專利名稱：A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別是涉及一個A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因及其編碼蛋白與其在制備A型肉毒毒素疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肉毒毒素(Botulinum Toxin，BoNT)是目前已知毒力最強(qiáng)的蛋白，1.0g肉毒毒素結(jié)晶物足以殺死100萬人，由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)在厭氧環(huán)境中產(chǎn)生的外毒素有7個血清型(A-G)，其中，A、B型肉毒毒素是致人中毒的常見型，E、F型偶爾引起食物中毒流行，C、D型則僅引起動物、禽類中毒，G型引起中毒的報道較少。臨床觀察表明，A型肉毒毒素相比其它型可引起更嚴(yán)重的中毒癥狀，并導(dǎo)致更高的死亡率。肉毒毒素中毒在人群中發(fā)病機(jī)率小，但其毒性大，致死率高，對公共衛(wèi)生安全危害極大，必須引起人們的高度重視。由于產(chǎn)生肉毒毒素的肉毒梭菌在自然界廣泛存在，并且其芽孢對外界環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，肉毒毒素中毒仍然是一個十分嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。近年，我國許多地區(qū)均發(fā)生數(shù)例肉毒中毒的疫情，甚至有群體肉毒毒素中毒事件發(fā)生。尤其是A型肉毒毒素還被數(shù)十個國家(如前蘇聯(lián)和伊拉克)用于制造生物武器，同時其也可被恐怖組織利用以制造生物恐怖。因此，進(jìn)行肉毒毒素的防治研究無論是對國家生物安全，公共衛(wèi)生安全，還是對人們的生命健康安全都具有重要的實際意義。
目前，類毒素疫苗(PBT)由于存在許多缺點，如工藝復(fù)雜、有危險性、保護(hù)性不好、免疫周期長，無法進(jìn)行推廣應(yīng)用，且未能獲得FDA批準(zhǔn)，因此，研制高效、安全、方便的新型疫苗勢在必行。肉毒毒素由二硫鍵連接的兩條鏈組成(輕鏈50KD、重鏈100KD)，輕鏈?zhǔn)荁oNT的毒性成分，而重鏈?zhǔn)墙Y(jié)合神經(jīng)細(xì)胞的毒素受體，是保護(hù)性結(jié)合和進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞所必需的，但其本身不具神經(jīng)毒性。重鏈的50KDa C末端(簡稱為Hc)參與神經(jīng)特異性結(jié)合，免疫學(xué)實驗已證明此受體區(qū)是保護(hù)性抗原。肉毒毒素新型疫苗研究主要集中在重組蛋白Hc亞單位疫苗和核酸疫苗兩個方向，此新型疫苗較類毒素疫苗有以下優(yōu)點費用低，生產(chǎn)過程較安全，多次免疫后可以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
在大腸桿菌中有效地表達(dá)Hc片段能夠保護(hù)小鼠抵御高劑量的肉毒毒素攻擊，具有良好的免疫原性。但惟一不盡如人意之處是以前無論是原始的，還是優(yōu)化序列人工合成的A型肉毒毒素Hc基因在大腸桿菌中重組蛋白的表達(dá)量較低，常常為包涵體，并且產(chǎn)物不穩(wěn)定，這在一定程度上限制了它的使用。為了解決重組蛋白Hc的表達(dá)問題，研究人員嘗試?yán)媒湍赶到y(tǒng)中高效表達(dá)A型肉毒毒素重組蛋白Hc并獲得成功，人工合成的A型肉毒毒素Hc基因已經(jīng)在酵母系統(tǒng)中得到了高效表達(dá)(Smith LA.，Toxicon，1998，361539-1548)，此外，用純化的重組蛋白Hc免疫動物(小鼠和非人類靈長類動物)可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對高劑量的肉毒毒素的保護(hù)性免疫反應(yīng)。下一個里程碑是以其為候選Hc亞單位疫苗進(jìn)行臨床試驗。最近，有兩篇文獻(xiàn)報道原始的A型肉毒毒素Hc基因在大腸桿菌中得到了有效地可溶性表達(dá)，其純化的表達(dá)水平為10-20mg/L，所用的原核表達(dá)載體為pET28，表達(dá)條件為在25℃或16℃下培養(yǎng)20小時或過夜(MahmoodTavallaie，et al，F(xiàn)EBS，2004，572299-306；Baldwin MR，et al，Infection andImmunity，2005，73(10)6998-7005)。天然的A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc片段基因序列A和T含量高達(dá)76％，并且經(jīng)常出現(xiàn)連續(xù)的A和T串，另外，遍布整個基因序列有大量的稀有密碼子出現(xiàn)，使得該天然的基因在異種宿主細(xì)胞中的表達(dá)存在一定困難并且表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，產(chǎn)量極低。本發(fā)明的發(fā)明人曾嘗試直接PCR擴(kuò)增原始的BoNT/A Hc基因，再將其克隆入原核表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果Hc的表達(dá)水平很低并且為包涵體，與前人的實驗結(jié)果一致(LaPenotiere HF，et al.，Toxicon，1995，331383-1386)。
肉毒毒素的新型疫苗發(fā)展的另一個研究方向是研究肉毒毒素核酸疫苗。DNA疫苗優(yōu)于類毒素疫苗和亞單位疫苗的主要優(yōu)點是，操作簡便靈活、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品易于純化并方便儲藏。生產(chǎn)DNA疫苗不需要培養(yǎng)病原菌，較類毒素疫苗具有更高的生產(chǎn)安全性。抗原蛋白在免疫動物的細(xì)胞中產(chǎn)生，不需要進(jìn)行蛋白純化，較亞單位疫苗使用更加方便。有兩篇文獻(xiàn)報道用含有A型肉毒毒素Hc基因的傳統(tǒng)DNA載體免疫小鼠后，能夠產(chǎn)生對A型肉毒毒素的保護(hù)作用(Jennifer Clayton，et al.，Vaccine，2000，181855-1862；Shyu RH，et al.，J Biomed Sci，2000，751-57)。但是，DNA疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體水平較低，其相應(yīng)的保護(hù)作用不高。復(fù)制型核酸疫苗是一種新型疫苗，它具有諸多優(yōu)點，如仍具有復(fù)制子載體的全部特點，DNA制備簡單、成本低，疫苗更加安全，不像重組病毒顆粒疫苗存在病毒污染問題，也不像傳統(tǒng)DNA疫苗，可能發(fā)生DNA整合到基因組，它是“自殺性”DNA疫苗，具有良好的安全性。到目前為止，利用基于DNA的SFV復(fù)制子研制A型肉毒毒素新型核酸疫苗還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個可激發(fā)機(jī)體對A型肉毒毒素產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因。
