專利名稱：表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的重組偽狂犬病病毒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種應(yīng)用在動物體上的皰疹病毒載體及其應(yīng)用，特別是以呈弱毒疫苗株為材料，分離并克隆復(fù)制非必需的毒力基因，以其為基礎(chǔ)構(gòu)建的通用偽狂犬病病毒轉(zhuǎn)移載體。
背景技術(shù)：
偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV或Aujeszky’s diseasevirus，ADV)是引起多種動物共患的偽狂犬病的病原。PRV在分類學(xué)上屬于病毒界(Vira)----皰疹病毒科(Herpesviridae)----甲皰疹病毒亞科(Alphaherpesviridae)----水痘病毒屬(Varicellovirus)----偽狂犬病病毒(pseudorabies virus)豬是PRV的自然宿主，但其它多種動物也可被感染。感染豬呈現(xiàn)的臨床癥狀常因年齡、免疫力、病毒的毒力以及感染的劑量不同而不一致。通常首次感染的豬群發(fā)病最為嚴(yán)重，架子豬最為易感，表現(xiàn)的臨床癥狀多為神經(jīng)紊亂，斷奶前仔豬死亡率高達(dá)100％，隨著年齡增長，死亡率逐漸降低，成年豬則以發(fā)熱、食欲下降、流鼻涕、咳嗽、呼吸困難和增重減慢為主，但癥狀比較輕微，死亡率通常低于5％。在公豬和妊娠母豬可以看到繁殖障礙，如睪丸鞘膜炎、流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等。防制偽狂犬病主要靠疫苗接種，目前已有商品化滅活疫苗和弱毒疫苗，弱毒疫苗容易制備，成本較低。
PRV Bartha-K61株是二十世紀(jì)六十年代匈牙利Bartha等人將PRV野毒株用雞胚成纖維細(xì)胞反復(fù)傳代而獲得的一個人工致弱疫苗株(Res Vet Sci，1975，19(1)17-22)，其毒力大大減弱，免疫原性很好，在國內(nèi)外應(yīng)用數(shù)十年，證明是安全有效的，在防制偽狂犬病中發(fā)揮了重要作用。該毒株最大特點是呈現(xiàn)gE-表型，亦即其gE基因編碼功能喪失，據(jù)此可以進(jìn)行疫苗接種動物與野毒感染動物的鑒別診斷，使得撲滅計劃的實施成為可能，然而它也有不足之處，通過傳代致弱的疫苗株是非克隆變異株的混合物，容易回復(fù)突變，此外它具有一定的神經(jīng)毒力，可引起潛伏感染(J Virol Methods，1994，50(1-3)269-280)，因此對Bartha-K61株的改造十分必要。
目前有好幾種豬源病毒被用作疫苗載體，如豬腺病毒(J Gen Virol，1995，(12)3153-3157；J Gen Virol，1995，76(7)1583-1589；Vaccine，1996，14(11)1083-1087；J Gen Virol，1999，80(3)563-570)、豬痘病毒(Adv Vet Med，1999，41463-480)、痘苗病毒(Can J Vet Res，1996，60(4)315-317)、偽狂犬病病毒(Gene，1986，50215-224；J Virol，1991，5 (5)2761-2765)，等等。
一些學(xué)者在這方面進(jìn)行了開拓性研究。Keeler等最早構(gòu)建了表達(dá)gIII-β-半乳糖苷融合蛋白的重組偽狂犬病病毒(Gene，1986，50215-224)。繼之，Thomsen等用偽狂犬病病毒作為活病毒載體，表達(dá)出了顯著水平的人組織纖溶酶原激活劑(tPA)(Gene，1987，57261-265)。此后，Whealey等用偽狂犬病病毒作為載體表達(dá)了PRV gIII-HIV-1囊膜蛋白的融合蛋白(J Virol，1988，624185-4195)，開創(chuàng)了研制偽狂犬病病毒活載體疫苗的先河。Van Zijl等構(gòu)建了表達(dá)豬瘟病毒E1基因的重組偽狂犬病病毒，并取得了令人鼓舞的免疫保護(hù)效果(J Virol，1991，65(5)2761-2765)。為了降低病毒載體的傳播能力，Peeters等進(jìn)一步缺失了偽狂犬病病毒侵入相關(guān)基因gD，構(gòu)建了表達(dá)豬瘟病毒E2基因(即以前的E1基因)的gD-/gE-重組偽狂犬病病毒，它是一株自限性、非傳播性突變株，只能通過細(xì)胞-細(xì)胞間的直接傳遞方式局部擴散，但子代病毒沒有感染性，該重組病毒也能對豬瘟和偽狂犬病提供雙重免疫保護(hù)(J Gen Virol，1997，783311-3315)。
