專利名稱：CB與特異性免疫球蛋白IgG的偶聯(lián)物及其醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及霍亂原B亞基作為配基/載體與生物活性多肽、免疫球蛋白或免疫活性原的偶聯(lián)物，及其醫(yī)藥用途和制備方法，以及含有其的組合物。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的藥物學(xué)投藥系統(tǒng)基本上都是‘經(jīng)血途徑’(Blood routeddelivery system)無論是從歷史上最初口服的‘經(jīng)胃腸血循’，還是到近代和當(dāng)代的各種注射(i.m，i.v，等)‘經(jīng)肌肉內(nèi)微血管入血循或直接注入血管’。傳統(tǒng)研究對(duì)不能透過血腦屏障(BBB)的藥物制劑，也都是專注于‘經(jīng)血途徑’，著眼于BBB本身，設(shè)法改變制劑，使之易于透過腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的BBB。如改變制劑使之更有脂溶性、改變制劑的若干分子結(jié)構(gòu)或偶聯(lián)上能進(jìn)入腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的物質(zhì)使之能蒙混過BBB(Science 2002，2971116-1118)。
藥物入腦的途徑是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)藥物設(shè)計(jì)的源頭問題。近代醫(yī)藥學(xué)史記載血腦屏障BBB是德國醫(yī)學(xué)家Paul Ehrlich在十九世紀(jì)七十年代發(fā)現(xiàn)的(他在細(xì)菌免疫學(xué)上的貢獻(xiàn)曾獲1908年諾貝爾醫(yī)學(xué)及生理學(xué)獎(jiǎng))；他的學(xué)生Edwin Goldmann隨之發(fā)現(xiàn)腦實(shí)質(zhì)與腦脊液CSF密切相通，從而建立了經(jīng)CSF進(jìn)入腦脊髓實(shí)質(zhì)的腦室注射及腰穿等侵害性的投藥途徑。百余年來，中樞神經(jīng)的醫(yī)藥學(xué)全是追隨著Ehrlich和Goldmann開辟的源頭，把藥物經(jīng)過血循，生方設(shè)法使之穿過BBB或作侵害性的腦室注射、腰椎穿刺等[近年還有腦內(nèi)移植細(xì)胞的手術(shù)，其對(duì)病人的外科手術(shù)侵害性、只能作一次植入、且轉(zhuǎn)基因細(xì)胞常只釋放一種營養(yǎng)因子、并不能保證長期持續(xù)釋放，這都使之難予推廣]。本專利發(fā)明首次在醫(yī)藥學(xué)史上開辟了大分子制劑入腦的”神經(jīng)受體介導(dǎo)入胞投藥系統(tǒng)”RME-D神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)投藥的新途徑，從源頭上設(shè)計(jì)了一系列經(jīng)過神經(jīng)進(jìn)入腦脊髓的新藥，是一項(xiàng)源頭創(chuàng)新的重大發(fā)明。
2002年八月美國Science(2971116-1118，2002)的‘焦點(diǎn)新聞’綜合報(bào)導(dǎo)了試圖突破BBB的當(dāng)代情況走在前面的UCLA的Pardridge等人也仍還在此老路上徘徊、摸索。近年，Pardridge利用腦血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)受體或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporter)的抗體偶聯(lián)BDNF(腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子)，從而把BDNF偷渡過BBB，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上治療實(shí)驗(yàn)性腦缺血等，其臨床目標(biāo)是中風(fēng)[Science的報(bào)導(dǎo)形象地把這方法比作是‘愚弄’了內(nèi)皮細(xì)胞的特洛伊木馬計(jì)，也說明其偷渡的性質(zhì)]。此技術(shù)的缺點(diǎn)一是，系統(tǒng)經(jīng)血給藥沒有靶向性，它使全腦脊髓均介入，多功能的神經(jīng)營養(yǎng)因子在這種情況下很可能發(fā)生副作用(如有人報(bào)道BDNF可能誘發(fā)癲癇)；二是，針對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抗體會(huì)阻滯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的正常功能，從而可能影響腦功能。這都是Pardridge要在臨床試用的障礙。2002年Science的這次報(bào)導(dǎo)預(yù)示著大分子CNS藥物即將走上臨床應(yīng)用的藥物市場(chǎng)，與及偶聯(lián)結(jié)合是這一發(fā)展的技術(shù)趨勢(shì)。
現(xiàn)行的對(duì)神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT)的投藥方式有三種使之越過血腦屏障(BBB)的方法，一是腦室內(nèi)注射，二是椎管內(nèi)蛛膜下腔注射，三是把分泌NT的細(xì)胞或組織行腦內(nèi)移植(或蛛膜下腔移植)手術(shù)。三種都有較大的手術(shù)創(chuàng)傷，不能作長期的或多次反復(fù)的使用。而本發(fā)明使用普通的肌肉注射或滴鼻，安全、無創(chuàng)傷，可作常規(guī)多次反復(fù)使用。肌注部位視治療目的所需的靶向，而選擇相應(yīng)的神經(jīng)節(jié)段部位。滴鼻的制劑(如CB-NGF，CB-Anti betaA，CB-IGF等)可經(jīng)嗅神經(jīng)進(jìn)入端腦嗅球，進(jìn)而影響基底前腦區(qū)(Basal forebrain area)，特別是Meynert基底核(nucleusbasalis of Meynert)膽堿能神經(jīng)元、海馬及大腦皮質(zhì)等大腦結(jié)構(gòu)(治療Alzheimer’s disease AD阿滋海默氏老年性癡呆、帕金森氏病或中風(fēng)、腦栓塞等大腦疾患或損傷)；經(jīng)III，V，VII，XI，XII對(duì)腦神經(jīng)分布區(qū)域的肌肉注射或肌內(nèi)置放緩釋膠囊的方式給藥即靶向性地把治療和/或預(yù)防腦干疾病的大分子藥物導(dǎo)入腦干；經(jīng)相應(yīng)節(jié)段的脊神經(jīng)分布區(qū)域的肌肉注射或肌內(nèi)置放緩釋膠囊把治療和/或預(yù)防脊髓疾病或損傷的大分子藥物導(dǎo)入脊髓(CB-CNTF，CB-BDNF，CB-MnA等治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病，CB-BDNF，CB-IGF，CB-Anti Nogo治療脊髓損傷或截癱)。
各種病毒性腦炎的治愈率低、后遺癥嚴(yán)重。雖在病毒學(xué)上已能產(chǎn)生許多特異性的抗病毒抗體，但I(xiàn)gG大分子不能或很不易通過BBB，特異性的治療抗體不能進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，發(fā)揮不了治療/預(yù)防作用。
霍亂原(Choleragen，即霍亂毒素，Cholera Toxin)B亞基或單位(CB，choleragen B subunit)是無毒性的受體結(jié)合單位，也稱為類霍亂原(choleragenoid)。80年代初，萬選才在美國賓大(Univ.ofPennsylvania，UPenn)用霍亂毒素(CT)及WGA等植物凝集素(lectins)與辣根過氧化物酶(HRP)共價(jià)結(jié)合，用作神經(jīng)解剖學(xué)探針。實(shí)驗(yàn)證明CT-HRP受體介導(dǎo)入胞(RME)的軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)(At)效率比UPenn實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)導(dǎo)人，細(xì)胞生物學(xué)教授Dr.N.Ganatas推薦的WGA-HRP更為靈敏有效。萬回國后又率先甩去CT的毒性A亞單位，只用CB結(jié)合HRP。CT或CB作為軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)利化劑(a potent axonal transport facilitator)比非RME轉(zhuǎn)運(yùn)的效果高百余倍(Wan et al.，1982，Brain Res.243215)。萬選才并以之發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)解剖學(xué)歷史上用經(jīng)典Golgi方法(高爾基銀染法)從所未見的神經(jīng)元樹突，萬命名為Golgi-phobic Dendrites，GBD，“嫌高爾基樹突”(Exp.Neurol 1982，78167-175；Anat.Rec，1984，208(3)190A；PROC.CAMS&PUMC 1986，11-10)。這一工作在1984年獲國家衛(wèi)生部甲級(jí)科研成果獎(jiǎng)，1985年獲國家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步二等獎(jiǎng)。
