專利名稱：一種用于快速檢測對蝦桃拉病毒的lamp試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒檢測領(lǐng)域，具體涉及一種利用環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)快速檢測對蝦桃拉病毒的試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
桃拉病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)是一種給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成極大危害的病 原。該病毒可感染對蝦種類眾多，諸如凡納濱對蝦(Litopenaeusvarmamei)、細角濱對蝦 (L. stylirostris)、中國對蟲下(Fenneropenaeus chinensis)、斑節(jié)對蟲下(P. monodon)禾口日 本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)等，其中以凡納濱對蝦最為敏感，感染后造成對蝦死 亡率高達40-95%。TSV為單鏈RNA病毒，目前歸類于細小RNA病毒科中一個新命名的蟋蟀 麻痹病毒屬。近幾年隨著我國引進凡納濱對蝦并進行大規(guī)模養(yǎng)殖，該病毒也傳入了我國，給 我國的對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了危害。目前對TSV引起的對蝦病害尚無有效的治療方法，只能以預防為主；而這又主要 依賴于早期快速的診斷和篩查。近年來基于臨床組織病理學、免疫學以及PCR技術(shù)等的各 種診斷方法已被用于TSV的檢測。但是現(xiàn)有的這些方法都存在一定的不足，例如基于組 織病理學的方法不僅操作繁瑣、費時，而且靈敏度較低；基于免疫學的方法雖然具有敏感性 高、檢測快速等特點，可用于大批標本的檢測，但對新鮮樣品進行檢測時出現(xiàn)的假陽性問題 在一定程度上還限制著該方法的廣泛應用；而PCR方法敏感、準確、快速，可替代病原學檢 測，但由于需要昂貴的儀器設備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技術(shù)要求而使其不 適用于現(xiàn)場快速檢測及基層普及應用。LAMP是一種新型的核酸等溫擴增技術(shù)，該技術(shù)針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特 異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件下即可完成核酸擴 增反應，擴增出LAMP特征性梯狀條帶。LAMP技術(shù)在保持PCR技術(shù)優(yōu)點的基礎(chǔ)上，進一步增 強了反應的特異性和縮短了檢測時間；特別是它不需使用昂貴的熱循環(huán)儀，在等溫條件下 就能完成反應，且擴增產(chǎn)物用肉眼能觀察，可用于病原微生物的現(xiàn)場快速檢測。但是在實際 應用中，由于特異性引物設計和其檢測試劑盒研制的復雜性，導致LAMP技術(shù)還未能推廣于 醫(yī)療衛(wèi)生、食品等領(lǐng)域；在水產(chǎn)動物病原的檢測方面更是未能見到有LAMP診斷試劑盒的推 出和應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測TSV的試劑盒。該試 劑盒特異性強，敏感性高，準確快速。本發(fā)明另一目的在于提供一種利用上述試劑盒檢測TSV的方法。該方法方便、靈 敏，增強了反應的特異性并縮短了檢測時間。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)
一種用于檢測對蝦桃拉病毒的LAMP試劑盒，包括病毒RNA提取試劑和LAMP反應 試劑；其中的LAMP反應試劑中含有序列為SEQ ID NO :1的引物TSV-FIP、SEQ ID NO 2的 引物TSV-BIP、SEQ ID NO 3的引物TSV-F3和SEQID NO 4的引物TSV-B3。還包括陽性對 照試樣和陰性對照試樣陽性對照試樣為桃拉病毒基因組RNA ；陰性對照試樣為健康對蝦 組織RNA。所含有的4個引物序列如下 序列SEQ ID NO 1 (TSV-FIP) AGACGCTACATCTCGAGCTGTTTTTGTGTCGGATTGTTAGTGGA序列SEQ ID NO :2 (TSV-BIP)TCAGCTACATAACACCCCCATTTTAATTCTCATACGGGAGGGA序列SEQ ID N0:3(TSV-F3) CCAGGATTATAGTGAAGGGA序列SEQ ID N0:4(TSV-B3) GCTCAACTGCAAATTCCAG本發(fā)明所采用的4個引物是根據(jù)在線軟件PrimerExplorer V4 (http // primerexplorer. jp/e/)設計而得，這四條引物能特異識別靶序列的六個不同位點，增加了 擴增的特異性，并在反應中產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)。試劑盒中的LAMP反應試劑包括以下組分(I)LAMP 預反應液20 25mM pH 為 8. 8 的 Tris_HCl、2 4mM硫酸鎂、10 12mM 氯化鉀、10 12mM硫酸銨、1 1. 25% TritonX-100,400 500 μ M dNTP、0. 8 1· 2M甜菜 堿、15 20U RNase抑制劑、1 2U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、0. 8 1 μ M序列SEQ ID NO :1的引物 TSV-FIP、0. 8 1 μ M 序列 SEQ ID NO 2 的引物 TSV_BIP、0. 2 0. 4 μ M 序列 SEQ ID NO 3 的引物 TSV-F3 禾口 0. 2 0. 