專利名稱:聚乙二醇修飾蛇毒凝血酶樣酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一類蛇毒凝血酶樣酶,具體地說是一類聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶。
背景技術(shù):
蛇毒凝血酶樣酶(thrombin-like enzyme,TLE)是指從蛇毒中提取的一類蛋白酶,它類同生理凝血酶能降解血漿纖維蛋白原,因此也被稱為類凝血酶。迄今已發(fā)現(xiàn)30余種蛇毒中含有凝血酶樣酶組份,并有20余種先后得到分離和純化,其中部分已作為治療藥物而廣泛應(yīng)用于臨床(賀海平,梁寧生.蛇毒類凝血酶的研究概況.蛇志,2000;1273-77.)。其中在國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的凝血酶樣酶有來自于馬來西亞紅口蝮蛇(Agkistrodon rhodostoma)蛇毒的安可洛酶(Ancrod),來自于巴西矛頭蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒的巴曲酶(Batroxobin),來自于江浙尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)和長白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halysbrevicaudus stejneger)蛇毒的降纖酶,以及來自于江浙尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)蛇毒的蘄蛇酶。國內(nèi)外多年的臨床實(shí)踐證明這些來自于蛇毒的凝血酶樣酶在去纖、抗凝、溶栓、降脂、擴(kuò)張血管和改善微循環(huán)等方面作用明顯,療效確切,但是在使用過程中也發(fā)現(xiàn)這些藥物同樣具有蛋白質(zhì)藥物所共有的特點(diǎn),如具有免疫原性,半衰期短,穩(wěn)定性差等。幾十年來已有多例蛇毒凝血酶樣酶的臨床不良反應(yīng)報(bào)告,其中最常見的不良反應(yīng)是過敏反應(yīng)。臨床上迫切需要具有低免疫原性的蛇毒凝血酶樣酶,從而改善該類藥物的藥效,降低毒性。
目前,在對蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行化學(xué)修飾的研究領(lǐng)域中,應(yīng)用最多,成功率最高的是聚乙二醇(PEG)修飾技術(shù)。在蛋白質(zhì)藥物的PEG修飾研究中大多數(shù)是將多肽分子中賴氨酸的ε氨基或N末端氨基作為修飾位點(diǎn),其它的PEG修飾基團(tuán)包括半胱氨酸的巰基、游離羧酸基團(tuán)(例如,C末端氨基酸殘基的游離羧酸基團(tuán),天冬氨酸或谷氨酸殘基的游離羧酸基團(tuán))、絲氨酸及蘇氨酸的羥基。蛋白質(zhì)藥物經(jīng)聚乙二醇化修飾后具有降低免疫原性、增加水溶性、顯著延長其在生物體內(nèi)的半衰期等優(yōu)點(diǎn),但也可能因修飾而影響其與受體的結(jié)合,因此尋找合適的修飾位點(diǎn),保持持續(xù)、有效的生物活性是多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究的主要目的,也是研究中的難點(diǎn)所在。目前大多數(shù)的觀點(diǎn)認(rèn)為,N末端氨基修飾的產(chǎn)物可以最大程度的保留原蛋白質(zhì)藥物的活性。
專利申請CN1563367公開了聚乙二醇修飾降纖酶,在該申請中僅公開了聚乙二醇對降纖酶的修飾,沒有公開對其它幾種蛇毒凝血酶樣酶如安可洛酶、巴曲酶和蘄蛇酶的聚乙二醇修飾,同時也沒有進(jìn)一步公開修飾產(chǎn)物的具體修飾位點(diǎn),只是公布了對降纖酶分子的單修飾,這種單修飾可以是降纖酶分子的N末端氨基,也可能是其中一個賴氨酸殘基的氨基,作為藥物進(jìn)行開發(fā)它具有樣品的均一性低,質(zhì)量控制較難的缺陷。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一類聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶及其制備方法,具體地講是僅N末端氨基聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶,以滿足蛇毒凝血酶樣酶在臨床應(yīng)用方面的需求。
所說的聚乙二醇修飾技術(shù)是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的,并且描述于例如Robert MJ等,先進(jìn)藥物輸送評論(Advanced Drug Delivery Reviews)(2002;54459-476)。我們采用各種帶酰胺基或亞酰胺基的聚乙二醇衍生物、各種帶醛基的聚乙二醇衍生物對蛇毒類凝血酶中的氨基進(jìn)行修飾;采用PEG-馬來酰亞胺(PEG-maleimide)、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺(PEG-iodoacetamide)、PEG-鄰-吡啶-二硫醚(PEG-ortho-pyridyl-disulphide)對蛇毒類凝血酶中半胱氨酸的巰基進(jìn)行修飾;采用各種帶酯或酰氨基的聚乙二醇衍生物對蛇毒類凝血酶中的羧基進(jìn)行修飾;采用PEG-酰肼(PEG-hydrazide)對蛇毒類凝血酶中絲氨酸或蘇氨酸的羥基進(jìn)行修飾。