瑞典免疫學(xué)者Holmgren在90年代初已用CB作為免疫佐劑，以CB-結(jié)合過敏原或抗原(antigen，Ag)的結(jié)合物作疫苗，實(shí)驗(yàn)證明可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，使抗原產(chǎn)生的致敏作用受到抑制或得到耐受(tolerance)。對(duì)致敏原或自身免疫抗原所致的過敏及自身免疫病，可以由接種CB-Ag獲得治療性的緩解(口服或滴鼻，經(jīng)粘膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用)。特別是CB的免疫佐劑作用(滴鼻或口服)已在北歐瑞典志愿人群中實(shí)驗(yàn)過，證明CB對(duì)人體安全無損(Holmgren et al.，Am.J.Trop.Med.Hyg.1994，505 Suppl.42-54)。但他從未涉及也未觀察CB-GM1受體介導(dǎo)入胞或神經(jīng)系統(tǒng)疾患。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者經(jīng)過多年研究，發(fā)現(xiàn)霍亂原B亞基(CB)作為配基/載體與對(duì)腦脊髓疾病有治療作用的生物活性肽(神經(jīng)營養(yǎng)因子neurotrophicfactors和neurotrophins，NT等)、或抗體免疫球蛋白immunoglobulins，IgG連接成偶聯(lián)物，這些偶聯(lián)物能經(jīng)周圍神經(jīng)進(jìn)入腦脊髓，即繞開了血腦屏障(BBB)，把大多數(shù)原本是不能透過BBB、但在實(shí)驗(yàn)中對(duì)腦脊髓疾病有治療作用的活性多肽/蛋白或IgG等導(dǎo)入了腦脊髓實(shí)質(zhì)，神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)投藥使這些活性物質(zhì)的臨床防治潛力得到充分有效的發(fā)揮，而有現(xiàn)實(shí)可能應(yīng)用于臨床，由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了霍亂原B亞基作為配基/載體與對(duì)腦脊髓疾病或損傷有治療作用的生物活性多肽、免疫球蛋白或免疫活性原的偶聯(lián)物及其復(fù)方組合物。
在本發(fā)明中，所述生物活性肽指包括多肽/蛋白及神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors NT，包括神經(jīng)生長因子nerve growth factorNGF，neurotrophins家族及其他細(xì)胞因子家族)、神經(jīng)激素(neurohormones)、神經(jīng)肽(neuropeptides)、鎮(zhèn)痛肽和細(xì)胞凋亡抑制因子(inhibitors for apoptosis)；免疫球蛋白主要是對(duì)腦脊髓疾病或損傷有治療作用的特異性抗體IgG；免疫活性原主要是導(dǎo)致腦脊髓疾病的自身免疫原(immunogens)及過敏原(allergens)。
可以用本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)因子包括，但不限于神經(jīng)生長因子(NGF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、胰島素樣生長因子(IGF)等；神經(jīng)激素有退黑素(melantonin)等；細(xì)胞凋亡抑制因子有Bcl 2等。
可以用本發(fā)明對(duì)腦脊髓疾病或損傷有治療作用的抗體有抗β淀粉樣蛋白1-42(betaA)的IgG(anti betaA)(治療阿滋海默氏老年癡呆)；對(duì)疼痛遞質(zhì)的抗體，其中包括抗P物質(zhì)IgG；對(duì)親神經(jīng)病毒的抗體IgG；抗白介素-1受體的抗體；和抗Nogo蛋白(抑制中樞神經(jīng)纖維再生的Nogo蛋白)的IgG。
可以用本發(fā)明治療免疫型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(如側(cè)索硬化肌無力ALS等)的導(dǎo)致腦脊髓疾病的自身免疫原有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元抗原蛋白(MnA)；單涎酸節(jié)苷酯2(GM2)；乙酰膽堿N受體a亞基(針對(duì)重癥肌無力)等。
本發(fā)明提供了兩類以霍亂原B亞基(CB)作為配基/載體的偶聯(lián)物1.CB與對(duì)腦脊髓疾病或損傷有治療作用的生物活性多肽/蛋白的偶聯(lián)物-CB-NT。
在本發(fā)明中，對(duì)腦脊髓疾病或損傷有治療作用的生物活性多肽/蛋白，它們是指以神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NT)為代表的神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子neurotrophins家族(NGF及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF，NT3等)，還包括別的幾種神經(jīng)營養(yǎng)因子家族(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子CNTF，胰島素樣生長因子IGF，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF等)、神經(jīng)激素、神經(jīng)肽和細(xì)胞凋亡抑制因子等。
即本發(fā)明中的NT包括神經(jīng)生長因子NGF及以其為代表的別的幾種神經(jīng)營養(yǎng)因子家族、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子CNTF、胰島素樣生長因子IGF、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF等以及神經(jīng)激素、神經(jīng)肽和細(xì)胞凋亡抑制因子等。對(duì)腦脊髓疾病或損傷有治療作用的生物活性肽/蛋白的CB偶聯(lián)制劑是指以CB-NGF為代表的CB-CNTF，CB-BDNF，CB-IGF，CB-GDNF，以及CB-Bcl 2，CB-細(xì)胞凋亡抑制因子，CB-melatonin，CB-神經(jīng)激素、CB-神經(jīng)肽等。
2.CB與對(duì)腦脊髓疾病或損傷有治療作用的抗體(IgG)或免疫活性原(immunogen Ig)的偶聯(lián)物-CB-IgG或CB-Ig在本發(fā)明中，對(duì)腦脊髓疾病有治療作用的抗體是指一類免疫球蛋白IgG的單克隆或多克隆抗體，其包括但不限于IgG也包括IgE、IgM等。IgG一類包括有抗痛的抗P物質(zhì)抗體，抗β淀粉樣蛋白1-42單克隆抗體(抗beta Amyloid 1-42，Anti betaA)，抗白介素-1受體的抗體(AntiIL-1r)，抗親神經(jīng)病毒的抗體、抗腦炎病毒及抗腦脊髓炎病毒的抗體及抗抑制神經(jīng)生長蛋白Nogo的抗體等。其中所述的免疫活性原Ig主要是指導(dǎo)致腦脊髓疾病的自身免疫原(immunogens Ig)及過敏原(allergens)，包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元抗原蛋白(MnA)及單涎酸節(jié)苷酯2(GM2)，乙酰膽鹼N受體a亞基等。
對(duì)腦脊髓疾病或損傷有治療作用的抗體IgG或免疫活性原的CB偶聯(lián)物——CB-IgG/Ig是指以CB-抗P物質(zhì)抗體(CB-Anti P)為代表的CB-AntibetaA及CB-Anti Nogo，CB-Anti IL-1r，CB-MnA等。
本發(fā)明還提供了含有霍亂原B亞基作為配基/載體與對(duì)腦脊髓疾病有治療作用的生物活性肽、免疫球蛋白或免疫活性原的偶聯(lián)物和可藥用輔劑及增強(qiáng)劑的藥物組合物?！霸鰪?qiáng)劑”是指增強(qiáng)CB偶聯(lián)物被神經(jīng)受體攝取或延緩其被鼻黏液或肌肉血液稀釋帶走的一些制劑?！逅幱幂o劑″是指制藥領(lǐng)域通常認(rèn)為是安全、無毒性的輔劑，并且它們既無生物學(xué)活性也無不良作用。這些輔劑例如可以包括乳糖、淀粉，水，醇等。本發(fā)明的復(fù)方組合物中可以含有本發(fā)明偶聯(lián)物補(bǔ)充輔助劑。
本發(fā)明的藥物組合物可以制成緩釋膠囊、溶液劑、噴霧劑、注射液等劑型，可以采用胃腸外給藥或鼻腔滴入、噴霧等形式給藥。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選采用滴鼻給藥、肌肉注射或肌內(nèi)置放緩釋膠囊的方式給藥(經(jīng)肌肉神經(jīng)終末的CB-GM 1介導(dǎo)入胞，并不經(jīng)血)。
本發(fā)明涉及上述的偶聯(lián)制劑在RME-DS靶向給藥、繞開血腦屏障對(duì)腦脊髓疾患或損傷進(jìn)行治療/預(yù)防的醫(yī)藥用途具有堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。附

