染H9細(xì)胞，并按照類似的方法將H9細(xì)胞用于試驗(yàn)(實(shí)心圓)。(A)顯示出試驗(yàn)方法，(B)顯示出結(jié)果。
圖7顯示出通過導(dǎo)入表達(dá)TAP抑制蛋白的SeV載體，細(xì)胞表面MHC I類/肽復(fù)合物水平的降低。以m.o.i.為3的ICP47his/SeVc或US6his/SeVc感染H9細(xì)胞，感染18，24，30和42小時(shí)之后收集細(xì)胞，接著用抗-MHC I類抗體染色，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)水平(A)。(B)組中的數(shù)值表示M.F.I.(平均熒光強(qiáng)度)。另外，點(diǎn)線表示被同種型對(duì)照SeV感染的細(xì)胞，而實(shí)線表示被野生型SeV感染的細(xì)胞(圖8，9和11中使用了相同的符號(hào))。TAP抑制蛋白的表達(dá)使細(xì)胞膜表面新MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)受抑制，從而導(dǎo)致MHC I類/肽復(fù)合物水平一直降低。然而，由于已有的MHC I類/肽復(fù)合物不受影響，因此降低的水平較低。
圖8顯示出酸處理對(duì)已有的MHC I類/肽復(fù)合物的作用。酸處理1，3和6小時(shí)之后，用抗-MHC I類抗體染色MT-2細(xì)胞，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)水平(A)。酸處理從細(xì)胞膜表面的MHCI類/肽復(fù)合物中除去了肽，從而導(dǎo)致MHC I類/肽復(fù)合物水平降低(B)。然后，在約6小時(shí)之內(nèi)，細(xì)胞膜表面MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)即可恢復(fù)到與酸處理前幾乎相同的水平。
圖9顯示出酸處理和導(dǎo)入表達(dá)TAP抑制蛋白的SeV載體對(duì)抑制MHC I類/肽復(fù)合物表達(dá)的作用。以m.o.i.為3的ICP47his/SeVc或US6his/SeVc感染MT-2細(xì)胞，用酸處理14小時(shí)之后，用抗-HLA-A24抗體染色6小時(shí)。然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞膜表面MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)水平(A)。由于通過酸處理除去了已有的MHC I類/肽復(fù)合物，同時(shí)通過TAP抑制蛋白抑制了細(xì)胞表面新MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)，甚至在酸處理后6小時(shí)，細(xì)胞表面MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)水平仍然較低(B)。
圖10的照片顯示由導(dǎo)入細(xì)胞的SeV載體共表達(dá)的與表位相連的β2m和TAP抑制蛋白。用抗-(His)6抗體(A)和抗-β2m抗體(B)檢測(cè)兩種蛋白。這些照片顯示，被<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV感染的細(xì)胞表達(dá)出e/Nef138-β2m和US6his。泳道M，分子量標(biāo)記；泳道1，<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV；泳道2，US6his/SeVc；泳道3，e/Nef138-β2m/SeVb；泳道4，e/Nef138-β2m/SeVc和泳道5，wt(野生型)SeV。
圖11顯示出因?qū)胧古c表位相連的β2m和TAP抑制蛋白共表達(dá)的SeV載體所致的與表位相連型β2m結(jié)合的MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)。(A)顯示出試驗(yàn)方法，(B)顯示出結(jié)果。盡管在僅導(dǎo)入了表達(dá)ICP47his或US6his的SeV載體(<e/Nef138-β2m+ICP47his>/SeV或<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV)的細(xì)胞中，甚至在酸處理6小時(shí)后，細(xì)胞表面MHC I類/肽復(fù)合物的水平仍然較低，但在導(dǎo)入了共表達(dá)e/Nef138-β2m和ICP47his或US6his的SeV載體的細(xì)胞中，在酸處理6小時(shí)后，即可恢復(fù)酸處理前細(xì)胞表面MHC I類/肽復(fù)合物的水平。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式下文將參照實(shí)施例具體闡述本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于此。另外，本說明書中提及的所有參考文獻(xiàn)都列入本文作為參考。
分離HLA-A*2402基因和人β2m基因HLA-A*2402基因、人MHC I類基因和人β2m基因克隆自外周血單核細(xì)胞(PBMC)的信使RNA(mRNA)，所述細(xì)胞取自攜有HLA-A24的正常健康受試者。用Micro-FastTrack試劑盒(Invitrogen)制備mRNA，用AMV-RTFirst-strand cDNA合成試劑盒(LIFE SCIENCE)合成cDNA。
將所得cDNA用作模板，使用分別針對(duì)HLA-A*2402和β2m基因的引物套HLA-5P2和HLA-3B以及b2m-5’和b2m-3’進(jìn)行PCR。
HLA-5P2，5’-GGGCGGATCCGGACTCAGAATCTCCCCAGACGCCGAG-3’(SEQ IDNO7)HLA-3B，5’-CCGCCTCGAGCTGGGGAGGAAACAGGTCAGCATGGGAAC-3’(SEQID NO8)b2m-5’，5’-GGCACGAGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGC-3’(SEQ ID NO9)b2m-3’，5’-AATTTGGAATTCATCCAATCCAAATGCGGC-3’(SEQ ID NO10)以94℃30秒，58℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35輪PCR循環(huán)，接著于72℃進(jìn)行延伸反應(yīng)達(dá)7分鐘。使用Ex Taq(TaKaRa)進(jìn)行PCR。使用pGEM-T載體系統(tǒng)(Promega)(分別被稱為A*2402/pGEM和β2m/pGEM)克隆所獲得的PCR產(chǎn)物，通過測(cè)序反應(yīng)進(jìn)一步證實(shí)其核苷酸序列。通過在AB1-377DNA測(cè)序儀上電泳，使用染料終止劑化學(xué)(Big-Dye terminator cycle sequencingReady Reaction Kit；Applied Biosystems)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。
構(gòu)建與表位相連的β2m的表達(dá)載體進(jìn)行下述步驟以構(gòu)建編碼SeV載體的質(zhì)粒(e/β2m/pSeVb)，所述SeV載體表達(dá)與表位相連的β2m。通過PCR將每種表位和接頭的序列插入β2m信號(hào)序列的下游，并通過PCR添加仙臺(tái)病毒的E和S信號(hào)以及NotI識(shí)別位點(diǎn)(圖1)。接頭的氨基酸序列(GGGSGGGSGGGS/SEQ ID NO11)被設(shè)計(jì)成具有3個(gè)重復(fù)的GGGS(SEQ ID NO1)序列。所用引物如下e/b2m-al， 5’-GGAGGTGGCGGGTCCGGAGGTGGTTCTGGTGGAGGTTCGATCCAGCGTACTCCAAAGATT-3’(SEQ ID NO12)e(Nef)-a2， 5’-TCTGGCCTGGAGGCTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTTCGGAGGAGGTGGCGGGTCC-3’(SEQ ID NO13)e(Env)-a2， 5’-TCTGGCCTGGAGGCTAGATACCTAAGGGATCAACAGCTCCTAGGGATTGGAGGTGGCGGGTCC-3’(SEQ ID NO14)e/b2m-a3， 5’-TGCGGCCGCCGTACGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCT-3’(SEQ ID NO15)b2m-d， 5’-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGTTACATGTCTCGATCCCACTT-3’(SEQ ID NO16)使用β2m/pGEM為模板，并使用一套引物e/b2m-al和e/b2m-d，以94℃1分鐘，48℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行15輪PCR循環(huán)，接著于72℃進(jìn)行延伸反應(yīng)達(dá)7分鐘。在相同條件下，以所得PCR產(chǎn)物為模板，使用e(Nef)-a2或e(Env)-a2和b2m-d再次進(jìn)行PCR，接著，在相同條件下使用這些產(chǎn)物為模板，并使用e/b2m-a3和b2m-d再次進(jìn)行PCR，分別獲得e/Nef138-β2m和e/Env584-β2m片段。使用pGEM-T載體系統(tǒng)(Promega)克隆每個(gè)片段，通過測(cè)序反應(yīng)進(jìn)一步證實(shí)其序列。然后用NotI消化含有任一片段的每種載體，并將其插入pSeV18+b(+)經(jīng)NotI消化的位點(diǎn)，再證實(shí)其核苷酸序列。由此獲得e/Nef138-β2m/pSeVb和e/EnV584-β2m/pSeVb(統(tǒng)稱“e/β2m/pSeVb”)。另一方面，按照與上文所述類似的方法，使用b2m-a(5’-TGCGGCCGCCGTACGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTA-3’(SEQ ID NO17)和b2m-d構(gòu)建僅表達(dá)天然β2m的仙臺(tái)病毒β2m/pSeVb。Nef表位(Nef138-10)和Env表位(Env584-11)的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO21和23。
構(gòu)建表達(dá)膜結(jié)合形式的MHC I類重鏈的載體通過PCR添加仙臺(tái)病毒的E和S信號(hào)和NotI位點(diǎn)(圖2)。
所用引物如下A24-a#，5′-TGCGGCCGCCGTACGCCGAGGATGGCCGTCATGGCGCCCCG-3′(SEQID NO28)A24-d4，5′-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGTCACACTTTACAAGCTGTGAG-3′(SEQ ID NO29)使用A*2402/pGEM為模板，并使用一套引物A24-a#和A24-d4，以94℃1分鐘，48℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行15輪PCR循環(huán)，接著于72℃進(jìn)行延伸反應(yīng)達(dá)7分鐘，產(chǎn)生A24full片段。按照與產(chǎn)生e/β2m/pSeVb類似的方法獲得A24full/pSeVb。
構(gòu)建ICP47的表達(dá)載體以及ICP47和表位的共表達(dá)載體如文獻(xiàn)所述(McGeoch，D.J.，Nucleic Acids Res.14(4)1727-1745(1986))，將得自單純皰疹病毒1型(HSV-1)的ICP47(US12)基因克隆至質(zhì)粒US12/pGEX-5X-2。使用PCR在ICP47基因片段上添加組氨酸標(biāo)記(his)、仙臺(tái)病毒的E和S信號(hào)以及NotI位點(diǎn)(圖3)。
所用引物如下ICP-Esn，5′-TGCGGCCGCAGTAAGAAAAACTTAGGGTCAAACGTACGGCCGAGATGTCGTGGGCCCTGGAAAT-3′(SEQ ID NO34)ICPhis-R，5′-TTGCGGCCGCTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGAGCTCCACGGGTTACCGGATTAC-3′(SEQ ID NO35)使用US12/pGEX-5X-2為模板，以94℃1分鐘，48℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行15輪PCR循環(huán)，接著于72℃進(jìn)行延伸反應(yīng)達(dá)7分鐘，產(chǎn)生ICP47his片段。按照與產(chǎn)生e/β2m/pSeV類似的方法，通過將ICP47his片段導(dǎo)入pSeV18+c(+)，獲得ICP47his/pSeVc(Kato，A.et al.，J.Virol.73(11)9237-9246(1999))。