國內(nèi)專利查新結(jié)果表明，有兩個專利涉及偽狂犬病病毒基因缺失突變株，一個涉及gp50(gD)基因的缺失和豬瘟病毒E1基因的插入(中華人民共和國專利局，專利申請?zhí)?3108005.3)，一個涉及蛋白激酶(即PK)基因和或28K基因缺失(中華人民共和國專利局，專利申請?zhí)?0106840.3)，均未涉及TK和gE缺失。目前尚無表達(dá)PRRSV蛋白基因的重組偽狂犬病病毒疫苗株方面的專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以PRV Bartha-K61株(呈gE/gI陰性表型)為親本株，采用分子克隆和重組DNA技術(shù)構(gòu)建了通用偽狂犬病病毒轉(zhuǎn)移載體(插入載體)，在此基礎(chǔ)上，利用同源重組培育了一株表達(dá)PRRSV GP5基因的重組偽狂犬病病毒。該重組病毒TK基因被缺失，故在神經(jīng)組織復(fù)制能力和毒力得以減弱，可以作為預(yù)防偽狂犬病的雙基因缺失標(biāo)記疫苗，同時該病毒表達(dá)PRRSV保護(hù)性抗原GP5，因此可以作為抗豬繁殖與呼吸綜合征和偽狂犬病的雙價基因工程活載體疫苗。此外該病毒基因組內(nèi)插入了LacZ基因，它不僅可以作為一個篩選標(biāo)記，還可以被其它外源基因替換以構(gòu)建預(yù)防多種疫病的多價基因工程疫苗。
本發(fā)明是由以下的方法實現(xiàn)的本發(fā)明以呈gE-表型的弱毒疫苗Bartha-K61株為材料，分離并克隆了PRV復(fù)制非必需的毒力基因TK基因，以其為基礎(chǔ)構(gòu)建了通用偽狂犬病病毒轉(zhuǎn)移載體。
一種表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒(Herpesviridae-Alphaherpesviridae---Varicellovirus---pseudorabies virus)保藏號CCTCC-V200307。保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2003年5月26日。
上述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒，所述的病毒衍生于偽狂犬病病毒Bartha-K61疫苗株。
上述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒，所述的病毒與偽狂犬病病毒Bartha-K61疫苗株均為弱毒株，二者共有特征是gE/gI基因缺失，不產(chǎn)生功能性gE/gI蛋白。
上述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒，該病毒是利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的偽狂犬病病毒突變株，其不同于偽狂犬病病毒Bartha-K61疫苗株的新特征有TK基因的缺失、豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因的插入以及大腸桿菌半乳糖苷酶基因的插入。
上述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒，所述的病毒不產(chǎn)生功能性胸苷激酶，但表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白抗原和大腸桿菌半乳糖苷酶。
上述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒，所述的病毒不產(chǎn)生功能性胸苷激酶，但表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白抗原和大腸桿菌半乳糖苷酶。
一種上述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒在生產(chǎn)預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征和偽狂犬病的標(biāo)記疫苗上的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點是1.本發(fā)明以呈gE-表型的弱毒疫苗Bartha-K61株為材料，分離并克隆了PRV復(fù)制非必需的毒力基因TK基因，以其為基礎(chǔ)構(gòu)建了通用偽狂犬病病毒轉(zhuǎn)移載體。我們在此轉(zhuǎn)移載體中引入了完整的表達(dá)元件(強啟動子和polyA信號)，這十分有利于表達(dá)實用的異源基因(如病原體抗原基因或生物活性因子基因)，多克隆位點的引入更提高了該轉(zhuǎn)移載體的通用性和實用性。
