專利名稱：一種具有抗腫瘤活性的茯苓菌絲體胞外多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的茯苓菌絲體胞外多糖的制備方法。它屬于高分子化學(xué)領(lǐng)域，也屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
80年代以來的研究表明，真菌多糖對多種危害人類健康的疾病，如免疫紊亂、癌癥、糖尿病、高血壓、肝炎、肺炎等都具有顯著的療效。多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的吞噬功能，誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF)和白細(xì)胞素，從而提高人體的免疫機(jī)能，而且對正常細(xì)胞沒有毒副作用(Intern.J.Orient.Med.17，57，1992)。茯苓長期用于中藥配方，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上用作靈丹妙藥。從茯苓菌核和菌絲體中堿提取的多糖具有明顯的抗腫瘤活性(Carbohydr.Res.87，161，1980；Yakugaku Zasshi，106，307，1986)。我們已用實(shí)驗(yàn)室搖床培養(yǎng)了茯苓菌絲體，并得到三種水溶性多糖，它們具有抗腫瘤活性(Carbohydr.Res.338，1507，2003；Carbohydr.Res.338，1517，2003)然而實(shí)驗(yàn)室搖床培養(yǎng)不僅菌絲體產(chǎn)量很少，而且全部用手工，費(fèi)時(shí)且繁雜。采用液體深層發(fā)酵(Submergedfermentation)技術(shù)通過中試自動化裝置和程序獲得菌絲體可克服這些缺點(diǎn)。另外通過培養(yǎng)茯苓菌絲體，并分離出具有抗腫瘤活性的成分，同時(shí)弄清它們的一級和二級結(jié)構(gòu)以及生物活性尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是提供一種具有抗腫瘤活性的茯苓菌絲體胞外多糖的制備方法，該方法簡單易行、成本較低廉，產(chǎn)率較高。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種具有抗腫瘤活性的茯苓菌絲體胞外多糖的制備方法，采用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的野生茯苓菌種wolf Poria cocos(編號P0)在pH值為5.0～6.0的玉米漿培養(yǎng)基中用經(jīng)高壓滅菌的發(fā)酵罐進(jìn)行茯苓菌絲體深層發(fā)酵；培養(yǎng)溫度25～30℃，罐內(nèi)壓力0.7～0.9Mpa，空氣流量為發(fā)酵罐體積的0.5～1倍/分鐘，攪拌速度120～200rpm；發(fā)酵48～72小時(shí)，然后空氣流量加大到發(fā)酵罐體積的1～1.5倍/分鐘；總共發(fā)酵7～10天，收集培養(yǎng)液；采用噴霧干燥機(jī)干燥得到胞外粗多糖，干燥機(jī)的入口溫度250℃，出口溫度70～80℃；用蒸餾水將胞外粗多糖溶解，過濾后用20～30wt％H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)，反復(fù)進(jìn)行9～12次，然后分別用清水和二次蒸餾水透析5～7天和3～5天，減壓蒸餾，冷凍干燥得純胞外多糖(Pi-PCM0)。
上述培養(yǎng)基的基本組成為玉米漿5～15mL、D-葡萄糖20～30g、酵母膏3～3.5g、KH2PO40.8～1.2g、CaCl2·2H2O 0.04～0.08g、MnCl2·4H2O 3～7mg、MgSO4·7H2O 0.3～0.7g、ZnCl22～6mg、Fe2(SO4)33～7mg、維生素B10.08～0.12mg、蒸餾水1L。
上述水溶性胞外多糖用酚磺酸法測定多糖中碳水化合物的含量，用紅外、氣相色譜、粘度計(jì)及光散射儀確定了其化學(xué)組成和二級結(jié)構(gòu)。上述水溶性胞外多糖的單糖組成主要由α-D-葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成，其重均分子量為7.7×104。本發(fā)明簡單易行、成本較低廉，產(chǎn)率較高。本發(fā)明培養(yǎng)的茯苓菌絲體多糖Pi-PCM0在小鼠體內(nèi)對Sarcoma180腫瘤表現(xiàn)出較高的抗腫瘤活性。由此表明，本發(fā)明采用噴霧高溫干燥并未影響胞外多糖的抗腫瘤活性。體外活性實(shí)驗(yàn)也表明，該類多糖對人體急性白血病毒細(xì)胞(HL-60)的增殖有顯著的抑制效果，而不會破壞正常猴腎細(xì)胞的增殖。因此，該多糖可用于制備抗腫瘤藥物和提高機(jī)體免疫功能的保健品，具有極大的推廣和應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體的實(shí)例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明實(shí)施例茯苓菌種為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌研究所從湖北羅田野生茯苓菌核分離出的野生茯苓菌種(編號P0；公眾可隨時(shí)購買)。液體培養(yǎng)基配方如下玉米漿(10mL)，D-葡萄糖(25g)，酵母膏(3.2g)，KH2PO4(1.0g)，CaCl2·2H2O(0.06g)，MnCl2·4H2O(5mg)，MgSO4·7H2O(0.5g)，ZnCl2(4mg)，F(xiàn)e2(SO4)3(5mg)，維生素B1(0.1mg)，蒸餾水(1L)。