專利名稱：可可茶提取物用于制備抗過(guò)敏及炎癥的藥物、食品及化妝品的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然植物提取及應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是涉及可可茶提取物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年的流行病學(xué)調(diào)查顯示，過(guò)敏性疾病具有逐年增加的趨勢(shì)，特別是由環(huán)境原因引起的過(guò)敏反應(yīng)及抗遺傳性過(guò)敏性皮膚炎的增加趨勢(shì)尤為顯著，已成為不可忽視的社會(huì)現(xiàn)象。其問(wèn)題的出現(xiàn)不僅由于過(guò)敏源的逐年增加、大氣污染、食品添加物的濫用，而且也由于近年來(lái)人們飲食習(xí)慣的變化。過(guò)敏性疾病的治療方法通常以消除過(guò)敏源為本，進(jìn)而根據(jù)臨床癥狀的程度、起因及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行選擇性藥物治療。過(guò)敏反應(yīng)根據(jù)臨床引發(fā)疾病的免疫球蛋白、相關(guān)細(xì)胞等不同，一般分為4種類型。I～I(xiàn)II型過(guò)敏癥主要以體液性抗體免疫反應(yīng)為主，其特征是過(guò)敏反應(yīng)出現(xiàn)的比較快，又被稱為實(shí)時(shí)型過(guò)敏反應(yīng)癥；IV型過(guò)敏反應(yīng)是以淋巴細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)，臨床上又被稱為遲發(fā)型過(guò)敏癥。
過(guò)敏性鼻炎、支氣管哮喘及蕁麻疹等疾病，臨床上屬于I型過(guò)敏反應(yīng)。I型過(guò)敏反應(yīng)以免疫球蛋白[Immunoglobulin E(IgE)]抗體作用為介質(zhì)，由肥大細(xì)胞及嗜堿性白細(xì)胞、游離的組胺、白三烯[leukotrienes(LT)]等為化學(xué)遞質(zhì)，進(jìn)而刺激血管擴(kuò)張，增大血管通透性，促進(jìn)支氣管平滑肌收縮，提高末端神經(jīng)感應(yīng)等過(guò)度生物體應(yīng)激反應(yīng)。因此，對(duì)I型過(guò)敏性疾病的治療，臨床上主要使用抗組胺劑及對(duì)肥大細(xì)胞釋放化學(xué)遞質(zhì)具有抑制活性的抗過(guò)敏藥物。但是，抗組胺劑等抗過(guò)敏藥物在臨床使用中多數(shù)出現(xiàn)瞌睡、口渴、胃腸消化系統(tǒng)受損等副作用，長(zhǎng)期服用也存在一定的臨床安全性問(wèn)題。
IV型過(guò)敏反應(yīng)是與T細(xì)胞相關(guān)的遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)。是由胰島細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫提承細(xì)胞向T細(xì)胞提供抗原信息并促進(jìn)感應(yīng)，隨后T細(xì)胞釋放各種細(xì)胞介素，啟動(dòng)嗜酸性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，結(jié)果引起遲發(fā)型炎癥反應(yīng)。過(guò)敏性接觸皮膚炎實(shí)際上是IV型過(guò)敏反應(yīng)的一種臨床代表癥狀。臨床上對(duì)IV型過(guò)敏性疾病的治療一般使用甾醇類外用制劑療法和加強(qiáng)生活指導(dǎo)。甾醇類制劑的藥理作用是抑制T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞介素，對(duì)濕疹的治療確有一定的臨床效果。但大量或長(zhǎng)時(shí)間使用將會(huì)引起副腎皮質(zhì)機(jī)能低下，出現(xiàn)局部皮膚萎縮、潮紅、毛細(xì)血管擴(kuò)張等副作用。此外，盡管甾醇類制劑在臨床上常常用作抗組胺制劑使用，但其抗過(guò)敏效果也僅僅是在一定程度上減輕皮膚搔癢。近年來(lái)過(guò)敏性皮膚疾病，特別是遺傳性過(guò)敏性皮膚炎在臨床上逐年增加。有關(guān)遺傳性過(guò)敏性皮膚炎的成因長(zhǎng)期以來(lái)也有各種學(xué)說(shuō)。近年來(lái)，基于病理和臨床癥狀的特征，人們注意到遺傳性過(guò)敏性皮膚炎并非起因于I型過(guò)敏反應(yīng)，而與IV型過(guò)敏反應(yīng)在病理起因上有很大的相關(guān)性。