2.構(gòu)建偽狂犬病病毒突變株大體有以下幾種方法。一是構(gòu)建引入突變的轉(zhuǎn)移載體，與病毒基因組共轉(zhuǎn)染通過同源重組構(gòu)建變異株，這是經(jīng)典的重組病毒構(gòu)建方法，但效率較低；二是構(gòu)建偽狂犬病病毒基因文庫，然后將突變引入某一克隆片段，通過該克隆與其它互補克隆共轉(zhuǎn)染而將突變引入到偽狂犬病病毒基因組中；三是將噬菌體P1的LoxP位點引入偽狂犬病病毒基因組中，然后通過Lox/Cre介導(dǎo)的點特異性重組而將突變引入偽狂犬病病毒基因組中，這種方法重組效率為5～20％；四是運用雙鏈斷裂修復(fù)和單鏈退火機制將外源基因通過同源重組引入到病毒基因組中，重組率高，篩選容易，但由于PRV基因組中缺少單一位點無法應(yīng)用此策略。本專利采用轉(zhuǎn)移載體與PRV基因組共轉(zhuǎn)染法獲得重組偽狂犬病病毒。避免或者減輕了以上的問題。
3.現(xiàn)行的偽狂犬病疫苗Bartha-K61株是一株gE基因缺失疫苗。本發(fā)明以Bartha-K61株為親本株，利用重組DNA技術(shù)和同源重組構(gòu)建了一株偽狂犬病病毒突變株。該毒株TK基因已被人工失活，對動物神經(jīng)毒力大大降低，其gE基因缺失可作為該毒株的一個生物學(xué)標(biāo)記，該表型使之與野毒株相鑒別，該毒株能表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒保護(hù)性抗原GP5和大腸桿菌LacZ，LacZ可以作為另一篩選標(biāo)記。該毒株可作為基因工程標(biāo)記疫苗用于偽狂犬病和豬繁殖與呼吸綜合征的免疫預(yù)防。此外，可用其它病原的抗原基因置換其LacZ基因，構(gòu)建以該毒株為基礎(chǔ)的多價基因工程活載體疫苗。
構(gòu)建基于偽狂犬病病毒弱毒株的病毒活載體疫苗，既保留了偽狂犬病弱毒疫苗的優(yōu)良特性，又賦予其對其它病原的免疫保護(hù)能力。病毒活載體疫苗的最大特點是這種病毒活載體疫苗集亞單位疫苗的安全性和弱毒疫苗的抗原增殖能力于一身，能誘使機體產(chǎn)生針對載體持續(xù)表達(dá)的抗原的保護(hù)性細(xì)胞免疫和體液免疫，因此具有廣闊的開發(fā)前景。
4.胸苷激酶(TK)基因是PRV復(fù)制非必需基因，也是其主要毒力基因之一，TK基因賦予病毒在神經(jīng)元中的感染和復(fù)制能力，而TK缺失變異株在神經(jīng)細(xì)胞等非分裂細(xì)胞中的復(fù)制能力則相當(dāng)?shù)?，使得潛伏于神?jīng)組織的病毒難以激活。由于分化的神經(jīng)組織中內(nèi)源性TK的正常含量低，刪除TK基因使病毒不再產(chǎn)生胸苷激酶，可大大降低疫苗病毒的毒力，提高其安全性，故TK基因成為構(gòu)建基因缺失疫苗的首選靶基因。而gE基因是與神經(jīng)嗜性有關(guān)的毒力基因，也是復(fù)制非必需基因，因此近年來國際上偽狂犬病疫苗研究的發(fā)展趨勢是開發(fā)以TK-/gE-PRV突變株為基礎(chǔ)的疫苗株。已經(jīng)證實Bartha-K61株是一個gE基因缺失疫苗株，如果再缺失其TK基因?qū)⑦M(jìn)一步降低其毒力，有利于該疫苗株的推廣應(yīng)用。采用酶解缺失的方法刪去TK基因部分片段，這樣獲得的TK缺失PRV突變株不僅安全性更有保障，而且便于重組病毒的篩選(用TK陰性細(xì)胞系加以5′-溴脫氧尿苷或其類似物進(jìn)行篩選)，同時在TK基因缺失位置可以插入外源基因構(gòu)建其它病原的病毒活載體疫苗株。
5.本發(fā)明使用的病毒活載體疫苗的最大特點是它能激發(fā)機體對載體呈送的抗原產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞免疫和體液免疫，但使用重組病毒疫苗面臨的首要問題是親本病毒的致病可能性。因此在遺傳操作過程中，在確保外源基因獲得最佳表達(dá)又不影響病毒繁殖的前提下，盡量降低載體病毒的致病性是非常必要的。開發(fā)成功的病毒載體的要素包括支持病毒增殖的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、病毒基因組中存在適當(dāng)?shù)姆潜匦鑵^(qū)可供插入外源基因而不影響病毒的復(fù)制、編碼病原的免疫原基因、強大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件以保證外源基因的最適表達(dá)、將外源基因?qū)敕潜匦栉稽c的操作程序以及鑒別重組病毒和野毒的便利方法。本發(fā)明實現(xiàn)了這些要素。
6.皰疹病毒作為載體構(gòu)建多價基因工程疫苗歷史并不短，但偽狂犬病病毒載體的開發(fā)應(yīng)用則起步較晚，主要是由于該病毒基因組龐大、分子生物學(xué)研究相對滯后之故。偽狂犬病病毒是作為一種皰疹病毒，擁有龐大的基因組(基因組長達(dá)145kb)和許多病毒復(fù)制非必需區(qū)可供插入外源基因，這構(gòu)成開發(fā)偽狂犬病病毒活載體疫苗的分子病毒學(xué)基礎(chǔ)。此外PRV宿主感染譜廣泛，卻不容易感染人類，因而可以用于開發(fā)表達(dá)其它動物病原基因的基因工程疫苗。