4 μ M 序列 SEQ ID NO :4 的引物 TSV-B3 ；(2)聚合酶每微升含8個活性單位的Bst DNA聚合酶；(3) LAMP反應穩(wěn)定液由礦物油或液體石蠟油組成；(4) LAMP反應顯色液含有10% SYBR Green I的熒光染料。試劑盒中的RNA提取試劑包括組織裂解液RNAiso Reagent，購買于大連寶生物公 司(Takara)。除此，RNA提取試劑還包括氯仿、異丙醇、乙醇和無RNase水。本發(fā)明試劑盒的主要原理為①設計一組能特異識別靶DNA的六個不同序列的兩 個內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個外引物(上游外引物和下游外引物)，內(nèi)引 物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；②其中一個外引物首先與靶RNA雜交，然后在AMV逆轉(zhuǎn)錄 酶參與下，將靶RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；③隨后一個內(nèi)引物與靶cDNA雜交，進行鏈置換DNA合 成，在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下，由一個外引物啟動，釋放出單鏈DNA，并 作為由雜交到靶的另一端的一個內(nèi)引物和一個外引物啟動的DNA合成的模板，產(chǎn)生一個原 始的莖環(huán)DNA ；④內(nèi)引物以原始的莖環(huán)DNA為模板，啟動鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個原始 的莖環(huán)DNA和一個新的有兩倍莖長度的莖環(huán)DNA ；⑤在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模 板，通過鏈置換形成多個含有靶DNA反復重復序列的莖環(huán)DNA，在一小時內(nèi)該循環(huán)反應可使 靶DNA累積到IO9拷貝，最后通過加入熒光染料來觀察擴增結(jié)果。利用本發(fā)明試劑盒檢測TSV的方法包括如下步驟(1)待檢樣品總RNA的提取A.取待檢樣品置于離心管中，加入組織裂解液RNAiso Reagent，搗爛，室溫裂解；
B.離心取上清，置于離心管中；C.加入氯仿，上下顛倒充分混勻，冰上放置； D.離心，取上清液，加入等體積冰冷異丙醇，上下顛倒混勻，-20°C放置30分鐘；E.離心，棄上清液，加入冰冷的75%乙醇(無RNase水配制)淋洗RNA沉淀，然后 離心，倒去上清液。室溫晾干； F.用無RNA酶水溶解，得到含有桃拉病毒基因組RNA的溶液。(2)桃拉病毒的LAMP擴增A.根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設置所需LAMP反應管數(shù)；B.吸取LAMP預反應液，加入一潔凈的離心管中，然后加入Bst DNA聚合酶，混合均 勻，離心，得到混合液；C.向反應管中分別加入上述混合液，然后在每個反應管中再分別加入LAMP反應 穩(wěn)定液，離心；D.向上述反應管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照RNA、待檢模板RNA和陽性對照 RNA ；E.置恒溫金屬浴中于62°C恒溫反應；(3)顯色檢測取出LAMP反應管，冷卻至室溫，離心，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序 依次分別加入顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。利用本發(fā)明試劑盒檢測TSV的方法優(yōu)選為
(1)待檢樣品的總RNA提取A.取待檢樣品50 IOOmg置于1. 5ml離心管中，加入500 μ L組織裂解液RNAiso Reagent，搗爛樣品，室溫裂解5分鐘；B.在40C以12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清，置于1. 5ml離心管中；C.加入200 μ 1氯仿，上下顛倒充分混勻，冰上放置10分鐘；D.在4°C以12000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，小心取上清，等體積冰冷異丙醇，上下顛倒 混勻，-20°C放置30分鐘；E.在4°C以12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清液，加入冰冷的75%乙醇(無RNase 水配制)淋洗RNA沉淀，然后離心，倒去上清液。室溫晾干；F.用30ul無RNA酶水溶解，得到含桃拉病毒基因組RNA的溶液。(2)桃拉病毒的LAMP擴增A.根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設置所需LAMP反應管數(shù)N，N =樣品數(shù)+1管陽性對照 +1管陰性對照；B.吸取LAMP預反應液的體積為NX 23 μ L，加入一潔凈的1. 5mL離心管中，然后加 入N μ L BstDNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒；C.向設定的N個反應管中分別加入24 μ L上述混合液，然后在上述每個反應管中 再分別加入30 μ L LAMP反應穩(wěn)定液，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；D.向上述N個PCR反應管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板DNA和 陽性對照DNA各1 μ L，蓋緊管蓋并做好標記；Ε.置恒溫金屬浴中于62°C恒溫反應60分鐘；
(3)顯色檢測