令人驚喜的是,采用離子交換層析技術(shù)和凝膠過濾層析技術(shù)進(jìn)行色譜分離,我們得到了僅N末端氨基聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶。并且動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示僅N末端氨基修飾的產(chǎn)物最大程度的保留了原蛋白質(zhì)藥物的活性。
本發(fā)明的具體的技術(shù)方案如下一類聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶,其結(jié)構(gòu)通式為mPEG-Y-NH-R其中m為單甲氧基(monomethoxy)的縮寫;Y代表聚乙二醇或其衍生物在修飾后留下的殘基,是mPEG-YD與蛇毒凝血酶反應(yīng)后除聚乙二醇長鏈外的殘基,其中mPEG-YD為活化的聚乙二醇或其衍生物,可以是單甲氧基聚乙二醇、單甲氧基聚乙二醇羧酸衍生物、單甲氧基聚乙二醇酯類衍生物、單甲氧基聚乙二醇二氯三嗪衍生物、單甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇對硝基苯碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇三氯苯碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇碳酰咪唑、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇羧酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇甲醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛、單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇丙醛和單甲氧基聚乙二醇乙醛通過酸水解形成的乙縮醛水合物等等。
R為去除一個N末端氨基(NH2)的蛇毒凝血酶樣酶分子。
優(yōu)選的結(jié)構(gòu)為mPEG-O-(CH2)n-T-NH-R其中m為單甲氧基的縮寫,n=0~3;T為 或CH2;R為去除一個N末端氨基(NH2)的蛇毒凝血酶樣酶分子。
當(dāng)T為 時為一種修飾產(chǎn)物,具體為 當(dāng)T為CH2時為另一種修飾產(chǎn)物,具體為mPEG-O-(CH2)n-CH2-NH-R;具體地分別為ImPEG-O-(CH2)n-T-NH-R1其中m為單甲氧基的縮寫,n=0~3;T為 或CH2;R1代表去除一個N末端氨基的降纖酶分子。
IImPEG-O-(CH2)n-T-NH-R2其中m為單甲氧基的縮寫,n=0~3;T為 或CH2;R2代表去除一個N末端氨基的安可洛酶分子。
IIImPEG-O-(CH2)n-T-NH-R3其中m為單甲氧基的縮寫,n=0~3;
T為 或CH2;R3代表去除一個N末端氨基的巴曲酶分子。
IVmPEG-O-(CH2)n-T-NH-R4其中m為單甲氧基的縮寫,n=0~3;T為 或CH2;R4代表去除一個N末端氨基的蘄蛇酶分子。
本發(fā)明的特點(diǎn)是在蛇毒凝血酶樣酶的N末端氨基上連接聚乙二醇鏈,該聚乙二醇鏈可以是直鏈的也可以是帶支鏈的。所說的聚乙二醇鏈的分子量為2000~200000。優(yōu)選的聚乙二醇鏈的分子量為5000-30000。
所說的蛇毒凝血酶樣酶包括從蛇毒中提取或用基因工程手段制備的重組蛇毒凝血酶樣酶;具體地指降纖酶、安可洛酶、巴曲酶和蘄蛇酶這四種蛇毒凝血酶樣酶,但并不僅限于這四種蛇毒凝血酶樣酶。
本發(fā)明的聚乙二醇修飾蛇毒凝血酶樣酶的制備方法包括如下步驟在蛇毒凝血酶樣酶溶液中,加入磷酸氫二鈉溶液,調(diào)節(jié)其pH值在4.5-9.5,然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物,反應(yīng)溫度為4-40℃,反應(yīng)時間為5~120分鐘,反應(yīng)中活化的聚乙二醇或其衍生物與蛇毒凝血酶樣酶的摩爾比為0.1~100,將反應(yīng)混合液采用離子交換層析技術(shù)和凝膠過濾層析技術(shù)進(jìn)行色譜分離。離子交換層析采用陰離子交換層析,流動相為含NaCl的磷酸鹽緩沖液,即可得聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶。
制備反應(yīng)按下式進(jìn)行
mPEG-YD為活化的聚乙二醇或其衍生物,可以是單甲氧基聚乙二醇、單甲氧基聚乙二醇羧酸衍生物、單甲氧基聚乙二醇酯類衍生物、單甲氧基聚乙二醇二氯三嗪衍生物、單甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇對硝基苯碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇三氯苯碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇碳酰咪唑、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇羧酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇甲醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛、單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇丙醛單甲氧基聚乙二醇乙醛通過酸水解形成的乙縮醛水合物等等。