本發(fā)明所提供的A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因，名稱為HcA，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激發(fā)機(jī)體對A型肉毒毒素產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO1由1287個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1287堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA編碼的蛋白(HcA)，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO2；2)將序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有激發(fā)機(jī)體對A型肉毒毒素產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO2由429個氨基酸殘基組成。
所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產(chǎn)生影響。
含有本發(fā)明基因HcA的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
含有本發(fā)明基因HcA的表達(dá)載體包括原核表達(dá)載體、傳統(tǒng)真核表達(dá)載體及基于DNA的復(fù)制子載體等。
所述重組原核表達(dá)載體中A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA的上游還可連接有硫氧還蛋白基因Trx(來源于Novagen公司的pET-32a(+)載體中的Trx基因序列，位于該載體的自5’端第366-692堿基處，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO8，編碼109個氨基酸殘基)。
用于構(gòu)建含有本發(fā)明A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA的重組原核表達(dá)載體的出發(fā)載體為任意一種原核表達(dá)載體，如pET-22b(+)、pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a等。
以pET-22b(+)為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA和硫氧還蛋白基因Trx的重組原核表達(dá)載體為pTIG-Trx-Hc。
用于構(gòu)建含有本發(fā)明A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA的傳統(tǒng)真核表達(dá)載體的出發(fā)載體為任意一種真核表達(dá)載體，如pcDNA(pcDNA3.1(+)等)、pCMV5、pSilence1.0-U6(Ambion，Austin，TX，USA)、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo(購于Promega公司)、pTEF1、pPICZα、pAM82或pAAh5等。
以pcDNA3.1(+)為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA的重組真核表達(dá)載體為pcDNASHc。
為使HcA分泌到胞外，所述基于DNA的復(fù)制子表達(dá)載體中A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA的5’端還可連接有分泌信號肽(Murine Ig□-chain V-J2-C signalpeptide，簡稱S)編碼序列(來源于pSecTag，Invitrogen公司)，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO6，編碼序列表中SEQ ID NO7的氨基酸序列。
用于構(gòu)建含有本發(fā)明A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA的復(fù)制子表達(dá)載體的出發(fā)載體為任意一種復(fù)制子表達(dá)載體，如pSCAR(余云舟等，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2006，33(1)87-94)。
以pSCAR為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA和分泌信號肽S編碼序列的復(fù)制子表達(dá)載體為pSCARSHc。
上述重組表達(dá)載體可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
擴(kuò)增HcA中任一片段的引物對也是本發(fā)明要保護(hù)的。
本發(fā)明還提供了一種表達(dá)上述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼蛋白HcA的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)上述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼蛋白HcA的方法，是將上述含有A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼蛋白HcA。
所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。
所述大腸桿菌可為E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS或E.coli Top10等。