首先在斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌種。培養(yǎng)用的試管以及棉塞先在121℃消毒滅菌30分鐘(空消)，再裝入培養(yǎng)基在121℃消毒滅菌30分鐘，斜放冷卻使其凝固成斜面。然后在無菌室接種。斜面培養(yǎng)在恒溫28℃下進(jìn)行，為期7天得到茯苓菌種。將40L上述液體培養(yǎng)基(pH＝5.5)倒入50升經(jīng)120-150℃蒸汽滅菌的發(fā)酵罐設(shè)備，然后將上述斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌種接入發(fā)酵罐設(shè)備(中船總公司七一九研究所一九零工廠(武漢)設(shè)計(jì)制造)進(jìn)行茯苓菌絲體深層發(fā)酵。培養(yǎng)溫度28℃，罐內(nèi)壓力0.8Mpa，空氣流量2m3/h，攪拌速度150rpm。兩天后空氣流量加大到3m3/h。培養(yǎng)7天。共生產(chǎn)出茯苓菌絲體約300g(干重)，產(chǎn)率為7.5g/L，比實(shí)驗(yàn)室搖床培養(yǎng)的菌絲體產(chǎn)率高56.25％(搖床培養(yǎng)產(chǎn)率4.8g/L)。所得茯苓菌絲體培養(yǎng)液外觀澄清透明，淺棕黃色，略帶清香氣味。終止發(fā)酵時(shí)，培養(yǎng)液pH值為3，較開始時(shí)(pH＝5.5)有所降低。菌絲體為淺黃色，且有一種淡香味。
40升茯苓菌絲體培養(yǎng)液用PSD52型噴霧干燥機(jī)(丹麥APV安海達(dá)諾公司)干燥得到51.8g胞外粗多糖，噴霧干燥機(jī)的入口溫度250℃，出口溫度70～80℃。用蒸餾水將胞外粗多糖溶解，過濾后用30％H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)，反復(fù)進(jìn)行9次以上直至紫外檢測無280nm的蛋白質(zhì)吸收峰，然后分別用清水和二次蒸餾水透析5天和3天，濃縮，最后冷凍干燥得5.2克胞外多糖(Pi-PCM0)。所得多糖為白色粉狀固體。
多糖Pi-PCM0的組成、碳水化合物含量、分子量列于附表1。它們對植入Sarcoma180腫瘤的小鼠進(jìn)行體內(nèi)腹腔注射試驗(yàn)列于附表2。對人體急性白血病毒細(xì)胞(HL-60)的抗增殖試驗(yàn)的生物活性結(jié)果示于附表3。由此表明這種茯苓菌絲體胞外多糖具有明顯抗腫瘤活性以及對人體急性白血病毒細(xì)胞增殖的抑制作用。
附表1.茯苓菌絲體水溶性胞外多糖單糖組成、碳水化合物含量和分子量多糖中單糖含量(％)樣品 碳水化合物 Mw×10-4巖藻糖阿拉伯糖木糖甘露糖 半乳糖葡萄糖含量(％) (gmol-1)Pi-PCM0 - 2.5 1.5 70.6 18.5 7.0 82.6 7.7-未檢測到附表2.茯苓菌絲體水溶性胞外多糖抗Sarcoma180腫瘤活性劑量樣品 抑制率(％)完全抑制(mg/kg×days)Pi-PCM020×1042.1 0/8注生物活性試驗(yàn)在香港中文大學(xué)生物系進(jìn)行附表3.茯苓菌絲體水溶性胞外多糖對人體急性白血病毒細(xì)胞(HL-60)增殖的抑制作用樣品 200μg/mL 100μg/mL 50μg/mLPi-PCM0 81.03％68.08％57.56％注生物活性試驗(yàn)在香港中文大學(xué)生物系進(jìn)行
權(quán)利要求
1.一種具有抗腫瘤活性的茯苓菌絲體胞外多糖的制備方法，其特征在于采用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的野生茯苓菌種wolf Poria cocos在pH值為5.0～6.0的玉米漿培養(yǎng)基中用經(jīng)高壓滅菌的發(fā)酵罐進(jìn)行茯苓菌絲體深層發(fā)酵；培養(yǎng)溫度25～30℃，罐內(nèi)壓力0.7～0.9Mpa，空氣流量為發(fā)酵罐體積的0.5～1倍/分鐘，攪拌速度120～200rpm；發(fā)酵48～72小時(shí)，然后空氣流量加大到發(fā)酵罐體積的1～1.5倍/分鐘；總共發(fā)酵7～10天，收集培養(yǎng)液；采用噴霧干燥機(jī)干燥得到胞外粗多糖，干燥機(jī)的入口溫度250℃，出口溫度70～80℃；用蒸餾水將胞外粗多糖溶解，過濾后用20～30wt％H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)，反復(fù)進(jìn)行9～12次，然后分別用清水和二次蒸餾水透析5～7天和3～5天，減壓蒸餾，冷凍干燥得純胞外多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基的基本組成為玉米漿5～15mL、D-葡萄糖20～30g、酵母膏3～3.5g、KH2PO40.8～1.2g、CaCl2.2H2O 0.04～0.08g、MnCl2·4H2O 3～7mg、MgSO4·7H2O 0.3～0.7g、ZnCl22～6mg、Fe2(SO4)33～7mg、維生素B10.08～0.12mg、蒸餾水1L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性的茯苓菌絲體胞外多糖的制備方法，采用野生茯苓菌種在pH值為5.0～6.0的玉米漿培養(yǎng)基中用經(jīng)高壓滅菌的發(fā)酵罐進(jìn)行茯苓菌絲體深層發(fā)酵；收聚培養(yǎng)液；采用噴霧干燥機(jī)干燥得到胞外粗多糖；用蒸餾水將胞外粗多糖溶解，過濾后用H
文檔編號A61P35/00GK1587279SQ200410060650
公開日2005年3月2日 申請日期2004年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月28日
發(fā)明者張俐娜, 金勇 , 陳莉, 陳立國, 張志強(qiáng) 申請人:武漢大學(xué)