迄今為止，人們?cè)趯?duì)過(guò)敏性疾病的病理生理進(jìn)行分析的同時(shí)，也注重對(duì)其治療藥物的研制和開(kāi)發(fā)。但臨床應(yīng)用的抗過(guò)敏制劑多數(shù)具有副作用，在效果上也僅僅局限于暫時(shí)性的緩解，而不能從根本上改善過(guò)敏性體質(zhì)?，F(xiàn)代社會(huì)帶來(lái)的生活方式及環(huán)境上的變化，使得過(guò)敏性疾病逐年顯示出增加的趨勢(shì)。從身體健康及生活習(xí)慣角度出發(fā)，一種可以長(zhǎng)期服用而且安全性高的用于改善或治療過(guò)敏性疾病的健康食品或醫(yī)藥品的研制為人們所期待。當(dāng)然，從預(yù)防觀點(diǎn)出發(fā)，可作為日常飲料的抗過(guò)敏劑或可作為日?；瘖y品添加物的抗過(guò)敏劑更為理想。
茶的故鄉(xiāng)在中國(guó)南部，其根據(jù)之一是中國(guó)南部自然分布生長(zhǎng)著茶的多種變種及野生種?？煽刹?Camellia ptilophylla Chang)是一種野生茶，在植物分類學(xué)上是傳統(tǒng)茶葉(Camellia sinensis)的近緣種植物，被人們發(fā)現(xiàn)后又稱為新種茶。根據(jù)近年的調(diào)查結(jié)果，野生可可茶主要自然分布在廣東省龍門地區(qū)的狹窄范圍，長(zhǎng)期以來(lái)被當(dāng)?shù)厝藗兺ㄟ^(guò)殺青、半發(fā)酵、發(fā)酵等不同方法制成綠茶、烏龍茶及紅茶等茶葉日常飲用?？煽刹枋且环N飲用安全的日常飲料，長(zhǎng)期以來(lái)被當(dāng)?shù)厝藗冇米鹘】挡栾嬘茫駷橹箾](méi)有發(fā)現(xiàn)任何副作用及不安全的現(xiàn)象。與傳統(tǒng)茶葉中的甲基黃嘌呤(methyxanthine)類物質(zhì)代謝途徑不同，可可茶中不含有咖啡因(caffeine)，而含有可可豆堿(theobromine)(為巧克力的原料-可可豆cacao的主要活性成分)，因此被稱為可可茶(cocoa tea)。與咖啡因的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，可可豆堿在咖啡因化學(xué)結(jié)構(gòu)的1位上沒(méi)有甲基取代，因而表現(xiàn)出與咖啡因不同的生理作用，不僅不顯示咖啡因特有的中樞興奮作用，相反顯示出鎮(zhèn)靜等功能。因此，可可茶又被稱作睡前可以飲用的休息茶，適用于老年、孕婦、兒童、胃腸功能低下或心臟不健康等人的飲用。
近年來(lái)，人們非常關(guān)心天然物質(zhì)生理活性的研究，對(duì)茶類所具有生物功能更是特別關(guān)注。茶和咖啡、可可被并稱為世界三大嗜好飲料，為世界絕大多數(shù)人所喜愛(ài)。人類飲茶已有數(shù)千年的歷史。茶葉對(duì)健康的種種調(diào)節(jié)功能自古以來(lái)早以為人們所知，例如茶葉的抗氧化作用、抗菌作用、對(duì)血中膽固醇的調(diào)節(jié)作用等更是令人注目。傳統(tǒng)茶葉的提取物及所含主要活性成分多酚類(polyphenols)物質(zhì)對(duì)肥大細(xì)胞釋放組胺的抑制作用等已有報(bào)道。盡管可可茶是傳統(tǒng)茶葉的近緣種植物，但對(duì)于可可茶的生物活性及其中主要活性成分尚無(wú)任何應(yīng)用方面的探討。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供以可可茶(Camellia ptilophylla Chang)提取物及可可茶活性成分為原料，制備一種安全性高、無(wú)副作用的抗過(guò)敏、抗炎癥及抗接觸性過(guò)敏性皮膚炎，對(duì)炎癥及過(guò)敏反應(yīng)的藥物的用途。所述的藥物包括有效治療劑量的可可茶提取物，以及藥學(xué)上可接受的載體。該藥物特別是對(duì)IV型過(guò)敏反應(yīng)引起的臨床癥狀的預(yù)防、治療有效，例如對(duì)接觸性過(guò)敏性皮膚炎及由它所引起的臨床癥狀有抑制或減輕作用。
本發(fā)明的另一發(fā)明目的在于提供以可可茶提取物及可可茶活性成分為原料，制備用于預(yù)防、改善過(guò)敏、炎癥，且可長(zhǎng)期服用、安全性高、無(wú)副作用的健康食品、食品及食品添加劑的用途。日常服用含有可可茶提取物的食品可以減輕和預(yù)防感冒引起的咽炎等炎癥、花粉癥癥狀及咳嗽等癥狀。
本發(fā)明的另一發(fā)明目的在于提供以可可茶提取物及可可茶活性成分為原料，制備用于減輕和治療一些炎癥的安全性高、無(wú)副作用的皮膚外用劑或者化妝品的用途。該皮膚外用劑或者化妝品可用于日常的皮膚保護(hù)。