所述酵母菌優(yōu)選為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏畢赤酵母優(yōu)選為巴氏畢赤酵母GS115、KM71(購自美國Invitrogen公司)或SMD1168(購自美國Invitrogen公司)。
上述重組菌可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
培養(yǎng)含有A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。其中，培養(yǎng)所述重組大腸桿菌宿主時需加入誘導(dǎo)劑，如IPTG等，所加入IPTG的濃度為0.1-1.0mmol/L，優(yōu)選為0.2mmol/L，誘導(dǎo)溫度為16-37℃，優(yōu)選為30℃，誘導(dǎo)時間為2-4小時，優(yōu)選為3小時。
本發(fā)明的A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因可用于制備A型肉毒毒素核酸疫苗，該基因的編碼蛋白可用于制備A型肉毒毒素亞單位疫苗。
所述DNA疫苗中的A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因可存在于基于DNA的復(fù)制子表達(dá)載體中，其中，以pSCAR為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA和分泌信號肽S編碼序列的復(fù)制子表達(dá)載體為pSCARSHc。
需要的時候，以A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼蛋白制備的A型肉毒毒素亞單位疫苗中還可以融入顆粒白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一種或多種細(xì)胞因子的基因或蛋白質(zhì)作為分子免疫佐劑。
本發(fā)明的疫苗可以制成注射液、干粉針劑或噴霧劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述核酸疫苗和亞單位疫苗的用量可采用藥學(xué)領(lǐng)域中核酸疫苗和亞單位疫苗的常規(guī)劑量，如3-30μg(核酸疫苗)和1-10μg(亞單位疫苗)，并可根據(jù)實際情況調(diào)整。
本發(fā)明提供了一個A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA及其編碼蛋白。該基因是根據(jù)A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc片段的基因序列和氨基酸殘基序列優(yōu)化后得到的，使A和T含量由76％降低至57％，并用大腸桿菌常用的密碼子替代稀有密碼子，同時兼顧真核細(xì)胞常用的密碼子，并保證所編碼的氨基酸殘基序列不變。將上述HcA基因克隆到原核表達(dá)載體中構(gòu)建得到原核表達(dá)載體pTIG-Trx-Hc，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌(例如BL21(DE3)等)后培養(yǎng)重組菌，可使A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA在宿主菌中獲得了高效可溶性表達(dá)，可溶性表達(dá)產(chǎn)物占細(xì)菌可溶性總量的36％以上，經(jīng)一步小量純化可獲得30mg/L以上的重組蛋白HcA，用其免疫動物能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的高滴度ELISA抗體、中和抗體及細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，并能對抗A型肉毒毒素的攻擊，實驗證明，A型肉毒毒素重組蛋白HcA以1μg劑量免疫二次或三次即可保護(hù)106LD50A型肉毒毒素的攻擊，表明本發(fā)明的重組蛋白HcA具有良好的免疫原性，可用于制備A型肉毒毒素亞單位疫苗。此外，針對傳統(tǒng)DNA載體免疫后產(chǎn)生的免疫保護(hù)力仍不夠強(qiáng)的缺點，本發(fā)明還將上述基因HcA克隆到基于DNA的SFV復(fù)制子載體中構(gòu)建得到了SFV復(fù)制子載體，與所構(gòu)建的含有HcA的傳統(tǒng)真核表達(dá)載體pcDNASHc相比，復(fù)制子載體可產(chǎn)生更高水平的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且所需免疫劑量更低，該復(fù)制子DNA載體能夠保護(hù)免疫動物免受更高水平的A型肉毒毒素的攻擊，可用于制備A型肉毒毒素核酸疫苗。本發(fā)明的A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA及其編碼蛋白將在制備A型肉毒毒素疫苗中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為制備抗A型肉毒毒素的亞單位疫苗和核酸疫苗的技術(shù)路線2為HcA大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖3為經(jīng)親和層析純化的重組HcA的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖4為含HcA的基于DNA的SFV復(fù)制子載體pSCARSHc和傳統(tǒng)的真核表達(dá)載體pcDNASHc的部分結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。