圖1顯示了CB-NT，CB-Ab(IgG)受體介導(dǎo)入胞投藥(RME-DS)的細(xì)胞生物學(xué)原理。
本發(fā)明還涉及上述的偶聯(lián)物在制備經(jīng)外周神經(jīng)受體介導(dǎo)入胞、軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入中樞神經(jīng)的藥物的用途。具體地，本發(fā)明的偶聯(lián)物經(jīng)神經(jīng)膜上的神經(jīng)節(jié)苷酯寡糖受體介導(dǎo)入胞、軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)，從周圍進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并進(jìn)一步在腦脊髓內(nèi)作跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。
本發(fā)明涉及上述的偶聯(lián)物的制備用于治療和/或預(yù)防腦脊髓疾病或損傷中的醫(yī)藥用途。具體而言，所述腦脊髓疾病或損傷包括退行性神經(jīng)疾患，其選自阿滋海默氏老年性癡呆(Alzheimer’s dementia，AD)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(motor neuron disease，MND)、帕金森氏病(Parkinson’sdisease，PD)、頑固性偏頭疼和神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫??；腦脊髓損傷，其選自中風(fēng)、腦血栓、腦缺血、腦外傷和脊髓外傷；疼痛；病毒性腦炎及病毒性腦脊髓炎；HIV腦炎。
退行性中樞(或外周)神經(jīng)疾患的病理—生理學(xué)機(jī)制或發(fā)病過程多少都有免疫失調(diào)或自身免疫參與，有的已明確基本上是自身免疫病(如重癥肌無力，多發(fā)性硬化及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病)。所以，免疫調(diào)節(jié)復(fù)合神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)投藥的靶向性神經(jīng)營養(yǎng)治療是緩解、治療和預(yù)防現(xiàn)為不治之癥的退行性神經(jīng)疾患的最好戰(zhàn)略。
另一方面，本發(fā)明還涉及的霍亂原B亞基作為配基/載體與對(duì)腦脊髓疾病有治療作用的生物活性肽或抗體、免疫活性原的偶聯(lián)物的制備改良方法，包括將霍亂原B亞基與對(duì)腦脊髓疾病或損傷有治療作用的生物活性肽或免疫球蛋白或免疫活性原連接起來，并保持偶聯(lián)物的生物活性不變。具體地，將霍亂原B亞基的氨基或羧基與對(duì)腦脊髓疾病或損傷有治療作用的生物活性肽或免疫球蛋白或免疫活性原的羧基或氨基連接起來；或?qū)肓驓浠蚨蛲远蜴I連接起來。也就是說，將霍亂原B亞基的氨基酸與對(duì)腦脊髓疾病有治療作用的生物活性肽或抗體、免疫活性原的氨基酸經(jīng)橋聯(lián)劑以化學(xué)共價(jià)連接起來，而又保持生物活性的改良技術(shù)。
近年來連接不同蛋白/多肽的方法很多，常用的方法學(xué)可以參見[Chemistry of Protein and Cross-Linking.Wong 1991 CRC Press Inc.；Boca Raton，F(xiàn)la；及E.Harlow and D.Lan，Eds，AntibodiesALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor.NY，1988]。蛋白/多肽之間可以用羧酸酯類、酐類、酰基鹵類、酰基疊氮化合物等有機(jī)化合物作為橋聯(lián)劑，與蛋白/多肽的反應(yīng)基團(tuán)形成共價(jià)連接(如與賴氨酸的氨基或與蛋白/多肽的硫基結(jié)合等)。具體的方法可參閱上兩書。理想的共價(jià)連接是經(jīng)過蛋白/多肽賴氨酸氨基的氨基側(cè)鏈。五聚體的霍亂原B亞基在每個(gè)單體上有9個(gè)賴氨酸，可見CB是一個(gè)特別合適做偶聯(lián)的對(duì)象。在偶聯(lián)結(jié)合物中CB的結(jié)構(gòu)及活性狀況可用與單涎酸節(jié)苷GM1的結(jié)合做鑒定。在我們的實(shí)踐中優(yōu)選改良的是以下兩種方法方法I(戊二醛GA兩步改良法)是對(duì)Avrameas和Ternyck及Gonatas等的改良法(Modification of Avrameas and Ternyck 1971，Immunochemistry 8，1175；Gonatas等，1979，J.Histochem.Cytochem.27，728；Wan，XST 1986，Proc.CAMS & PUMC，1，1-10；1984，Anat.Rec.208，3，190A)。近年為適應(yīng)不同的活性多肽又經(jīng)改良。第一步用1.25％戊二醛活化CB；經(jīng)Sephadex G-25 column膠柱(60×0.9cm)分離活化的CB與未連接的戊二醛(或不過柱而在0.15M NaCl透析，去除未被連接的戊二醛)；濃縮。第二步在濃縮的經(jīng)戊二醛活化的CB中加入等容積的對(duì)腦脊髓疾病有治療作用的生物活性肽/蛋白或抗體等進(jìn)行偶聯(lián)(注意不同的等電點(diǎn)及生物活性位點(diǎn))；經(jīng)Sephadex G-200膠柱分離結(jié)合態(tài)與非結(jié)合態(tài)的成分；濃縮并穩(wěn)定。
CB-對(duì)腦脊髓疾病有治療作用的生物活性肽的生物活性可用離體的細(xì)胞培養(yǎng)鑒定(如PC12)。
方法II(二硫鍵連接改良法)是對(duì)Friden等人原法的改良(Modification from Friden et al.，1993，Science 259，373；Kordoweret al.，1994，PNAS USA 91，9077)。它是先以EDC[1-ethyl-3-(3-dimethylaminoproyl)carbodiimide]作用于有治療作用的生物活性肽/蛋白(如NGF或IgG)使其賴氨酸的羧基易與疊氮物連接，再用Carlson等七十年代提出的有機(jī)試劑SPDP(Carlson et al.1978，Biochem J173，723)的衍生物，吡啶二硫丙酸酰肼PDP[pyridyldithiopropionate-hydrazide]在生物活性肽(或IgG及其他蛋白)賴氨酸的羧基附上一個(gè)反應(yīng)硫基(2-pyridyl-sulfide group)。注意不同的等電點(diǎn)及生物活性位點(diǎn)。用SATA[N-succinimidyl-S-acetylthioacetate]作用于CB上的賴氨酸胺基使其接上硫氫基。CB上的硫氫基與NGF(或IgG)賴氨酸的吡啶硫化基(2-pyridyl-sulfide group)置換形成二硫鍵，即把兩個(gè)蛋白分子偶聯(lián)結(jié)合，釋放出2-硫吡啶(pyridine-2-thione)。用蛋白A-Sepharose柱純化偶聯(lián)結(jié)合物。此法獲得的偶聯(lián)結(jié)合物其營養(yǎng)因子的生物活性較好。不同的CB偶聯(lián)物在制備細(xì)節(jié)上均有各自的改良特點(diǎn)和技術(shù)竅門。
本發(fā)明醫(yī)藥學(xué)意義及經(jīng)濟(jì)開發(fā)價(jià)值本發(fā)明者在藥物治療學(xué)上第一次設(shè)計(jì)提出了神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)投藥法，即以神經(jīng)受體介導(dǎo)入胞的配基/載體把藥物從外周神經(jīng)軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腦脊髓的“RME-投藥系統(tǒng)(RME-Delivery System，RME-DS)。本發(fā)明者首次從基礎(chǔ)理論及方法學(xué)上提出了RME的神經(jīng)軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)不只是生理性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)通道，也可是制劑藥物等進(jìn)入腦脊髓實(shí)質(zhì)的大道。二十世紀(jì)后半葉細(xì)胞分子生物學(xué)的發(fā)展獲得了一序列特異性的生物活性肽/蛋白，稱之為生長因子、細(xì)胞因子等。Rita Levi-Montalcini及Stanley Cohen的NGF，EGF工作獲1986年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，標(biāo)志著這一廣闊領(lǐng)域的學(xué)術(shù)成就。但這一序列大分子多肽/蛋白對(duì)中樞神經(jīng)(CNS)腦脊髓疾患和損傷的醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力，卻受到血腦屏障BBB的限制，得不到發(fā)揮。能通過BBB的500Da以下的小分子藥物仍是當(dāng)前CNS藥物的主流。本發(fā)明為一序列特異性的生物活性肽/蛋白，神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡抑制因子等無侵害性入腦開辟了道路；為老年癡呆及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病等不治之癥帶來新希望。