本發(fā)明所述的可可茶提取物是采用熱水或水與甲醇、乙醇等低級(jí)醇類、丙酮等極性溶劑的一種或二種以上的任意混合溶劑進(jìn)行提取的。
因?yàn)榭煽刹柚械纳飰A(alkaloid)及兒茶酚類(catechins)都屬于小分子化合物，一般用水提取即可，也可用不同濃度的低級(jí)醇類、丙酮等極性溶劑或任意混合溶劑來(lái)提取。在提取時(shí)，隨著醇的添加，可可茶中活性成分的回收率會(huì)有所增加。盡管用水提取效果不如用醇添加提取，但隨著水溫增加，以及提取時(shí)間的延長(zhǎng)，也可以達(dá)到與醇提取法相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。因此，對(duì)可可茶中活性成分的提取而言，上述提取方法及其任意組合都可得到本發(fā)明所述的提取物。
鑒于可可茶提取物是以藥劑或飲料作為最終產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，故從安全性角度考慮提取溶劑盡量選擇乙醇為宜。提取時(shí)可可茶與溶劑的比率沒(méi)有特定限制，但一般可可茶與溶劑的比例以5∶1～50范圍為宜。本發(fā)明對(duì)提取溫度沒(méi)有特定限制，從室溫到溶劑沸點(diǎn)范圍都可適用。當(dāng)然室溫、常壓及在溶劑沸點(diǎn)范圍內(nèi)提取最為理想。提取時(shí)間從10秒到24小時(shí)范圍都可以。在提取可可茶提取物時(shí)，根據(jù)需要也可以在溶劑中添加碳酸氫鈉、抗壞血酸鈉鹽(sodium ascorbate)等物質(zhì)。這些提取方法不會(huì)影響可可茶本來(lái)具有的生物活性。
本發(fā)明提供的可可茶提取物固形劑使用量一般在0.1％至40％(W/W)，因?yàn)橥ǔｏ嬃咸砑訚舛纫话阍?.1％至40％(W/W)范圍較為適宜。在這個(gè)濃度范圍內(nèi)，可可茶提取物適于直接服用，容易被消費(fèi)者接受。當(dāng)然，作為添加物的可可茶提取物隨著加入量的增大，可能會(huì)出現(xiàn)苦澀感覺(jué)。其解決辦法可以根據(jù)市場(chǎng)需要及消費(fèi)者的心理要求改換劑型，例如使用片劑、顆粒劑、膠囊劑等劑型。低濃度可可茶提取物溶液可以作為日常飲料提供給消費(fèi)者。
本發(fā)明提供的可可茶提取物，可以多種口服劑型投放市場(chǎng)，用于預(yù)防、改善和治療炎癥、過(guò)敏。當(dāng)然，可可茶提取物也可以與常用的賦形劑等醫(yī)藥用載體結(jié)合并制劑化。必要時(shí)也可以添加一些防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑等制劑添加物。
比較適宜的可可茶賦形劑，一般考慮有乳糖、白糖、D-甘露醇、淀粉、結(jié)晶纖維素等。潤(rùn)滑劑一般應(yīng)采用硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石粉等。溶劑通常使用精制水、乙醇、丙二醇等。防腐劑一般采用氯丁醇、芐醇、二羥基乙酸等?？寡趸瘎┩ǔＲ詠喠蛩猁}、抗壞血酸等比較適宜。
本發(fā)明提供的可可茶提取物，可以其原型、提取物或粉末添加到制品中用于口服。可可茶提取物也可與其它飲料原料結(jié)合制成一定的飲料制品，如可可茶飲料、炭酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、運(yùn)動(dòng)飲料、豆乳等?？煽刹杼崛∥锸称愤€可以考慮制成餅干、巧克力類、糖果類、口香糖類、快餐點(diǎn)心類、果凍點(diǎn)心類、面包、豆腐、酸奶酪等日常食品。
本發(fā)明中提供的可可茶提取物，也可以原型、水溶液稀釋后作為皮膚外用劑使用。當(dāng)然也可以通過(guò)與醫(yī)藥用載體結(jié)合制成一定的制劑，如氣霧劑、液體制劑、提取物、混懸劑、乳劑、軟膏劑、半流體制劑、擦劑、洗劑等劑型提供化妝品、醫(yī)藥品市場(chǎng)的消費(fèi)。
本發(fā)明提供可可茶提取物作為炎癥、過(guò)敏的預(yù)防、改善及治療劑為下述實(shí)驗(yàn)所證明。在使用IV型過(guò)敏動(dòng)物模型的藥理實(shí)驗(yàn)中，可可茶提取物在投藥劑量達(dá)到50mg/kg以上時(shí)，即顯示出有效的抑制浮腫的效果。本發(fā)明中可可茶提取物的投藥量，根據(jù)應(yīng)用者的健康狀況、年齡、性別及體重等條件可以調(diào)節(jié)。成人平均體重如以60Kg計(jì)，可可茶提取物日口服量一般可以考慮在3g至10g范圍內(nèi)，分次服用。當(dāng)然10g以上也不存在副作用等問(wèn)題。