實施例1、A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因HcA的獲得根據(jù)A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc片段的基因序列和氨基酸殘基序列(BoNT/A，A62，國際標(biāo)準(zhǔn)株，序列號M30196)優(yōu)化Hc基因，使A和T含量由76％降低至57％，并用大腸桿菌常用的密碼子替代稀有密碼子，同時兼顧真核細(xì)胞常用的密碼子，并保證所編碼的氨基酸殘基序列不變，再根據(jù)優(yōu)化后基因序列設(shè)計23對(46條)引物人工合成該基因片段，引物序列如下23條正向引物序列如下(5’-3’端)F1 CGGAATTCACCATGGCTGAATACATCAAGF2 AACATCATCAATACCTCCATCCTGAACCTGCGTTACGAATCCAATCACCTGATCGACCTF3 GTCTCGTTACGCTTCCAAAATCAACATCGGTTCTAAAGTTAACTTCGATCCAATCGACAF4 AGAATCAGATCCAGCTGTTCAATCTGGAATCTTCCAAAATCGAAGTTATCCTGAAGAATF5 GCTATCGTATACAACTCTATGTACGAAAACTTCTCCACCTCCTTCTGGATTCGTATCCCF6 AAAATACTTCAACTCCATCTCTCTGAACAATGAATACACCATCATCAACTGCATGGAAAF7 ACAATTCTGGTTGGAAAGTATCTCTGAACTACGGTGAAATCATCTGGACTCTGCAGGACF8 ACTCAGGAAATCAAACAGCGTGTTGTATTCAAATACTCTCAGATGATCAACATCTCTGAF9 CTACATCAATCGTTGGATCTTCGTTACCATCACCAACAATCGTCTGAATAACTCCAAAAF10 TCTACATCAACGGCCGTCTGATCGACCAGAAACCAATCTCCAATCTGGGTAACATCCACF11 GCTTCTAATAACATCATGTTCAAACTGGACGGTTGCCGTGACACTCACCGTTACATCTGF12 GATCAAATACTTCAATCTGTTCGACAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATCAAAGATCTGTF13 ACGACAACCAGTCCAATTCTGGTATCCTGAAAGACTTCTGGGGTGACTACCTGCAGTAC
F14 GACAAACCATACTACATGCTGAATCTGTACGATCCAAACAAATACGTTGACGTCAACAAF15 TGTAGGTATCCGTGGTTACATGTACCTGAAAGGTCCACGTGGTTCTGTTATGACTACCAF16 ACATCTACCTGAACTCTTCCCTGTACCGTGGTACCAAATTCATCATCAAGAAATACGCGF17 TCTGGTAACAAGGACAATATCGTTCGTAACAATGATCGTGTATACATCAATGTTGTAGTF18 TAAGAACAAAGAATACCGTCTGGCTACCAATGCTTCTCAGGCTGGTGTAGAAAAAATCTF19 TGTCTGCTCTGGAAATCCCAGACGTTGGTAATCTGTCTCAGGTAGTTGTAATGAAATCCF20 AAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAATGCAAAATGAATCTGCAGGACAACAATGGTAAF21 CGATATCGGTTTCATCGGTTTCCACCAGTTCAACAATATCGCTAAACTGGTTGCTTCCAF22 ACTGGTACAATCGTCAGATCGAACGTTCCTCTCGTACTCTGGGTTGCTCTTGGGAGTTCF23 ATCCCAGTTGATGACGGTTGGGGTGAACGTCCACTGCATCATCATCATCATCATTAAGCGGCCGCAAGCTTGGG與上述23條正向引物對應(yīng)的23條反向引物如下(5’-3’端)B1CCCAAGCTTGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCAGTGGB2ACGTTCACCCCAACCGTCATCAACTGGGATGAACTCCCAAGAGCAACCCAGAGTACGAGB3AGGAACGTTCGATCTGACGATTGTACCAGTTGGAAGCAACCAGTTTAGCGATATTGTTGB4AACTGGTGGAAACCGATGAAACCGATATCGTTACCATTGTTGTCCTGCAGATTCATTTTB5GCATTTGTTAGTGATACCCTGGTCGTTCTTGGATTTCATTACAACTACCTGAGACAGATB6TACCAACGTCTGGGATTTCCAGAGCAGACAAGATTTTTTCTACACCAGCCTGAGAAGCAB7TTGGTAGCCAGACGGTATTCTTTGTTCTTAACTACAACATTGATGTATACACGATCATTB8GTTACGAACGATATTGTCCTTGTTACCAGACGCGTATTTCTTGATGATGAATTTGGTACB9CACGGTACAGGGAAGAGTTCAGGTAGATGTTGGTAGTCATAACAGAACCACGTGGACCTB10TTCAGGTACATGTAACCACGGATACCTACATTGTTGACGTCAACGTATTTGTTTGGATCB11GTACAGATTCAGCATGTAGTATGGTTTGTCGTACTGCAGGTAGTCACCCCAGAAGTCTTB12TCAGGATACCAGAATTGGACTGGTTGTCGTACAGATCTTTGATTTCTTTTTCGTTCAGTB13TCTTTGTCGAACAGATTGAAGTATTTGATCCAGATGTAACGGTGAGTGTCACGGCAACCB14GTCCAGTTTGAACATGATGTTATTAGAAGCGTGGATGTTACCCAGATTGGAGATTGGTTB15TCTGGTCGATCAGACGGCCGTTGATGTAGATTTTGGAGTTATTCAGACGATTGTTGGTGB16ATGGTAACGAAGATCCAACGATTGATGTAGTCAGAGATGTTGATCATCTGAGAGTATTTB17GAATACAACACGCTGTTTGATTTCCTGAGTGTCCTGCAGAGTCCAGATGATTTCACCGTB18AGTTCAGAGATACTTTCCAACCAGAATTGTTTTCCATGCAGTTGATGATGGTGTATTCAB19TTGTTCAGAGAGATGGAGTTGAAGTATTTTGGGATACGAATCCAGAAGGAGGTGGAGAAB20GTTTTCGTACATAGAGTTGTATACGATAGCATTCTTCAGGATAACTTCGATTTTGGAAGB21ATTCCAGATTGAACAGCTGGATCTGATTCTTGTCGATTGGATCGAAGTTAACTTTAGAAB22CCGATGTTGATTTTGGAAGCGTAACGAGACAGGTCGATCAGGTGATTGGATTCGTAACGB23CAGGTTCAGGATGGAGGTATTGATGATGTTCTTGATGTATTCAGCCATGGTGAATTCCG。