7.豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是1991年前發(fā)現(xiàn)的新豬病，引起豬繁殖障礙和呼吸道疾病，現(xiàn)已遍及全球，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大損失。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是其病原(Vet Q，1991，13121-130)，其基因組包括8個開放閱讀框架(ORF)，其中ORF5編碼糖基化的囊膜蛋白GP5(Virology，1995，206155-163)，是病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白和保護(hù)性抗原。據(jù)報道，識別PRRSVGP5的單抗可中和病毒的感染性(J Gen Virol，1997，78(8)1867-1873；J GenVirol，1998，79989-999)，研究結(jié)果還表明GP5至少存在兩種類型的抗原表位，一種是線性的，一種是構(gòu)象依賴性的(J Gen Virol，1997，78(8)1867-1873)。本發(fā)明在通用偽狂犬病病毒轉(zhuǎn)移載體基礎(chǔ)上，插入PRRSV GP5基因，通過體外轉(zhuǎn)染篩選構(gòu)建了以Bartha-K61為親本株的表達(dá)PRRSV GP5基因、呈TK-/gE-表型重組偽狂犬病病毒。該重組病毒可作為預(yù)防豬繁殖障礙的二價基因工程疫苗候選株，為改造和利用Bartha-K61株、培育表達(dá)外源基因的TK-/gE-重組PRV突變株、開發(fā)二價甚至多價基因工程疫苗提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)平臺，對我國基因工程疫苗產(chǎn)品的系列化、規(guī)范化發(fā)展具有促進(jìn)作用。


圖1為偽狂犬病病毒基因組酶切圖譜。BglII將偽狂犬病病毒基因組切成A-F共6個片段，BamHI將切成1-15共18個片段，KpnI將其切成A-M共16個片段。本發(fā)明涉及的轉(zhuǎn)移載體插入位點及同源臂位于BamHI-11片段或KpnI-J片段中。
圖2為通用PRV轉(zhuǎn)移載體結(jié)構(gòu)圖。ColE1為復(fù)制子，Amp+為氨芐青霉素抗性基因，PCMV為人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子，MCS為多克隆位點，包括HindIII、EcoRI、PstI、EcoRV、NotI、XhoI、NsiI和XbaI，BGH polyA為牛生長激素轉(zhuǎn)錄終止信號，PRVR/PRVL為來自偽狂犬病病毒基因組的同源臂序列，TKR/TKL為TK基因兩側(cè)序列，中間缺失277bp。
圖3為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建流程。pCR-GP5為含有PRRSV GP5基因的重組質(zhì)粒，pSTK為含有PRV基因組BamHI-11片段的重組pBluescript II SK+質(zhì)粒，其中1.4kb的BamHI/KpnI片段與KpnI-J片段中的BamHI/KpnI片段同源，pBS-LacZ含有SV-40啟動子控制下的LacZ基因表達(dá)盒。
圖4為應(yīng)用Western blotting檢測PRRSV GP5基因在重組PRV病毒中的表達(dá)。PK15細(xì)胞單層分別接種rPRV-GP5和Bartha-K61株后，提取病毒粒子，進(jìn)行SDS-PAGE分析，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上，用PRRS特異性抗血清檢測。1.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，2.PRV Bartha-K61株感染PK-15細(xì)胞，3.rPRV-GP5感染PK-15細(xì)胞，4.PK-15細(xì)胞。
具體實施例方式
實施例偽狂犬病病毒基因組及其物理圖譜見附圖1。偽狂犬病病毒轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建策略見附圖2。分子克隆按已報道的方法操作(Molecular Cloning.A LaboratoryManual，2ndedition，Cold Spring Press，Cold Spring Harbor，1991)。偽狂犬病病毒Bartha-K61株用PK15細(xì)胞按已報道的方法(Aujeszky’s disease(CurrentTopics in Veterinary Medicine and Animal Science)，USA，1982，721768-1772)增殖。
