專利名稱：多元醇干擾素β偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多元醇-IFN-β偶聯(lián)物，其中多元醇單元和Cys17共價結(jié)合。本發(fā)明的另一個目的是其位點特異性產(chǎn)生的過程以及其在細(xì)菌感染、病毒感染、自身免疫疾病和炎癥疾病中治療、預(yù)后或診斷中的用途。本發(fā)明還涉及兩個或多個PEG分子分步結(jié)合到多肽上的方法。
背景技術(shù)：
人成纖維細(xì)胞干擾素(IFN-β)具有抗病毒活性而且也能刺激針對致瘤性細(xì)胞的自然殺傷細(xì)胞。它是由病毒和雙鏈RNA誘導(dǎo)的約20,000Da的多肽。Derynk等(自然，285542-547，1980)用重組DNA技術(shù)克隆的成纖維細(xì)胞基因的核苷酸序列推出了該蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列。它長166個氨基酸。
Shepard等(自然，294536-565，1981)描述了842位的堿基突變能消除其抗病毒活性(位點141Cys→Tyr)，以及具有1119-1121核苷酸缺失的變異克隆。
Mark等(Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，81(18)5662-5666.1984)通過用(A)置換469(T)堿基，導(dǎo)致在位點17從Cys→Ser的氨基酸轉(zhuǎn)變，插入了一個人工突變。報道了得到的IFN-β與“天然”IFN-β活性相同，并且在長期儲藏(-70℃)中保持穩(wěn)定。
將親水性多聚物聚乙二醇(PEG)(也稱作聚環(huán)氧乙烷)與分子共價結(jié)合是生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)上的重要應(yīng)用。PEG在其最常見形式下是在各末端具有羥基基團(tuán)的線性多聚物HO-CH2-CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-OH該分子式能簡單的代表為HO-PEG-OH，其中指-PEG-代表沒有末端基團(tuán)的多聚物主鏈“-PEG-”指“-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-PEG通常用作甲氧基-PEG-OH，其中一個末端是相對惰性的甲氧基基團(tuán)，而另一個末端是要化學(xué)修飾的羥基基團(tuán)。
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH也常用支鏈PEG。支鏈PEG可以表示成R(-PEG-OH)m，其中R代表例如季戊二醇或丙三醇的中央核心分子，而m代表支化臂的數(shù)目。支化臂的數(shù)目(m)能從三變化到100或更多。羥基基團(tuán)要進(jìn)行化學(xué)修飾。
其它如PCT專利申請WO 96/21469所述的支鏈形式具有要進(jìn)行化學(xué)修飾的單個末端。這種PEG類型能表示成(CH3O-PEG-)pR-X，其中p等于2或3，R代表例如賴氨酸或丙三醇的中央核心，而X代表如能進(jìn)行化學(xué)活化的羧基的功能性基團(tuán)。而另一個支鏈形式，“側(cè)基PEG”具有如羧基(其主要在PEG主鏈上而不是在PEG鏈末端)的反應(yīng)性基團(tuán)。
除了PEG的這些形式，也能用在主鏈中的弱鍵或可降解鍵來制備多聚物。例如，Harris已在美國專利申請06/026,716中顯示能用多聚物主鏈中可進(jìn)行水解的酯鍵來制備PEG。該水解(反應(yīng))導(dǎo)致多聚物被切成較小分子量的片段，根據(jù)反應(yīng)流程
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語聚乙二醇或PEG指包括所有上述衍生物。
環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的共多聚物在其化學(xué)上和PEG密切相關(guān)，而且它們能用來代替PEG的許多應(yīng)用。它們具有以下通式HO-CH2CHRO(CH2CHRO)nCH2CHR-OH其中R是H或CH3。
PEG是具有高水溶性以及在許多有機溶劑中具有高溶解性的性質(zhì)的有用的多聚物。PEG無毒性也無免疫原性。當(dāng)PEG和水不溶性化合物化學(xué)結(jié)合(PEG化)時，得到的偶聯(lián)物通常是水溶性的，以及在許多有機溶劑中是可溶的。
現(xiàn)在，PEG-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物被用于蛋白質(zhì)替代治療和其它治療性用途中。例如，PEG化腺苷脫氨酶(ADAGEN_)正將用于治療重度聯(lián)合免疫缺陷病(SCIDS)，PEG化L-天冬酰胺酶(ONCAPSPAR_)正將用于治療急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL)，而PEG化干擾素-α(INTRON(R)A)正在進(jìn)行治療丙型肝炎的三期試驗。