用KpnI和SpnI(New England BioLab)消化e/Nef138-β2m/pSeVb和ICP47his/pSeVc以分別產(chǎn)生e/Nef138-β2m/pSeVb的含有e/Nef138-β2m的片段(4kb)和ICP47his/pSeVc的含有ICP47his的片段(15kb)，接著使用LigationKit Ver.2(TaKaRa)將它們連接起來，產(chǎn)生<e/Nef138-β2m+ICP47his>/pSeV(圖4)。
構(gòu)建US6的表達(dá)載體以及US6和表位的共表達(dá)載體文獻(xiàn)中已描述過人巨細(xì)胞病毒(CMV)株AD169的溶液(Chen，Z.et al.，Virology 258(2)240-248(1999))。使用CMV毒株AD169溶液的DNA提取物為模板進(jìn)行PCR(圖3)。所用引物如下US6-a，5′-TGCGGCCGCCACTCCTTCACTATGGATCTCTTG-3′(SEQ ID NO36)US6his-d1，5′-CTACGGCGTACGTCAATGGTGGTGATGGTGGTGAGCTCCGGAGCCACAACGTCGAAT-3′(SEQ ID NO37)US6his-d2，5′-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGTCA-3′(SEQ ID NO38)使用一套引物US6-a和US6his-d1，以94℃1分鐘，48℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行15輪PCR循環(huán)，接著于72℃進(jìn)行延伸反應(yīng)達(dá)7分鐘，產(chǎn)生US6his片段。按照與產(chǎn)生e/β2m/pSeVb類似的方法獲得US6his/pSeVc。
按照與構(gòu)建<e/Nef138-β2m+ICP47his>/pSeV類似的方法，由e/Nef138-β2m/pSeVb和US6his/pSeVc的重組獲得<e/Nef138-β2m+US6his>/pSeV(圖4)。
仙臺(tái)病毒載體的重建和感染文獻(xiàn)中已描述過pSeV18+b(+)，pGEM-L，pGEM-P，pGEM-N和vTF7-3(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820(1997)；Kato，A.et al.，EMBO.J.16578-587(1997)；Yu，D.et al.，Genes Cells，2457-466(1997))。根據(jù)上述參考文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)行仙臺(tái)病毒載體的重建。分別由e/Nef138-β2m/pSeVb和e/Env584-β2m/pSeVb產(chǎn)生仙臺(tái)病毒載體e/Nef138-β2m/SeVb和e/Env584-β2m/SeVb(總稱為e/β2m/SeVb)。另外，由A24full/pSeVb產(chǎn)生仙臺(tái)病毒載體A24full/SeVb。
仙臺(tái)病毒載體ICP47his/SeVc和<e/Nef138-β2m+ICP47his>/SeV分別得自ICP47his/pSeVc和<e/Nef138-β2m+ICP47his>/pSeV。仙臺(tái)病毒載體US6his/SeVc和<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV分別得自US6his/pSeVc和<e/Nef138-β2m+US6his>/pSeV。
在添加有10％胎牛血清(FCS)、100U/ml鏈霉素和100U/ml青霉素(LifeTechnologies)的MEM(Sigma)(M10)中培養(yǎng)猴腎細(xì)胞系CV-1和LLCMK2。除非另有說明，以每個(gè)所示的m.o.i，用重組仙臺(tái)病毒感染CV-1細(xì)胞，然后在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。
回收和定量測(cè)定與表位相連的β2m(e/β2m)以40,000×g離心被e/β2m/SeVb或β2m/SeVb(無表位)感染的CV-1細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液以除去仙臺(tái)病毒顆粒，并收集上清液。
使用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)定量培養(yǎng)物上清液中的e/β2m。將2.5μg/ml抗-人β2微球蛋白單克隆抗體(DAKO)用作捕獲抗體，將500ng/ml經(jīng)過氧化物酶標(biāo)記的抗-人β2微球蛋白單克隆抗體(DAKO)用作檢測(cè)抗體。使用TMB過氧化物酶顯色試劑盒(BIO-RAD)來顯色。
將純化的人β2微球蛋白(Biogenesis)用作標(biāo)準(zhǔn)樣品。
建立Nef138-10-特異性CTL克隆在每孔含100μl R10培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中，將攜有HLA-A*2402的HIV-1感染者的3×105個(gè)PBMC培養(yǎng)過夜。第二天，加入刺激細(xì)胞(在添加有0.2μg/ml PHA(Sigma)和10％Lymphocult-T(Biotest)的RPMI1640(Sigma)(R10)中活化過夜，以3000拉德照射，并用10μM Nef138-10脈沖1小時(shí)的自身PHA-blast)，在1μg/ml抗-人CD28的存在下培養(yǎng)2周。每隔2周，再用刺激細(xì)胞(以10,000拉德(rad)照射并用10μM Nef138-10脈沖的、被EB病毒轉(zhuǎn)化的自身B細(xì)胞系(B-LCL))進(jìn)一步刺激細(xì)胞。2至4次刺激之后，當(dāng)證實(shí)了CTL活性時(shí)，便可克隆細(xì)胞。
通過在10％Lymphocult-T和2.5％PHA-sup(來自正常健康受試者、用0.2μg/ml PHA刺激48小時(shí)的PBMC(3×106/ml)的培養(yǎng)物上清液)的存在下，將0.8個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞與1×105個(gè)細(xì)胞/孔的刺激細(xì)胞(以10,000拉德照射并用10μM Nef138-10脈沖的自身B-LCL)和5×104個(gè)細(xì)胞/孔的飼養(yǎng)細(xì)胞(來自正常健康受試者、以3000拉德照射的PBMC)一起保溫3至4周以進(jìn)行克隆。
CTL識(shí)別導(dǎo)入了SeV的細(xì)胞，該細(xì)胞形成膜結(jié)合形式的MHCI類/肽復(fù)合物按下述進(jìn)行CTL51Cr釋放試驗(yàn)。在添加有10％FCS，100U/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPMI1640(Sigma)(R10)中培養(yǎng)人CD4+T淋巴細(xì)胞系H9。用100μCiNa251CrO4標(biāo)記細(xì)胞(2×103個(gè)細(xì)胞/孔；靶細(xì)胞)2小時(shí)，用R10洗滌3次并用10μM肽(Nef138-10)脈沖1小時(shí)。當(dāng)將導(dǎo)入SeV載體的細(xì)胞用作靶細(xì)胞時(shí)，在標(biāo)記之前17小時(shí)(即在加入效應(yīng)細(xì)胞之前20小時(shí))，以10∶2的m.o.i.用圖5中所述的SeV載體組合感染細(xì)胞。以每種E∶T比例(效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞)加入實(shí)施例8的細(xì)胞以用作效應(yīng)細(xì)胞。37℃保溫細(xì)胞4小時(shí)，使用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定培養(yǎng)物上清液中釋放的51Cr的量。分別以R10和4％TritonX-100/PBS替代效應(yīng)細(xì)胞以測(cè)定自發(fā)釋放和最大釋放。
特異性裂解(％)的計(jì)算公式為(每個(gè)樣品的cpm-自發(fā)釋放的cpm)/(最大釋放的cpm-自發(fā)釋放的cpm)×100。
圖5顯示出CTL識(shí)別膜結(jié)合形式的MHC I類/肽復(fù)合物的結(jié)果。結(jié)果表明在被A24full/SeVb和e/Nef138-β2m/SeVb共感染的細(xì)胞中可檢測(cè)到抗原-特異性CTL激活。
從被SeV感染的細(xì)胞中回收的與表位相連的β2m的作用為了制備被SeV感染的細(xì)胞所產(chǎn)生的與表位相連的β2m，以m.o.i 2用e/Nef138-β2m/SeVb感染H9細(xì)胞。3天后，收集培養(yǎng)物上清液并過濾，產(chǎn)生含有與表位相連的β2m的溶液。與實(shí)施例9類似，使用被A24full/SeVb感染的H9細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行CTL試驗(yàn)，以比較用肽和上述含有與表位相連的β2m的溶液脈沖的效果。
圖6顯示出與表位相連的β2m的作用。通過在靶細(xì)胞培養(yǎng)物溶液中加入從被SeV感染的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中回收的與表位相連的β2m，檢測(cè)到抗原-特異性CTL活性。
通過ICP47或US6下調(diào)細(xì)胞表面的MHC I類/肽復(fù)合物在添加有10％FCS，100U/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPMI1640(Sigma)(R10)中培養(yǎng)人CD4+T淋巴細(xì)胞系H9的細(xì)胞，MT-2細(xì)胞和小鼠雜交瘤A11.1M(Foung，S.K.H.，et al.，Human Immunol.15316-319(1986))細(xì)胞。在含有10％Lymphocult-T(Biotest)的R10培養(yǎng)基中培養(yǎng)由HIV-1患者誘導(dǎo)的CTL系和CTL克隆。
以m.o.i.3用ICP47his/pSeVc和US6his/pSeVc共感染人CD4+T淋巴細(xì)胞系H9細(xì)胞，18，24，30和42小時(shí)之后，用經(jīng)FITC標(biāo)記的抗-MHC I類單克隆抗體3F10(Ancell)染色，然后通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。即，于4℃使H9細(xì)胞與100倍稀釋的抗-MHC I類抗體3F10-FITC反應(yīng)20分鐘，接著洗滌3次，并用含有1％低聚甲醛的PBS(磷酸緩沖鹽水)固定。將含有2％胎牛血清和0.1％疊氮鈉的PBS用于染色和洗滌。使用FACS Caliber(BecktonDickinson)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，并使用FlowJo Ver.3.3(Treestar)進(jìn)行分析。
當(dāng)將被野生型SeV感染的細(xì)胞用作對(duì)照時(shí)，未檢測(cè)到MHC I類/肽復(fù)合物表達(dá)的顯著變化，但是，當(dāng)用ICP47his/SeVc或US6his/SeVc感染細(xì)胞時(shí)，MHC I類/肽復(fù)合物水平卻一直在降低，這表明膜表面新MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)受到抑制(圖7)。然而，由于存在已有的MHC I類/肽復(fù)合物，因此未觀察到顯著的降低。
酸處理對(duì)已有的MHC I類/肽復(fù)合物的作用既然通過抑制TAP活性可抑制新MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)，那么可以檢查酸處理對(duì)已有的MHC I類/肽復(fù)合物的作用。
于4℃，用200μl肽剝離緩沖液(0.13M檸檬酸(pH3)，66mM Na2HPO4，150mM NaCl，17μg/ml酚紅)處理MT-2細(xì)胞(HLA-A24+)1分鐘以進(jìn)行釋放肽的酸處理，接著用12ml RPMI1640中和。處理后立即(0小時(shí))和1，3和6小時(shí)之后，用能產(chǎn)生抗-HLA-A24抗體的雜交瘤A11.1M的培養(yǎng)物上清液染色細(xì)胞，接著用經(jīng)FITC標(biāo)記的抗-小鼠IgG抗體(Immunotech)染色細(xì)胞，并按上文所述通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析(圖8)。