其中R-NH2為蛇毒凝血酶樣酶。
Y為聚乙二醇或其衍生物在修飾后留下的殘基;更具體的其中R-NH2為蛇毒凝血酶樣酶。mPEG為CH3O-(CH2CH2O)n’-CH2CH2其中m=單甲氧基的縮寫,n’=44~2200,n=0~3;D為 R代表去除一個氨基(NH2)的蛇毒凝血酶樣酶分子。
所說的活化的聚乙二醇或其衍生物是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的,如甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇甲醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛、單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛。優(yōu)選地,使用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯,也可使用單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛,這些修飾劑可采用美國Nektar Therapeutics公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。
離子交換層析采用陰離子交換層析進(jìn)行分離,所使用的陰離子交換層析介質(zhì)為本領(lǐng)域所公知的層析介質(zhì),根據(jù)其骨架的不同可分為聚苯乙烯型、纖維素型、葡聚糖型、瓊脂糖型、球狀纖維素型等,如Q Sepharose系列、DEAE Sepharose系列、DEAE Sephacel系列、QAE Sephadex系列、DEAE Sephadex系列、SOURCEQ系列等,其中最優(yōu)的使用SOURCE 30Q作為層析介質(zhì)進(jìn)行分離,陰離子層析的柱體積為6~600ml,流速為0.5~50ml/min;用起始緩沖液平衡3~8倍柱體積;上樣量為2~200ml;先用1~5倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分,再使用梯度洗脫,梯度液組成為起始緩沖液(A),起始緩沖液+NaCl緩沖液(B),優(yōu)選為起始緩沖液+1.0mol/L NaCl緩沖液,B從0~100%,洗脫20倍CV。起始緩沖液可使用乙酸-乙酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、磷酸二氫鈉-氫氧化鈉緩沖液、Tris-HCl緩沖液、巴比妥-鹽酸緩沖液、硼砂緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液等,這些緩沖液的pH可從3.0~10.0,其中最優(yōu)地使用pH為6~9的Tris-HCl緩沖液。收集各洗脫組份,用SDS-PAGE和反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行分析,合并聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶,待進(jìn)行下一步的凝膠過濾層析。
用截留分子量1000~10000Da的醋酸纖維素膜超濾濃縮,取濃縮液做凝膠過濾層析,所使用的凝膠過濾介質(zhì)為本領(lǐng)域所公知的各種層析介質(zhì),根據(jù)其骨架的不同可分為葡聚糖型、瓊脂糖型、球狀纖維素型等,如Sepharose系列、Sephacel系列Sephadex系列和Superdex系列等,其中最優(yōu)的使用Superdex75pregrade作為層析介質(zhì)進(jìn)行分離,凝膠過濾層析柱體積為25~2500ml;流速為0.1~10ml/min;PBS緩沖液平衡1~2倍柱體積;上樣量為0.2~20ml;PBS緩沖液洗脫1~2倍柱體積。收集各洗脫組份,用SDS-PAGE和RP-HPLC進(jìn)行分析,合并單聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶。
本發(fā)明聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶具有去纖、抗凝、溶栓、降脂、擴(kuò)張血管和改善微循環(huán)的藥理作用,可以用于制備高效低毒的抗凝溶栓藥物,神經(jīng)保護(hù)藥物。