對于具有臨床功效的PEG蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的綜述，可見N.L.Burnham，Am.J.Hosp.Pharm.，15210-218，1994。
已經(jīng)開發(fā)了得到PEG化蛋白質(zhì)的不同方法。將PEG與蛋白質(zhì)上發(fā)現(xiàn)的反應(yīng)性基團(tuán)結(jié)合通常是利用親電活化PEG衍生物完成的。將PEG與賴氨酸殘基和N末端上找到的α-和ε-氨基基團(tuán)結(jié)合，得到組成產(chǎn)物混合物的偶聯(lián)物。
通常，這些偶聯(lián)物包括每個蛋白質(zhì)分子結(jié)合的PEG分子數(shù)從0到蛋白質(zhì)中氨基基團(tuán)數(shù)變化的偶聯(lián)物。對于已經(jīng)單獨修飾的蛋白質(zhì)分子，PEG單元可以結(jié)合在許多不同的胺位點上。
非特異性PE固化的這種類型已經(jīng)產(chǎn)生了許多變得幾乎無活性的偶聯(lián)物?；钚詼p弱通常是由于如同在許多細(xì)胞因子和抗體中一樣，屏蔽了蛋白質(zhì)的活性結(jié)合功能域所致。例如，Katre等在美國專利4,766,106和美國專利4,917,888中描述了用超量許多的甲氧基-聚乙二醇基N-琥珀酰亞胺基戊二酸和甲氧基-聚乙二醇基N-琥珀酰亞胺基琥珀酸PEG化IFN-β和IL-2。兩種蛋白質(zhì)都是在微生物宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的，其允許自由半胱氨酸位點特異性突變?yōu)榻z氨酸。突變在IFN-β的微生物表達(dá)中是必需的，以促進(jìn)蛋白折疊。具體的，這些實驗中所用的IFN-β是商業(yè)產(chǎn)品Betaseron_，其中Cys17被絲氨酸替換。另外，無糖基化減弱了它在水溶液中的可溶性。非特異性PEG化導(dǎo)致可溶性提高，但主要問題是活性和產(chǎn)量的水平降低。
歐洲專利申請EP 593 868(題為PEG-干擾素結(jié)合物)，描述了PEG-IFN-α的制備。然而，PEG化反應(yīng)不是位點特異性的，并因此獲得了PEG-IFNα偶聯(lián)物位置異構(gòu)體的混合物(也見Monkarsh等，ACS.Symp.Ser.，680207-216，1997)。
Kinstler等在歐洲專利申請EP 675 201中演示了用mPEG-丙醛對巨核細(xì)胞生長和發(fā)育因子(MGDF)的N-末端殘基的選擇性修飾。這考慮到批間可重復(fù)性PEG化和藥物代謝動力學(xué)。Gilbert等在美國專利5,711,944中證明能產(chǎn)生具有最適水平活性的IFN-α的PEG化。在該例中需要費力的純化步驟來獲得最適偶聯(lián)物。
大部分細(xì)胞因子，以及其它蛋白質(zhì)沒有特異性PEG結(jié)合位點，而且除上文提到的例子以外，很可能一些通過PEG化反應(yīng)產(chǎn)生的異構(gòu)體部分或完全無活性，從而導(dǎo)致最終混合物的活性喪失。
因此位點特異性單-PEG化是這些蛋白質(zhì)偶聯(lián)物制備中的理想目標(biāo)。
Woghiren等在Bioconjugate Chem.，4(5)314-318，1993中為這樣的位點特異性PEG化合成了硫醇選擇性PEG衍生物。顯示了穩(wěn)定的硫醇保護(hù)的PEG衍生物以二硫?qū)拎し磻?yīng)基團(tuán)的形式與蛋白質(zhì)木瓜蛋白酶的自由半胱氨酸特異性偶聯(lián)。木瓜蛋白酶和PEG酯鍵新形成的二硫鍵能在溫和降解條件下被切開，以再生天然蛋白。
本文任何文件的引用并不承認(rèn)這些文件是有關(guān)現(xiàn)有技術(shù)，或是本申請任何權(quán)利要求專利性的材料。任何對任一文件的內(nèi)容和時間的陳述是基于在提交時對申請人可得的信息，不是對該陳述正確性的承認(rèn)。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中提供了多元醇-IFN-β偶聯(lián)物，具體是PEG-IFN-β偶聯(lián)物，其中多元醇單元與Cys17共價結(jié)合。通過使硫醇反應(yīng)性多元醇劑和IFN-β中的Cys17殘基反應(yīng)獲得特異性偶聯(lián)物。希望這種偶聯(lián)物在體內(nèi)顯示提高的作用。目標(biāo)是獲得在中等pH可溶性提高，穩(wěn)定性提高(減少聚集)，免疫原性減弱，以及與“天然”IFN-β比較不損失活性。這種聚合反應(yīng)的結(jié)果將減少達(dá)到所需效果的劑量，簡化和穩(wěn)定藥物組合物的配制，以及可能提高長期功效。