已證實(shí)酸(pH3)處理能從膜表面的MHC I類/肽復(fù)合物中除去肽，導(dǎo)致細(xì)胞表面MHC I類/肽復(fù)合物水平的降低。6小時(shí)之后可恢復(fù)至處理前的水平。
通過酸處理和使用TAP抑制蛋白的表達(dá)載體使細(xì)胞表面MHC I類/肽復(fù)合物水平降低既然已證實(shí)酸處理可有效降低已有的MHC I類/肽復(fù)合物的水平，那么可以通過用TAP抑制蛋白的表達(dá)載體感染細(xì)胞，在TAP抑制蛋白被有效表達(dá)之后(感染后14小時(shí))進(jìn)行酸處理以除去已有的MHC I類/肽復(fù)合物，在酸處理之后6小時(shí)分析細(xì)胞膜表面的MHC I類/肽復(fù)合物水平，進(jìn)而檢查TAP抑制蛋白在抑制細(xì)胞膜表面新MHC I類/肽復(fù)合物中的作用。
以m.o.i.3用ICP47his/SeVc或US6his/SeVc感染MT-2細(xì)胞，如實(shí)施例12所述，14小時(shí)之后用酸處理，如實(shí)施例12所述，處理后6小時(shí)用MHCI類/肽復(fù)合物(A11.1M)染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析(圖9)。結(jié)果證實(shí)ICP47和US6都能有效抑制細(xì)胞表面新MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)。另外，還證實(shí)了ICP47和US6具有幾乎相同的抑制作用。
通過TAP抑制蛋白和與表位相連的β2m的共表達(dá)載體共表達(dá)TAP抑制蛋白和與表位相連的β2m使用Western印跡分析實(shí)施例5構(gòu)建的表達(dá)TAP抑制蛋白和與表位相連的β2m的載體是否能實(shí)際表達(dá)出這兩種蛋白質(zhì)。
以m.o.i.3，用分別或同時(shí)表達(dá)e/Nef138-β2m和US6his的SeV載體以及野生型SeV感染CV-1細(xì)胞，24小時(shí)之后收集被感染的細(xì)胞。用TNE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH7.8)，1％NP40，0.15M NaCl，1mM EDTA，10μg/ml抑蛋白酶肽)裂解收集到的被感染細(xì)胞，將溶解的組分上樣至SDS-PAGE，接著使用抗-(His)6抗體和抗-β2m抗體進(jìn)行Western印跡以證實(shí)US6his和e/Nef138-β2m蛋白的表達(dá)(圖10)。將樣品印跡至PVDF膜上，然后使用BlockAce(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)進(jìn)行封閉，于4℃，使膜與1000-倍稀釋的抗-(His)6抗體，Penta-His抗體(QIAGEN)或抗-β2m抗體(Immunotech)反應(yīng)1小時(shí)。洗滌4次之后，室溫下使膜與2000-倍稀釋的經(jīng)HRP標(biāo)記的抗-小鼠IgG抗體(Roche)反應(yīng)1小時(shí)，洗滌4次，然后使用Lumi-Light plussubstrate(Roche)顯色。使用Lumi Imager F1(Boehringer Manheim)進(jìn)行檢測(cè)。用TBS-T(20mM Tris-HCl(pH7.5)，500mM NaCl，0.05％Tween-20)洗滌，用10-倍稀釋的Block Ace稀釋抗體。結(jié)果，在被<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV感染的細(xì)胞中，證實(shí)了US6his和e/Nef138-β2m的表達(dá)。而且，US6his的表達(dá)水平與被US6his/SeVc感染的細(xì)胞中的幾乎相同。
在酸處理之后通過共表達(dá)TAP抑制蛋白和與表位相連的β2m的載體回收MHC I類/肽復(fù)合物從實(shí)施例13和14的結(jié)果看，在被共表達(dá)TAP抑制蛋白和與表位相連的β2m的載體感染的、用酸處理過的細(xì)胞中，在細(xì)胞膜表面展示內(nèi)源性蛋白質(zhì)衍生表位的MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)有望受抑制，導(dǎo)致無需TAP-介導(dǎo)的肽轉(zhuǎn)移、具有與表位相連的β2m的MHC I類/肽復(fù)合物高頻率表達(dá)。
因此，以m.o.i.3，用ICP47his/SeVc或US6his/SeV，和<e/Neff138-β2m+ICP47his>/SeV或<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV感染MT-2細(xì)胞，如實(shí)施例13所述，14小時(shí)之后用酸處理，如實(shí)施例13所述，6小時(shí)后用MHC I類/肽復(fù)合物(A11.1M)染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析(圖11)。在被ICP47his/SeVc或US6his/SeVc感染的細(xì)胞中，細(xì)胞膜表面MHC I類/肽復(fù)合物的表達(dá)受抑制，在被<e/Nef138-β2m+ICP47his>/SeV或<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV感染的細(xì)胞中回收到的MHC I類/肽復(fù)合物水平與被野生型SeV感染的細(xì)胞中的幾乎相同。這表明被共表達(dá)TAP抑制蛋白和與表位相連的β2m的載體感染的細(xì)胞高密度地表達(dá)了同與表位相連的β2m結(jié)合的MHC I類/肽復(fù)合物。
工業(yè)實(shí)用性當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)與表位相連的MHC I類或β2m時(shí)，本發(fā)明通過抑制內(nèi)源性表位的展示，能有效展示所需的外來表位。因此，本發(fā)明能在細(xì)胞表面高頻率表達(dá)能展示某些特異性(單個(gè))表位的MHC I類/肽復(fù)合物。通過使用本發(fā)明的方法體內(nèi)或回體導(dǎo)入表達(dá)與表位相連的MHC I類或β2m的載體，可以有效誘導(dǎo)所需的抗原-特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明能用于誘導(dǎo)針對(duì)感染的保護(hù)性免疫力，并可用于癌癥免疫治療中的基因治療等。
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<141>
<150>JP 2002-288394<151>2002-10-01<160>54<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>1Gly Gly Gly Ser1<210>2<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>2Gly Gly Gly Gly Ser1 5
<210>3<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>3Gly Gly Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly1 5 10<210>4<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>4Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly1 5 10 15Ser Gly Gly Gly20<210>5<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>5Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly20 25 30<210>6<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>6Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly1 5 10<210>7<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>7gggcggatcc ggactcagaa tctccccaga cgccgag 37<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>10aatttggaat tcatccaatc caaatgcggc 30<210>11<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>11Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser1 5 10<210>12
<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>12ggaggtggcg ggtccggagg tggttctggt ggaggttcga tccagcgtac tccaaagatt 60<210>13<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>13tctggcctgg aggctagata tccactgacc tttggatggt gcttcggagg aggtggcggg 60tcc 63<210>14<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>14tctggcctgg aggctagata cctaagggat caacagctcc tagggattgg aggtggcggg 60tcc 63<210>15
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<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>15tgcggccgcc gtacggccga gatgtctcgc tccgtggcct tagctgtgct cgcgctactc 60tctctttctg gcctggaggc t 81<210>16<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>16ttgcggccgc gatgaacttt caccctaagt ttttcttact acggcgtacg ttacatgtct 60cgatcccact t 71<210>12<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>17tgcggccgcc gtacggccga gatgtctcgc tccgtggcct ta42<210>18<211>80
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<220>
<221>CDS<222>(21)..(80)<400>18gcggccgccg tacggccgag atg tct cgc tcc gtg gcc tta gct gtg ctc gcg 53Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala1 5 10cta ctc tct ctt tct ggc ctg gag gct 80Leu Leu Ser Leu Ser Gly Leu Glu Ala15 20<210>19<211>20<212>PRT<213>人工序列<400>19Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser1 5 10 15Gly Leu Glu Ala20<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(30)<400>20aga tat cca ctg acc ttt gga tgg tgc ttc 30Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe1 5 10<210>21<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>21Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe1 5 10<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(33)<400>22aga tac cta agg gat caa cag ctc cta ggg att33Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile1 5 10<210>23<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>23
Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile1 5 10<210>24<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(60)<400>24gga ggt ggc ggg tcc gga ggt ggt tct ggt gga ggt tcg atc cag cgt 48Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg1 5 10 15act cca aag att 60Thr Pro Lys Ile20<210>25<211>20<212>PRT<213>人工序列<400>25Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg1 5 10 15Thr Pro Lys Ile20<210>26<211>69<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(18)<400>26aag tgg gat cga gac atg taacgtacgc cgtagtaaga aaaacttagg48Lys Trp Asp Arg Asp Met1 5gtgaaagttc atcgcggccg c 69<210>27<211>6<212>PRT<213>人工序列<400>27Lys Trp Asp Arg Asp Met1 5<210>28<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>28tgcggccgcc gtacgccgag gatggccgtc atggcgcccc g41<210>29<211>71<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>29ttgcggccgc gatgaacttt caccctaagt ttttcttact acggcgtacg tcacacttta 60caagctgtga g 71<210>30<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<220>
<221>CDS<222>(21)..(38)<400>30gcggccgccg tacgccgagg atg gcc gtc atg gcg ccc 38Met Ala Val Met Ala Pro1 5<210>31<211>6<212>PRT<213>人工序列<400>31Met Ala Val Met Ala Pro1 5<210>32<211>69<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(18)<400>32ctc aca gct tgt aaa gtg tgacgtacgc cgtagtaaga aaaacttagg48Leu Thr Ala Cys Lys Val1 5gtgaaagttc atcgcggccg c 69<210>33<211>6<212>PRT<213>人工序列<400>33Leu Thr Ala Cys Lys Val1 5<210>34<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>34tgcggccgca gtaagaaaaa cttagggtca aacgtacggc cgagatgtcg tgggccctgg 60aaat 64<210>35<211>56
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>35ttgcggccgc tatcaatggt ggtgatggtg gtgagctcca cgggttaccg gattac 56<210>36<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>36tgcggccgcc actccttcac tatggatctc ttg 33<210>37<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>37ctacggcgta cgtcaatggt ggtgatggtg gtgagctccg gagccacaac gtcgaat 57<210>38<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列
<400>38ttgcggccgc gatgaacttt caccctaagt ttttcttact acggcgtacg tca 53<210>39<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<220>
<221>CDS<222>(43)..(60)<400>39gcggccgcag taagaaaaac ttagggtcaa acgtacggcc gag atg tcg tgg gcc 54Met Ser Trp Ala1ctg gaa 60Leu Glu5<210>40<211>6<212>PRT<213>人工序列<400>40Met Ser Trp Ala Leu Glu1 5<210>41<211>55<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(42)<400>41cgt aat ccg gta acc cgt gga gct cac cac cat cac cac cat 42Arg Asn Pro Val Thr Arg Gly Ala His His His His His His1 5 10tgatagcggc cgc55<210>42<211>14<212>PRT<213>人工序列<400>42Arg Asn Pro Val Thr Arg Gly Ala His His His His His His1 5 10<210>43<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<220>
<221>CDS<222>(41)..(58)<400>43gcggccgcag taagaaaaac ttagggtcaa agccttcact atg gat ctc ttg att 55Met Asp Leu Leu Ile1 5
cgt 58Arg<210>44<211>6<212>PRT<213>人工序列<400>44Met Asp Leu Leu Ile Arg1 5<210>45<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(42)<400>45att cga cgt tgt ggc tcc gga gct cac cac cat cac cac cat 42Ile Arg Arg Cys Gly Ser Gly Ala His His His His His His1 5 10tgatagcggc cgc 55<210>46<211>14<212>PRT<213>人工序列<400>46Ile Arg Arg Cys Gly Ser Gly Ala His His His His His His1 5 10
<210>47<211>2960<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(165)..(2588)<223>
<400>47ggcacgaggg tgtgcgtgat ggagaaaatt gggcaccagg gctgctcccg agattctcag60atctgatttc cacgcttgct accaaaatag tctgggcagg ccacttttgg aagtaggcgt120tatctagtga gcaggcggcc gctttcgatt tcgctttccc ctaa atg gct gag ctt 176Met Ala Glu Leu1ctc gcc agc gca gga tca gcc tgt tcc tgg gac ttt ccg aga gcc ccg 224Leu Ala Ser Ala Gly Ser Ala Cys Ser Trp Asp Phe Pro Arg Ala Pro5 10 15 20ccc tcg ttc cct ccc cca gcc gcc agt agg gga gga ctc ggc ggt acc 272Pro Ser Phe Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Gly Gly Leu Gly Gly Thr25 30 35cgg agc ttc agg ccc cac cgg ggc gcg gag agt ccc agg ccc ggc cgg 320Arg Ser Phc Arg Pro His Arg Gly Ala Glu Ser Pro Arg Pro Gly Arg40 45 50gac cgg gac ggc gtc cga gtg cca atg gct agc tct agg tgt ccc gct 368Asp Arg Asp Gly Val Arg Val Pro Met Ala Ser Ser Arg Cys Pro Ala55 60 65ccc cgc ggg tgc cgc tgc ctc ccc gga gct tct ctc gca tgg ctg ggg 416Pro Arg Gly Cys Arg Cys Leu Pro Gly Ala Ser Leu Ala Trp Leu Gly70 75 80aca gta ctg cta ctt ctc gcc gac tgg gtg ctg ctc cgg acc gcg ctg 464Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Asp Trp Val Leu Leu Arg Thr Ala Leu85 90 95 100
ccc cgc ata ttc tcc ctg ctg gtg ccc acc gcg ctg cca ctg ctc cgg 512Pro Arg Ile Phe Ser Leu Leu Val Pro Thr Ala Leu Pro Leu Leu Arg105 110 115gtc tgg gcg gtg ggc ctg agc cgc tgg gcc gtg ctc tgg ctg ggg gcc 560Val Trp Ala Val Gly Leu Ser Arg Trp Ala Val Leu Trp Leu Gly Ala120 125 130tgc ggg gtc ctc agg gca acg gtt ggc tcc aag agc gaa aac gca ggt 608Cys Gly Val Leu Arg Ala Thr Val Gly Ser Lys Ser Glu Asn Ala Gly135 140 145gcc cag ggc tgg ctg gct gct ttg aag cca tta gct gcg gca ctg ggc 656Ala Gln Gly Trp Leu Ala Ala Leu Lys Pro Leu Ala Ala Ala Leu Gly150 155 160ttg gcc ctg ccg gga ctt gcc ttg ttc cga gag ctg atc tca tgg gga 704Leu Ala Leu Pro Gly Leu Ala Leu Phe Arg Glu Leu Ile Ser Trp Gly165 170 175 180gcc ccc ggg tcc gcg gat agc acc agg cta ctg cac tgg gga agt cac 752Ala Pro Gly Ser Ala Asp Ser Thr Arg Leu Leu His Trp Gly Ser His185 190 195cct acc gcc ttc gtt gtc agt tat gca gcg gca ctg ccc gca gca gcc 800Pro Thr Ala Phe Val Val Ser Tyr Ala Ala Ala Leu Pro Ala Ala Ala200 205 210ctg tgg cac aaa ctc ggg agc ctc tgg gtg ccc ggc ggt cag ggc ggc 848Leu Trp His Lys Leu Gly Ser Leu Trp Val Pro Gly Gly Gln Gly Gly215 220 225tct gga aac cct gtg cgt cgg ctt cta ggc tgc ctg ggc tcg gag acg 896Ser Gly Asn Pro Val Arg Arg Leu Leu Gly Cys Leu Gly Ser Glu Thr230 235 240cgc cgc ctc tcg ctg ttc ctg gtc ctg gtg gtc ctc tcc tct ctt ggg 944Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Val Val Leu Ser Ser Leu Gly245 250 255 260gag atg gcc att cca ttc ttt acg ggc cgc ctc act gac tgg att cta 992Glu Met Ala Ile Pro Phe Phe Thr Gly Arg Leu Thr Asp Trp Ile Leu265 270 275