本發(fā)明聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶能夠基本保持蛇毒凝血酶樣酶的生物活性,同時它比未修飾的蛇毒凝血酶樣酶有較低的免疫原性和更好的穩(wěn)定性,因此作為藥物它比未修飾的蛇毒凝血酶樣酶有更大的優(yōu)越性。特別是本發(fā)明得到的N末端氨基聚乙二醇修飾蛇毒凝血酶樣酶同文獻(xiàn)專利申請CN1563367公開的聚乙二醇修飾降纖酶相比較,其酶活性保留和降纖能力得到了提高,穩(wěn)定性增加。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶的制備方法,簡單易行。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000(mPEG-SPA-20000)對蛇毒凝血酶樣酶修飾條件的選擇反應(yīng)溫度的選擇取0.8mg/ml的降纖酶溶液2ml,加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為6.5,再加入mPEG-SPA-20000固體8.0mg,溶解,混勻,各取0.3ml置于4支帶塞試管中,然后分別置于4℃、10℃、25℃和37℃反應(yīng)30min后終止反應(yīng)。比較修飾率,確定修飾條件。結(jié)果表明在這些溫度下都能得到聚乙二醇修飾的降纖酶,其中25℃的修飾率最高。
反應(yīng)時間的選擇取0.8mg/ml的降纖酶溶液2ml,加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為6.5,再加入mPEG-SPA-20000固體8.0mg,溶解,混勻,各取0.3ml置于4支帶塞試管中,然后于25℃分別反應(yīng)5、15、30、60、120min后終止反應(yīng)。比較修飾率,確定修飾條件。結(jié)果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的降纖酶,其中30min后的修飾率沒有明顯提高。
降纖酶同mPEG-SPA-20000的摩爾比的選擇取0.8mg/ml的降纖酶溶液2ml,加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為6.5,各取0.3ml置于4支帶塞試管中,然后分別加入mPEG-SPA-20000固體0.0067、0.067、0.67、6.7mg(分別相當(dāng)于降纖酶同mPEG-SPA-20000的摩爾比在1∶0.1、1∶1、1∶10、1∶100),溶解,混勻,反應(yīng)30min后終止反應(yīng)。比較修飾率,確定修飾條件。結(jié)果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的降纖酶,當(dāng)降纖酶同mPEG-SPA-20000的摩爾比在1∶10時修飾率已達(dá)到最高,進(jìn)一步增加mPEG-SPA-20000的量修飾率也沒有明顯地增加。
反應(yīng)pH值的選擇各取0.1mg/ml的降纖酶溶液2ml,置于6支帶塞試管中,分別加2ml不同pH值的磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5,再加入mPEG-SPA-20000固體1.10mg,溶解,混勻,于25℃反應(yīng)30min后終止反應(yīng)。比較修飾率,確定修飾條件。結(jié)果表明在這些條件均能得到聚乙二醇修飾的降纖酶,其中pH值為6.5時修飾率最高。
分別用安可洛酶、巴曲酶和蘄蛇酶替換降纖酶按如上的方法進(jìn)行反應(yīng)溫度的選擇、反應(yīng)時間的選擇、蛇毒凝血酶樣酶同mPEG-SPA-20000的摩爾比的選擇和反應(yīng)pH值的選擇的試驗(yàn),結(jié)果表明,這三種酶在25℃、反應(yīng)時間為30min,pH值等于6.5,摩爾比1∶10均得到了相同的最佳修飾條件。
實(shí)施例2聚乙二醇修飾降纖酶的分離純化與鑒定取1.1mg/ml的降纖酶溶液2ml,加約5ml的磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為6.5,再加入mPEG-SPA-20000固體12.2mg,溶解,混勻,于25℃反應(yīng)30min,加入3g甘氨酸固體終止反應(yīng)。
取上述反應(yīng)液,對0.05mol/L,pH 7.8的Tris-HCl緩沖液透析,用截流分子量為10000的超濾膜濃縮至5ml,上柱分離。色譜條件如下層析介質(zhì)SOURCE 30Q柱體積5ml流速1.0ml/min柱平衡用0.05mol/L,pH 7.8的Tris-HCl(起始緩沖液)平衡5倍柱體積上樣量5ml洗脫先用3倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分,再使用梯度洗脫,梯度液組成為起始緩沖液(A),起始緩沖液+1.0mol/L NaCl緩沖液(B),B從0~100%,洗脫20倍CV收集1.0ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC進(jìn)行跟蹤分析,合并聚乙二醇修飾的降纖酶,再用截流分子量為10000的超濾膜濃縮至5ml,待做凝膠過濾層析分離。
凝膠過濾層析的色譜條件如下層析填料Superdex 75pre grade柱規(guī)格1.6×60cm流動相0.05M Na2HPO4-NaH2PO4,pH 7.0,含0.15mol/L NaCl流速0.3ml/min檢測波長215nm收集0.5ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC進(jìn)行跟蹤分析,合并單聚乙二醇修飾的降纖酶。
