專利名稱：一種蛇毒類凝血酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛇毒類凝血酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及蛇毒類凝血酶、蛇毒類凝血酶成熟蛋白及它們的編碼基因與以該蛇毒類凝血酶或蛇毒類凝血酶成熟蛋白為活性成分的具有溶栓和防止血栓形成作用的藥物。
背景技術(shù)：
血栓形成是外科手術(shù)的常見并發(fā)癥，也是現(xiàn)代介入性血管成形術(shù)后發(fā)生再阻塞的重要因素以及多種心腦血管疾病的致病、致死原因。生理性血栓形成是止血的一種手段，而病理性血栓形成則可導(dǎo)致相關(guān)的臟器發(fā)生功能障礙。目前，心、腦部位的血栓性疾病已成為致殘率與致死率最高的疾病之一，嚴(yán)重威脅到人類的健康。據(jù)統(tǒng)計，全世界有血栓栓塞性患者約1500萬，所需溶栓劑的潛在市場可達(dá)20億美元，因而世界上很多國家都致力于這方面藥物研究與開發(fā)。
血栓是血液成份在血液循環(huán)過程中形成的一種非均質(zhì)性結(jié)構(gòu)的凝塊。血栓由血小板、白細(xì)胞、紅細(xì)胞和纖維蛋白構(gòu)成，各種成份所占的比率因血管部位和血液流動條件不同而有所差異。血栓形成是一個復(fù)雜的且牽涉面極廣的生理或病理過程，主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮損傷、血液成分改變和血流動力學(xué)異常。內(nèi)皮細(xì)胞受損和皮下膠原組織暴露會引發(fā)血小板的粘附和聚集。例如，血管性假血友病因子一端與內(nèi)皮膠原結(jié)合，一端與血小板膜血小板表面糖蛋白Ib(GP Ib)結(jié)合，從而發(fā)生血小板的粘附，粘附的血小板隨即被激活，并引發(fā)血小板的聚集，即在Ca2+輔助下和二個血小板膜上的膜蛋白GP IIb-IIa相結(jié)合；活化的血小板快速發(fā)生釋放反應(yīng)釋出其顆粒內(nèi)容物，如5-羥色胺、ADP、Ca2+、B-血小板球蛋白、花生四烯酸等，這些釋放物又進一步促進血小板的粘附、聚集與活化，使血小板聚合物不斷增大。同時，內(nèi)皮細(xì)胞的破損激活一系列凝血因子，并進一步引發(fā)體內(nèi)凝血因子的活化，纖維蛋白原在凝血酶作用下生成纖維蛋白多肽A和纖維蛋白多肽B，兩種纖維蛋白多肽轉(zhuǎn)化成纖維蛋白單體(α，β，γ)2后自發(fā)聚合成不穩(wěn)定的纖維蛋白多聚體，不穩(wěn)定的纖維蛋白多聚體在Ca2+、XIII因子的作用下交聯(lián)成穩(wěn)定的纖維蛋白多聚體，這就是血栓的主要基質(zhì)。纖維蛋白支持嵌入血小板血栓，最終形成血小板一纖維蛋白凝塊。
實質(zhì)上，血栓在體內(nèi)不是永久性的結(jié)構(gòu)，它處于纖維蛋白的不斷沉積和溶解的動態(tài)平衡之中。因此，清除纖維蛋白的前體，可有效地預(yù)防前者而控制血栓的發(fā)展，并增強人體正常的纖溶作用。
蛇毒類凝血酶在體內(nèi)具有較強的溶栓效果，它具有精氨酸酯酶活性，能夠直接作用于纖維蛋白原，水解釋放血纖肽2，導(dǎo)致纖維蛋白的單體首尾聚合而凝固，被稱為類凝血酶。但它在體內(nèi)不激活凝血因子I，由它水解生成的纖維蛋白凝塊不產(chǎn)生側(cè)鏈交聯(lián)，對纖溶酶的消化高度敏感，易被天然網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)或正常的纖溶作用所清除，因此導(dǎo)致胞漿中纖維蛋白原濃度顯著下降，表現(xiàn)降纖、抗凝的效果。臨床上，蛇毒類凝血酶已成為防治血栓栓塞性疾病的有效藥物。
纖維蛋白原是決定血液粘度的重要因素之一，類凝血酶減低了血漿中纖維蛋白原水平，從而降低了全血粘度及血漿粘度，增強了血流速度。同時，與凝血酶相反，類凝血酶不誘導(dǎo)血小板凝聚和釋放，它們與富含血小板的血漿所形成的凝塊不收縮，使機體能維持正常的止血功能。
國外已有Ancrod和Batroxobin蛇毒抗凝劑，國內(nèi)則有五步蛇毒祛纖酶、東北白眉蝮蛇抗栓酶(清栓酶)、江浙蝮蛇抗栓酶等用于臨床。雖然上述藥物的名稱不同，但主要成分是一致的，均為類凝血酶。這些抗凝劑因具有祛纖、降粘、溶栓、解聚等獨特的性質(zhì)，已用于臨床治療腦血栓形成、脈管炎、治療冠心病、心肌梗死，也有人用于治療癌痛綜合癥。目前認(rèn)為抗栓酶是治療脈管炎、深靜脈炎、靜脈栓塞形成最為理想的有效藥物。臨床上試用的適應(yīng)癥有深部靜脈血栓形成(并發(fā)癥或不并發(fā)肺栓塞)，視網(wǎng)膜中央靜脈血栓形成，心肌梗死，來自人工瓣膜的栓塞，陰莖異常勃起，鐮狀細(xì)胞貧血，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，臟器移植排斥，血栓形成經(jīng)外科或纖維溶解治療后復(fù)發(fā)的預(yù)防，靜脈外科的抗凝和血栓形成的預(yù)防，體外血液透析，人工心肺生命的維持，外周動脈阻塞和冠狀動脈狹窄等。一些結(jié)果證明它們是很有希望的治療劑。