提取Bartha-K61株基因組DNA，用KpnI充分消化，回收其KpnI-J片段(約5.9 kb)，將其克隆于pUC119的KpnI位點，獲得pBTK5.9，經(jīng)用引物PSTK/PRTK進(jìn)行PCR擴增證實其中的KpnI-PstI或KpnI-BamHI片段含有完整的TK基因。PSTK5′-CCC AAG CTT GCT GGG CGT CTT GAA G-3′，PRTK5′-ATG CTG CAG GGC ACG GCAAAC TTT-3′，根據(jù)已發(fā)表的PRV NIA-3株(J Gen Virol，1991，721435-1439)TK基因序列設(shè)計。將此KpnI-PstI片段(2.6kb左右)亞克隆于pUC119的KpnI/PstI位點，獲得重組質(zhì)粒pBTK2.6，用ABI PRISM 377 DNA Sequencer測定插入片段的序列，測序結(jié)果顯示，Bartha-K61株KpnI-J片段的KpnI-PstI片段為2 576bp，其中含有完整的UL24和UL23(即TK基因)編碼序列以及UL25和UL22的部分編碼序列，它們的相對位置和方向與其它甲皰疹病毒相近(J Gen Virol，1989，703003-3013)。
用EcoRI消化pBTK2.6后，用Klenow酶大片段補平并自連，得到pBTKΔE，再分別用NotI和HindIII消化缺失384bp(其中含有PstI和NotI位點)，以Klenow酶大片段補平后自連，得到pBTKΔEΔH/N。這樣，質(zhì)粒pBTK2.6上的EcoRI及PstI、NotI和HindIII位點相繼消失。
用引物PSUni/PRUni(PSUni5′-TTT TGC CGA TTT CGG CCT ATT GGTT-3′，PRUni5′-GGA TAA CCG TAT TAC CGC CAC TGG TT-3′)擴增真核表達(dá)質(zhì)粒pCR3-Uni(PCR條件為95℃5min；94℃1min，53.1℃，72℃1min，35個循環(huán)；72℃7min)，獲得1kb左右的片段(其中含有CMV極早期啟動子、多克隆位點和BGH polyA信號)。用Klenow酶大片段補平，得到Uni-CMB。用AccI消化pBTKΔEΔH/N以缺失277bp(該片段的缺失導(dǎo)致XhoI位點的消失)，回收大片段，用Klenow大片段酶補平，再用堿性磷酸酶脫磷酸，與Uni-CMB相連接，得到TK基因缺失的通用轉(zhuǎn)移載體pBdTK-Uni(附圖3、4)。其多克隆位點中獨特的插入位點有HindIII、EcoRI、PstI、EcoRV、NotI、XhoI、NsiI和XbaI。該轉(zhuǎn)移載體含有氨芐青霉素抗性基因，用它轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞后，轉(zhuǎn)化菌可在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基增殖，轉(zhuǎn)化菌可以置于含30％甘油的LB培養(yǎng)基中，放于-70℃冰箱保存。
用EcoRI/PstI從pCR-ORF5切下GP5基因(生物技術(shù)，1999，9(2)1-3)，GP5基因核苷酸序列及其氨基酸序列見附圖4，將其插入到上述通用轉(zhuǎn)移載體的EcoRI/PstI位點，獲得pBdTK-GP5，在其中KpnI位點插入來源于pSTK的1.7kb KpnI片段(其中含有TK基因的下游部分序列，pSTK為含有PRV基因組BamHI-11片段的重組pBluescript II SK+質(zhì)粒，其中1.4kb的BamHI/KpnI片段與KpnI-J片段中的BamHI/KpnI片段同源)(周復(fù)春，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，1998，p48)，獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBdTK2-GP5。用SalI將LacZ表達(dá)盒從pBS-LacZ(劉長軍，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2000，p43)切下補平，插入到Tth111I酶切并補平的pBdTK2-GP5中，得到pBdTK2-GP5-LacZ。經(jīng)酶切和PCR鑒定后制備重組質(zhì)粒，采用WizardPureFection Plasmid DNAPurification System(Promega公司產(chǎn)品)按廠家提供的操作手冊制備和純化轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，測定純度和濃度后凍存，供轉(zhuǎn)染之用。