本發(fā)明的CB-偶聯(lián)物以其靶向性投藥、無損傷性等特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)而具有很大的醫(yī)學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)開發(fā)價(jià)值。Science(Vol.2971116-1118，2002)的資料估計(jì)1998年全球市場(chǎng)上中樞神經(jīng)(CNS)藥物為380億美元，幾乎全是小分子藥物；大分子藥物尚未進(jìn)入市場(chǎng)，本發(fā)明的CNS大分子藥物如經(jīng)臨床試用投入市場(chǎng)后，經(jīng)濟(jì)效益是巨大的。
本發(fā)明的霍亂原B亞基作為配基/載體與對(duì)腦脊髓疾病有治療作用的生物活性肽/蛋白的偶聯(lián)物，能繞過血腦屏障(BBB)把大多數(shù)原本是不能透過BBB的對(duì)腦脊髓疾病有治療作用的生物活性肽/蛋白如NT、免疫活性球蛋白IgG等導(dǎo)入了腦脊髓實(shí)質(zhì)，使這些活性物質(zhì)的臨床防治潛力得到充分有效的發(fā)揮。
作為與CB偶聯(lián)的對(duì)腦脊髓疾病有治療/預(yù)防作用的生物活性肽/蛋白、抗體或免疫活性原都是在已知文獻(xiàn)中有大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明有療效并安全可靠的，有的是已用于臨床或正有意通過臨床試用的治療制劑。而經(jīng)與CB偶聯(lián)后，則成為了更高效、安全、無侵害地進(jìn)入腦脊髓的目前臨床和市場(chǎng)所未有的新藥制劑。
霍亂原B亞基(CB)是無毒性的受體結(jié)合單位。其本身無毒安全，經(jīng)我們的實(shí)驗(yàn)說明，尚有一定的神經(jīng)營養(yǎng)作用，這是由于CB激活了神經(jīng)細(xì)胞GM 1的代謝再利用率(Liu Z-P and Wan X-C，1995，ChineseJ.Neuroimmurol.Neurol 261)。
附圖表說明圖1顯示了CB-NT，CB-Ab(IgG)受體介導(dǎo)入胞投藥(RME-DS)的細(xì)胞生物學(xué)原理圖2顯示了NGF、CB-NGF體外生物活性的測(cè)定比較曲線。說明偶聯(lián)未影響生物活性圖3a顯示了實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1，A-E組水迷宮實(shí)驗(yàn)的逃遁潛伏期(Escapelatency，El)的比較及老齡鼠G組CB-NGF滴鼻治療前Gb與滴鼻治療后Gp的比較。
圖3b顯示了實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1，A-E組水迷宮實(shí)驗(yàn)的游泳距離(Distancetraveled，Dt)的比較及老齡鼠G組CB-NGF滴鼻前Gb滴鼻后Gp的比較。
圖3c顯示了實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1，A-E組水迷宮實(shí)驗(yàn)游泳速度(Dt/El)的比較及老齡鼠G組CB-NGF滴鼻前Gb滴鼻后Gp的比較。
圖4照片A-F顯示了實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1，A，B，C，D，E組及F青少組前腦基底ChAT(膽堿乙醯轉(zhuǎn)移酶)陽性神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)比較(并見表1)。
圖5顯示了在實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2中，CB-兔抗P物質(zhì)IgG對(duì)甩尾痛閾的影響。說明了兔抗P物質(zhì)IgG已從腰髓跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到了控制甩尾痛反應(yīng)的骶尾髓。
圖6照片1顯示了在實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3中，以蔗糖梯度超速離心分離的豬脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(膽堿脂酶組化染色，600倍放大)Swine spinalmotoneurons isolated by sucrose gradient ultra-centrifuge method(cholinesterase staining.Magnification，x 600)圖6照片2顯示了在實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3中，免疫損傷Lewis大鼠的腰骶膨大脊髓前角(焦油紫染色，300倍放大)照片右側(cè)膠質(zhì)細(xì)胞增生，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失。The anterior horn of the lumbosacral enlargement ofan immuno-injured Lewis rat(Cresyl violet staining，x 300)圖6照片3顯示了在實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3中，正常對(duì)照Lewis大鼠的腰骶膨大脊髓前角(焦油紫染色，250倍放大)圖6照片4顯示了免疫損傷Lewis大鼠的腰骶膨大脊髓前角(焦油紫染色，250倍放大)照片中間(前角外側(cè))膠質(zhì)細(xì)胞增生，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失。
圖6照片5顯示了免疫損傷Lewis大鼠(癥狀中度者)的腰骶膨大脊髓前角已有萎變的深染神經(jīng)細(xì)胞(焦油紫染色，600倍放大)圖6照片6顯示了免疫損傷Lewis大鼠(癥狀較重，頻臨死亡者)的腰骶膨大脊髓前角。有膠質(zhì)細(xì)胞增生，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元潰變及丟失(焦油紫染色，600倍放大)圖6照片7顯示了正常對(duì)照Lewis大鼠血清(稀釋1∶40)不能染出Wistar大鼠的前角運(yùn)動(dòng)細(xì)胞，免疫組化陰性。(ABC方法，600倍放大)圖6照片8顯示了MND模型動(dòng)物的血清(稀釋1∶800)可以作為第一抗體用于免疫組化反應(yīng)，可染出Wistar大鼠的前角運(yùn)動(dòng)細(xì)胞，免疫組化陽性。(ABC方法，600倍放大)圖6照片9顯示了正常對(duì)照大鼠兩后肢有力的支撐狀況。
圖6照片10顯示了MND模型大鼠后肢的無力拖懈狀況。
圖6照片11顯示了正常大鼠脛前肌注射10ul HRP在脊髓前角標(biāo)記細(xì)胞較少之處(400倍放大)。
圖6照片12顯示了中度免疫損傷大鼠脛前肌注射10ul HRP在脊髓前角標(biāo)記細(xì)胞較多之處，以示免疫損傷大鼠神經(jīng)的軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)尚基本正常，可以轉(zhuǎn)運(yùn)藥物制劑(400倍放大)。
圖7顯示了在實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3中，CB-CNTF復(fù)合CB-MnA治療免疫損傷MND大鼠(1-4組)的存活比較圖實(shí)施例制備實(shí)施例1CB-IgG[兔抗P物質(zhì)]的戊二醛GA偶聯(lián)CB[五聚體pentamer分子量45-50kDa，List Ltd.，US]3.0mg溶于1.25％GA[Sigma，用于電鏡標(biāo)本者]1ml，0.1M磷酸鈉(pH6.5)于室溫作用過夜[較低的pH可防止CB中賴氨酸的氨基自身偶聯(lián)]；經(jīng)Sephadex G-25 column膠柱(40×0.9cm，用0.15M NaCl溶液過柱)分離活化的CB與未連接的戊二醛(或不過柱而在0.15M NaCl透析，去除未被連接的戊二醛)；用微孔濾膜濃縮過柱液的CB組份(分子量45-50kDa)到約1ml。
用1M的碳酸鹽緩沖液(pH9.5)調(diào)節(jié)濃縮的活化CB的pH到9.5，加入兔抗P物質(zhì)IgG(分子量150kDa)9.0mg溶于1M的碳酸鹽緩沖液(pH9.5)1ml，與活化CB在4度低溫中作用24小時(shí)；經(jīng)SephadexG-200膠柱(1.6×90cm)分離結(jié)合態(tài)(分子量200kDa)與非結(jié)合態(tài)的成分；濃縮并穩(wěn)定(加入賴氨酸，使成0.1M)。
制備實(shí)施例2CB-NGF的GA偶聯(lián)CB[分子量45-50kDa，List Ltd.，US]4mg溶于1.25％GA[Sigma，用于電鏡標(biāo)本者]1ml，0.1M磷酸鈉(pH6.5)于室溫作用過夜[較低的pH可防止CB中賴氨酸的氨基自身偶聯(lián)]；經(jīng)Sephadex G-25 column膠柱(40×0.9cm，用0.15M NaCl溶液過柱)分離活化的CB與未連接的戊二醛(或不過柱而在0.15M NaCl透析，去除未被連接的戊二醛)；用微孔濾膜濃縮過柱液的CB組份(分子量45-50kDa)到約1ml。