本發(fā)明所述的可可茶提取物含有以下活性成分gallogatechin-gallate(GCG)、1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)及gallogatechin-3，5-digallate(GC-3，5-diGA)。
每克可可茶提取物中，上述活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少為40mg、25mg及100mg。
發(fā)明人首次從可可茶提取物中分離得到三個(gè)成分，經(jīng)核磁共振(NMR)等波譜學(xué)方法測(cè)定化學(xué)結(jié)構(gòu)，確認(rèn)為以下三種已知化合物1)gallogatechin-gallate(GCG)2)1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)3)gallogatechin-3，5-digallate(GC-35diGA)上述三種成分在傳統(tǒng)茶葉品種中尚無(wú)報(bào)道，可能是含量很少或很難檢測(cè)出的。
本發(fā)明以2，4-dinitrofluorobenzene(DNFB)誘發(fā)小鼠耳接觸性皮膚炎作為IV型過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，評(píng)價(jià)可可茶提取物及其所含活性成分對(duì)IV型過(guò)敏反應(yīng)的抑制效果。結(jié)果顯示，可可茶提取物及其活性成分對(duì)DNFB誘發(fā)的小鼠耳接觸性皮膚炎表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的治療活性。此外，本發(fā)明也發(fā)現(xiàn)可可茶提取物及其活性成分對(duì)巴豆油(croton oil)誘發(fā)的小鼠耳皮膚炎具有一定抑制作用，并可抑制肥大細(xì)胞釋放組胺的活性?；谏鲜鼋Y(jié)果確認(rèn)本發(fā)明成立。


圖1為可可茶提取物的HPLC分析圖譜。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明可以通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但并不僅僅局限于以下實(shí)施例。
實(shí)施例一可可茶提取物的制備取可可茶干燥葉100g，加入90℃熱水2000ml浸提4分鐘。提取液經(jīng)紗布濾過(guò)后，將濾液在1000rpm、5分鐘離心分離，回收上清液冷凍干燥即成?？煽刹枞~的上述冷凍干燥提取物用于本發(fā)明的下列實(shí)施例。
實(shí)施例二可可茶提取物的HPLC分析將上述可可茶提取物配制成1％水溶液后，經(jīng)Sep-PaktC18 Cartridge(5ml，Waters制)吸附過(guò)濾，水洗凈后，用乙腈洗脫分離。隨后，將250mg所得分離組分在Develosil C30-UG-5(20mm×250mm，野村化學(xué)制)柱上，在0.05％三氟乙酸(TFA)存在條件下，用5-30％乙腈按線性梯度洗脫方式(5ml/mim，180分鐘，220nm紫外檢測(cè))洗脫分離?；厥盏玫降姆蛛x組分，再用YMC-Pak ODS(20×250mm、YMC制)柱，在0.1％TFA存在下，用20-25％乙腈按線性梯度洗脫方式(6ml/mim、60分鐘，280nm紫外檢測(cè))洗脫精制。結(jié)果如圖1所示，從中分離得到與傳統(tǒng)茶葉不同的三個(gè)組分。
可可茶提取物的HPLC分析條件。層析柱資生堂capcell pak C18(φ4.6mm×150mm)，流動(dòng)相A＝0.05％TFA/水；B＝90％CH3CN/0.05％TFA/水。B5→B35％(13分鐘)，B35％→B70％(7分鐘)，B70％(5分鐘)。檢測(cè)A280nm峰面積定量。PDA 220～500nm檢測(cè)。
從可可茶提取物中分離得到三個(gè)成分，經(jīng)核磁共振(NMR)等波譜學(xué)方法測(cè)定化學(xué)結(jié)構(gòu)，確認(rèn)為以下三種在傳統(tǒng)茶葉品種中含量很少或很難檢測(cè)出的已知化合物gallogatechin-gallate(GCG)、1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)及gallogatechin-3，5-digallate(GC-35diGA)。
左側(cè)為EGCG的結(jié)構(gòu)式 右側(cè)為gallogatechin-gallate(GCG)的結(jié)構(gòu)式傳統(tǒng)茶主要含有EGCG。