用0.25％胰酶-EDTA消化液消化PK15細(xì)胞，用含100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(雙抗)和10％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基分種于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，長至50～80％細(xì)胞單層。用Lipfect AMINE PLUSTMReagent(GIBCO公司)按產(chǎn)品說明書用2μg純化轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBdTK-GP5-LacZ和1μg Bartha-K61基因組DNA共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，同時設(shè)無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照，感作5小時，加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72～96h，收獲轉(zhuǎn)染產(chǎn)物。將轉(zhuǎn)染產(chǎn)物反復(fù)凍融三次后，接種于LM單層細(xì)胞培養(yǎng)物(TK陰性小鼠成纖維細(xì)胞系，引自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，武漢)，吸附1h。加入維持液(含雙抗和5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)，另加終濃度為100μg/ml的5-溴脫氧尿苷(BrdU，GIBCO產(chǎn)品)，置于37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后收獲，反復(fù)凍融三次。如此反復(fù)篩選3次，每次取樣提取總DNA，用引物P5S/P5R和PSTK/PRTK進(jìn)行PCR鑒定。PS55′-GAA TTC GAA TTC ATG TTG GGG AAATGC TTG ACC-3′，PR55′-GGA TCC GGA TCC GGC AAA AGC CAT CTAGGG-3′，根據(jù)CH-1a株序列(AY032626)設(shè)計。
按已敘述的方法(動物病毒學(xué)，第二版，北京科學(xué)出版社，1997，p239-242)將疑似重組病毒進(jìn)行3輪蝕斑純化，每次用上述PCR方法鑒定。獲得的重組病毒命名為rPRV-GP5，凍存于-70℃冰箱，或凍干后保存于-20℃。
用PK15細(xì)胞測定重組PRV蝕斑形成能力和病毒滴度，與PRV Bartha-K61株相比，重組病毒rPRV-GP5在PK-15細(xì)胞中增殖滴度和蝕斑大小無明顯差異。
將PRV Bartha-K61株和重組PRV分別接種于LM細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞系，TK陰性，購自中國典型培養(yǎng)物菌種收藏中心(武漢))單層，同時設(shè)未接種細(xì)胞對照。37℃下吸附1h，用Hank’s液洗3次，加入含1μCi[3H]dThd(脫氧胸苷，Sigma公司產(chǎn)品)DMEM維持液，置37℃培養(yǎng)12h，刮取細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌3次，用WizardGenomic DNA Purification Kit(Promega公司產(chǎn)品)提取細(xì)胞基因組DNA，點于DE-81膜上，烘干后放于閃爍瓶中進(jìn)行放射性測定，結(jié)果顯示，該重組PRV明顯缺乏胸苷激酶活性(附圖6)，表明該重組病毒的TK基因確已失活。此前已經(jīng)證實，Bartha-K61為gE-表型(J Virol，1984，58970-979)，從而表明本研究構(gòu)建的重組PRV為gE-/TK-變異株，是一株候選的雙基因缺失標(biāo)記疫苗。
將rPRV-GP5和Bartha-K61株分別接種于PK-15單層細(xì)胞中，待出現(xiàn)細(xì)胞病變后，用PBS緩沖液洗滌三次后，收集感染細(xì)胞，制備細(xì)胞涂片，以未接種的PK-15細(xì)胞作為陰性對照，用PRRSV特異性抗血清和羊抗豬熒光抗體按照郭寶清等報道的方法(中國獸醫(yī)科技，1996，26(3)3-5)進(jìn)行間接免疫熒光試驗，可見特異性免疫熒光。