SDS-PAGE分析表明得到的聚乙二醇修飾的降纖酶的分子量比降纖酶的分子量大20000,在56000Da左右。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修飾的降纖酶的純度在95%以上,具有較高的純度。聚乙二醇修飾的降纖酶經(jīng)MALDI-TOF-MS分析,測得其分子量為52360.2(降纖酶的分子量為33691.0),二者分子量相差約20000,這也證實(shí)得到的聚乙二醇修飾的降纖酶為單修飾產(chǎn)物,同時在52361(M+1峰)附近有一系列峰,相鄰兩峰的分子量相差44,具有聚乙二醇的典型結(jié)構(gòu)特征。分別對降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶進(jìn)行N末端氨基酸測序分析,結(jié)果聚乙二醇修飾的降纖酶的N末端氨基酸測不出,這表明聚乙二醇修飾的位點(diǎn)是降纖酶的N末端NH2基。
實(shí)施例3聚乙二醇修飾安可洛酶的分離純化與鑒定取0.8mg/ml的安可洛酶溶液2ml,加約5ml的磷酸鹽緩沖液,使溶液的pH值為6.5,再加入mPEG-SPA-20000固體9.1mg,溶解,混勻,于25℃反應(yīng)30min,加入3g甘氨酸固體終止反應(yīng)。
取上述反應(yīng)液,對0.05mol/L,pH 8.3的Tris-HCl緩沖液透析,用截流分子量為10000的超濾膜濃縮至5ml,上柱分離。色譜條件如下層析介質(zhì)SOURCE 30Q柱體積5ml流速1.0ml/min柱平衡用0.05mol/L,pH 8.3的Tris-HCl(起始緩沖液)平衡5倍柱體積上樣量5ml洗脫先用3倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分,再使用梯度洗脫,梯度液組成為起始緩沖液(A),起始緩沖液+1.0mol/L NaCl緩沖液(B),B從0~100%,洗脫20倍CV收集1.0ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC進(jìn)行跟蹤分析,合并聚乙二醇修飾的安可洛酶,再用截流分子量為10000的超濾膜濃縮至5ml,待做凝膠過濾層析分離。
凝膠過濾層析的色譜條件如下層析填料Superdex 75pre grade柱規(guī)格1.6×60cm流動相0.05M Na2HPO4-NaH2PO4,pH7.0,含0.15mol/L NaCl流速0.3ml/min檢測波長215nm收集0.5ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC進(jìn)行跟蹤分析,合并單聚乙二醇修飾的安可洛酶。
SDS-PAGE分析表明得到的聚乙二醇修飾安可洛酶的分子量比安可洛酶的分子量大20000,在55000Da左右。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修飾的降纖酶的純度在97%以上,具有較高的純度。分別對安可洛酶和聚乙二醇修飾的安可洛酶進(jìn)行N末端氨基酸測序分析,結(jié)果聚乙二醇修飾的安可洛酶的N末端氨基酸測不出,這表明聚乙二醇修飾的位點(diǎn)是安可洛酶的N末端NH2基。
實(shí)施例4聚乙二醇修飾巴曲酶的分離純化與鑒定取0.9mg/ml的巴曲酶溶液2ml,加約5ml的磷酸鹽緩沖液,使溶液的pH值為6.5,再加入mPEG-SPA-20000固體8.6mg,溶解,混勻,于25℃反應(yīng)30min,加入3g甘氨酸固體終止反應(yīng)。
取上述反應(yīng)液,對0.05mol/L,pH 9.0的Tris-HCl緩沖液透析,用截流分子量為10000的超濾膜濃縮至5ml,上柱分離。色譜條件如下層析介質(zhì)SOURCE 30Q柱體積5ml流速1.0ml/min柱平衡用0.05mol/L,pH 9.0的Tris-HCl(起始緩沖液)平衡5倍柱體積上樣量5ml洗脫先用3倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分,再使用梯度洗脫,梯度液組成為起始緩沖液(A),起始緩沖液+0.2mol/L NaCl緩沖液(B),B從0~100%,洗脫20倍CV收集1.0ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC進(jìn)行跟蹤分析,合并聚乙二醇修飾的巴曲酶,再用截流分子量為10000的超濾膜濃縮至5ml,待做凝膠過濾層析分離。
凝膠過濾層析的色譜條件如下層析填料Superdex 75pre grade柱規(guī)格1.6×60cm流動相0.05M Na2HPO4-NaH2PO4,pH7.0,含0.15mol/L NaCl流速0.3ml/min檢測波長215nm收集0.5ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC進(jìn)行跟蹤分析,合并單聚乙二醇修飾的巴曲酶。
SDS-PAGE分析表明得到的聚乙二醇修飾巴曲酶的分子量比巴曲酶的分子量大20000,在62000Da左右。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修飾的巴曲酶的純度在96%以上,具有較高的純度。分別對巴曲酶和聚乙二醇修飾的巴曲酶進(jìn)行N末端氨基酸測序分析,結(jié)果聚乙二醇修飾的巴曲酶的N末端氨基酸測不出,這表明聚乙二醇修飾的位點(diǎn)是巴曲酶的N末端NH2基。
實(shí)施例5聚乙二醇修飾蘄蛇酶的分離純化與鑒定取1.2mg/ml的蘄蛇酶溶液2ml,加約5ml的磷酸鹽緩沖液,使溶液的pH值為6.5,再加入mPEG-SPA-20000固體17.8mg,溶解,混勻,于25℃反應(yīng)30min,加入3g甘氨酸固體終止反應(yīng)。