本發(fā)明還提供了PEG分子連續(xù)分步結(jié)合到多肽上的方法。


圖1顯示PEG-IFN-β純化前毛細(xì)管電泳(CE)圖。
圖2A-2C顯示通過分子排阻層析(Superose 12)進(jìn)行的PEG-IFN-β偶聯(lián)物純化圖2A-首次通過；圖2B-二次通過；圖2C-第三次通過。
圖3顯示來自第三次通過層析的純化PEG-IFN-β偶聯(lián)物的SDS-PAGE層析。泳道1和4是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2是“天然”IFN-β，而泳道3是PEG-IFN-β偶聯(lián)物。
圖4報道了純化的PEG-IFN-β偶聯(lián)物(其中IFN用mPEG-OPSS5kPEG化)的毛細(xì)管電泳(CE)圖。
圖5報道了純化PEG-IFN-β偶聯(lián)物的MALDI MS色譜。
圖6顯示了“天然IFN-β和PEG-IFN-β偶聯(lián)物的抗病毒活性酯鍵的比較。用指定濃度的IFN-β樣品與WISH細(xì)胞在用水泡性口炎病毒的致細(xì)胞病變的劑量攻擊前一起培養(yǎng)24小時。在另外48小時后用MTT法測定細(xì)胞病變作用。
圖7顯示了Daudi細(xì)胞中IFN-β和PEG-IFN的結(jié)合。
圖8顯示了靜脈施藥后小鼠中IFN-β和PEG-IFN的藥物代謝動力學(xué)。虛線表明各標(biāo)準(zhǔn)曲線的LOQ測定。
圖9顯示了皮下施藥后小鼠中IFN-β和PEG-IFN的藥物代謝動力學(xué)。虛線表明各標(biāo)準(zhǔn)曲線的LOQ測定。
具體實施例方式
本發(fā)明基于多元醇分子，具體是PEG分子，與人IFN-β的Cys17殘基的結(jié)合出乎意料的比天然人干擾素-β提高了(或至少保持了并不導(dǎo)致減弱了)IFN-β生物學(xué)活性的發(fā)現(xiàn)。因此，具有多元醇分子與Cys17殘基結(jié)合的IFN-β不僅展示了相同或提高的IFN-β活性，而且該多元醇-IFN-β偶聯(lián)物也提供了多元醇分子授予的理想性質(zhì)，例如提高的可溶性。
“IFN-β”，如本文所用，指如從生物液分離獲得的，或用DNA重組技術(shù)從原核或真核宿主細(xì)胞獲得的人成纖維細(xì)胞干擾素，以及其鹽、功能性衍生物、前體和活性片段，規(guī)定其含有在天然存在形式的位點17出現(xiàn)的半胱氨酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明，多元醇-IFN-β偶聯(lián)物中的多元醇分子可能是任何具有線性或支鏈的水溶性單-或雙功能性聚(環(huán)氧烷基)。通常，多元醇是聚(乙二醇)(PEG)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到也能合適的使用其它多元醇，例如聚(丙三醇)和聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
如本文所用的術(shù)語“PEG分子”指包括但不限于，線性或分支PEG，甲氧基PEG，可水解或酶解PEG，側(cè)基(pendant)PEG，樹枝聚物(dendrimer)PEG，PEG和一或多個多元醇的共聚物，以及PEG和PLGA(聚(乳酸/乙醇酸))共聚物。
本文使用的定義“鹽”同時指羧基基團(tuán)的鹽和可用已知方法獲得的化合物氨基官能團(tuán)的鹽。羧基的鹽包含無機鹽，如鈉、鉀、鈣鹽和例如用胺如三羥乙基胺、精氨酸或賴氨酸形成的有機堿的鹽。氨基的鹽包含與無機酸，如鹽酸的鹽，和與有機酸，例如乙酸的鹽。
本文所用的定義“功能性衍生物”指能從存在于氨基酸分子側(cè)鏈或末端N-C-基團(tuán)的官能團(tuán)根據(jù)已知方法制備的，并當(dāng)其是藥物學(xué)可接受時，亦即，當(dāng)其不毀壞蛋白質(zhì)活性或不授予含有它們的藥物組合物毒性時包括在本發(fā)明中的衍生物。這種衍生物包含羧基的酯或脂肪酸，和自由氨基的N-?；苌铮蜃杂闪u基的O-?；苌?，并通過酰基如鏈?；?或芳酰基-基團(tuán)形成。
“前體”是在人或動物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為IFN-β的化合物。
對于蛋白質(zhì)的“活性片段”，本發(fā)明指當(dāng)這種片段或前體顯示和藥物相同的IFN-β活性時，單獨或和與其結(jié)合的相關(guān)分子或殘基，例如蔗糖或磷酸殘基，或多肽分子的聚合物聯(lián)合的化合物本身多肽鏈的任何片段或前體。
本發(fā)明的偶聯(lián)物能用任何本領(lǐng)域已知的方法制備。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，將IFN-β和PEG化劑在合適溶劑中反應(yīng)，分離并純化所要的偶聯(lián)物，例如，通過進(jìn)行一或多次層析方法。