取出LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品 和陽性對照的順序依次分別加入1 μ L顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。本發(fā)明的核心之一是引物的設計，根據(jù)對蝦桃拉病毒基因組序列設計了 4條特異 性引物，能特異識別靶序列上的6個位點；核心之二是在加樣時引入反應穩(wěn)定劑，阻止反應 產(chǎn)物的外逸，避免了再次反應時的污染。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明試劑盒特異性強，可廣泛應用于科研，特別是養(yǎng)殖現(xiàn)場的TSV的檢測。本發(fā) 明檢測方法快速靈敏，較PCR方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，降低了成本，結(jié)果 檢測方法簡單直觀，可直接用肉眼觀察判斷結(jié)果，適用于多種實驗條件下的檢測工作。
具體實施例方式以下就實施例來具體解釋本發(fā)明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于實施例。實施例1待檢樣品的RNA提取(1)待檢樣品有TSV感染典型癥狀的對蝦樣品2只(取自廣東湛江某養(yǎng)殖場發(fā)病 對蝦，體重大約分別2. 2g和2. 7g)、健康對蝦樣品1只(購買于廣州某菜市場，體重約6g)； 分別編號為#1、#2、#3。(2)取待檢樣品組織70mg左右置于1. 5ml離心管中，加入500 μ L μ L組織裂解液 RNAiso Reagent，搗爛樣品，室溫裂解5分鐘；(3)用臺式離心機40C 12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清，置于1. 5ml離心管中；(4)加入200 μ 1氯仿，上下顛倒充分混勻，冰上放置10分鐘；(5)用臺式離心機在4°C以12000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，小心取上清，等體積冰冷異 丙醇，上下顛倒混勻，_20°C放置30分鐘；(6)用臺式離心機在4°C以12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清液，加入冰冷的75% 乙醇(無RNase水配制)淋洗RNA沉淀，然后離心，倒去上清液。室溫晾干；(7)用30ul無RNA酶水溶解，得到待檢樣品#1、#2和#3的RNA模板。實施例2桃拉病毒的LAMP擴增A.根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目為3，設置所需LAMP反應管數(shù)應為5 ；B.吸取LAMP預反應液的體積為5X23 = 115 μ L，加入一潔凈的1. 5mL離心管中， 然后加入5 μ L Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒；C.取5個LAMP反應管置于冰上，向每個反應管中分別加入24 μ L上述混合液，然 后在上述每個反應管中再分別加入30 μ L LAMP反應穩(wěn)定液，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；D.向上述5個LAMP反應管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照RNA、待檢#1、#2、 #3RNA模板和陽性對照RNA各1 μ L，蓋緊管蓋并做好標記；Ε.置恒溫金屬浴中于62°C恒溫反應60分鐘；實施例3顯色檢測取出LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品 和陽性對照的順序依次分別加入1 μ L顯色液，輕輕混勻。實施例4結(jié)果判斷
檢測結(jié)果在陰性對照反應管液體為橙色，陽性對照反應管液體呈綠色的情況下有 效，而本次檢測結(jié)果符合以上特點，說明檢測有效；待檢樣品#1和#2反應管液體呈綠色，與陽性對照相同，說明該樣品結(jié)果為TSV陽性；而待檢樣品#3反應管液體呈橙色，與陰性對照 相同，則表明該樣品TSV檢驗結(jié)果為陰性。
權(quán)利要求
一種用于檢測對蝦桃拉病毒的LAMP試劑盒，其特征在于包括病毒RNA提取試劑和LAMP反應試劑；其中的LAPM反應試劑中含有序列為SEQID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的4個引物。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的LAMP反應試劑包括以下組分 (1)LAMP預反應液含有Tris-HCl、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸銨、TritonX-100,dNTP、甜菜 堿、RNase抑制劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、序列SEQ ID NO 1的引物TSV-FIP、序列SEQ ID NO 2的 引物TSV-BIP、序列SEQ ID NO 3的引物TSV-F3和序列SEQ ID NO 4的引物TSV-B3 ；(2)聚合酶BstDNA聚合酶；(3)LAMP反應穩(wěn)定液含有由礦物油或液體石蠟油組成；(4)LAMP反應顯色液含有熒光染料。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的LAMP反應試劑包括以下組分(1)LAMP預反應液20 25mMpH為8. 8的Tris_HCl、2 4mM硫酸鎂、10 12mM氯 化鉀、10 12mM 硫酸銨、1 1. 25% TritonX-100,400 500 μ M dNTP、0. 8 1· 2M 甜菜 堿、15 20U RNase抑制劑、1 2U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、0. 8 1 μ M序列SEQ ID NO 1的引物 TSV-FIP、0. 8 1 μ M 序列 SEQ ID NO 2 的引物 TSV_BIP、0. 