如圖1中的步驟A-C所示，首先，通過人工拼接的方法(重疊延伸PCR)，利用23對引物相互互補將全長序列拼接為三段，分別命名為A、B和C，反應(yīng)結(jié)束后，對A、B和C三種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用購自鼎國公司的DNA回收試劑盒回收長度分別約為500bp、400bp和400bp的目的片段并對其進(jìn)行純化，將回收片段連接入到T-A載體pGEM-T(Promega公司)中，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN)，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，得到分別含有回收片段A、B、C的重組質(zhì)粒，分別命名為pGEM-T-A、pGEM-T-B、pGEM-T-C，對其進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明擴(kuò)增片段A具有序列表中的SEQ ID NO3的核苷酸序列，由484個堿基組成，編碼序列表中SEQ ID NO1中自氨基端第1-161位氨基酸殘基；擴(kuò)增片段B具有序列表中的SEQ ID NO4的核苷酸序列，由413個堿基組成，編碼序列表中SEQ ID NO1中自氨基端第162-299位氨基酸殘基；擴(kuò)增片段C具有序列表中的SEQ ID NO5的核苷酸序列，由390個堿基組成，編碼序列表中SEQ ID NO1中自氨基端第300-429位氨基酸殘基，再將B和C拼接，50μl PCR反應(yīng)體系為作為模板DNA的片段B和C各0.5μl，pfu Taq 0.5μl，10×PCR緩沖液(含Mg2+)5μl，dNTPs(各25mM)4μl，引物F10和B23各0.5μl，用ddH2O補充反應(yīng)體系至50μl，PCR反應(yīng)條件為先95℃3min；然后94℃50s，62℃50s，72℃60s，共25個循環(huán)；最后72℃10min，得到片段BC，最后將片段A和片段BC拼接，除模板外，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與上述相同，對拼接后獲得的目的片段進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA回收試劑盒回收長度分別為1287bp的目的片段并對其進(jìn)行純化，將回收片段連接入到載體pGEM-T中，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，得到含有目的片段的重組質(zhì)粒，命名為pGEM-Hc，對其進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明目的片段具有序列表中的SEQ ID NO1的核苷酸序列，由1287個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1287位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，位于A型肉毒毒素的868aa-1296aa間，蛋白分子量約為50KD。測序結(jié)果表明獲得了序列正確的經(jīng)優(yōu)化的全長Hc基因，將該基因命名為HcA，其編碼蛋白命名為HcA。
實施例2、原核表達(dá)載體pTIG-Trx-Hc的構(gòu)建及重組蛋白HcA在大腸桿菌中的表達(dá)與純化如圖1中的步驟D和E所示，用下述方法使HcA在大腸桿菌中獲得表達(dá)及純化，得到重組HcA一、原核表達(dá)載體pTIG-Trx-Hc的構(gòu)建硫氧還蛋白(Trx)是參與新生蛋白肽鏈折疊的輔助蛋白，當(dāng)重組蛋白HcA與之共表達(dá)時，它可促進(jìn)下游正在折疊的目的蛋白通過異構(gòu)反應(yīng)獲得正確的折疊，另外，也能夠增強(qiáng)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的二硫鍵的形成，使表達(dá)產(chǎn)物不易形成包涵體，能夠以可溶性形式表達(dá)，因此用下述方法構(gòu)建含有Trx基因的HcA基因的原核表達(dá)載體1、重組載體pTIG-Trx的構(gòu)建首先，通過普通PCR方法克隆(以載體pET-32a(+)為模板)硫氧還蛋白基因序列(來源于Novagen公司的pET-32a(+)載體中的Trx基因序列，位于該載體的自5’端第366-692位堿基處，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO8，編碼109個氨基酸殘基)，然后將獲得的Trx基因序列連接入質(zhì)粒載體pET-22b(+)(Novagen公司)的NdeI和EcoR I酶切位點之間，得到含有Trx基因的重組載體，命名為pTIG-Trx，其多克隆位點的后面具有編碼6個組氨酸的標(biāo)簽序列(pET-22b(+)自帶)，多克隆位點的結(jié)構(gòu)如下5’-Nde I-Trx-GCGGGATCCGG AATTCGA…-Sac I-Sal I-Hind III-Not I-XhoI-6His-TAG-3’RBS EcoR I。
2、原核表達(dá)載體pTIG-Trx-Hc的獲得以實施例1獲得的質(zhì)粒pGEM-Hc為模板，在引物F-HcE5’-GCCGGAATTC GAATACATCAAGAACATCATC-3’(帶單下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoR I識別位點，方框內(nèi)堿基為終止密碼子，帶雙下劃線堿基為起始密碼子)和引物R-HcX5’-CTAGCTCGAGAGTGGACGTTCACCCCAAC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶XhoI識別位點)的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增全長HcA基因序列，并在序列兩端分別添加EcoR I和Xho I識別位點，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA回收試劑盒回收長度約1300bp的目的片段并對其進(jìn)行純化，將回收片段用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切后與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pTIG-Trx連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，測序，測序結(jié)果表明得到了序列及插入位置均正確的HcA的原核表達(dá)載體，命名為pTIG-Trx-Hc。