caa gat ggc tca gcc gat acc ttc act cga aac tta act ctc atg tcc 1040Gln Asp Gly Ser Ala Asp Thr Phe Thr Arg Asn Leu Thr Leu Met Ser280 285 290att ctc acc ata gcc agt gca gtg ctg gag ttc gtg ggt gac ggg atc 1088Ile Leu Thr Ile Ala Ser Ala Val Leu Glu Phe Val Gly Asp Gly Ile295 300 305tat aac aac acc atg ggc cac gtg cac agc cac ttg cag gga gag gtg 1136Tyr Asn Asn Thr Met Gly His Val His Ser His Leu Gln Gly Glu Val310 315 320ttt ggg gct gtc ctg cgc cag gag acg gag ttt ttc caa cag aac cag 1184Phe Gly Ala Val Leu Arg Gln Glu Thr Glu Phe Phe Gln Gln Asn Gln325 330 335 340aca ggt aac atc atg tct cgg gta aca gag gac acg tcc acc ctg agt 1232Thr Gly Asn Ile Met Ser Arg Val Thr Glu Asp Thr Ser Thr Leu Ser345 350 355gat tct ctg agt gag aat ctg agc tta ttt ctg tgg tac ctg gtg cga 1280Asp Ser Leu Ser Glu Asn Leu Ser Leu Phe Leu Trp Tyr Leu Val Arg360 365 370ggc cta tgt ctc ttg ggg atc atg ctc tgg gga tca gtg tcc ctc acc 1328Gly Leu Cys Leu Leu Gly Ile Met Leu Trp Gly Ser Val Ser Leu Thr375 380 385atg gtc acc ctg atc acc ctg cct ctg ctt ttc ctt ctg ccc aag aag 1376Met Val Thr Leu Ile Thr Leu Pro Leu Leu Phe Leu Leu Pro Lys Lys390 395 400gtg gga aaa tgg tac cag ttg ctg gaa gtg cag gtg cgg gaa tct ctg 1424Val Gly Lys Trp Tyr Gln Leu Leu Glu Val Gln Val Arg Glu Ser Leu405 410 415 420gca aag tcc agc cag gtg gcc att gag gct ctg tcg gcc atg cct aca 1472Ala Lys Ser Ser Gln Val Ala Ile Glu Ala Leu Ser Ala Met Pro Thr425 430 435gtt cga agc ttt gcc aac gag gag ggc gaa gcc cag aag ttt agg gaa 1520Val Arg Ser Phe Ala Asn Glu Glu Gly Glu Ala Gln Lys Phe Arg Glu440 445 450
aag ctg caa gaa ata aag aca ctc aac cag aag gag gct gtg gcc tat 1568Lys Leu Gln Glu Ile Lys Thr Leu Asn Gln Lys Glu Ala Val Ala Tyr455 460 465gca gtc aac tcc tgg acc act agt att tca ggt atg ctg ctg aaa gtg 1616Ala Val Asn Ser Trp Thr Thr Ser Ile Ser Gly Met Leu Leu Lys Val470 475 480gga atc ctc tac att ggt ggg cag ctg gtg acc agt ggg gct gta agc 1664Gly Ile Leu Tyr Ile Gly Gly Gln Leu Val Thr Ser Gly Ala Val Ser485 490 495 500agt ggg aac ctt gtc aca ttt gtt ctc tac cag atg cag ttc acc cag 1712Ser Gly Asn Leu Val Thr Phe Val Leu Tyr Gln Met Gln Phe Thr Gln505 510 515gct gtg gag gta ctg ctc tcc atc tac ccc aga gta cag aag gct gtg 1760Ala Val Glu Val Leu Leu Ser Ile Tyr Pro Arg Val Gln Lys Ala Val520 525 530ggc tcc tca gag aaa ata ttt gag tac ctg gac cgc acc cct cgc tgc 1808Gly Ser Ser Glu Lys Ile Phe Glu Tyr Leu Asp Arg Thr Pro Arg Cys535 540 545cca ccc agt ggt ctg ttg act ccc tta cac ttg gag ggc ctt gtc cag 1856Pro Pro Ser Gly Leu Leu Thr Pro Leu His Leu Glu Gly Leu Val Gln550 555 560ttc caa gat gtc tcc ttt gcc tac cca aac cgc cca gat gtc tta gtg 1904Phe Gln Asp Val Ser Phe Ala Tyr Pro Asn Arg Pro Asp Val Leu Val565 570 575 580cta cag ggg ctg aca ttc acc cta cgc cct ggc gag gtg acg gcg ctg 1952Leu Gln Gly Leu Thr Phe Thr Leu Arg Pro Gly Glu Val Thr Ala Leu585 590 595gtg gga ccc aat ggg tct ggg aag agc aca gtg gct gcc ctg ctg cag 2000Val Gly Pro Asn Gly Ser Gly Lys Ser Thr Val Ala Ala Leu Leu Gln600 605 610aat ctg tac cag ccc acc ggg gga cag ctg ctg ttg gat ggg aag ccc 2048Asn Leu Tyr Gln Pro Thr Gly Gly Gln Leu Leu Leu Asp Gly Lys Pro615 620 625
ctt ccc caa tat gag cac cgc tac ctg cac agg cag gtg gct gca gtg 2096Leu Pro Gln Tyr Glu His Arg Tyr Leu His Arg Gln Val Ala Ala Val630 635 640gga caa gag cca cag gta ttt gga aga agt ctt caa gaa aat att gcc 2144Gly Gln Glu Pro Gln Val Phe Gly Arg Ser Leu Gln Glu Asn Ile Ala645 650 655 660tat ggc ctg acc cag aag cca act atg gag gaa atc aca gct gct gca 2192Tyr Gly Leu Thr Gln Lys Pro Thr Met Glu Glu Ile Thr Ala Ala Ala665 670 675gta aag tct ggg gcc cat agt ttc atc tct gga ctc cct cag ggc tat 2240Val Lys Ser Gly Ala His Ser Phe Ile Ser Gly Leu Pro Gln Gly Tyr680 685 690gac aca gag gta gac gag gct ggg agc cag ctg tca ggg ggt cag cga 2288Asp Thr Glu Val Asp Glu Ala Gly Ser Gln Leu Ser Gly Gly Gln Arg695 700 705cag gca gtg gcg ttg gcc cga gca ttg atc cgg aaa ccg tgt gta ctt 2336Gln Ala Val Ala Leu Ala Arg Ala Leu Ile Arg Lys Pro Cys Val Leu710 715 720atc ctg gat gat gcc acc agt gcc ctg gat gca aac agc cag tta cag 2384Ile Leu Asp Asp Ala Thr Ser Ala Leu Asp Ala Asn Ser Gln Leu Gln725 730 735 740gtg gag cag ctc ctg tac gaa agc cct gag cgg tac tcc cgc tca gtg 2432Val Glu Gln Leu Leu Tyr Glu Ser Pro Glu Arg Tyr Ser Arg Ser Val745 750 755ctt ctc atc acc cag cac ctc agc ctg gtg gag cag gct gac cac atc 2480Leu Leu Ile Thr Gln His Leu Ser Leu Val Glu Gln Ala Asp His Ile760 765 770ctc ttt ctg gaa gga ggc gct atc cgg gag ggg gga acc cac cag cag 2528Leu Phe Leu Glu Gly Gly Ala Ile Arg Glu Gly Gly Thr His Gln Gln775 780 785ctc atg gag aaa aag ggg tgc tac tgg gcc atg gtg cag gct cct gca 2576Leu Met Glu Lys Lys Gly Cys Tyr Trp Ala Met Val Gln Ala Pro Ala790 795 800
gat gct cca gaa tgaaagcctt ctcagacctg cgcactccat ctccctccct 2628Asp Ala Pro Glu805tttcttctct ctgtggtgga gaaccacagc tgcagagtag gcagctgcct ccaggatgag 2688ttacttgaaa tttgccttga gtgtgttacc tcctttccaa gctcctcgtg ataatgcaga 2748cttcctggag tacaaacaca ggatttgtaa ttccttactg taacggagtt tagagccagg 2808gctgatgctt tggtgtggcc agcactctga aactgagaaa tgttcagaat gtacggaaag 2868atgatcagct attttcaaca taactgaagg catatgctgg cccataaaca ccctgtaggt 2928tcttgatatt tataataaaa ttggtgtttt gt 2960<210>48<211>808<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>48Met Ala Glu Leu Leu Ala Ser Ala Gly Ser Ala Cys Ser Trp Asp Phe1 5 10 15Pro Arg Ala Pro Pro Ser Phe Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Gly Gly20 25 30Leu Gly Gly Thr Arg Ser Phe Arg Pro His Arg Gly Ala Glu Ser Pro35 40 45Arg Pro Gly Arg Asp Arg Asp Gly Val Arg Val Pro Met Ala Ser Ser50 55 60Arg Cys Pro Ala Pro Arg Gly Cys Arg Cys Leu Pro Gly Ala Ser Leu65 70 75 80Ala Trp Leu Gly Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Asp Trp Val Leu Leu85 90 95Arg Thr Ala Leu Pro Arg Ile Phe Ser Leu Leu Val Pro Thr Ala Leu100 105 110