1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)的結(jié)構(gòu)式 gallogatechin-3，5-digallate(GC-3，5-diGA)的結(jié)構(gòu)式實(shí)施例一所得到的可可茶提取物中各成分的含量如下Theobromine 278.75EGC 43.25(+)C 62.75EC 14.50EGCG 37.25GCG 199.001，3，4，6-GA-glc54.75GC-3，5-diGA 32.50由于用水提取、用醇提取、用其他極性溶劑提取，或者混合法提取，每克可可茶提取物中，上述活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量有或多或少的差別，但發(fā)明人的不同實(shí)驗(yàn)多次表明，活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少為40mg、25mg及100mg。
實(shí)施例三耳接觸性皮膚炎實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)使用雄性7周齡ICR小鼠，由日本CLEA公司購(gòu)入。
飼養(yǎng)條件23±2℃，濕度55±5％，換氣次數(shù)12～15次/小時(shí)，照明時(shí)間12小時(shí)/天(7:00～19:00)，5匹/飼養(yǎng)籠(235×325×170H mm)。
飼育條件固體飼料CE-2(CLEA公司)，自由飲水。
飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠10匹/組，經(jīng)由背部皮下注射1.5％的2，4-DNFB乙醇溶液100μl作為抗原使之增敏(sensitization)。注射2，4-DNFB 5天后增敏(sensitization)成立，第6天在小鼠右耳上涂1％2，4-DNFB-橄欖油溶液作為抗原攻擊，使小鼠產(chǎn)生耳緣接觸性皮膚炎。24小時(shí)后，用直徑8mm打孔器取下左右兩耳，測(cè)定左右耳緣/8mm重量差及比較浮腫程度?？煽刹杼崛∥镉谠雒?sensitization)前一天到2，4-DNFB攻擊當(dāng)天連續(xù)7天經(jīng)口給藥。對(duì)照組喂以同體積蒸餾水。結(jié)果以student t-test作顯著差異性檢定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表一所示，與蒸餾水對(duì)照組2，4-DNFB誘發(fā)耳緣浮腫重量相比，可可茶提取物連續(xù)7天經(jīng)口給藥，對(duì)小鼠耳緣浮腫顯示出一定的抑制效果，并呈劑量依存關(guān)系。
表一可可茶對(duì)2，4-DNFB誘發(fā)小鼠耳緣接觸性皮服炎的影響

實(shí)施例四可可茶對(duì)巴豆油誘發(fā)的小鼠耳緣炎癥的改善效果實(shí)驗(yàn)使用雄性7周齡ICR小鼠由日本CLEA公司購(gòu)買。
飼養(yǎng)條件23±2℃，濕度55±5％，換氣次數(shù)12～15次/小時(shí)，照明時(shí)間12小時(shí)/天(7:00～19:00)，5匹/飼養(yǎng)籠(235×325×170H mm)。
飼育條件固體飼料CE-2(CLEA公司)，自由飲水。
飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠10匹/組。首先將0.3％巴豆油(Sigma)按照25μl/耳劑量涂抹在小鼠右耳緣中央部，3小時(shí)后按0.1ml/10g體重劑量向小鼠尾靜脈內(nèi)注射1％埃文斯蘭(Evans blue)生理鹽水溶液。注射埃文斯蘭生理鹽水一小時(shí)候后，用直徑8mm打孔器取下兩耳，參照katayama方法(A newmethod for extraction of extravasated dye in the skin and the influence offasting stress on passive cutaneous anaphylaxis in guinea pigs and rats.Microbiol.Immunol.197822(2)89-101.)，將耳緣放入1ml的1N KOH水溶液中，37℃下浸泡24小時(shí)后，添加9ml 0.6N磷酸-丙酮(5∶13)溶液，充分?jǐn)嚢韬箅x心分離(3000rpm/15分鐘)。取出上清液于620nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算埃文斯蘭量作為血管通透性指標(biāo)，分析判斷浮腫情況?？煽刹杼崛∥镉趯?shí)驗(yàn)前日及巴豆油涂抹1小時(shí)前兩次口服給藥。對(duì)照組給以同容量蒸餾水，藥物對(duì)照組用抗炎藥物地賽美松(Dexamethasone)于巴豆油涂抹1小時(shí)前1mg/kg一次口服給藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以student t-test作顯著性差異檢定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表二所示，與蒸餾水對(duì)照組巴豆油誘發(fā)小鼠耳緣炎癥相比，可可茶提取物經(jīng)口給藥，也顯示出一定的劑量依存性抑制效果。