“層析方法”指任何用它們與溶劑(流動相)流過的載體(固定相)連接來分離混合物組分的方法。層析的分離原理是根據(jù)固定相和流動相的不同物理性質(zhì)。
一些層析方法文獻(xiàn)中熟知的具體類型包含液相，高效液相，離子交換，吸收，親和，分離，疏水，反相，凝膠過濾，超濾或薄層層析。
如本申請所用的“硫醇反應(yīng)性PEG化劑”指任何能與半胱氨酸殘基的硫醇基團(tuán)反應(yīng)的PEG衍生物。它可能是，含有例如二硫?qū)拎?、乙烯砜、馬來酰亞胺、碘乙酰胺及其它官能團(tuán)的PEG。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選例，硫醇反應(yīng)性PEG化劑是PEG的二硫吡啶(OPSS)衍生物。
以其單-甲氧基化形式使用PEG化劑，其中僅一個末端能被偶聯(lián)，或以雙功能形式使用，其中兩個末端都能偶聯(lián)，例如以兩個IFN-β與一個PEG分子共價連接形成偶聯(lián)物。分子量優(yōu)選在500和100,000之間。
本發(fā)明偶聯(lián)物制備的典型反應(yīng)流程如下 上述流程的第二行報道了一種切開PEG-蛋白鍵的方法。mPEG-OPSS衍生物對于自由巰基高選擇性，并且在IFN-β穩(wěn)定的酸性pH條件下迅速反應(yīng)。能從與IFN-β和PEG的天然形式偶聯(lián)的減少證明高選擇性。
已顯示蛋白質(zhì)和PEG分子之間產(chǎn)生的二硫鍵在循環(huán)中是穩(wěn)定的，但它在進(jìn)入細(xì)胞環(huán)境后會被還原。因此希望該偶聯(lián)物不進(jìn)入細(xì)胞，在循環(huán)中都保持穩(wěn)定，直到被清除。
需要注意的是，上述反應(yīng)是位點特異性的，因為在人IFN-β天然存在形式中的位點31和141處的其它兩個Cys殘基由于形成二硫橋，不和硫醇反應(yīng)性PEG化劑反應(yīng)。
本發(fā)明還指出了兩個或多個PEG分子連續(xù)分步結(jié)合到多肽的方法。該方法是根據(jù)低分子量的活化PEG比高分子量的活化PEG能更完整的和蛋白質(zhì)上的空間位阻反應(yīng)位點反應(yīng)的認(rèn)識。昂貴的治療用蛋白質(zhì)的PEG修飾為了使PEG偶聯(lián)物能實踐生產(chǎn)，必須是花費有效的。另外，為了減少腎小球濾過和優(yōu)化PEG-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的藥理學(xué)性質(zhì)，偶聯(lián)物必須具有和分子量為70kDa的蛋白質(zhì)相當(dāng)?shù)挠行С叽?。這意味著對于將結(jié)合一個PEG的位點特異性修飾，優(yōu)選結(jié)合一個具有20kDa以上分子量的PEG衍生物。如果修飾位點是空間擁擠的，大PEG分子上的反應(yīng)基團(tuán)可能難于達(dá)到修飾位點從而因此將導(dǎo)致低產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明PEG化多肽的優(yōu)選方法通過首先結(jié)合由于其相對較小的尺寸能和空間擁擠的位點反應(yīng)的小異雙功能或同雙功能性PEG分子來提高位點特異性PEG化的產(chǎn)量。大分子量PEG衍生物隨后和該小PEG的結(jié)合得到高產(chǎn)量的所要的PEG化蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，兩個或多個PEG分子連續(xù)分步與多肽結(jié)合的方法包含首先將低分子量異雙功能性或同雙功能性PEG分子與多肽結(jié)合，然后將單功能性或雙功能性PEG分子和結(jié)合于多肽的低分子量PEG分子末端結(jié)合。在兩個或多個PEG分子連續(xù)分步與多肽結(jié)合(其中多肽優(yōu)選是IFN-β，而且其中位于空間擁擠位點的Cys17是PEG結(jié)合的優(yōu)選位點)后，能用一或多種純化技術(shù)例如離子交換層析、分子排阻層析、疏水反應(yīng)層析、親和層析和反相層析來純化PEG-多肽偶聯(lián)物。
低分子量PEG分子具有分子式W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X，其中W和X是分別和胺、巰基、羧基或羥基官能團(tuán)反應(yīng)，來將低分子量PEG分子和多肽結(jié)合的基團(tuán)。W和X優(yōu)選分別選自二硫?qū)拎?、馬來酰亞胺、乙烯砜、碘乙酰胺、胺、硫醇、羧基、活性酯、苯并三唑碳酸、p-硝基苯碳酸、異氰酸鹽和生物素。低分子量PEG分子優(yōu)選具有范圍在大約100到5,000道爾頓的分子量。