用1M的碳酸鹽緩沖液(pH9.5)調(diào)節(jié)濃縮的活化CB的pH到9.5，加入NGF(betaNGF，4mg二鏈，分子量26.0kDa，Sigma，N 8133)2.0mg溶于1M的碳酸鹽緩沖液(pH9.5)1ml，與活化CB在4度低溫中作用24小時(shí)；經(jīng)Sephadex G-200膠柱(1.6×90cm)分離結(jié)合態(tài)(分子量80kDa)與非結(jié)合態(tài)的成分；濃縮并穩(wěn)定(加入賴氨酸，使成0.1M)。
制備實(shí)施例3CB-NGF的二硫鍵S-S偶聯(lián)過程把NGF(beta NGF，二鏈，分子量26.0kDa，Sigma，N 8133)2.0mg溶于1ml，1M的碳酸鹽緩沖液(pH8.5)中，緩慢加上6.0mg/ml的citraconic anhydride(檸檬酐，Sigma，US)，置室溫作用1小時(shí)以阻斷游離氨基；以G10膠柱分離檸檬酐及NGF肽。在2.0mg/2ml的NGF加入EDC 20mg作用于羧基，先調(diào)pH為5，隨調(diào)至8，置室溫10分鐘；過G10膠柱去除EDC；濃縮NGF液為2ml；滴加20mM的PDP溶液(Sigma，US)0.5ml于NGF液中，在室溫中攪拌30分鐘；過Sephadex G-25(0.1M，PBS elute)膠柱去除多余的PDP，微孔濾膜濃縮NGF液至2ml。
把4mg CB(List，US)溶于1ml，1M的碳酸鹽緩沖液(pH8.5)中，滴加20mM的SATA溶液(Sigma，US)0.5ml，在室溫中攪拌30分鐘，使CB的賴氨酸胺基接上硫氫基；過Sephadex G-25(0.1M，PBS elute)膠柱去除多余的SATA，微孔濾膜濃縮容積至1.5ml。
混合NGF(-2pyridyl sulfide)及CB(-sulfhydryl)兩溶液，在室溫中攪拌30分鐘；用蛋白A-Sepharose柱及NGF單抗親和柱純化偶聯(lián)結(jié)合物的CB-NGF。濃縮至2ml，分裝，速凍于負(fù)20-40度備用。NGF，CB-NGF(S-S偶聯(lián))及CB-NGF(GA偶聯(lián))的生物活性測(cè)定比較(圖2)以NGF，CB-NGF(S-S偶聯(lián))及CB-NGF(GA偶聯(lián))分別作用于PC-12細(xì)胞，視其對(duì)細(xì)胞神經(jīng)突起生長的影響而代表生物活性。
用96孔培養(yǎng)盤(牛膠元蛋白IV貼壁)培養(yǎng)PC-12細(xì)胞，每孔約1×10k個(gè)細(xì)胞，貼壁生長6小時(shí)后分別加入不同劑量的NGF，CB-NGF(S-S偶聯(lián))及CB-NGF(GA偶聯(lián))，測(cè)試對(duì)細(xì)胞神經(jīng)突起生長的影響[200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6ng/ml，3ng/ml，1ng/ml，0ng/ml]；5天后，觀察記錄各孔(每孔2-3視野)細(xì)胞神經(jīng)突起長度超過胞體2個(gè)直徑以上的細(xì)胞數(shù)與觀察細(xì)胞總數(shù)的百分比，NGF、CB-NGF體外生物活性的測(cè)定比較曲線如圖2所示。結(jié)果說明CB-NGF(S-S偶聯(lián))和CB-NGF(GA偶聯(lián))都具有與NGF相當(dāng)?shù)纳锘钚?，S-S偶聯(lián)的CB-NGF活性似較好。
生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)說明偶聯(lián)的過程均未影響所偶聯(lián)的生物活性肽及蛋白的活性。
圖2顯示了NGF、CB-NGF體外生物活性的測(cè)定比較曲線。
制備實(shí)施例4CB-CNTF的二硫鍵S-S偶聯(lián)過程把CNTF(Sigma，C 3835)400μg溶于1ml，1M的碳酸鹽緩沖液(pH8.5)中，緩慢加上6.0mg/ml的citraconic anhydride(檸檬酐，Sigma，US)，置室溫作用1小時(shí)以阻斷游離氨基；以G10膠柱分離檸檬酐及CNTF肽。在400mu g/2ml的CNTF加入EDC 20mg作用于羧基，先調(diào)pH為5.5，隨調(diào)至8.5，置室溫10分鐘；過G10膠柱去除EDC；濃縮CNTF液為2ml；滴加20mM的PDP溶液(Sigma，US)0.5ml于CNTF液中，在室溫中攪拌30分鐘；過Sephadex G-25(0.1M，PBS elute)膠柱去除多余的PDP，微孔濾膜濃縮CNTF液至2ml。
把4mg CB(List，US)溶于1ml，1M的碳酸鹽緩沖液(pH8.5)中，滴加20mM的SATA溶液(Sigma，US)0.5ml，在室溫中攪拌30分鐘，使CB的賴氨酸胺基接上硫氫基；過Sephadex G-25(0.1M，PBS elute)膠柱去除多余的SATA，微孔濾膜濃縮容積至1.5ml。
混合CNTF(-2pyridyl sulfide)及CB(-sulfhydryl)兩溶液，在室溫中攪拌30分鐘；用蛋白A-Sepharose柱及CNTF單抗親和柱純化偶聯(lián)結(jié)合物的CB-CNTF。濃縮至2ml，分裝，速凍于負(fù)20-40度備用。
制備實(shí)施例5，CB-MnA/MnA的GA偶聯(lián)制備運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元抗原蛋白(MnA)按Engelhardt et al.，的方法(JNeurosci Methods 1985，15219)由鮮屠豬的頸段及上胸段脊髓分離前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體[見圖6照片1]作勻漿，電泳，提取高分子量(150-180kD)蛋白3.0mg作為MnA。
以CB[五聚體pentamer分子量45-50kDa，List Ltd.，US]2.0mg溶于1.25％GA[Sigma，用于電鏡標(biāo)本者]1ml，0.1M磷酸鈉(pH6.5)于室溫作用過夜[較低的pH可防止CB中賴氨酸的氨基自身偶聯(lián)]；經(jīng)Sephadex G-25 column膠柱(40×0.9cm，用0.15M NaCl溶液過柱)分離活化的CB與未連接的戊二醛GA(或不過柱而在0.15M NaCl透析，去除未被連接的戊二醛)；用微孔濾膜濃縮過柱液的CB組份(分子量45-50kDa)到約1ml。
用1M的碳酸鹽緩沖液(pH9.5)調(diào)節(jié)濃縮的活化CB的pH到9.5，加入MnA(分子量150-180kDa)3.0mg溶于1M的碳酸鹽緩沖液(pH9.5)1ml，與活化CB在4度低溫中作用24小時(shí)。此CB-MnA及MnA是用于滴鼻誘發(fā)黏膜免疫，CB起佐劑作用，使機(jī)體產(chǎn)生對(duì)免疫原MnA的耐受，故不需分離結(jié)合態(tài)與非結(jié)合態(tài)的成分。只以0.15M NaCl透析，濃縮至2.0ml(此CB-MnA，MnA混合液，相當(dāng)于MnA 3mg/2.0ml)。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1CB-NGF滴鼻保護(hù)前腦基底膽鹼能神經(jīng)元及改善學(xué)習(xí)記憶的實(shí)驗(yàn)CB(CTB，美國List公司產(chǎn)品)，betaNGF(美國Sigma公司產(chǎn)品)；偶聯(lián)用的試劑均為美國Sigma的產(chǎn)品。
Wistar大鼠(4-5月齡)15只，分五組(A-E)A.正常無損傷對(duì)照組(n＝3)；B.假損傷對(duì)照組(n＝3)；C.背側(cè)海馬損傷組(n＝3)；D.海馬損傷+非結(jié)合的CB，NGF對(duì)照滴鼻組(n＝3)，治療期五周；E.海馬損傷+結(jié)合態(tài)CB-NGF滴鼻組(n＝3)，治療期五周。F.青少年(1月齡)大鼠及G老齡大鼠(22月齡)各兩只CB-NGF滴鼻四周。F作ChAT免疫組化分析(圖4)；G作滴鼻治療前(Gb)及治療后(Gp)的水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為比較(圖3)。
NGF滴鼻的劑量在結(jié)合態(tài)及非結(jié)合態(tài)均為25mu g/100ul，日滴一次，保持大鼠仰臥位40分鐘以使制劑較好進(jìn)入嗅粘膜嗅細(xì)胞。
背側(cè)海馬損傷手術(shù)水化氯醛(400mg/kg，i.p.)麻醉；微量注射器(Hamilton)進(jìn)入海馬的立體定位坐標(biāo)為AP前囟點(diǎn)之后4.5mm，L中線旁開3mm，DV自腦表面向下，即-3mm.海仁酸類神經(jīng)毒制損(Quinolinate or ibotenate 10nmol溶于人工腦脊液，注射2.0ul.)微量注射速度為0.5/min，注射結(jié)束后留針5min。
假手術(shù)損傷組動(dòng)物以同樣麻醉及手術(shù)定位坐標(biāo)注射入海馬人工腦脊液2.0ul，注射結(jié)束后留針5min。
I.學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)(Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)圖3a，3b，3c)手術(shù)損傷及治療組(B，C，D，E)均在術(shù)后2周及治療開始后2周才做水迷宮實(shí)驗(yàn)，共作十次(日)，每次(日)做6回水迷宮測(cè)試。