蛇毒類凝血酶主要存在于蝰科中的蝮亞科蛇的蛇毒中，蝰亞科中的有些蛇毒也含有類凝血酶。然而，在海蛇科中還未有報道發(fā)現(xiàn)過類凝血酶，并且現(xiàn)在臨床運用的蛇類類凝血酶為從蛇毒中提純而來，產(chǎn)量有限，其中含有的不純的蛇類雜蛋白或酶類正是產(chǎn)生較大毒副作用的原因之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蛇毒類凝血酶、蛇毒類凝血酶成熟蛋白及它們的編碼基因。
本發(fā)明所提供的蛇毒類凝血酶，名稱為TLE，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有溶栓和防止血栓形成作用的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中的SEQ ID №1由265個氨基酸殘基組成。
該蛇毒類凝血酶成熟蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有溶栓和防止血栓形成作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №3由232個氨基酸殘基組成，是SEQ ID №1的自氨基端第34-265位氨基酸殘基序列。
上述蛇毒類凝血酶的編碼基因(TLE)也屬于本發(fā)明的保護范圍。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼具有溶栓和防止血栓形成功能的蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
其中，序列表中的SEQ ID №2由827個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1到第795位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
上述蛇毒類凝血酶成熟蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼具有溶栓和防止血栓形成功能的蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
其中，序列表中的SEQ ID №4由728個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1到第696位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
含有本發(fā)明蛇毒類凝血酶的編碼基因及其成熟蛋白的編碼基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系及工程菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增上述蛇毒類凝血酶的編碼基因及其成熟蛋白的編碼基因中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達(dá)上述蛇毒類凝血酶及其成熟蛋白的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)上述蛇毒類凝血酶的方法，是將含有上述蛇毒類凝血酶編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到蛇毒類凝血酶。
本發(fā)明所提供的表達(dá)上述蛇毒類凝血酶成熟蛋白的方法，是將含有上述蛇毒類凝血酶成熟蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到蛇毒類凝血酶成熟蛋白。
所述宿主可為酵母菌、大腸桿菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為酵母菌。
所述酵母菌優(yōu)選為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏畢赤酵母優(yōu)選為巴氏畢赤酵母GS115，KM7或SMD1168。
用于構(gòu)建所述重組酵母表達(dá)載體的出發(fā)載體可為在上述宿主中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，如可在巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達(dá)的pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815或pPSC3K。
當(dāng)所述宿主為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)時，需用甲醇進行誘導(dǎo)表達(dá)，甲醇的終濃度可為1％。
上述重組表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
培養(yǎng)含有本發(fā)明的蛇毒類凝血酶編碼基因或上述蛇毒類凝血酶成熟蛋白的編碼基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
本發(fā)明還提供了一種具有溶栓和防止血栓形成作用的藥物。