用來與結(jié)合于多肽的低分子量PEG自由末端結(jié)合的單功能性或雙功能性PEG分子優(yōu)選具有范圍大約100道爾頓到200kDa的分子量，而且優(yōu)選是甲氧基PEG，分支PEG，可水解或酶解PEG，側(cè)基PEG，或樹枝聚物PEG。但功能性或雙功能性PEG還具有分子式Y(jié)-CH2CH2O(CH2CH2O)MCH2CH2-Z，其中Y和結(jié)合于多肽上的低分子量PEG分子的自由末端基團(tuán)反應(yīng)，而Z是-OCH3或一個與其反應(yīng)來形成雙功能性偶聯(lián)物的基團(tuán)。
為了兩個或多個PEG分子連續(xù)分步與多肽結(jié)合的方法產(chǎn)生的PEG-多肽偶聯(lián)物能用來產(chǎn)生用于治療疾病或失常的醫(yī)學(xué)或藥物組合物，其中多肽作為活性成分是有效的。
本發(fā)明的另一個目的是提供充分純化形式的偶聯(lián)物，來使它們適合用作藥物組合物，細(xì)菌和病毒感染以及自身免疫、炎癥疾病和腫瘤的治療、診斷或預(yù)后的活性成分。這種藥物組合物代表了本發(fā)明的另一個目的。
上述疾病的非限制性例子包含感染性休克、AIDS、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化癥。
本發(fā)明的其它實施例和優(yōu)點將在下列描述中被證明。
本發(fā)明的一個實施例是將本發(fā)明偶聯(lián)物的藥理活性量施用給受到上面報道的疾病之一發(fā)生的威脅的人或已經(jīng)顯示這種病理狀態(tài)的人。
能使用任何與活性要素兼容的施藥途徑。腸道外施藥，例如皮下、肌肉內(nèi)或靜脈注射都是優(yōu)選的。要施用的活性成分劑量由參照病人年齡、體重和個人反應(yīng)的醫(yī)學(xué)處方的基礎(chǔ)而定。
對于75公斤平均體重，劑量可能是每日10微克和1毫克之間，而優(yōu)選的每日劑量是20微克和200微克之間。
能夠用含有活性要素和合適載體的可注射形式制備胃腸外施藥的藥物組合物。用于胃腸外施藥的載體是本領(lǐng)域熟知的，并且包含例如水、鹽溶液、Ringer溶液和/或葡萄糖。載體能含有小量賦形劑來保持藥物學(xué)制備物的穩(wěn)定性和等滲性。溶液制備能參照常規(guī)形式進(jìn)行。
本發(fā)明已經(jīng)根據(jù)具體實施例描述，但描述內(nèi)容包括所有本領(lǐng)域技術(shù)人員可提出的變體和替換物，不超過權(quán)利要求的意圖和目的。
現(xiàn)在本發(fā)明將通過下列實施例來詳述，它們不意圖以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1PEG-IFN-β偶聯(lián)物的制備IFN-β用mPEG5k-OPSS的修飾將在50mM醋酸鈉緩沖液濃度為0.37mg/ml，pH3.6中是穩(wěn)定的重組人IFN-β用于PEG-IFN-β的制備。將大約1.0ml的6M尿素以濃度為0.37mg/ml(0.74mg，3.7×1-8摩爾)加到2毫升IFN-β中。以50M對1M IFN-β摩爾剩余量加入mPEG5K-OPSS，兩者在聚丙烯瓶中37℃反應(yīng)2小時或50℃反應(yīng)1小時。在任何純化步驟之前，用毛細(xì)管電泳(CE)圖分析反應(yīng)混合物來測定通過PEG化反應(yīng)PEG-IFN-β偶聯(lián)物形成的程度(圖1)。該反應(yīng)的通常產(chǎn)量為50％PEG-IFN-β。將反應(yīng)產(chǎn)物從反應(yīng)混合物中用0.22mm針筒式濾器過濾出來，然后將濾出液加到分子排阻層析柱(Superose 12或Suoerdex 75，Pharmacia)上，用50mM磷酸鈉，150mMNaCl，pH7.5緩沖液洗脫。圖2A顯示了PEG-IFN-β偶聯(lián)物在Superose 12分子排阻層析柱上純化的洗脫圖譜。收集峰并用SDS-PAGE分析(圖3)。由于“天然”IFN-β峰靠得很近(圖2B)，將含有PEG-IFN-β偶聯(lián)物的組分合并在一起，然后將濃縮液重新加到同一分子排阻層析柱上，來再次純化PEG-IFN-β偶聯(lián)物。再次重復(fù)該程序(第三次通過)來確保純度(圖2C)。圖4和圖5分別顯示了純化PEG-IFN-β偶聯(lián)物的毛細(xì)管電泳圖和MALDI MS色譜。
IFN-β用mPEG30K-OPSS的修飾提供了以0.36mg/ml溶于50mM醋酸鈉緩沖液，pH3.6中是穩(wěn)定的重組人IFN-β。將溶于3ml去離子H2O的約36毫克mPEG30K-OPSS加到濃度為0.36mg/ml(1.08mg，4.9×10-8摩爾)的3毫升IFN-β中。使兩者在聚丙烯試管中50℃反應(yīng)2小時。用毛細(xì)管電泳分析反應(yīng)混合物的修飾程度。該反應(yīng)的通常產(chǎn)量低于30％。然后將溶液加到分子排阻層析柱(Superose12，Pharmacia)上，用50mM磷酸鈉，150mMNaCl，pH7.0緩沖液洗脫。收集峰并用SDS-PAGE分析其內(nèi)容。