A，(正常對(duì)照)，B(假手術(shù)對(duì)照)，兩組在逃遁潛伏期(Escapelatency，尋找平臺(tái)的時(shí)間El)，經(jīng)3-4次測(cè)試后均為10sec(SEM＝2)，幾無差別；找到逃遁平臺(tái)的游泳距離(Distance traveled，Dt)分別為210cm(SEM＝12)，220cm(SEM＝11)，無明顯差別[p＞0.05]；游泳速度(Dt/El)分別為21cm/sec及22cm/sec，無明顯差別[p＞0.05]。
C.背側(cè)海馬損傷組的上三參數(shù)大有變化El及Dt均成倍增加，游泳速度(Dt/El)大為減慢[p＜0.001，ANOVA]。說明學(xué)習(xí)記憶受到損害。
D.海馬損傷加非結(jié)合態(tài)CB，NGF滴鼻，水迷宮的三個(gè)參數(shù)與C損傷組無明顯差別[p＞0.05，ANOVA]。說明了非結(jié)合態(tài)CB，NGF基本無效。
E.海馬損傷加CB-NGF滴鼻治療組在水迷宮的三個(gè)參數(shù)上與A，B，對(duì)照組無明顯差別[p＞0.05，ANOVA]。說明海馬損傷對(duì)學(xué)習(xí)記憶的損害已得到恢復(fù)。
D，E水迷宮測(cè)試相比較也說明只CB-NGF具有明顯療效。
F少年鼠CB-NGF滴鼻實(shí)驗(yàn)組未做水迷宮行為實(shí)驗(yàn)，只做了前腦基底區(qū)ChAT神經(jīng)元的神經(jīng)解剖學(xué)分析(見圖4)。
G.組老齡鼠在CB-NGF治療前Gb與治療后Gp相比，學(xué)習(xí)記憶能力也有改善[p＜0.05，t-test]。提示CB-NGF可有預(yù)防保健作用。(見圖3)II.前腦基底膽鹼乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)神經(jīng)元的神經(jīng)解剖學(xué)分析(見圖4及表1)上述A，B，C，D，E，F(xiàn)組的動(dòng)物均在實(shí)驗(yàn)第五周末犧牲取腦做冰凍切片(20um)[前腦基底區(qū)連續(xù)切片]，用抗ChAT抗體(CambridgeBiochemicals)作免疫細(xì)胞化學(xué)染色反應(yīng)(Vector ABC試劑盒).
結(jié)果如圖4和數(shù)字表1所示圖4照片A顯示了正常無損傷成鼠對(duì)照組前腦基底區(qū)(BFA)ChAT(choline acetyl transferase)免疫細(xì)胞化學(xué)染色；圖4照片B顯示了假損傷(注射人工腦脊液)成鼠對(duì)照組BFA，ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色與A比較基本無改變；圖4照片C顯示了成鼠背側(cè)海馬損傷組BFA，ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色大為減弱，細(xì)胞萎縮并有丟失；圖4照片D顯示了成鼠海馬損傷+非結(jié)合的CB混合NGF對(duì)照滴鼻組BFA ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色減弱，細(xì)胞萎縮并有丟失[較輕于C](治療期五周后)；
圖4照片E顯示了成鼠海馬損傷+結(jié)合態(tài)CB-NGF滴鼻治療組，BFA ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色基本恢復(fù)正常(治療期五周后)；圖4照片F(xiàn)顯示了青少年大鼠(1月齡)兩只CB-NGF滴鼻五周后BFAChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色，較A有所增強(qiáng)。
表1顯示了實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1，A，B，C，D，E實(shí)驗(yàn)組前腦基底Meynert基核中ChAT(膽堿乙醯轉(zhuǎn)移酶)陽性神經(jīng)元的數(shù)目、大小及一級(jí)樹突的量化情況表1前腦基底Meynert基核中ChAT(膽堿乙醯轉(zhuǎn)移酶)陽性神經(jīng)元的數(shù)目、大小及一級(jí)樹突的定量情況

CB-NGF滴鼻實(shí)驗(yàn)明確地說明了RME-DS經(jīng)嗅細(xì)胞-嗅神經(jīng)入腦后，NGF在端腦嗅球跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)生了‘細(xì)胞生物機(jī)理圖解’中指出的NGF二級(jí)作用(secondary effect)通過前腦基底膽鹼能神經(jīng)元向嗅球投射的側(cè)支，NGF保護(hù)了因背側(cè)海馬損傷而萎縮潰變的前腦基底膽鹼能神經(jīng)元。背側(cè)海馬破壞損傷是國際公認(rèn)AD老年癡呆的解剖學(xué)模型，本實(shí)驗(yàn)是CB-NGF能治療或改善AD老年癡呆的重要實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。老年大鼠Gb，Gp及F青少年大鼠的實(shí)驗(yàn)提示CB-NGF對(duì)前腦基底膽鹼能神經(jīng)元的保護(hù)有增強(qiáng)記憶的保健作用及對(duì)癡呆的預(yù)防作用。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2(見圖5)CB-兔抗P物質(zhì)IgG肌注提高痛閾及抗P物質(zhì)IgG在脊髓的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)材料CB(CTB，美國List公司產(chǎn)品)，兔抗P物質(zhì)IgG(美國Sigma公司產(chǎn)品)；偶聯(lián)用的兔抗P物質(zhì)抗體IgG及其他試劑均為美國Sigma的產(chǎn)品；羊抗兔ABC試劑盒(美國Vector公司產(chǎn)品)。
Wistar大鼠(4-5月齡)及瑞士小鼠(2月齡)各12只，各分三組A組為未作處理的對(duì)照(n＝3)；B組作假處理對(duì)照(n＝4)每隔1日于股四頭肌(腰神經(jīng)L 2-3支配)處注射非結(jié)合態(tài)兔抗P物質(zhì)IgG 20μg(n＝2)；鼠(或小鼠)的非特異性IgG 20μg(n＝2)；C組為實(shí)驗(yàn)組(n＝6)，每隔1日于股四頭肌處(腰神經(jīng)L 2-3支配)注射CB-兔抗P物質(zhì)IgG偶聯(lián)結(jié)合物(含20μg兔IgG)。
I.CB-兔抗P物質(zhì)IgG肌注股四頭肌[腰段脊髓支配]對(duì)甩尾痛閾的影響(見圖5)[甩尾痛反應(yīng)為脊髓骶尾段支配]實(shí)驗(yàn)處理(C)及假處理(B)的注射均歷時(shí)三周；自第一周至第四周(停止注射處理后一周)測(cè)A，B，C組動(dòng)物的甩尾痛閾，每周三日(次)，每次測(cè)試8回；測(cè)痛的刺激儀為AusBio G16型(AusBio Pty Ltd)，刺激參數(shù)固定為N-6.6(大鼠)，N-4.4(小鼠)，定距電熱灼痛，記錄甩尾痛閾值(sec)。
A組痛閾值平均5(SEM＝2)，B組痛閾值平均5(SEM＝2.5)，沒有明顯差異(p＞0.05)。把A組的痛閾值(sec)作為基礎(chǔ)(轉(zhuǎn)換為100％)，C組的痛閾值在處理后的第二周及第三周分別提高為180％(SEM＝10)及200％(SEM＝12)，與A，B組比較具有明顯的差異(p＜0.05)。停止注射處理后一周動(dòng)物(n＝3)的痛閾有恢復(fù)趨勢(shì)，最后一天C組動(dòng)物的測(cè)痛痛閾值平均5(SEM＝2.5)，表明痛閾已恢復(fù)正常，與A，B組無明顯差異(p＞0.05)。實(shí)驗(yàn)說明CB-兔抗P物質(zhì)IgG具有抗痛作用，明顯提高了痛閾。結(jié)果見圖5。
II.兔抗P物質(zhì)IgG在脊髓內(nèi)的免疫細(xì)胞化學(xué)分析在實(shí)驗(yàn)的第三周末犧牲A(n＝2)，B(n＝2)，C(n＝3)組的大、小鼠各7只，取腰骶尾髓做冰凍切片(30um)，用Vector羊抗兔ABC試劑盒做脊髓切片的免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)。以顯微分光光度儀(Nikon-CA)掃描檢測(cè)各組動(dòng)物脊髓切片灰質(zhì)(Rexed II-VII層)免疫反應(yīng)產(chǎn)物的光密度值OD。把A，B組的OD作為100％(SEM＝10)與C組分析比較。結(jié)果C組腰髓的OD值是200％(SEM＝10)，骶尾髓的OD值分別是185％(SEM＝12)，180％(SEM＝12)；與A，B組相比均具有明顯差異(p＜0.05)。OD半定量實(shí)驗(yàn)說明兔抗P物質(zhì)IgG已進(jìn)入腰髓并有跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)一步到達(dá)了骶尾髓的Rexed II-VII層灰質(zhì)。