表二可可茶對(duì)巴豆油誘發(fā)小鼠耳緣炎癥的抑制效果

實(shí)施例五遲發(fā)型足浮腫實(shí)驗(yàn)使用雄性7周齡ICR小鼠，由日本CLEA公司購(gòu)入。
飼養(yǎng)條件23±2℃，濕度55±5％，換氣次數(shù)12～15次/小時(shí)，照明時(shí)間12小時(shí)/天(7:00～19:00)，5匹/飼養(yǎng)籠(235×325×170H mm)。
飼育條件固體飼料CE-2(CLEA公司)，自由飲水。
飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠10匹/組，右后肢足掌皮下注射棉羊紅血球(SRBC)107cells/25μl作為抗原增敏(sensitization)。4天后，左后肢足掌皮下以108cells/25μlSRBC作為抗原注射再次攻擊?？乖?4小時(shí)后使用專門的標(biāo)準(zhǔn)尺(gauge)測(cè)定和比較左右足掌厚度，通過(guò)左右足之間的差值計(jì)算浮腫率。可可茶提取物于增敏(sensitization)前一天到用SRBC攻擊當(dāng)天連續(xù)5天經(jīng)口給藥。對(duì)照組給以同容量蒸餾水。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以student t-test作顯著性差異檢定。如表三所示，與蒸餾水對(duì)照組SRBC誘發(fā)小鼠遲發(fā)型足掌浮腫相比，可可茶提取物連續(xù)5天經(jīng)口給藥，顯示出一定的劑量依存性抑制效果。
表三可可茶對(duì)SRBC誘發(fā)小鼠遲發(fā)型組掌浮腫的抑制效果


實(shí)驗(yàn)六對(duì)肥大細(xì)胞釋放組胺的抑制作用組胺是肥大(mast)細(xì)胞及嗜堿細(xì)胞(basocyte)等在過(guò)敏反應(yīng)時(shí)釋放出的化學(xué)遞質(zhì)。抑制組胺釋放無(wú)疑可以改善過(guò)敏癥狀。發(fā)明人從可可茶中分離得到了在傳統(tǒng)茶葉中含量極少或很難檢測(cè)到的三種化合物GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA。盡管它們均為已知化合物，但有關(guān)1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA的抗過(guò)敏、抗炎癥作用尚無(wú)人報(bào)道。為此本發(fā)明對(duì)1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA對(duì)肥大細(xì)胞釋放組胺的抑制作用進(jìn)行了研究。
大鼠腹腔內(nèi)肥大細(xì)胞的采集及配制。將7周齡Wistar雌性大鼠麻醉放血致死后，立即向腹腔內(nèi)注射50ml冷的Ca2+free mast cell medium(+MCM)液(MCM液組成150mM NaCl，3.7mM KCl，3mM Na2HPO4，5.6mM Glucose，0.1％BSA，0.1％ Gelatin，pH6.8)，揉動(dòng)3分鐘后，收集腹腔內(nèi)含有肥大細(xì)胞的MCM液。然后在580rpm，4℃條件下離心7分鐘，回收肥大細(xì)胞。再添加35ml MCM，在580rpm，4℃條件下離心7分鐘。繼用MCM液稀釋配成1×105細(xì)胞懸濁液。
測(cè)定組胺釋放抑制活性的方法是取500μl/管上述肥大細(xì)胞懸濁液，在37℃孵化培養(yǎng)5分鐘后，加入4μl 250mM鈣。在37℃孵育5min后加入5μl供試樣品，繼在37℃孵育10min后加入5μl0.05mg/ml的化合物48/80溶液刺激細(xì)胞，孵育10min后冷卻中止反應(yīng)。6000rpm 4℃條件下離心3分鐘，回收細(xì)胞上清液。將400μl中添加20μl 60％PCA除蛋白。室溫放置20分鐘后，添加400μl生理鹽水，然后在13000rpm 4℃條件下離心3分鐘，上清液用HPLC方法測(cè)定組胺含量。