取上述反應(yīng)液,對0.05mol/L,pH 7.2的Tris-HCl緩沖液透析,用截流分子量為10000的超濾膜濃縮至5ml,上柱分離。色譜條件如下層析介質(zhì)SOURCE 30Q柱體積5ml流速1.0ml/min柱平衡用0.05mol/L,pH 7.2的Tris-HCl(起始緩沖液)平衡5倍柱體積上樣量5ml洗脫先用3倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分,再使用梯度洗脫,梯度液組成為起始緩沖液(A),起始緩沖液+1.0mol/L NaCl緩沖液(B),B從0~100%,洗脫20倍CV收集1.0ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC進(jìn)行跟蹤分析,合并聚乙二醇修飾的蘄蛇酶,再用截流分子量為10000的超濾膜濃縮至5ml,待做凝膠過濾層析分離。
凝膠過濾層析的色譜條件如下層析填料Superdex 75pre grade柱規(guī)格1.6×60cm
流動相0.05M Na2HPO4-NaH2PO4,pH7.0,含0.15mol/L NaCl流速0.3ml/min檢測波長215nm收集0.5ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC進(jìn)行跟蹤分析,合并單聚乙二醇修飾的蘄蛇酶。
SDS-PAGE分析表明得到的聚乙二醇修飾蘄蛇酶的分子量比蘄蛇酶的分子量大20000,在47000Da左右。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修飾的蘄蛇酶的純度在95%以上,具有較高的純度。分別對蘄蛇酶和聚乙二醇修飾的蘄蛇酶進(jìn)行N末端氨基酸測序分析,結(jié)果聚乙二醇修飾的蘄蛇酶的N末端氨基酸測不出,這表明聚乙二醇修飾的位點(diǎn)是蘄蛇酶的N末端NH2基。
實(shí)施例6修飾產(chǎn)物的生物活性(比活力)保留率的測定(方法參見國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)降纖酶)用蛇毒凝血酶樣酶標(biāo)準(zhǔn)品作為對照,測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品凝固纖維蛋白原的初凝時間,然后計(jì)算聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶的活性保留率。保留率的計(jì)算公式為 四種聚乙二醇修飾蛇毒凝血酶樣酶的生物活性的保留率見表1。從表1中可看出這些聚乙二醇修飾蛇毒凝血酶樣酶的生物活性保留在50%以上,實(shí)現(xiàn)了較高的保留。
表1四種聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶的生物活性保留率
實(shí)施例7聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶穩(wěn)定性的研究熱穩(wěn)定性取降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶(在液體狀態(tài),無任何保護(hù)劑),分別置于25℃、37℃、45℃、60℃條件下,定時取樣測定其生物活性。結(jié)果表明,降纖酶在60℃下15min內(nèi)活性不變,而聚乙二醇修飾的降纖酶在120min內(nèi)活性不變。在25℃時降纖酶5天內(nèi)活性不變,而聚乙二醇修飾的降纖酶在20天內(nèi)活性不變。因此,可以初步認(rèn)為聚乙二醇修飾的降纖酶可以明顯增加降纖酶的熱穩(wěn)定性。
酶穩(wěn)定性取0.1%胰蛋白酶溶液(pH 7.8)2.7ml,分別加入0.3ml降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶樣品,37℃水浴,于0、0.5、1、2、4h取樣0.3ml,測定樣品的生物活性。結(jié)果表明降纖酶在0.5h內(nèi)活性迅速降到原來的30%,而聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶在1.5h內(nèi)活性僅降到原來的45%。因此,聚乙二醇修飾的降纖酶能明顯增加降纖酶抵抗胰蛋白酶水解的能力。
分別用安可洛酶、巴曲酶和蘄蛇酶替換降纖酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性和酶穩(wěn)定性研究試驗(yàn),結(jié)果得到了同聚乙二醇修飾的降纖酶相似的試驗(yàn)結(jié)果,穩(wěn)定性均比修飾前提高。
實(shí)施例8聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶對實(shí)驗(yàn)動物的去纖維蛋白作用的研究對兔和大鼠兩種實(shí)驗(yàn)動物分別由靜脈注射降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶,在注藥前及注藥后1、3、6、12、24、36、48、72h靜脈采血,測量纖維蛋白原值。兩種樣品均為對兔靜脈一次給藥,劑量為1.25U/kg;對大鼠也為一次給藥,劑量為8U/kg。
兔給藥前纖維蛋白原的濃度為218±13.45mg/dl,給藥降纖酶后3h降至113±12.13mg/dl(降至原來的52.0%),給藥后12h開始回升,24h回升至正常;給藥聚乙二醇修飾的降纖酶后3h降至105±10.31mg/dl(降至原來的48.0%),給藥后24h開始回升,48h回升至正常。