2 0. 4 μ M 序列 SEQ ID NO 3 的引物 TSV-F3 禾口 0. 2 0. 4 μ M 序列 SEQ ID NO :4 的引物 TSV-B3 ；(2)聚合酶每微升含8個活性單位的BstDNA聚合酶；(3)LAMP反應穩(wěn)定液由礦物油或液體石蠟油組成；(4)LAMP反應顯色液含有10% SYBR Green I的熒光染料。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于還包括陽性對照試樣和陰性對照試樣；所 述的陽性對照試樣為桃拉病毒基因組RNA ；所述的陰性對照試樣為健康對蝦組織RNA。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的RNA提取試劑包括組織裂解液 RNAiso Reagent。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的RNA提取試劑還包括氯仿、異丙醇、 乙醇和無RNase水。
7.一種用權(quán)利要求1所述試劑盒檢測對蝦桃拉病毒的方法，其特征在于包括以下步驟(1)待檢樣品總RNA的提取A.取待檢樣品置于離心管中，加入組織裂解液RNAisoReagent，搗爛，室溫裂解；B.離心取上清，置于離心管中；C.加入氯仿，上下顛倒充分混勻，冰上放置；D.離心，取上清液，加入等體積冰冷異丙醇，上下顛倒混勻，低溫下放置；E.離心，棄上清液，加入冰冷的乙醇溶液淋洗RNA沉淀，然后離心，倒去上清液；室溫晾干；F.用無RNA酶水溶解，得到待檢RNA模板；(2)桃拉病毒的LAMP擴增A.根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設置所需LAMP反應管數(shù)；B.吸取LAMP預反應液，加入一潔凈的離心管中，然后加入BstDNA聚合酶，混合均勻， 離心，得到混合液；C.向反應管中分別加入上述混合液，然后在每個反應管中再分別加入LAMP反應穩(wěn)定液，離心；D.向上述反應管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照RNA、待檢RNA模板和陽性對照RNA；E.恒溫反應；(3)顯色檢測取出LAMP反應管，冷卻至室溫，離心，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次 分別加入顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。
8.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1)待檢樣品的總RNA提取A.取待檢樣品50 IOOmg置于1.5ml離心管中，加入500μ L組織裂解液RNAiso Reagent，搗爛樣品，室溫裂解5分鐘；B.在4°C以12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清，置于1.5ml離心管中；C.加入200μ1氯仿，上下顛倒充分混勻，冰上放置10分鐘；D.在4°C以12000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，小心取上清，等體積冰冷異丙醇，上下顛倒混 勻，-20°C放置30分鐘；E.在4°C以12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清液，加入冰冷的由無RNase水配制的75% 乙醇溶液淋洗RNA沉淀，然后離心，倒去上清液；室溫晾干；F.用30ul無RNA酶水溶解，得到含桃拉病毒基因組RNA的溶液；(2)桃拉病毒的LAMP擴增A.根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設置所需LAMP反應管數(shù)N，N=樣品數(shù)+1管陽性對照+1管 陰性對照；B.吸取LAMP預反應液的體積為NX23yL，加入一潔凈的1.5mL離心管中，然后加入 NyL Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒；C.向設定的N個反應管中分別加入24μ L上述混合液，然后在上述每個反應管中再分 別加入30 μ L LAMP反應穩(wěn)定液，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；D.向上述N個PCR反應管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板DNA和陽性 對照DNA各1 μ L，蓋緊管蓋并做好標記；Ε.在62 °C下恒溫反應60分鐘；(3)顯色檢測取出LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽 性對照的順序依次分別加入1 μ L顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測對蝦桃拉病毒(Taura syndromevirus，TSV)的試劑盒。該試劑盒包括病毒RNA提取試劑和含有序列為SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4四個引物LAMP反應試劑；除此，還包括含有對蝦桃拉病毒基因組RNA的陽性對照試樣和含有健康對蝦組織總RNA的陰性對照試樣。本發(fā)明還公開了一種利用上述試劑盒檢測TSV的方法。本發(fā)明試劑盒特異性強，可廣泛應用于科研，特別是養(yǎng)殖現(xiàn)場的TSV的檢測。本發(fā)明檢測方法快速靈敏，成本低，不需要PCR儀和電泳儀，可直接用肉眼判定檢測結(jié)果。
文檔編號C12Q1/68GK101845519SQ20101010575
公開日2010年9月29日 申請日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者任春華, 張呂平, 江曉, 羅鵬, 胡超群, 趙哲 申請人:中國科學院南海海洋研究所