用PK-15細(xì)胞大量培養(yǎng)rPRV-GP5，反復(fù)凍融3次，再用超聲波處理，經(jīng)高速離心除去細(xì)胞碎片，再用10000×g超速離心2h制備病毒粒子，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。分離膠為8％，積層膠為5％，200V電壓下電泳45min。再用Bio-Rad半干型轉(zhuǎn)移電泳儀將凝膠轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。將轉(zhuǎn)印的硝酸纖維素膜置于含10％馬血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，4℃下封閉24h后，用PBS洗三次。繼續(xù)加入100倍稀釋的PRRSV陽性血清混勻后置于37℃溫箱中作用1h，用含0.05％吐溫的PBS洗滌三次，再用洗膜緩沖液(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris.Cl，pH7.5)漂洗二次，傾去洗液，加入30ml洗膜緩沖液，加入以1∶30000稀釋的堿性磷酸梅酶標(biāo)記的兔抗豬IgG(二抗)，于室溫下平緩搖動，作用1h。用洗膜緩沖液(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris.Cl，pH7.5)漂洗3次。再加顯色緩沖液(100mol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris.Cl，pH9.5)緩沖液和99μl底物NBT與BCIP(華舜公司產(chǎn)品)混合液[66μl NBT溶液(取0.5g NBT溶于10ml 70％二甲基甲酰胺中)和33μl BCIP(取0.5g BCIP溶于10ml100％二甲基甲酰胺中)混勻]，避光顯色數(shù)秒后，用PBS終止顯色反應(yīng)。結(jié)果表明，GP5基因在重組病毒rPRV-GP5中獲得表達(dá)(附圖7)。
該毒株已經(jīng)在申請日前保藏，保藏號CCTCC-V200307，該毒株可作為基因工程標(biāo)記疫苗用于偽狂犬病和豬繁殖與呼吸綜合征的免疫預(yù)防。此外，可用其它病原的抗原基因置換其LacZ基因，構(gòu)建以該毒株為基礎(chǔ)的多價基因工程活載體疫苗。
通用PRV轉(zhuǎn)移載體全序列agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaa 100cgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaattt 200
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PRRSV GP5基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列1 ATGTTGGGGA AATGCTTGAC CACGGGCTGT TGCTCGCGAT TGCTTTCTTT GTGGTGTATCM L G K C L T T G C C S R L L S L W C I61 GTGCCGTTCT GTTTTGCTGT GCTCGTCAAC GCCAACAGCA ACAGCAGCTC TCATTTTCAGV P F C F A V L V N A N S N S S S H F Q121 TTGATTTATA ACTTGACGCT ATGTGAGCTG AATGGCACAG ATTGGCTGGC TAACAAATTTL I Y N L T L C E L N G T D W L A N K F181 GACTGGGCAG TGGAGACTTT TGTCATCTTT CCCGTGTTGA CTCACATTGT TTCCTATGGGD W A V E T F V I F P V L T H I V S Y G241 GCACTCACCA CCAGCCATTT CCTTGACACA GTTGGTCTGG TCACTGTGTC CACCGCCGGGA L T T S H F L D T V G L V T V S T A G301 TTTTATCACG GGCGGTATGT CTTGAGTAGC ATCTACGCGG TCTGTGCTCT GGCTGCGTTGF Y H G R Y V L S S I Y A V C A L A A L361 ATTTGCTTCG TCATTAGGCT TGCGAAGAAC TGCATGTCCT GGCGCTACTC TTGTACCAGAI C F V I R L A K N C M S W R Y S C T R421 TATACCAACT TCCTTCTGGA CACTAAGGGC AGACTCTATC GTTGGCGGTC GCCCGTTATTY T N F L L D T K G R L Y R W R S P V I481 GTAGAGAAAG GGGGTAAGGT TGAGGTCGAG GGTCACCTGA TCGACCTCAA AAGAGTTGTGV E K G G K V E V E G H L I D L K R V V541 CTTGATGGTT CCGTGGCAAC CCCTTTAACC AGAGTTTCAG CGGAACAATG GGGTCGTCTCL D G S V A T P L T R V S A E Q W G R L601 TAGATC