二、HcA在大腸桿菌中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化1、HcA在大腸桿菌中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測將步驟一構(gòu)建的HcA的原核表達(dá)載體pTIG-Trx-Hc轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN公司)，篩選陽性重組子，以轉(zhuǎn)化有pTIG-Trx空載體的重組菌為陰性對照，然后按1∶100的比例將陽性重組菌接種至含100mg/mL氨芐青霉素的1000mL LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、250rpm下進(jìn)行大量培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600約為0.4-0.6)時加入化學(xué)誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.2mmol/L，在30℃下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時，分別于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)3小時和5小時后取樣。培養(yǎng)結(jié)束后，超聲打碎細(xì)胞，離心收集上清進(jìn)行12％SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖2所示(泳道1為誘導(dǎo)5小時的表達(dá)產(chǎn)物，泳道2為誘導(dǎo)3小時的表達(dá)產(chǎn)物，泳道3為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量，泳道4為未誘導(dǎo)對照，泳道5為空載體對照)，結(jié)果顯示經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白以可溶性方式表達(dá)，分子量約為50KD，與預(yù)期的分子量一致，而未誘導(dǎo)的菌株和誘導(dǎo)的空載體對照未出現(xiàn)該目的蛋白帶，說明所表達(dá)的蛋白可能就是目的蛋白HcA，且由圖2可以看出，在30℃下誘導(dǎo)表達(dá)3小時后蛋白的表達(dá)量可達(dá)到較高水平，經(jīng)分析，表達(dá)產(chǎn)物約占細(xì)菌可溶性總蛋白的36％，5小時后可達(dá)53％。
2、表達(dá)產(chǎn)物的純化、Western blot和ELISA鑒定及穩(wěn)定性檢測1)目的蛋白的純化步驟1所表達(dá)的重組蛋白HcA的C端含有六個組氨酸標(biāo)簽，因此用Ni-NTA親和層析柱(購自法瑪西亞公司)并參照說明書對可溶性表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化方法為先將超聲上清與平衡后的Ni-NTA親和層析樹脂結(jié)合，然后用含10-100mM咪唑(10T和100mM的濃度均進(jìn)行洗滌)的結(jié)合緩沖液洗滌，再用含500mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫，得到純化蛋白，然后對經(jīng)純化的蛋白進(jìn)行12％SDS-PAGE檢測，檢測結(jié)果如圖3所示(泳道1為低分子量蛋白Marker，分子量范圍14.4-116KD，泳道2為經(jīng)含500mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫后得到的純化產(chǎn)物，泳道3為PBS透析脫鹽后的產(chǎn)物)，檢測結(jié)果表明得到了高純度的目的蛋白，經(jīng)薄層掃描分析，純化到的蛋白質(zhì)純度達(dá)95％，產(chǎn)量可達(dá)30mg/L以上。
2)表達(dá)產(chǎn)物的Western blot和ELISA鑒定分別以鼠抗His-tag mAb(購自MERCK)和馬源抗BONT/A多抗(購自中國藥品生物制品檢定所)為一抗，以HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(購自Sigma公司)或HRP標(biāo)記兔抗馬IgG(購自北京中杉金橋生物有限公司)為二抗對空載體對照、誘導(dǎo)表達(dá)的超聲上清及純化的重組蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果誘導(dǎo)表達(dá)或經(jīng)純化的重組蛋白與鼠抗His-tag mAb和馬源抗BoNT/A多抗均能特異性結(jié)合，大小位置與電泳位置一致，分子量約為50KD，表明誘導(dǎo)表達(dá)或經(jīng)純化的重組蛋白即為目的蛋白HcA。另外，還用A型肉毒抗毒素對空載體對照、誘導(dǎo)表達(dá)的超聲上清及純化的重組蛋白進(jìn)行了ELISA檢測，結(jié)果A型肉毒抗毒素與表達(dá)并經(jīng)純化的BoN/A HcA蛋白具有特異結(jié)合活性，而與空載體誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物不結(jié)合，表明重組表達(dá)蛋白具有天然蛋白的分子構(gòu)象，可以被特異性抗毒素所識別。
3)重組蛋白HcA的穩(wěn)定性檢測從上述表達(dá)及純化過程中可見，表達(dá)的重組蛋白HcA比較穩(wěn)定，在表達(dá)及純化過程中沒有發(fā)生降解。為了進(jìn)一步鑒定純化的重組蛋白HcA在保存條件下的穩(wěn)定性，對在不同溫度下保存一定時期(4℃(1個月)，-20℃和-80℃(3個月和6個月))的重組蛋白HcA進(jìn)行12％SDS-PAGE檢測，結(jié)果純化的重組蛋白HcA在4℃(1個月)，-20℃和-80℃(3個月和6個月)均保持穩(wěn)定，即使是經(jīng)反復(fù)凍融也沒有發(fā)生降解，表明本發(fā)明用上述方法表達(dá)獲得的重組HcA具有較高的穩(wěn)定性。