Pro Leu Leu Arg Val Trp Ala Val Gly Leu Ser Arg Trp Ala Val Leu115 120 125Trp Leu Gly Ala Cys Gly Val Leu Arg Ala Thr Val Gly Ser Lys Ser130 135 140Glu Asn Ala Gly Ala Gln Gly Trp Leu Ala Ala Leu Lys Pro Leu Ala145 150 155 160Ala Ala Leu Gly Leu Ala Leu Pro Gly Leu Ala Leu Phe Arg Glu Leu165 170 175Ile Ser Trp Gly Ala Pro Gly Ser Ala Asp Ser Thr Arg Leu Leu His180 185 190Trp Gly Ser His Pro Thr Ala Phe Val Val Ser Tyr Ala Ala Ala Leu195 200 205Pro Ala Ala Ala Leu Trp His Lys Leu Gly Ser Leu Trp Val Pro Gly210 215 220Gly Gln Gly Gly Ser Gly Asn Pro Val Arg Arg Leu Leu Gly Cys Leu225 230 235 240Gly Ser Glu Thr Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Val Val Leu245 250 255Ser Ser Leu Gly Glu Met Ala Ile Pro Phe Phe Thr Gly Arg Leu Thr260 265 270Asp Trp Ile Leu Gln Asp Gly Ser Ala Asp Thr Phe Thr Arg Asn Leu275 280 285Thr Leu Met Ser Ile Leu Thr Ile Ala Ser Ala Val Leu Glu Phe Val290 295 300Gly Asp Gly Ile Tyr Asn Asn Thr Met Gly His Val His Ser His Leu305 310 315 320Gln Gly Glu Val Phe Gly Ala Val Leu Arg Gln Glu Thr Glu Phe Phe325 330 335Gln Gln Asn Gln Thr Gly Asn Ile Met Ser Arg Val Thr Glu Asp Thr
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Asp Val Leu Val Leu Gln Gly Leu Thr Phe Thr Leu Arg Pro Gly Glu580 585 590Val Thr Ala Leu Val Gly Pro Asn Gly Ser Gly Lys Ser Thr Val Ala595 600 605Ala Leu Leu Gln Asn Leu Tyr Gln Pro Thr Gly Gly Gln Leu Leu Leu610 615 620Asp Gly Lys Pro Leu Pro Gln Tyr Glu His Arg Tyr Leu His Arg Gln625 630 635 640Val Ala Ala Val Gly Gln Glu Pro Gln Val Phe Gly Arg Ser Leu Gln645 650 655Glu Asn Ile Ala Tyr Gly Leu Thr Gln Lys Pro Thr Met Glu Glu Ile660 665 670Thr Ala Ala Ala Val Lys Ser Gly Ala His Ser Phe Ile Ser Gly Leu675 680 685Pro Gln Gly Tyr Asp Thr Glu Val Asp Glu Ala Gly Ser Gln Leu Ser690 695 700Gly Gly Gln Arg Gln Ala Val Ala Leu Ala Arg Ala Leu Ile Arg Lys705 710 715 720Pro Cys Val Leu Ile Leu Asp Asp Ala Thr Ser Ala Leu Asp Ala Asn725 730 735Ser Gln Leu Gln Val Glu Gln Leu Leu Tyr Glu Ser Pro Glu Arg Tyr740 745 750Ser Arg Ser Val Leu Leu Ile Thr Gln His Leu Ser Leu Val Glu Gln755 760 765Ala Asp His Ile Leu Phe Leu Glu Gly Gly Ala Ile Arg Glu Gly Gly770 775 780Thr His Gln Gln Leu Met Glu Lys Lys Gly Cys Tyr Trp Ala Met Val785 790 795 800Gln Ala Pro Ala Asp Ala Pro Glu805
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Leu Val Gly Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Ser Trp Ser Leu Trp Ala Val105 110 115ctg agc cct cct gga gcc cag gag aag gag cag gac cag gtg aac aac 498Leu Ser Pro Pro Gly Ala Gln Glu Lys Glu Gln Asp Gln Val Asn Asn120 125 130aaa gtc ttg atg tgg agg ctg ctg aag ctc tcc agg ccg gac ctg cct 546Lys Val Leu Met Trp Arg Leu Leu Lys Leu Ser Arg Pro Asp Leu Pro135 140 145 150ctc ctc gtt gcc gcc ttc ttc ttc ctt gtc ctt gct gtt ttg ggt gag 594Leu Leu Val Ala Ala Phe Phe Phe Leu Val Leu Ala Val Leu Gly Glu155 160 165aca tta atc cct cac tat tct ggt cgt gtg att gac atc ctg gga ggt 642Thr Leu Ile Pro His Tyr Ser Gly Arg Val Ile Asp Ile Leu Gly Gly170 175 180gat ttt gac ccc cat gcc ttt gcc agt gcc atc ttc ttc atg tgc ctc 690Asp Phe Asp Pro His Ala Phe Ala Ser Ala Ile Phe Phe Met Cys Leu185 190 195ttc tcc ttt ggc agc tca ctg tct gca ggc tgc cga gga ggc tgc ttc 738Phe Ser Phe Gly Ser Ser Leu Ser Ala Gly Cys Arg Gly Gly Cys Phe200 205 210acc tac acc atg tct cga atc aac ttg cgg atc cgg gag cag ctt ttc 786Thr Tyr Thr Met Ser Arg Ile Asn Leu Arg Ile Arg Glu Gln Leu Phe215 220 225 230tcc tcc ctg ctg cgc cag gac ctc ggt ttc ttc cag gag act aag aca 834Ser Ser Leu Leu Arg Gln Asp Leu Gly Phe Phe Gln Glu Thr Lys Thr235 240 245ggg gag ctg aac tca cgg ctg agc tcg gat acc acc ctg atg agt aac 882Gly Glu Leu Asn Ser Arg Leu Ser Ser Asp Thr Thr Leu Met Ser Asn250 255 260tgg ctt cct tta aat gcc aat gtg ctc ttg cga agc ctg gtg aaa gtg 930Trp Leu Pro Leu Asn Ala Asn Val Leu Leu Arg Ser Leu Val Lys Val265 270 275gtg ggg ctg tat ggc ttc atg ctc agc ata tcg cct cga ctc acc ctc 978
Val Gly Leu Tyr Gly Phe Met Leu Ser Ile Ser Pro Arg Leu Thr Leu280 285 290ctt tct ctg ctg cac atg ccc ttc aca ata gca gcg gag aag gtg tac 1026Leu Ser Leu Leu His Met Pro Phe Thr Ile Ala Ala Glu Lys Val Tyr295 300 305 310aac acc cgc cat cag gaa gtg ctt cgg gag atc cag gat gca gtg gcc 1074Ash Thr Arg His Gln Glu Val Leu Arg Glu Ile Gln Asp Ala Val Ala315 320 325agg gcg ggg cag gtg gtg cgg gaa gcc gtt gga ggg ctg cag acc gtt 1122Arg Ala Gly Gln Val Val Arg Glu Ala Val Gly Gly Leu Gln Thr Val330 335 340cgc agt ttt ggg gcc gag gag cat gaa gtc tgt cgc tat aaa gag gcc 1170Arg Ser Phe Gly Ala Glu Glu His Glu Val Cys Arg Tyr Lys Glu Ala345 350 355ctt gaa caa tgt cgg cag ctg tat tgg cgg aga gac ctg gaa cgc gcc 1218Leu Glu Gln Cys Arg Gln Leu Tyr Trp Arg Arg Asp Leu Glu Arg Ala360 365 370ttg tac ctg ctc ata agg agg gtg ctg cac ttg ggg gtg cag atg ctg 1266Leu Tyr Leu Leu Ile Arg Arg Val Leu His Leu Gly Val Gln Met Leu375 380 385 390atg ctg agc tgt ggg ctg cag cag atg cag gat ggg gag ctc acc cag 1314Met Leu Ser Cys Gly Leu Gln Gln Met Gln Asp Gly Glu Leu Thr Gln395 400 405ggc agc ctg ctt tcc ttt atg atc tac cag gag agc gtg ggg agc tat 1362Gly Ser Leu Leu Ser Phe Met Ile Tyr Gln Glu Ser Val Gly Ser Tyr410 415 420gtg cag acc ctg gta tac ata tat ggg gat atg ctc agc aac gtg gga 1410Val Gln Thr Leu Val Tyr Ile Tyr Gly Asp Met Leu Ser Asn Val Gly425 430 435gct gca gag aag gtt ttc tcc tac atg gac cga cag cca aat ctg cct 1458Ala Ala Glu Lys Val Phe Ser Tyr Met Asp Arg Gln Pro Asn Leu Pro440 445 450tca cct ggc acg ctt gcc ccc acc act ctg cag ggg gtt gtg aaa ttc 1506