本發(fā)明所提供的藥物，它的活性成分為上述蛇毒類凝血酶或蛇毒類凝血酶成熟蛋白。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明所提供的蛇毒類凝血酶及其成熟蛋白可利用基因工程手段進行表達(dá)，獲得大量純度高、生物學(xué)活性高的酶蛋白，該酶蛋白具有蛇毒類凝血酶所具有的酰胺酶解活性、精氨酸酯酶活性，可以特異性地降解纖維蛋白原的β鏈，還可降解纖維蛋白原引起的血栓，具有降粘、溶栓的功效，可用于制備臨床治療各種因血栓而引發(fā)的病癥如冠心病、心肌梗死、脈管炎、靜脈栓塞的藥物，本發(fā)明在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為重組質(zhì)粒pPIC9k-TLE轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE電泳圖譜圖2為純化的蛇毒類凝血酶成熟蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖譜圖3為蛇毒類凝血酶成熟蛋白的降解纖維蛋白原活性的檢測結(jié)果具體實施方式
下述實施例中的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、TLE的獲得及蛇毒類凝血酶成熟蛋白表達(dá)1、TLE的獲得包括以下步驟1)從捕獲的中國北部灣海域的平頦海蛇(Lapemis curtus)和青灰海蛇(Hydrophiscaerulescens)分離出毒腺組織，提取兩種海蛇毒液的總RNA；2)分別從兩種海蛇毒液的總RNA中提取出mRNA，并以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成各自的cDNA序列；3)將合成的兩種cDNA分別與T7噬菌體載體(Novagen公司)進行連接反應(yīng)，通過體外包裝得到海蛇噬菌體展示多肽庫；4)采用ELISA方法，以纖維蛋白原(fibrinogen，sigma公司)為靶分子對步驟3)構(gòu)建的噬菌體展示肽庫進行篩選，并從中篩選出了與靶分子有特異結(jié)合力的噬菌體克隆。對篩選到的目標(biāo)噬菌體進行基因序列測定得到了該基因的cDNA序列(序列表中的序列1，來源于平頦海蛇(Lapemis curtus))，分析發(fā)現(xiàn)，該基因的核苷酸序列與Genebank中已公布的陸地蛇類凝血酶基因序列(如Gloydiushalys，Genebank號碼AY225505)具有81％相似性，它們編碼的氨基酸殘基序列有59％相似性。對獲得的基因序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，該酶蛋白序列的第1-18位氨基酸殘基序列為信號肽序列，從第34位開始是成熟蛋白；同時發(fā)現(xiàn)該酶具有典型的類凝血酶的活性位點一組氨酸活性位點(70-75)、絲氨酸活性位點(206-217)天冬氨酸活性位點(118)。根據(jù)該基因與多個已存在類凝血酶序列的高相似性及該基因各酶活性位點的確認(rèn)，得到了一蛇毒類凝血酶，該酶的cDNA序列為首次在海蛇中發(fā)現(xiàn)。
2、含有蛇毒類凝血酶成熟蛋白編碼基因序列的重組表達(dá)載體的構(gòu)建以步驟1獲得的目標(biāo)噬菌體的DNA為模板，在引物15’-CTCGAGAAAAGAATCATTGGAGGTTTTGAATG-3’(劃線部分堿基為XhoI識別位點)和引物23’-GAATTCCTAGGGGCAGATCACATTTG-5’(劃線部分堿基為EcoRI識別位點)的引導(dǎo)下進行PCR反應(yīng)，擴增蛇毒類凝血酶成熟蛋白的cDNA序列。在PCR反應(yīng)中，PCR反應(yīng)的溫度變化過程為先升溫至94℃，保持5分鐘，接著按以下的溫度變化程序循環(huán)28次升溫至94℃，保持50秒，降溫至57℃，保持1分鐘，升溫至72℃，保持1分鐘；最后于72℃保持10分鐘，結(jié)束擴增反應(yīng)。所獲得的PCR產(chǎn)物兩端具有XhoI和EcoRI限制性內(nèi)切酶識別位點，用XhoI和EcoRI限制型內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行雙酶切反應(yīng)后，用T4DNA連接酶將其與用同樣酶酶切后的質(zhì)粒載體pPIC9k(Invitrogen公司)連接，得到重組表達(dá)載體，命名為pPIC9k-TLE。對pPIC9k-TLE進行測序，證明融合連接入質(zhì)粒pPIC9k的DNA序列與序列表中的序列4相同，構(gòu)建的含有蛇毒類凝血酶成熟蛋白編碼基因序列的重組表達(dá)載體pPIC9k-TLE正確。該構(gòu)建好的重組質(zhì)粒將表達(dá)從序列表中的序列1第34位開始直至序列末端(即序列3)的蛇毒類凝血酶成熟蛋白。