實施例2PEG-IFN-β偶聯(lián)物的生物學(xué)活性為了評價PEG化對人重組IFN-β抗病毒活性的作用，將人WISH羊膜細(xì)胞和新制備IFN-β(用于PEG化的同一批)或PEG-IFN-β偶聯(lián)物一起預(yù)培養(yǎng)。根據(jù)基于Novick等，免疫學(xué)雜志，1292244-2247(1982)的方案開發(fā)的抗病毒W(wǎng)ISH生物試驗，如同用WISH-VSV細(xì)胞病變試驗測試的那樣來測定IFN-β介導(dǎo)的抗病毒活性。該WISH試驗中使用的材料如下WISH細(xì)胞(ATCC CCL 25)水泡性口角炎病毒原種(ATCC V-520-001-522)，貯藏在-70℃IFN-β，人重組，InterPharm Laboratories LTD(32,075-種，Batch#205035)，82×106IU/ml，比活性222×106IU/mg如實施例1制備的PEG-IFN-β偶聯(lián)物，保存在PBS，pH7.4WISH生長培養(yǎng)基(MEM高葡萄糖和Earls鹽+10％FBS+1。0％L-谷氨酰胺+青霉素/鏈霉素(100U/ml，100微克/ml))WISH試驗培養(yǎng)基(MEM高葡萄糖和Earls鹽+5％FBS+1.0％L-谷氨酰胺+青霉素/鏈霉素(100U/ml，100微克/ml))PBS中的5mg/mlMTT，儲藏在-70℃。
WISH試驗的方案如下將IFN-β樣品稀釋到2XWISH試驗培養(yǎng)基中的起始濃度。
將3倍稀釋度的WISH測定培養(yǎng)基中的IFN-β樣品置于平底96孔板中，從而使各孔含有50微升稀釋的IFN-β樣品(一些對照孔只加入了50微升WISH試驗培養(yǎng)基)用胰蛋白酶/EDTA溶液收集對數(shù)生長期的WISH細(xì)胞，用WISH試驗培養(yǎng)液洗滌，并得到最終濃度為0.8×106細(xì)胞/ml。
將50微升WISH細(xì)胞懸液(4×104細(xì)胞/孔)加到各孔中。接觸細(xì)胞的IFN-β最終濃度是1X。
在5％CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，將50微升1∶10稀釋(于WISH試驗培養(yǎng)液)的VSV原種(預(yù)定在48小時中裂解100％WISH細(xì)胞的劑量)加到除了無病毒對照孔(這些只加入等體積的試驗培養(yǎng)液)之外的所有孔中。
經(jīng)過另外48小時后，將25微升MTT溶液加到所有的孔中，然后將板在培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)2小時。
通過倒置板除去孔的內(nèi)容物，將200微升100％乙醇加到孔中。
1小時后，用Soft max Pro軟件包和Spectramax分光光度計系統(tǒng)(MolecularDevices)在595nm處對板讀數(shù)。
表1.PEG化和模擬-PEG化IFN-β樣品的抗病毒活性

*用氨基酸分析測定的樣品中IFN-β的原種濃度**用軟件程序Microcal Origin 4.1測定的EC50(+/-S.D.)如上文圖6和表1所示，PEG-IFN-β偶聯(lián)物維持了高于新制備的IFN-β母本批的抗病毒活性水平。
觀察到PEG-IFN-β偶聯(lián)物具有比新制備IFN-β大約高4倍的生物活性，這也可能是與“天然”IFN-β比較，在加入WISH細(xì)胞試驗培養(yǎng)基后PEG-IFN-β偶聯(lián)物穩(wěn)定性較高的結(jié)果。
實施例3PEG-IFN樣品相對活性的體外試驗用實施例2(表2)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方案通過WISH試驗測定了PEG[30kD]-IFN-β和PEG[2×20kD]-IFN-β的相對生物活性。通過三個不同的人在不同時間進(jìn)行了三次獨立試驗。
表2.PEG-IFN-β的相對抗病毒活性

*EC50劑量和各試驗中包含的標(biāo)準(zhǔn)IFN-β進(jìn)行比較**比較基于330微克/mlIFN-β濃度。用AAA測定PEG[30kD]-IFN-β(5.41微克/ml)和PEG[2×20kD]-IFN-β(6.86微克/ml)的原種濃度。
在固定量125I-IFN-α2a的存在下評估了PEG-IFN-β和細(xì)胞上其受體的結(jié)合。用氯胺T方法使用125I放射性標(biāo)記IFN-α2a。使反應(yīng)物通過Sephadex G25柱并合并含有組分的蛋白(Pharmacia)來從125I結(jié)合的IFNα2a中除去自由碘。用IFN-α2a ELISA試驗(Biosource，USA)定量125I-IFN-α2a并測定比活性。收集對數(shù)期的Daudi細(xì)胞，在不同濃度的稀釋于含有2％胎牛血清和0.1％疊氮化鈉的RPMI1640測定緩沖液中的PEG-IFN-β或IFN-α2a存在下，將2×106細(xì)胞和0.5nM125I-IFN-α2a在室溫下培養(yǎng)3小時。在培養(yǎng)終點，將細(xì)胞離心通過一層鄰苯二甲酸鹽油，并用γ計數(shù)器來對細(xì)胞結(jié)合放射性進(jìn)行計數(shù)。另外，PEG[30kD]-IFN-β和PEG[2×20kD]-IFN-β和受體的結(jié)合與如圖7所示的結(jié)合活性非常相似或接近。