實施例3、重組HcA蛋白亞單位疫苗免疫小鼠后體液和細(xì)胞免疫水平檢測及體內(nèi)中和活性測定以實施例2中表達(dá)并經(jīng)純化的重組蛋白HcA作為亞單位疫苗免疫小鼠，以檢測其免疫原性，具體方法為將Balb/c小(6-8周齡，雌性，SPF級，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)隨機(jī)分為4組，每組6只，免疫組I、II和III分別免疫10μg、5μg和1μg重組蛋白HcA，而對照組免疫不含重組蛋白HcA的PBS。免疫前，將重組蛋白HcA溶于200μlPBS，再與相同劑量的福氏完全佐劑(Sigma公司)按1∶1比例混合完全，然后皮下多點注射進(jìn)行初次免疫，2周后將相同劑量的重組蛋白HcA溶于200μl PBS后與相同劑量的福氏不完全佐劑(Sigma公司)按1∶1比例混合完全皮下多點注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，2周后再以相同劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次，皮下多點及腹腔注射免疫一次。每次免疫前，以及最后一次免疫后第2和第4周，小鼠尾部或眼球采血，分離血清，用ELISA法(用酶聯(lián)免疫板包被HcA抗原，濃度為2μg/mL，用分離的免疫小鼠血清為一抗，以HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(購自Sigma公司)為二抗)測定血清抗體。淋巴細(xì)胞的增殖能力是細(xì)胞免疫應(yīng)答的一個重要指標(biāo)，用MTS法測定淋巴細(xì)胞的增殖能力，方法為最后一次免疫后第4周取脾細(xì)胞，制備濃度為106個/mL的脾細(xì)胞懸液，在體外用抗原HcA，濃度為10μg/mL進(jìn)行刺激，4天后用MTS法檢測T細(xì)胞增殖能力。
ELISA檢測結(jié)果免疫一次后，免疫組I(10μg高劑量組)、II(5μg中劑量組)和III(1μg低劑量組)血清抗體滴度分別達(dá)到12800、6400和3200，隨著免疫次數(shù)的增加，抗體滴度也得到相應(yīng)提高，免疫4次后即可產(chǎn)生高水平的抗體滴度，分別達(dá)409600、409600和204800，并且對照免疫組血清與免疫前相比始終為陰性，上述檢測結(jié)果表明重組蛋白HcA免疫小鼠后可使其體內(nèi)產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體。
淋巴細(xì)胞的增殖能力的MTS法測定結(jié)果表明免疫組小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，其SI值分別為1.9、2.5和2.4，而對照免疫組小鼠的SI值為1.1(P＜0.05，差異顯著)。
上述檢測結(jié)果表明各劑量免疫組均能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生特異性的高滴度抗體并可引起細(xì)胞免疫應(yīng)答。
此外，還用經(jīng)典的體內(nèi)中和實驗測定了免疫小鼠血清抗體的體內(nèi)中和活性及中和抗體效價，方法為將免疫組I、II和III血清抗體按1∶10稀釋后能夠保護(hù)10LD50和100LD50A型肉毒毒素的攻擊；然后，進(jìn)一步將免疫組I血清抗體分別按1∶10、1∶100、1∶1000和1∶10000比例進(jìn)行稀釋后，用10LD50和100LD50A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，國際標(biāo)準(zhǔn)株，購自蘭州生物制品研究所)進(jìn)行攻擊，結(jié)果血清抗體按1∶1000稀釋時能夠完全保護(hù)10LD50A型肉毒毒素的攻擊，血清抗體按1∶10000比例稀釋時，也能部分保護(hù)10LD50A型肉毒毒素的攻擊，上述結(jié)果表明免疫小鼠血清中含有較高水平的A型肉毒毒素中和抗體，免疫血清也可中和體內(nèi)A型肉毒毒素，預(yù)防中毒，因此，本發(fā)明的HcA可用于制備高滴度免疫血清，用于體內(nèi)中和A型肉毒毒素(抗毒素)或用于制備A型肉毒毒素亞單位疫苗。
實施例4、檢測重組HcA蛋白亞單位疫苗免疫小鼠后對A型肉毒毒素的保護(hù)作用實施例3的實驗結(jié)果表明1μg重組蛋白HcA免疫小鼠3次后即可產(chǎn)生高滴度的抗體水平和中和抗體，用下述方法進(jìn)一步評價重組蛋白HcA免疫小鼠后對A型肉毒毒素保護(hù)作用用1μg重組蛋白HcA按實施例3的方法免疫二或三次的Balb/c小鼠(6-8周齡，雌性，SPF級，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)進(jìn)行攻毒試驗，以PBS免疫的小鼠為對照，統(tǒng)計存活率及時間，首先對1μg重組蛋白HcA免疫二次的小鼠用104LD50A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，國際標(biāo)準(zhǔn)株，購自蘭州生物制品研究所)進(jìn)行攻毒，結(jié)果如表1所示，表明其能保護(hù)A型肉毒毒素攻擊，隨后加大劑量，用105或106LD50A型肉毒毒素對二次免疫的其它組小鼠以及用105和106LD50A型肉毒毒素對經(jīng)三次免疫的小鼠進(jìn)行攻毒，結(jié)果如表1所示，表明這些免疫組小鼠均可保護(hù)A型肉毒毒素攻擊，并且免疫組小鼠無異常癥狀，但對照組小鼠用102LD50A型肉毒毒素進(jìn)行攻毒，小鼠均發(fā)生肉毒毒素中毒癥狀，在5小時內(nèi)死亡。以上試驗結(jié)果表明，HcA具有良好的免疫原性，以1μg劑量免疫二次即可保護(hù)106LD50A型肉毒毒素的攻擊，故可用于制備A型肉毒毒素亞單位疫苗，以預(yù)防A型肉毒毒素中毒。
表1 重組蛋白HcA免疫小鼠保護(hù)A型肉毒毒素攻毒的試驗結(jié)果

實施例5、HcA的SFV復(fù)制子載體和傳統(tǒng)真核表達(dá)載體的構(gòu)建用下述方法構(gòu)建含有本發(fā)明基因HcA的SFV復(fù)制子載體和傳統(tǒng)的真核表達(dá)載體一、HcA的SFV復(fù)制子載體的構(gòu)建pSFV1為Invitrogen公司的基于RNA的復(fù)制子表達(dá)載體，本發(fā)明的發(fā)明人以semliki森林病毒衍生的復(fù)制子載體pSFV1為骨架，通過在5′UTR上游克隆入CMV啟動子，在3′UTR下游插入BGH轉(zhuǎn)錄終止子序列和自我剪切核酶HDVr序列，將其改造成基于DNA的復(fù)制子載體系統(tǒng)，命名為pSCAR，該載體的部分結(jié)構(gòu)示意圖見圖4中的圖A，該復(fù)制子載體可在體內(nèi)外高水平表達(dá)外源基因，其詳細(xì)構(gòu)建方法見文獻(xiàn)(余云舟等，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2006，33(1)87-94)。