P物質(zhì)是疼痛遞質(zhì)，抗P物質(zhì)IgG可以中和P物質(zhì)的功能而發(fā)揮抗痛作用。周圍注射抗P物質(zhì)IgG，其抗痛作用最多只能一時(shí)性地表現(xiàn)在注射的局部，且由于血循的稀釋，作用并不明顯。本實(shí)驗(yàn)中，CB-兔抗P物質(zhì)IgG內(nèi)免疫細(xì)胞化學(xué)分析的實(shí)驗(yàn)證明了兔抗P物質(zhì)IgG確已進(jìn)入了腰骶尾髓的Rexed II-VII層灰質(zhì)。注射部位(股四頭肌)是腰髓支配，不跨細(xì)胞的軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)只到腰髓；本實(shí)驗(yàn)證明了抗P物質(zhì)IgG在脊髓的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)(已從腰髓轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)骶尾髓)。進(jìn)入骶尾髓的抗體中和了疼痛遞質(zhì)P物質(zhì)，這是CB-兔抗P物質(zhì)IgG能提高動(dòng)物甩尾痛閾的機(jī)理所在(甩尾運(yùn)動(dòng)為骶尾髓支配)。持續(xù)了一個(gè)時(shí)期的抗痛作用，只能以抗P物質(zhì)IgG進(jìn)入骶尾脊髓中樞的作用來解釋。
功能性IgG抗體在中樞神經(jīng)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的再次證明，并說明CB-治療性抗體IgG偶聯(lián)結(jié)合物靶向性地輸入腦脊髓能有良好的治療效果，這也是設(shè)計(jì)CB-Anti betaA經(jīng)鼻腔嗅神經(jīng)進(jìn)入大腦治療老年癡呆可行性的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[beta淀粉樣蛋白1-42對(duì)大腦的毒性已有大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)]。用CB-Anti betaA IgG滴鼻進(jìn)入大腦中滅活或中和導(dǎo)致老年癡呆較好的根治方法)。當(dāng)前，尚無兼顧AD老年癡呆兩大發(fā)病機(jī)理(膽堿能學(xué)說及beta Amyloid毒性學(xué)說)的藥物，本發(fā)明的CB-Anti betaA加CB-NGF的復(fù)方，第一次提供了這種對(duì)AD治本的新藥物。
腦脊髓損傷后，膠質(zhì)細(xì)胞釋放抑制再生的Nogo蛋白是截癱、偏癱的原兇。而在機(jī)體外周應(yīng)用抗Nogo的特異性抗體，大分子IgG不能通過血腦屏障發(fā)揮使Nogo失活的作用。通過與神經(jīng)元GM1特異親和的CB-IgG，則可把抗Nogo的特異性抗體IgG經(jīng)過神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)投藥繞開血腦屏障，直接進(jìn)入中樞神經(jīng)使Nogo失活，可有效地治療腦脊髓損傷(截癱、偏癱等)。
一些病毒性腦脊髓炎雖有預(yù)防疫苗，已近于根除(如polio小兒麻痹)。但一些病毒性腦炎及病毒性腦脊髓炎仍常發(fā)病，并有很高的致殘率及死亡率。親神經(jīng)病毒均在神經(jīng)胞體內(nèi)衍繁，破壞神經(jīng)細(xì)胞，釋放新病毒再感染相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞。CB偶聯(lián)不同類型抗病毒特異性抗體的神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)投藥，使特異性IgG能在被感染的細(xì)胞內(nèi)有效地殺滅病毒，提供了對(duì)病毒性腦炎及病毒性腦脊髓炎治療的新藥物及方法。
“CB與特異性抗體IgG的偶聯(lián)物及其醫(yī)藥用途”的創(chuàng)新發(fā)明具有重大的醫(yī)學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3(見圖6照片1-12及圖7)CB-CNTF及CB-MnA(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元抗原蛋白)治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)I.CB-CNTF及CB-MnA(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元抗原蛋白)的偶聯(lián)制備(已見制備實(shí)施例4-5)分別用S-S法及戊二醛GA法。CNTF購自Sigma；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元抗原蛋白(MnA)按Engelhardt et al.，的方法(J NeurosciMethods 1985，15219)由鮮屠豬的頸段及上胸段脊髓分離前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體[見圖6照片1]作勻漿，電泳提取高分子量(150-180kD)蛋白作為MnA。
II.運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(MND)的免疫動(dòng)物模型以剛屠宰后的豬脊髓(頸及上胸段)前角組織勻漿(SAH)1ml(含蛋白6mg)加1ml完全福氏佐劑接種于Lewis大鼠背部皮下(10點(diǎn))，一周后以相同劑量(用不完全福氏佐劑)作第二次接種。從第二周以后即出現(xiàn)程度不同的后肢無力、癱瘓、體重下降(圖6照片9-10)，最后呼吸衰竭死亡。病理組織切片檢查可見脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性及喪失；MND模型動(dòng)物的血清(稀釋1∶800)可以作為第一抗體用于免疫組化反應(yīng)、可染出另一大鼠或小鼠的前角運(yùn)動(dòng)細(xì)胞，免疫組化陽性(圖6照片8)，證明血清中存在抗運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的特異性抗體。正常對(duì)照Lewis大鼠(同樣的佐劑皮下注射)無任何癥狀及脊髓組織病理改變，其血清(稀釋1∶40)不能染出大鼠或小鼠的前角運(yùn)動(dòng)細(xì)胞，免疫組化陰性(圖6照片7)，說明其中不存在抗運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的特異性抗體。
III.CB-CNTF及CB-MnA治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的明顯療效[圖7]1組)5只免疫損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(MND)的Lewis大鼠，在SAH免疫接種后的26天內(nèi)全部死亡。免疫接種一周后的‘爬坡運(yùn)動(dòng)功能測(cè)驗(yàn)’評(píng)分2-0分[免疫接種一周后，讓動(dòng)物爬30度50cm長的斜坡，每周測(cè)試2次；正常動(dòng)物爬坡流利順當(dāng)，后肢的支撐有力，為5分；后肢支撐力不大，但尚能爬30-40cm，為4分；20-30cm為3分；10-20cm為2分；后肢支撐無力，但稍能邁動(dòng)，為1分；不能邁動(dòng)，后肢向后拖洩、癱瘓(如圖6照片10)，為0分]2組)經(jīng)CB-MnA/MnA滴鼻治療2周的5只免疫損傷MND的Lewis大鼠，在免疫接種后的4至6周間死亡2只，其余3只存活。[治療期為免疫接種后的1-3周；滴鼻劑量為每次相當(dāng)于MnA 30mu g的CB-MnA/MnA液20ul，隔日一次]。免疫接種一周后的‘爬坡運(yùn)動(dòng)功能測(cè)驗(yàn)’評(píng)分3-0分；3只存活的大鼠在6周以后的評(píng)分為3-4分。實(shí)驗(yàn)表明CB-MnA/MnA滴鼻有治療效果。[這實(shí)驗(yàn)的CB-MnA/MnA混合液中的CB是起黏膜免疫的佐劑作用，CB-MnA含量低。經(jīng)用1)組大鼠的血清為免疫組化的第一抗體做本組動(dòng)物嗅球切片的免疫組化反應(yīng)，染色微弱，也表明CB-MnA向中樞的逆行軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)很少]。
3組)經(jīng)CB-CNTF肌肉注射治療2周的5只免疫損傷MND的Lewis大鼠在免疫接種后的4至6周間死亡2只，其余3只存活。[治療期為接種后的1-3周；肌肉注射的劑量為每次相當(dāng)于CNTF 4μg的CB-CNTF100ul隔日一次，分十點(diǎn)注射于雙側(cè)的股四頭肌、肱二頭肌及頸項(xiàng)部肌]。免疫接種一周后的‘爬坡運(yùn)動(dòng)功能測(cè)驗(yàn)’評(píng)分3-0分；3只存活的大鼠在6周以后的評(píng)分為3-4分。實(shí)驗(yàn)表明CB-CNTF肌肉注射有治療效果。
4組)經(jīng)CB-CNTF肌肉注射治療又復(fù)合CB-MnA/MnA滴鼻治療，共作3周療程的5只免疫損傷MND的Lewis大鼠全部存活12周，無一死亡。肌肉注射的劑量為每次相當(dāng)于CNTF 4μg的CB-CNTF 100ul每日一次，分十點(diǎn)注射于雙側(cè)的股四頭肌、肱二頭肌及頸項(xiàng)部肌]。免疫接種一周后的‘爬坡運(yùn)動(dòng)功能測(cè)驗(yàn)’評(píng)分一直持續(xù)為4-5分。實(shí)驗(yàn)表明CB-CNTF肌肉注射復(fù)合CB-MnA/MnA滴鼻有很明顯的治療效果。