另外，在Daudi細(xì)胞(人B細(xì)胞淋巴瘤)抗增殖試驗中測定了相對活性(表3)。以200ng/ml的2X濃度制備了所有IFN。將樣品延著板長度3倍稀釋到最終體積為100微升。將1×105細(xì)胞/孔(100微升)加到各孔中，并在CO2加濕培養(yǎng)箱中37℃共培養(yǎng)72小時。48小時后，以20微升中1μCi/孔加入含氚(3H)胸苷。在72小時培養(yǎng)的終點，用Tomtek Plate Harvester收集板。顯示于表3的結(jié)果表明從PEG化未觀察到可檢測的IFN損失。實際上，發(fā)現(xiàn)活性比自由IFN-β稍微高一些。這可能是由于自由IFN中無活性聚集物的形成或由于定量方法之間的差異(對于PEG-IFN樣品的氨基酸分析和對于IFN-β的RP-HPLC)。
表3.Daudi抗增殖試驗

*pg/ml實施例4小鼠靜脈施藥的藥物動力學(xué)研究用100納克IFN-β，PEG[30kD]-IFN-β或PEG[2×20kD]-IFN-β注射小鼠，之后在指定時間采血。用IFN-β特異性ELIAS(Toray Industries)測定IFN-β的血清濃度，結(jié)果顯示于圖8。將28只雌性B6D2F1株小鼠(6-8周)(大約各重20克)分成如下4組組1含有9只用200微升500ng/ml人IFN-β(最終劑量為100ng/鼠)彈丸注射的小鼠；組2(9鼠)接受了200微升等量的PEG30kD-IFN-β；而組3接受了200微升等量的PEG(2×20kD)-IFN-β；而組4是3只作為陰性對照的未注射小鼠組。于9個指定時間通過用毛細(xì)管眼眶靜脈叢來收集血樣(大約200微升/樣品)。使血樣在室溫下凝結(jié)1小時，并微量離心。將血清儲藏在-70℃直到收集所有血清。用Toray試驗測定血清中生物活性的人IFN-β的存在。結(jié)果表明曲線下區(qū)域(AUC)在PEG-IFN樣品中比自由IFN-β顯著增加，而PEG[2×20kD]-IFN-β比PEG[30kD]-IFN-β更高。
皮下施藥用IFN-β和PEG-IFN(100ng/鼠)皮下注射小鼠。圖9顯示與自由IFN-β比較，PEG-IFN樣品總曲線下面積(AUC)顯著增加。藥物代謝動力學(xué)研究與具有較長半衰期及增加曲線下面積的PEG-IFN樣品一致。
實施例5低分子量PEG分子和多肽的結(jié)合IFN-β和OPSS-PEG2K-酰肼連接 重組人IFN-β以0.33mg/ml溶于50mM醋酸鈉緩沖液，pH3.8的溶液。將大約3.6mg(比蛋白質(zhì)摩爾多40摩爾)異雙功能PEG試劑，OPSS-PEG2K-酰肼(溶于2ml去離子水)加到3毫升0.33mg/ml(0.99mg)的IFN-β中，使二者在聚丙烯試管中45℃反應(yīng)1小時。然后用毛細(xì)管電泳分析反應(yīng)混合物，來測定修飾程度。通常產(chǎn)量由IFN-β和PEG試劑的純度而定，從90-97％變化。然后將溶液加到分子排阻層析柱(Superdex 75，Pharmacia)上，用5mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.0緩沖液洗脫。收集峰，用SDS-PAGE分析。將單PEG化IFN-β組分合并在一起，然后在用高分子量PEG進(jìn)一步修飾步驟中使用。
IFN-β和(OPSS)2-PEG3400連接 重組人IFN-β以0.33mg/ml溶于50mM醋酸鈉緩沖液，pH3.8的溶液。將大約6.1mg(比蛋白質(zhì)摩爾多40摩爾)同雙功能PEG試劑，(OPSS)2-PEG3400(溶于2ml去離子水)加到3毫升0.33mg/ml(0.99mg)的IFN-β中，使二者在聚丙烯試管中50℃反應(yīng)2小時。用無降解SDS-PAGE監(jiān)測反應(yīng)，用毛細(xì)管電泳分析最終反應(yīng)混合物，來測定修飾程度。和IFN-β的該反應(yīng)典型修飾量大于95％。然后將溶液加到分子排阻層析柱(Superdex 75，Pharmacia)上，用5mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.0緩沖液洗脫。收集峰，用SDS-PAGE分析其內(nèi)容物。單PEG化IFN-β組分被合并在一起。
實施例6第二個PEG分子和低分子量PEG化多肽的結(jié)合用mPEG30k-乙醛(ALD)對IFN-S-S-PEG2k-酰肼的修飾 將比蛋白質(zhì)多20摩爾的mPEG30k-ALD加到實施例5中的IFN-S-S-PEG2k-酰肼合并組分中。使反應(yīng)在室溫(25℃)下進(jìn)行4小時，將樣品加到分子排阻層析柱(Superose 6，Pharmacia)上來測定修飾量。本反應(yīng)的修飾量由PEG試劑和反應(yīng)條件而定，通常大于80％。