試驗項目 TK活性(c.p.m)未感染LM細(xì)胞 5013PRV Bartha-K61株感染LM細(xì)胞 4961rPRV-GP5感染LM細(xì)胞 48237c.p.m.＝curie per mmol重組偽狂犬病病毒胸苷激酶活性測定結(jié)果。將PRV Bartha-K61株和重組PRV分別接種于LM細(xì)胞單層，同時設(shè)未接種細(xì)胞對照。37℃下吸附1h，用Hank’s液洗3次，加入含1μCi[3H]dThd(脫氧胸苷，Sigma公司產(chǎn)品)DMEM維持液，置37℃培養(yǎng)12h，刮取細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌3次，用WizardGenomic DNA Purification Kit(Promega公司產(chǎn)品)提取細(xì)胞基因組DNA，點于DE-81膜上，烘干后放于閃爍瓶中進(jìn)行放射性測定。c.p.m.＝curie per mmol。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒(Herpesviridae-Alphaherpesviridae---Varicellovirus---pseudorabies virus)，保藏號CCTCC-V200307。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒，其特征是所述的病毒衍生于偽狂犬病病毒Bartha-K61疫苗株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒，其特征是所述的病毒與偽狂犬病病毒Bartha-K61疫苗株均為弱毒株，二者共有特征是gE/gI基因缺失，不產(chǎn)生功能性gE/gI蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒，其特征是該病毒是利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的偽狂犬病病毒突變株，其不同于偽狂犬病病毒Bartha-K61疫苗株的新特征有TK基因的缺失、豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因的插入以及大腸桿菌半乳糖苷酶基因的插入。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒，其特征是所述的病毒不產(chǎn)生功能性胸苷激酶，但表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白抗原和大腸桿菌半乳糖苷酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒，其特征是所述的病毒不產(chǎn)生功能性胸苷激酶，但表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白抗原和大腸桿菌半乳糖苷酶。
7.一種上述的權(quán)利要求所述的表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒在生產(chǎn)預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征和偽狂犬病的標(biāo)記疫苗上的應(yīng)用。
全文摘要
表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒及其應(yīng)用，現(xiàn)行的偽狂犬病疫苗Bartha－K61株是一株gE基因缺失疫苗。本發(fā)明是提供一種用以表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5的重組偽狂犬病病毒(Herpesviridae－Alphaherpesviridae－Varicellovirus－pseudorabies virus)保藏號CCTCC－V200307，它以Bartha－K61株為親本株，利用重組DNA技術(shù)和同源重組構(gòu)建了一株偽狂犬病病毒突變株。該毒株可作為基因工程標(biāo)記疫苗用于偽狂犬病和豬繁殖與呼吸綜合征的免疫預(yù)防。此外，可用其它病原的抗原基因置換其LacZ基因，構(gòu)建以該毒株為基礎(chǔ)的多價基因工程活載體疫苗。
文檔編號C12N7/01GK1513987SQ0313241
公開日2004年7月21日 申請日期2003年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月2日
發(fā)明者仇華吉, 田志軍, 童光志, 周艷君, 李昌文, 王云峰, 倪健強 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所