病理組織切片檢查1組)，2組)及3組)的死亡動(dòng)物均可見脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性及喪失。(圖6照片2，4，5，6與正常對(duì)的照片3比較)2組)，3組)存活的大鼠以及4組)存活大鼠，在12周犧牲做組織切片檢查，未發(fā)現(xiàn)明顯的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性及膈神經(jīng)的髓鞘纖維喪失。以其血清作為第一抗體(稀釋1∶40)均不能與Wistar大鼠的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生免疫組化反應(yīng)(一如圖6照片7)。
以非結(jié)合態(tài)的辣根過氧化物酶(HRP)在中度免疫損傷大鼠脛前肌及正常大鼠脛前肌做同等計(jì)量的肌肉注射，做顯示HRP逆行軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)的組化反應(yīng)，兩者的染色無大差別(圖6照片11，12)。中度免疫損傷大鼠逆行標(biāo)記的細(xì)胞柱在細(xì)胞數(shù)較多的切片處(圖6照片12)與正常大鼠細(xì)胞數(shù)較少處(圖6照片11)深染的細(xì)胞無大差別，甚至較深重。說明即使在中度免疫損傷大鼠，逆行軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)的功能仍存在，可以轉(zhuǎn)運(yùn)CB偶聯(lián)制劑。
在圖7中，顯示了CB-CNTF復(fù)合CB-MnA/MnA治療免疫損傷MND大鼠的存活比較圖。
方塊框死亡三角箭頭治療箭頭0免疫接種豬脊髓前角組織(SAH)縱坐標(biāo)動(dòng)物數(shù)(免疫損傷的Lewis大鼠)橫坐標(biāo)存活周數(shù)1組(紅線)MND(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病)免疫損傷模型(3-4周全部死亡)2組(綠線)CB-MnA(豬運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元抗原蛋白)治療MND免疫損傷(2只死亡，3只存活)3組(中等綠線)CB-CNTF(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)治療MND免疫損傷(2只死亡，3只存活)4組(粗綠線)CB-CNTF及CB-MnA復(fù)合治療MND免疫損傷(全部存活)以上實(shí)驗(yàn)說明CB-CNTF，CB-MnA的復(fù)合治療已使免疫型MND動(dòng)物模型得到存活治愈，并無明顯副作用。
人類的MND(側(cè)索硬化肌無力ALS，amyotrophic lateral sclerosis等)是危害極大的不治之癥，40至70歲發(fā)病，3-5年內(nèi)幾全部死亡，病因不明，目前尚無特效藥物。[有的科研工作認(rèn)為編碼Cu/Zn SOD超氧歧化酶的基因變異可能與之有關(guān)]。二十世紀(jì)90年代的實(shí)驗(yàn)工作發(fā)現(xiàn)CNTF，BDNF能保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，曾以CNTF作臨床試用(皮下給藥)因副作用很大，未能在臨床推廣[Clin Neuropharmacol 1995，18(6)515-32；Arch Neurol 1996，53(2)141-7]。本發(fā)明的CB-CNTF，CB-MnA/MnA復(fù)方具有很大的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3說明了CB佐劑自身免疫原CB-MnA/MnA的黏膜免疫調(diào)節(jié)(對(duì)自身免疫原產(chǎn)生了耐受性)復(fù)合以CB-神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合治劑(CB-CNTF，CB-BDNF等)神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)投藥的靶向性神經(jīng)營養(yǎng)治療，會(huì)是緩解、治療和預(yù)防現(xiàn)為不治之癥的退行性神經(jīng)疾患運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病ALS等的最好戰(zhàn)略。
權(quán)利要求
1.霍亂原B亞基作為配基/載體與對(duì)腦脊髓疾病或損傷有治療作用的抗體IgG的偶聯(lián)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述對(duì)腦脊髓疾病或損傷有治療作用的抗體IgG選自抗β淀粉樣蛋白1-42的IgG；對(duì)疼痛遞質(zhì)的抗體，其中包括抗P物質(zhì)IgG；對(duì)親神經(jīng)病毒的抗體IgG；抗白介素-1受體的抗體；抗Nogo蛋白的IgG；和抗運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體IgG的相關(guān)多肽蛋白(MnA)。
3.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1或2的一種或多種偶聯(lián)物和可藥用的輔劑及增強(qiáng)劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于將霍亂原B亞基與抗體IgG連接起來形成偶聯(lián)物，且所述偶聯(lián)物了保持霍亂原B亞基以及抗體IgG的生物活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于將霍亂原B亞基的氨基或羧基與抗體IgG的羧基或氨基經(jīng)過醛基連接起來；或?qū)肓驓浠蚨蛲远蜴I連接起來，形成偶聯(lián)物，且所述偶聯(lián)物保持了霍亂原B亞基以及抗體IgG的生物活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的偶聯(lián)物在制備經(jīng)外周神經(jīng)受體介導(dǎo)入胞、軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入中樞神經(jīng)的藥物的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述偶聯(lián)物經(jīng)神經(jīng)膜上的神經(jīng)節(jié)苷酯寡糖受體介導(dǎo)入胞、軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)，從周圍進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并進(jìn)一步在腦脊髓內(nèi)作跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)投藥。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2的偶聯(lián)物的制備用于治療和/或預(yù)防腦脊髓疾病或損傷的藥物的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述腦脊髓疾病或損傷包括退行性神經(jīng)疾患，其選自阿滋海默氏老年性癡呆、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?。徊《拘阅X炎及病毒性腦脊髓炎；腦脊髓損傷，其選自中風(fēng)、腦血栓、腦缺血、腦外傷、脊髓外傷、截癱和偏癱。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種安全、無創(chuàng)、無毒副作用，而又高效進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞的、GM1的‘外源配基CB’與特異性免疫球蛋白IgG的CB－IgG偶聯(lián)制劑CB－抗A.beta IgG；CB－抗病毒的特異性IgG；CB－MnA(MnA是抗運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體IgG的相關(guān)蛋白)；CB－抗IL－1受體的IgG；CB－抗Nogo IgG等。這些大分子新藥制劑能繞開‘血腦屏障’，經(jīng)過‘神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)投藥’進(jìn)入腦或脊髓實(shí)質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，有效地防治老年癡呆(CB－抗A beta 1－42的IgG)；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(CB－MnA)；腦脊髓損傷(CB－抗Nogo IgG治療中風(fēng)、腦?；蚪匕c、偏癱)，以及各種特異性對(duì)抗不同病毒的IgG，直接介導(dǎo)入神經(jīng)細(xì)胞胞體滅活病毒，以根治病毒性腦炎或腦脊髓炎。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1679963SQ200510006768
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者萬選才, 李小銀 申請(qǐng)人:萬選才, 李小銀