現(xiàn)在已完整描述了本發(fā)明，可以理解本領(lǐng)域技術(shù)人員在相當(dāng)?shù)膮?shù)、濃度和條件的廣闊范圍內(nèi)，不違背本發(fā)明的精神和范圍，不進(jìn)行不適當(dāng)?shù)膶嶒?，能進(jìn)行同樣的(實踐)。
由于本發(fā)明已經(jīng)與其特定實施例一起被描述，可以理解的是還能進(jìn)行其它修飾。本申請將要覆蓋任何本發(fā)明的變體、用途、或改變，它們是根據(jù)本發(fā)明的一般原理，并包含對本公開的違背(例如將其作為本發(fā)明涉及領(lǐng)域的已知或通常實踐，和例如應(yīng)用本文上文列出的如在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)的基本特征)。
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權(quán)利要求
1.一種分步連續(xù)將聚乙二醇和多肽結(jié)合的方法，其特征在于，該方法包括步驟將多肽和低分子量異雙功能性或同雙功能性聚乙二醇分子反應(yīng)，所述聚乙二醇分子具有下列分子式W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X其中W和X是分別和胺、巰基、羧基或羥基官能團(tuán)反應(yīng)，使低分子量聚乙二醇分子和多肽結(jié)合的基團(tuán)，所述聚乙二醇分子量在100-5000道爾頓之間；以及將結(jié)合在多肽上的低分子量聚乙二醇分子和單功能性或雙功能性聚乙二醇分子反應(yīng)，所述聚乙二醇分子量在100-200kD之間，使單功能性或雙功能性聚乙二醇分子與低分子量聚乙二醇分子的自由末端結(jié)合，形成聚乙二醇-多肽偶聯(lián)物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，單功能性或雙功能性聚乙二醇分子具有下列分子式Y(jié)-CH2CH2O(CH2CH2O)mCH2CH2-Z，其中Y和結(jié)合于多肽上的低分子量聚乙二醇分子的自由末端基團(tuán)反應(yīng)，而Z是-OCH3或一個與X反應(yīng)來形成雙功能性偶聯(lián)物的基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述單功能性或雙功能性聚乙二醇分子是甲氧基聚乙二醇，分支聚乙二醇，可水解或酶解聚乙二醇，側(cè)基聚乙二醇，或樹枝聚物聚乙二醇。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，W和X分別選自二硫?qū)拎?、馬來酰亞胺、乙烯砜、碘乙酰胺、酰肼、乙醛、琥珀酰酯、環(huán)氧化物、胺、硫醇、羧基、活性酯、苯并三唑碳酸、p-硝基苯碳酸、異氰酸鹽和生物素。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述低分子量聚乙二醇分子和/或單功能性或雙功能性聚乙二醇分子是聚乙二醇的共聚物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇的共聚物選自聚乙二醇/聚丙二醇共聚物和聚乙二醇/聚(乳酸/乙醇酸)共聚物。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括在兩個聚乙二醇分子分步連續(xù)結(jié)合到多肽上后，純化聚乙二醇-多肽偶聯(lián)物的步驟。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述純化步驟還包括一或多種純化技術(shù)，選自離子交換層析、分子排阻層析、疏水反應(yīng)層析、親和層析和反相層析。
9.如權(quán)利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述多肽是干擾素-β。
10.權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的聚乙二醇-多肽偶聯(lián)物的用途，其特征在于，該聚乙二醇-多肽偶聯(lián)物用于制備藥物。
全文摘要
用硫醇反應(yīng)PEG化劑通過位點特異性PEG化過程產(chǎn)生了PEG－IFN－β偶聯(lián)物(其中一個PEG分子和人IFN－β的Cys
文檔編號A61K47/48GK1637020SQ20041008984
公開日2005年7月13日 申請日期1999年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月28日
發(fā)明者N·埃爾塔亞, M·J·羅伯茨, M·哈里斯, W·索利維切 申請人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司