組胺含量的HPLC測(cè)定法。分析柱TSK gel histamine pak(4×60mm，Tosoh公司制)；前處理柱TSK precolumn his(4×60mm，Tosoh公司制)；反應(yīng)溫度45℃；流動(dòng)相流速0.6ml/min；前處理液流速0.6ml/min；反應(yīng)液流速0.1％OPA溶液0.2ml/min；4N NaOH溶液0.2ml/min；25％H3PO4溶液0.3ml/min；檢測(cè)(EM350nm；EX460nm)。HPLC詳細(xì)條件參照發(fā)明人的論文(Influence of histamine in a liver injury model induced byPropionibacterium acnes and lipopolysaccharide.Biol.Pharm.Bull.2003Oct；26(10)1393-7.)。
histamine釋放率(％)＝(Sample-Blank)/(Complete-Blank)×100histamine釋放抑制率(％)＝(1-(Sample-Blank))/(Comp48/80-Blank)×100實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表四所示，1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA對(duì)肥大細(xì)胞釋放組胺顯示有非常強(qiáng)的抑制活性。因此，本發(fā)明確認(rèn)1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA是可可茶抗過(guò)敏、抗炎癥的活性成分。
表四可可茶中不同化學(xué)成分對(duì)肥大細(xì)胞釋放組胺的抑制作用

權(quán)利要求
1.可可茶提取物用于制備預(yù)防及治療抗過(guò)敏及炎癥的藥物的用途。
2.可可茶提取物用于制備預(yù)防及改善過(guò)敏及炎癥的食品的用途。
3.可可茶提取物用于制備預(yù)防及改善過(guò)敏及炎癥的化妝品的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物含有活性成分gallogatechin-gallate，即GCG，每克可可茶提取物中GCG的含量至少為40毫克。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物含有活性成分1，3，4，6-tetragalloyl-glucose，即1，3，4，6-GA-glc，每克可可茶提取物中1，3，4，6-GA-glc的含量至少為25毫克。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物含有活性成分gallogatechin-3，5-digallate，即GC-3，5-diGA，每克可可茶提取物中GC-3，5-diGA的含量至少為100毫克。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物是采用熱水或水與低級(jí)醇類、極性溶劑的一種或二種以上的任意混合溶劑進(jìn)行提取的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物在提取時(shí)，在溶劑中添加碳酸氫鈉和/或抗壞血酸鈉鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物包括有效治療劑量的可可茶提取物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物的固形劑使用量為0.1％至40％重量比。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了可可茶提取物及其活性成分GCG、1，3，4，6－GA－glc、GC－3，5－diGA用于制備抗過(guò)敏及炎癥的藥物、食品及化妝品的應(yīng)用。本發(fā)明是基于2，4－dlinitrofluorobenzene (DNFB)誘發(fā)小鼠耳接觸性皮膚炎作為IV型過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物的試驗(yàn)?zāi)Ｐ停u(píng)價(jià)可可茶提取物及其所含活性成分對(duì)IV型過(guò)敏反應(yīng)的抑制效果得以確認(rèn)和證明的。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1562278SQ20041002672
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月1日
發(fā)明者栗原博, 姚新生, 葉創(chuàng)興 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)