3、蛇毒類凝血酶成熟蛋白的表達(dá)將重組表達(dá)載體pPIC9k-TLE用SalI限制性內(nèi)切酶酶切使之線性化后，采用電擊方式，將線性化的載體pPIC9k-TLE導(dǎo)入畢氏酵母菌GS115(Invitrogen公司)中，按Invitrogen公司操作手冊操作，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，G418 4mg/ml)培養(yǎng)，篩選His+和抗G418(4mg/ml)的高表達(dá)菌株。挑取在選擇性培養(yǎng)基上長出的單菌落接種于5ml YPD液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12-24小時后，轉(zhuǎn)入250mL BMGY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至菌液的OD600＝2-3，離心收集菌體，再用無碳源BMMY培養(yǎng)基將其稀釋至OD600＝1后加入1％甲醇進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每隔24小時補加甲醇至終濃度為1％，培養(yǎng)至96小時即可停止培養(yǎng)。離心收集上清液，取15μL上清液，用SDS-PAGE電泳進行檢測，結(jié)果如圖1所示(泳道1為Marker(116KD，66KD，45KD，35KD，25KD，18KD，14KD)，泳道2為空質(zhì)粒pPIC9k，泳道3為重組質(zhì)粒pPIC9k-TLE轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)液上清，箭頭示目的條帶)表明重組菌株在甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)的目的蛋白的分子量約為26KD，與蛇毒類凝血酶的成熟蛋白的分子量相符，得到了正確的表達(dá)產(chǎn)物。
4、蛇毒類凝血酶成熟蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化將步驟3的培養(yǎng)上清經(jīng)硫酸銨沉淀、HPCL陽離子柱(DEAD離子柱，waters公司。洗脫液pH8.0含NaCl 0-75％的0.05M的Tris-HCl緩沖液)層析和分子篩凝膠柱(Sephacryl S100，Pharmacia公司，洗脫液pH8.0的0.05M的Tris-HCl緩沖液)層析進行純化，得到高純度的蛇毒類凝血酶成熟蛋白，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖2所示(泳道1為純化的蛇毒類凝血酶成熟蛋白表達(dá)產(chǎn)物，泳道2為Marker(116KD(圖中未顯示)，66KD，45KD，35KD，25KD，18KD，14KD)，表明獲得了電泳純的蛇毒類凝血酶成熟蛋白。
實施例2、蛇毒類凝血酶成熟蛋白的酶活性檢測1、酰胺酶解活性測定在37℃，50mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中加入顯色底物(N-α-p-tosyl-Gly-Pro-Arg-p-nitronilide，Sigma公司)至濃度為2mM和實施例1獲得的蛇毒類凝血酶成熟蛋白至濃度為1mg/mL，反應(yīng)10min后，通過檢測OD405的變化來測定蛇毒類凝血酶成熟蛋白的酰胺酶解活性，實驗結(jié)果表明蛇毒類凝血酶成熟蛋白可以降解該顯色底物，具有酰胺酶解活性(1062.5酶活力U/min/mg酶)，說明該蛇毒類凝血酶成熟蛋白同其它陸地蛇的類凝血酶類似，都具有酰胺酶解活性，可以降解蛋白質(zhì)多肽中的酰胺鍵。
2、精氨酸酯酶活性測定在37℃，50mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中加入底物對甲苯磺酸-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽(TAME，Sigma公司)至濃度為1mM和實施例1獲得的蛇毒類凝血酶成熟蛋白至濃度為1mg/mL，反應(yīng)5min后，通過檢測OD247的變化來測定蛇毒類凝血酶成熟蛋白的精氨酸酯酶活性，實驗結(jié)果表明實施例1獲得的蛇毒類凝血酶成熟蛋白可以降解該顯色底物，具有精氨酸酯酶活性(1130酶活力U/min/mg酶)，說明該蛇毒類凝血酶成熟蛋白同其它陸地蛇的類凝血酶類似，都具有精氨酸酯酶活性，可以降解蛋白質(zhì)多肽中的特定的精氨酸酯鍵。
3、纖維蛋白凝結(jié)活性檢測取濃度為5mg/L的蛇毒類凝血酶成熟蛋白10μl，加入到100μl含4mg/ml纖維蛋白原的40mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，37℃進行水浴，在第0min、5min、30min和1h分別取樣，將樣品進行SDS-PAGE電泳以觀察纖維蛋白的凝結(jié)現(xiàn)象，結(jié)果如圖3所示(泳道1為水浴1h取的樣品，泳道2為水浴30min取的樣品，泳道3為水浴5min取的樣品，泳道4為水浴0min取的樣品，泳道5為Marker，表明隨著反應(yīng)時間的增加，該蛇毒類凝血酶成熟蛋白可逐漸降解纖維蛋白原的β鏈，說明該類凝血酶成熟蛋白同其它陸地蛇的類凝血酶類似，可以作為溶栓藥物先導(dǎo)化合物，用于降解由纖維蛋白原或纖維蛋白原形成的血栓塊，從而達(dá)到溶栓的效果。