大鼠給藥前纖維蛋白原的濃度為300±12.62mg/dl,給藥降纖酶后3h降至115±15.43mg/dl(降至原來的38.3%),給藥后12h開始回升,24h回升至正常;給藥聚乙二醇修飾的降纖酶后3h降至92±14.38mg/dl(降至原來的30.7%),給藥后24h開始回升,48h回升至正常。
分別用安可洛酶、巴曲酶和蘄蛇酶替換降纖酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物的去纖維蛋白作用的研究,結(jié)果得到了同聚乙二醇修飾的降纖酶相似的試驗(yàn)結(jié)果。
這些結(jié)果表明這四種聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶在體內(nèi)不但保留了蛇毒凝血酶樣酶降低纖維蛋白原濃度的生理作用,而且能延長其作用時間。因此,預(yù)期在人體內(nèi)聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶會有更好的溶栓抗凝作用和神經(jīng)保護(hù)的效果。
實(shí)施例9聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶對實(shí)驗(yàn)動物免疫原性的研究以家兔作為制備抗血清的實(shí)驗(yàn)動物,采用福氏佐劑免疫法,并分別以降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶作為抗原,劑量均為5U/kg/次,每周1次,共5次。
分別以降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶作為抗原,用雙向免疫擴(kuò)散法測定它們各自抗血清的效價,測定結(jié)果為降纖酶組抗血清的效價為1∶16;聚乙二醇修飾的降纖酶組抗血清的效價測不出。
分別以降纖酶和聚乙二醇修飾的蛇毒降纖酶作為抗原,然后用降纖酶組的抗血清作為第一抗體,再以辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG作為第二抗體,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定它們各自的免疫原性,測定結(jié)果為降纖酶組為陽性,聚乙二醇修飾的降纖酶組為陰性。
分別用安可洛酶、巴曲酶和蘄蛇酶替換降纖酶進(jìn)行對實(shí)驗(yàn)動物免疫原性的研究,結(jié)果得到了同聚乙二醇修飾的降纖酶相似的試驗(yàn)結(jié)果。
以上結(jié)果表明同蛇毒凝血酶樣酶比較,聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶的免疫原性顯著降低,這樣更有利用作為治療藥物進(jìn)行使用。
實(shí)施例10用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000(mPEG-SPA-20000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000(mPEG-SPA-30000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯60000(mPEG-SPA-60000)代替實(shí)施例1中的mPEG-SPA-20000,得到了實(shí)施例中1-6相似的結(jié)果。
實(shí)施例11用丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000(mPEG-SBA-2000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000(mPEG-SBA-10000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000(mPEG-SBA-20000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000(mPEG-SBA-30000)或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯60000(mPEG-SBA-60000)代替實(shí)施例1中的mPEG-SPA-20000,得到了實(shí)施例中1-6相似的結(jié)果。
實(shí)施例12用甲氧基聚乙二醇丙醛2000(mPEG-ALD-2000)、甲氧基聚乙二醇氧基聚乙二醇丙醛10000(mPEG-ALD-10000)、甲氧基聚乙二醇丙醛20000(mPEG-ALD-20000)、甲氧基聚乙二醇丙醛30000(mPEG-ALD-30000)或甲氧基聚乙二醇丙醛60000(mPEG-ALD-60000)代替實(shí)施例1中的mPEG-SPA-20000,同時加入0.082ml的1mol/L NaBH4,進(jìn)行反應(yīng),得到了實(shí)施例中1-6相似的結(jié)果。