Ser Pro Gly Thr Leu Ala Pro Thr Thr Leu Gln Gly Val Val Lys Phe455 460 465 470caa gac gtc tcc ttt gca tat ccc aat cgc cct gac agg cct gtg ctc 1554Gln Asp Val Ser Phe Ala Tyr Pro Asn Arg Pro Asp Arg Pro Val Leu475 480 485aag ggg ctg acg ttt acc cta cgt cct ggt gag gtg acg gcg ctg gtg 1602Lys Gly Leu Thr Phe Thr Leu Arg Pro Gly Glu Val Thr Ala Leu Val490 495 500gga ccc aat ggg tct ggg aag agc aca gtg gct gcc ctg ctg cag aat 1650Gly Pro Asn Gly Ser Gly Lys Ser Thr Val Ala Ala Leu Leu Gln Asn505 510 515ctg tac cag ccc aca ggg gga cag gtg ctg ctg gat gaa aag ccc atc 1698Leu Tyr Gln Pro Thr Gly Gly Gln Val Leu Leu Asp Glu Lys Pro Ile520 525 530tca cag tat gaa cac tgc tac ctg cac agc cag gtg gtt tca gtt ggg 1746Ser Gln Tyr Glu His Cys Tyr Leu His Ser Gln Val Val Ser Val Gly535 540 545 550cag gag cct gtg ctg ttc tcc ggt tct gtg agg aac aac att gct tat 1794Gln Glu Pro Val Leu Phe Ser Gly Ser Val Arg Asn Asn Ile Ala Tyr555 560 565ggg ctg cag agc tgc gaa gat gat aag gtg atg gcg gct gcc cag gct 1842Gly Leu Gln Ser Cys Glu Asp Asp Lys Val Met Ala Ala Ala Gln Ala570 575 580gcc cac gca gat gac ttc atc cag gaa atg gag cat gga ata tac aca 1890Ala His Ala Asp Asp Phe Ile Gln Glu Met Glu His Gly Ile Tyr Thr585 590 595gat gta ggg gag aag gga agc cag ctg gct gcg gga cag aaa caa cgt 1938Asp Val Gly Glu Lys Gly Ser Gln Leu Ala Ala Gly Gln Lys Gln Arg600 605 610ctg gcc att gcc cgg gcc ctt gta cga gac ccg cgg gtc ctc atc ctg 1986Leu Ala Ile Ala Arg Ala Leu Val Arg Asp Pro Arg Val Leu Ile Leu615 620 625 630gat gag gct act agt gcc cta gat gtg cag tgc gag cag gcc ctg cag 2034
Asp Glu Ala Thr Ser Ala Leu Asp Val Gln Cys Glu Gln Ala Leu Gln635 640 645gac tgg aat tcc cgt ggg gat cgc aca gtg ctg gtg att gct cac agg 2082Asp Trp Asn Ser Arg Gly Asp Arg Thr Val Leu Val Ile Ala His Arg650 655 660ctg cag gca gtt cag cgc gcc cac cag atc ctg gtg ctc cag gag ggc 2130Leu Gln Ala Val Gln Arg Ala His Gln Ile Leu Val Leu Gln Glu Gly665 670 675aag ctg cag aag ctt gcc cag ctc cag gag gga cag gac ctc tat tcc 2178Lys Leu Gln Lys Leu Ala Gln Leu Gln Glu Gly Gln Asp Leu Tyr Ser680 685 690cgc ctg gtt cag cag cgg ctg atg gac tgaggcccca gggatactgg 2225Arg Leu Val Gln Gln Arg Leu Met Asp695 700gccctcttct caggggcgtc tccaggaccc agagctgttc ctgctttgag tttccctaga 2285gctgtgcggc cagatagctg ttcctgagtt gcaagcacga tggagatttg gacactgtgt 2345gcttttggtg gggtggagag gtggggtggg gtggggtgtg gtggggtggg aggctgtctg 2405tgtccaggaa acttaattcc ctggtgacta gagctttgcc tggtgatgag gagtattttg 2465tggcataata catatatttt aaaatatttt ccttcttacg tgaactgtat acattcatat 2525agaaaattta gacaatataa aaaagtacaa agaagaaaag taaaagtacc cattgtttca 2585cttcctggag ataaccatag ttgctatttt gctgcctgtc ccatcagtcg tttatctgtt 2645gtttgagata gaaattaacc aaaaatgaca taaatattca tgagattgcc ttcctatatc 2705cttccttgtt cctaccagtg tctgctattt tgaagaagct agggtctgga gggacagaga 2765acagttccct gattaacagt attaatagcg acattggtaa cagctaccat ttatagagtt 2825ttaatgggag taggagctat gctaagtgtt tttcatgtat tatcgttttt aatcattatc 2885cccaacccta tgaggttggt tattatcccc attttacaga tgaggaaact gaagctcaaa 2945gaggctcaat gactttccca aggtggtcgt agtggtggag ttggagtttg aacacaggcc 3005
tgaccctaga gtccacaccc tgacccaatc aattatattg catcttgggt ccataaaccc 3065taatccataa tcccatcaag aaaagctctg ctgctcttag ctctaaataa ttcagaatct 3125attctcttct ctccagtccc gttgttatag tcttcactca tagacttaag atgatcccat 3185caccagagag gtttctctac cattagcttc cctcttccgg ccattcttca caaagtcatt 3245tttctaaatt ctgtgtcaca tacgatgatg gcatttctgg aaattccttc aggtgctctc 3305aagccctgct gcagagatcc ttttcagagc acacactgtt ccagcccatc tgtctcaccc 3365tctcctgttg tatccagctc cacgacaaac tttctgcctt ccccaacacc tttgtgcctt 3425tgcatatggt gttttcttgc ccattttctg ctcgactcgc ccctgatttt caagttcaag 3485acttaactca gggttcaggt cttccaggag gccttactta tgtcgtcagt ctggggaact 3545ctccatgtgc ttctatcact gtgcggttac ctctttcaca gcccttttaa agttctatct 3605tccctttccc accttttttg accttccact agaccatgag cacctgggcg gaaagccata 3665tatcttatta agctttatat ctgctacctg gccgagggct aattcatagt ggag 3719<210>50<211>703<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>50Met Arg Leu Pro Asp Leu Arg Pro Trp Thr Ser Leu Leu Leu Val Asp1 5 10 15Ala Ala Leu Leu Trp Leu Leu Gln Gly Pro Leu Gly Thr Leu Leu Pro20 25 30Gln Gly Leu Pro Gly Leu Trp Leu Glu Gly Thr Leu Arg Leu Gly Gly35 40 45Leu Trp Gly Leu Leu Lys Leu Arg Gly Leu Leu Gly Phe Val Gly Thr50 55 60
Leu Leu Leu Pro Leu Cys Leu Ala Thr Pro Leu Thr Val Ser Leu Arg65 70 75 80Ala Leu Val Ala Gly Ala Ser Arg Ala Pro Pro Ala Arg Val Ala Ser85 90 95Ala Pro Trp Ser Trp Leu Leu Val Gly Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Ser100 105 110Trp Ser Leu Trp Ala Val Leu Ser Pro Pro Gly Ala Gln Glu Lys Glu115 120 125Gln Asp Gln Val Asn Asn Lys Val Leu Met Trp Arg Leu Leu Lys Leu130 135 140Ser Arg Pro Asp Leu Pro Leu Leu Val Ala Ala Phe Phe Phe Leu Val145 150 155 160Leu Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Ile Pro His Tyr Ser Gly Arg Val165 170 175Ile Asp Ile Leu Gly Gly Asp Phe Asp Pro His Ala Phe Ala Ser Ala180 18 5190Ile Phe Phe Met Cys Leu Phe Ser Phe Gly Ser Ser Leu Ser Ala Gly195 200 205Cys Arg Gly Gly Cys Phe Thr Tyr Thr Met Ser Arg Ile Asn Leu Arg210 215 220Ile Arg Glu Gln Leu Phe Ser Ser Leu Leu Arg Gln Asp Leu Gly Phe225 230 235 240Phe Gln Glu Thr Lys Thr Gly Glu Leu Asn Ser Arg Leu Ser Ser Asp245 250 255Thr Thr Leu Met Ser Asn Trp Leu Pro Leu Asn Ala Asn Val Leu Leu260 265 270Arg Ser Leu Val Lys Val Val Gly Leu Tyr Gly Phe Met Leu Ser Ile275 280 285Ser Pro Arg Leu Thr Leu Leu Ser Leu Leu His Met Pro Phe Thr Ile