序列表<160>4<210>1<211>265<212>PRT<213>平頦海蛇(Lapemis curtus)<400>1Met Pro Leu Ile Arg Val Leu Ala Ser Leu Leu Ile Leu Gln Leu Ser1 5 10 15Tyr Gly Lys Ser Leu Asp Asn Gly Ala Lys Ala Ile Thr Ser Leu Asp20 25 30Arg Ile Ile Gly Gly Phe Glu Cys Asn Pro Ser Glu His Arg Ser Leu35 40 45Val Tyr Leu Tyr Asn Ser Ala Gly Phe Phe Cys Ser Gly Thr Leu Leu50 55 60Asn His Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg Glu Asp Ile65 70 75 80Gln Ile Arg Leu Gly Val His Asn Val His Val His Tyr Glu Asp Glu85 90 95Gln Ile Arg Val Pro Lys Glu Lys Leu Cys Cys Leu Ser Thr Asn Asn100 105 110Cys Thr Gln Phe Ser Gln Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asn Ser Pro115 120 125Val Asn Tyr Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro130 135 140Pro Ser Met Gly Ser Val Cys Cys Val Met Gly Trp Gly Thr Ile Thr145 150 155 160Ser Pro Glu Val Thr Tyr Pro Glu Val Pro His Cys Val Asp Ile Asn165 170 175
Ile Leu His Ile Pro Val Cys Gln Ala Ala Tyr Pro Thr Met Ser Gly180 185 190Lys Asn Ile Leu Cys Ala Gly Ile Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys195 200 205Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Ile Gln Gly210 215 220Ile Val Ser Trp Gly Arg Phe Pro Cys Ala Gln Phe Leu Glu Pro Gly225 230 235 240Ile Tyr Thr Lys Val Phe Asp Tyr Lys Asp Trp Ile Glu Gly Ile Ile245 250 255Ala Gly Asn Ser Asn Val Ile Cys Pro260 265<210>2<211>827<212>DNA<213>平頦海蛇(Lapemis curtus)<400>2atgcctctga tcagagtgct agcaagcctt ctgatactac agctttctta cggtaagagt60ctggacaatg gagcaaaagc aataacatct cttgatcgga tcattggagg ttttgaatgt120aacccaagtg aacatcgttc ccttgtatac ttgtataact ctgcagggtt tttctgttca180gggaccttgc tcaaccatga atgggtgctc accgctgcac actgcaacag ggaagatatc240cagataaggc ttggtgtgca taacgtacat gtacactatg aggatgagca gataagggtc300ccgaaggaga agttgtgttg tctcagtacc aataactgta cccaatttag ccaagatatc360atgttgatca ggctgaacag tcctgttaac tatagtgaac acatcgcacc tcttagtttg420ccttccaacc ctcccagtat gggctcagtt tgctgtgtta tgggctgggg cacaatcaca480tctcctgaag tgacttatcc tgaagtccct cattgtgttg acattaacat actccatatt540ccggtgtgtc aagcagctta cccaacaatg tcagggaaga acatattgtg tgcaggtatc600ctggaaggag gcaaagattc atgtaagggc gattctgggg gacccctcat ctgtaatgga660caaatccagg gcattgtatc ttgggggcgc tttccttgtg cccaatttct tgaacctggc720atctacacca aggtcttcga ttataaggac tggattgagg gtattattgc aggaaattca780