實(shí)施例13用甲氧基聚乙二醇丁醛2000(mPEG-ButyrALD-2000)、甲氧基聚乙二醇聚乙二醇丁醛10000(mPEG-ButyrALD-10000)、甲氧基聚乙二醇丁醛20000(mPEG-ButyrALD-20000)、甲氧基聚乙二醇丁醛30000(mPEG-ButyrALD-30000)或甲氧基聚乙二醇丁醛60000(mPEG-ButyrALD-60000)代替實(shí)施例1中的mPEG-SPA-20000,同時加入0.082ml的1mol/LNaBH4,進(jìn)行反應(yīng),得到了實(shí)施例中1-6相似的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶,結(jié)構(gòu)通式如下mPEG-Y-NH-R其中m為單甲氧基的縮寫;Y為聚乙二醇或其衍生物在修飾后留下的殘基;R為去除一個N末端氨基的蛇毒凝血酶樣酶分子。
2.如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶,結(jié)構(gòu)通式如下mPEG-O-(CH2)n-T-NH-R其中m為單甲氧基的縮寫,n=0~3;T為 或?yàn)镃H2;R為去除一個N末端氨基的蛇毒凝血酶樣酶分子。
3.如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶,為如下結(jié)構(gòu) 其中m為單甲氧基的縮寫,n=0~3;R為去除一個N末端氨基的蛇毒凝血酶樣酶分子。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶,其中R為去除一個N末端氨基的從蛇毒中提取或用基因工程手段制備的重組蛇毒凝血酶樣酶分子。
5.如權(quán)利要求4所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶,其中R為去除一個N末端氨基的提取的蛇毒凝血酶樣酶分子。
6.如權(quán)利要求5所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶,其中R為去除一個N末端氨基的降纖酶分子、安可洛酶分子、巴曲酶分子、蘄蛇酶分子。
7.如權(quán)利要求6所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶,其中R為去除一個N末端氨基的降纖酶分子。
8.如權(quán)利要求2或3所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶,其中n為2。
9.如權(quán)利要求1、2或3所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶,其中聚乙二醇鏈的分子量為2000-200000。
10.如權(quán)利要求1、2或3所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶,其中聚乙二醇鏈的分子量為5000-30000。
11.權(quán)利要求1的聚乙二醇化蛇毒凝血酶樣酶的制備方法,包括在蛇毒凝血酶樣酶溶液中,加入磷酸氫二鈉溶液,調(diào)節(jié)其pH值在4.5-9.5,然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物,反應(yīng)溫度為4-40℃,反應(yīng)時間為5~120分鐘,反應(yīng)中活化的聚乙二醇或其衍生物與蛇毒凝血酶樣酶的摩爾比為0.1~100,將反應(yīng)混合液采用離子交換層析技術(shù)和凝膠過濾層析技術(shù)進(jìn)行色譜分離,即可得聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶。
12.如權(quán)利要求11所述的制備方法,其中反應(yīng)溫度為25℃。
13.如權(quán)利要求11所述的制備方法,其中調(diào)節(jié)pH值在6.5。
14.如權(quán)利要求11所述的制備方法,其中反應(yīng)中蛇毒凝血酶樣酶與活化的聚乙二醇或其衍生物的摩爾比為1∶10。
15.如權(quán)利要求11、12、13或14所述的制備方法,其中離子交換層析采用陰離子交換層析,流動相為含NaCl的磷酸鹽緩沖液。
16.如權(quán)利要求11、12、13或14所述的制備方法,其中凝膠過濾層析使用Superdex75pre grade作為層析介質(zhì)。
17.如權(quán)利要求11、12、13或14所述的制備方法,其中活化的聚乙二醇或其衍生物,為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛。
18.權(quán)利要求1化合物在制備去纖、抗凝、溶栓、降脂、擴(kuò)張血管和改善微循環(huán)藥方面的應(yīng)用。
19.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用為在制備抗凝溶栓藥物或神經(jīng)保護(hù)藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一類聚乙二醇修飾的蛇毒凝血酶樣酶,其結(jié)構(gòu)式為mPEG-O-(CH
文檔編號A61P7/02GK1912115SQ20051004140
公開日2007年2月14日 申請日期2005年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月11日
發(fā)明者馮軍, 武霞, 趙文杰, 高勇, 張來芳, 張喜全, 張錫昌 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司