290 295 300Ala Ala Glu Lys Val Tyr Ash Thr Arg His Gln Glu Val Leu Arg Glu305 310 315 320Ile Gln Asp Ala Val Ala Arg Ala Gly Gln Val Val Arg Glu Ala Val325 330 335Gly Gly Leu Gln Thr Val Arg Ser Phe Gly Ala Glu Glu His Glu Val340 345 350Cys Arg Tyr Lys Glu Ala Leu Glu Gln Cys Arg Gln Leu Tyr Trp Arg355 360 365Arg Asp Leu Glu Arg Ala Leu Tyr Leu Leu Ile Arg Arg Val Leu His370 375 380Leu Gly Val Gln Met Leu Met Leu Ser Cys Gly Leu Gln Gln Met Gln385 390 395 400Asp Gly Glu Leu Thr Gln Gly Ser Leu Leu Ser Phe Met Ile Tyr Gln405 410 415Glu Ser Val Gly Ser Tyr Val Gln Thr Leu Val Tyr Ile Tyr Gly Asp420 425 430Met Leu Ser Asn Val Gly Ala Ala Glu Lys Val Phe Ser Tyr Met Asp435 440 445Arg Gln Pro Asn Leu Pro Ser Pro Gly Thr Leu Ala Pro Thr Thr Leu450 455 460Gln Gly Val Val Lys Phe Gln Asp Val Ser Phe Ala Tyr Pro Asn Arg465 470 475 480Pro Asp Arg Pro Val Leu Lys Gly Leu Thr Phe Thr Leu Arg Pro Gly485 490 495Glu Val Thr Ala Leu Val Gly Pro Asn Gly Ser Gly Lys Ser Thr Val500 505 510Ala Ala Leu Leu Gln Asn Leu Tyr Gln Pro Thr Gly Gly Gln Val Leu515 520 525
Leu Asp Glu Lys Pro Ile Ser Gln Tyr Glu His Cys Tyr Leu His Ser530 535 540Gln Val Val Ser Val Gly Gln Glu Pro Val Leu Phe Ser Gly Ser Val545 550 555 560Arg Asn Asn Ile Ala Tyr Gly Leu Gln Ser Cys Glu Asp Asp Lys Val565 570 575Met Ala Ala Ala Gln Ala Ala His Ala Asp Asp Phe Ile Gln Glu Met580 585 590Glu His Gly Ile Tyr Thr Asp Val Gly Glu Lys Gly Ser Gln Leu Ala595 600 605Ala Gly Gln Lys Gln Arg Leu Ala Ile Ala Arg Ala Leu Val Arg Asp610 615 620Pro Arg Val Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ala Leu Asp Val Gln625 630 635 640Cys Glu Gln Ala Leu Gln Asp Trp Asn Ser Arg Gly Asp Arg Thr Val645 650 655Leu Val Ile Ala His Arg Leu Gln Ala Val Gln Arg Ala His Gln Ile660 665 670Leu Val Leu Gln Glu Gly Lys Leu Gln Lys Leu Ala Gln Leu Gln Glu675 680 685Gly Gln Asp Leu Tyr Ser Arg Leu Val Gln Gln Arg Leu Met Asp690 695 700<210>51<211>264<212>DNA<213>人皰疹病毒1<220>
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<221>CDS<222>(1)..(549)<223>
<400>53atg gat ctc ttg att cgt ctc ggt ttt ctg ttg atg tgt gcg ttg ccg 48Met Asp Leu Leu Ile Arg Leu Gly Phe Leu Leu Met Cys Ala Leu Pro1 5 10 15acc ccc ggt gag cgg tct tcg cgt gac ccg aaa acc ctt ctc tct ctg 96Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Arg Asp Pro Lys Thr Leu Leu Ser Leu20 25 30tct ccg cga caa caa gct tgt gtt ccg aga acg aag tcg cac aga ccc 144Ser Pro Arg Gln Gln Ala Cys Val Pro Arg Thr Lys Ser His Arg Pro35 40 45gtt tgt tac aac gat aca ggg gac tgc aca gat gca gat gat agc tgg 192Val Cys Tyr Asn Asp Thr Gly Asp Cys Thr Asp Ala Asp Asp Ser Trp50 55 60aaa cag ctg ggt gag gac ttt gcg cac caa tgc ttg cag gcg gcg aaa 240Lys Gln Leu Gly Glu Asp Phe Ala His Gln Cys Leu Gln Ala Ala Lys65 70 75 80aag agg cct aaa acg cac aaa tcc cgt ccg aac gat agg aac ctt gag 288Lys Arg Pro Lys Thr His Lys Ser Arg Pro Asn Asp Arg Asn Leu Glu85 90 95ggt agg ctg acc tgt caa cga gtc cgt cgg cta ctg ccc tgt gat ttg 336
Gly Arg Leu Thr Cys Gln Arg Val Arg Arg Leu Leu Pro Cys Asp Leu100 105 110gat att cat cct agc cac cgg ttg tta acg ctt atg aat aac tgc gtc 384Asp Ile His Pro Ser His Arg Leu Leu Thr Leu Met Asn Ash Cys Val115 120 125tgt gac ggg gcc gtt tgg aac gcg ttt cgc ttg ata gaa cga cac gga 432Cys Asp Gly Ala Val Trp Asn Ala Phe Arg Leu Ile Glu Arg His Gly130 135 140ttc ttc gct gtg act ttg tat tta tgt tgc ggg att act ctg ctg gtt 480Phe Phe Ala Val Thr Leu Tyr Leu Cys Cys Gly Ile Thr Leu Leu Val145 150 155 160gtt att cta gca ttg ctg tgc agc ata aca tac gaa tcg act gga cgt 528Val Ile Leu Ala Leu Leu Cys Ser Ile Thr Tyr Glu Ser Thr Gly Arg165 170 175ggg att cga cgt tgt ggc tcc 549Gly Ile Arg Arg Cys Gly Ser180<210>54<211>183<212>PRT<213>人巨細(xì)胞病毒<400>54Met Asp Leu Leu Ile Arg Leu Gly Phe Leu Leu Met Cys Ala Leu Pro1 5 10 15Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Arg Asp Pro Lys Thr Leu Leu Ser Leu20 25 30Ser Pro Arg Gln Gln Ala Cys Val Pro Arg Thr Lys Ser His Arg Pro35 40 45Val Cys Tyr Asn Asp Thr Gly Asp Cys Thr Asp Ala Asp Asp Ser Trp50 55 60Lys Gln Leu Gly Glu Asp Phe Ala His Gln Cys Leu Gln Ala Ala Lys
65 70 75 80Lys Arg Pro Lys Thr His Lys Ser Arg Pro Asn Asp Arg Asn Leu Glu85 90 95Gly Arg Leu Thr Cys Gln Arg Val Arg Arg Leu Leu Pro Cys Asp Leu100 105 110Asp Ile His Pro Ser His Arg Leu Leu Thr Leu Met Asn Asn Cys Val115 120 125Cys Asp Gly Ala Val Trp Asn Ala Phe Arg Leu Ile Glu Arg His Gly130 135 140Phe Phe Ala Val Thr Leu Tyr Leu Cys Cys Gly Ile Thr Leu Leu Val145 150 155 160Val Ile Leu Ala Leu Leu Cys Ser Ile Thr Tyr Glu Ser Thr Gly Arg165 170 175Gly Ile Arg Arg Cys Gly Ser180
權(quán)利要求
1.增強(qiáng)MHC I類分子上的外來表位展示的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)抑制細(xì)胞中的TAP活性；和(b)在所述細(xì)胞中表達(dá)與表位融合的MHC I類重鏈或與表位融合的β2m。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包括酸處理步驟。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述抑制細(xì)胞中的TAP活性的步驟包括使所述細(xì)胞與具有TAP抑制活性的蛋白質(zhì)接觸的步驟，或?qū)⒕幋a所述蛋白質(zhì)的載體導(dǎo)入所述細(xì)胞的步驟。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的具有所述TAP抑制活性的蛋白質(zhì)是US6或ICP47。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述載體是感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述載體是仙臺(tái)病毒載體。
7.哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中(i)所述細(xì)胞中的TAP基因表達(dá)受到抑制，所述細(xì)胞含有TAP抑制劑，或所述細(xì)胞以可表達(dá)的方式攜有編碼所述TAP抑制劑的基因，且其中(ii)所述細(xì)胞以可表達(dá)的方式攜有編碼與表位融合的MHCI類重鏈或與表位融合的β2m的基因。
8.用于展示表位的試劑盒，其含有(i)TAP抑制劑或能表達(dá)所述抑制劑的載體；和(ii)與表位融合的MHC I類重鏈或與表位融合的β2m，或能表達(dá)所述與表位融合的MHC I類重鏈或所述與表位融合的β2m的載體。
9.能表達(dá)(i)和(ii)的載體(i)TAP抑制劑；和(ii)與表位融合的MHC I類重鏈或與表位融合的β2m。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過抑制TAP活性增強(qiáng)MHC I類分子上的外來表位展示的方法。構(gòu)建編碼TAP抑制因子和與表位相連的β2m并能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體，并將其導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明人通過TAP抑制因子的作用減少內(nèi)源性MHC I類/肽復(fù)合物，成功地在細(xì)胞表面高頻率地展示MHC I類/肽復(fù)合物，該復(fù)合物含有該載體所表達(dá)的與表位相連的β2m。本方法可用于感染、癌癥等的疫苗療法。
文檔編號(hào)A61K45/00GK1720326SQ20038010469
公開日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2003年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月1日
發(fā)明者巖本愛吉, 立川愛 申請(qǐng)人:株式會(huì)社載體研究所