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權(quán)利要求
1.一種蛇毒類凝血酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有溶栓和防止血栓形成作用的蛋白質(zhì)。
2.蛇毒類凝血酶成熟蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有溶栓和防止血栓形成作用的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1所述的蛇毒類凝血酶的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述蛇毒類凝血酶的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼具有溶栓和防止血栓形成功能的蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求2所述的蛇毒類凝血酶成熟蛋白的編碼基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述蛇毒類凝血酶成熟蛋白的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID№4的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼具有溶栓和防止血栓形成功能的蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
7.含有權(quán)利要求3或4所述的蛇毒類凝血酶編碼基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系及工程菌含有權(quán)利要求5或6所述的蛇毒類凝血酶成熟蛋白編碼基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系及工程菌。
8.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述的蛇毒類凝血酶的方法，是將含有權(quán)利要求3或4所述的蛇毒類凝血酶編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到蛇毒類凝血酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述宿主為酵母菌、大腸桿菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌；優(yōu)選為酵母菌，尤其優(yōu)選為巴氏畢赤酵母，特別優(yōu)選為巴氏畢赤酵母GS115，KM7或SMD1168；用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815或pPSC3K。
10.一種表達(dá)權(quán)利要求2所述的蛇毒類凝血酶成熟蛋白的方法，是將含有權(quán)利要求5或6所述的蛇毒類凝血酶成熟蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到蛇毒類凝血酶成熟蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述宿主為酵母菌、大腸桿菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌；優(yōu)選為酵母菌，尤其優(yōu)選為巴氏畢赤酵母，特別優(yōu)選為巴氏畢赤酵母GS115，KM7或SMD1168；用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815或pPSC3K。
12.一種具有溶栓和防止血栓形成作用的藥物，它的活性成分為權(quán)利要求1所述的蛇毒類凝血酶和/或權(quán)利要求2所述的蛇毒類凝血酶成熟蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛇毒類凝血酶及其編碼基因與應(yīng)用，其目的是提供一種蛇毒類凝血酶、蛇毒類凝血酶成熟蛋白及它們的編碼基因與以該蛇毒類凝血酶和/或蛇毒類凝血酶成熟蛋白為活性成分的具有溶栓和防止血栓形成作用的藥物。本發(fā)明所提供的蛇毒類凝血酶具有下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的序列1；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有溶栓和防止血栓形成作用的蛋白質(zhì)。該重組表達(dá)的蛇毒類凝血酶成熟蛋白具有蛇類類凝血酶所具有的酰胺酶解活性、精氨酸酯酶活性，可以特異性地降解纖維蛋白原的β鏈，還可降解纖維蛋白原引起的血栓，具有降粘、溶栓的功效。
文檔編號A61K38/48GK1763188SQ20041008405
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月19日
發(fā)明者顧軍, 陳師勇 申請人:北京大學(xué)