首先，以質(zhì)粒pGEM-Hc為模板，在引物F-HcN5’-GCCGCATATGGGAATACATCAAGAACATCATCAATACCTCC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Nde I識別位點)和序列R-HcC5’-TGACATCGATTTACAGTGGACGTTCACCCCAAC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Cla I識別位點)的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增長度約為1.3kb基因HcA的全長序列，回收并純化該目的片段后，將其用限制性內(nèi)切酶Nde I和Cla I進(jìn)行雙酶切后與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pSCARS(在pSCAR的引入一個分泌信號肽編碼序列(即Ig□-chain leader sequence，命名為S(來源于pSecTag，Invitrogen公司)，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO6，編碼序列表中SEQ ID NO7的氨基酸序列)后得到的重組載體，該序列位于pSCAR的BamH I和Nde I酶切位點之間)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，測序，測序結(jié)果表明得到了序列及插入位置均正確的HcA的SFV復(fù)制子載體，命名為pSCARSHc，其部分結(jié)構(gòu)示意圖見圖4中的圖A。
二、HcA的傳統(tǒng)的真核表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟一構(gòu)建的含HcA的SFV復(fù)制子載體pSCARSHc用限制性內(nèi)切酶BamH I和SpeI進(jìn)行雙酶切后，回收并純化約2.0Kb的含有基因HcA的DNA片段，將其與經(jīng)相同酶雙酶切的載體的pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，測序，測序結(jié)果表明得到了序列及插入位置均正確的HcA的傳統(tǒng)真核表達(dá)載體，命名為pcDNASHc，其部分結(jié)構(gòu)示意圖見圖4中的圖B。
實施例6、HcA的SFV復(fù)制子載體和傳統(tǒng)真核表達(dá)載體體外表達(dá)A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc的檢測首先，將pSCARSHc轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞和CHO細(xì)胞(均購自ATCC公司)，以pSCAR空載體為對照，分別以實施例3獲得的重組蛋白HcA免疫小鼠后獲得的多抗血清和A型肉毒毒素抗毒素多抗(購自衛(wèi)生部北京生物制品研究所)為一抗，以HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(購自Sigma公司)和HRP標(biāo)記兔抗馬IgG(購自北京中杉金橋生物有限公司)為二抗，用免疫熒光法(IFA)檢測經(jīng)pSCARSHc轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞和CHO細(xì)胞，結(jié)果均呈陽性，而pSCAR空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞無熒光，檢測結(jié)果表明HcA在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中得到了表達(dá)。
然后，提取經(jīng)pSCARSHc轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞和CHO細(xì)胞，以及pSCAR空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白，再對上述總蛋白及上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，分別以重組蛋白HcA免疫小鼠后獲得的多抗血清和A型肉毒毒素抗毒素多抗為一抗，以HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(購自Sigma公司)和HRP標(biāo)記兔抗馬IgG(購自北京中杉金橋生物有限公司)為二抗進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果經(jīng)pSCARSHc轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞和CHO細(xì)胞，及其培養(yǎng)上清在50kDa位置有特異條帶產(chǎn)生，與HcA重組蛋白大小一致，而對照細(xì)胞中則無此條帶，表明HcA在pSCARSHc轉(zhuǎn)染細(xì)胞中獲得表達(dá)，pSCARSHc轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清中也含有BoNT/A Hc抗原，上述結(jié)果表明含分泌信號肽序列及HcA的SFV復(fù)制子載體能夠有效地分泌表達(dá)BoNT/A Hc抗原，即HcA。
另外，還用ELISA法檢測了分別經(jīng)pSCARSHc、pcDNASHc轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞和CHO細(xì)胞的裂解液與培養(yǎng)上清與A型肉毒抗毒素多抗和重組蛋白HcA免疫小鼠后獲得的多抗血清的特異結(jié)合活性，以pSCAR空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照，結(jié)果pSCARSHc和pcDNASHc轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞裂解液與培養(yǎng)上清均能與A型肉毒抗毒素多抗和重組蛋白HcA免疫小鼠后獲得的多抗血清特異結(jié)合，而與空載體對照不結(jié)合，表明重組表達(dá)蛋白HcA具有天然蛋白的分子構(gòu)象，可以特異性被A型肉毒抗毒素多抗識別。
實施例7、HcA的SFV復(fù)制子載體和傳統(tǒng)真核表達(dá)載體疫苗的免疫原性比較經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)制型DNA載體在低劑量時就可誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，其用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)DNA載體(Leitner WW，et al.，Cancer research，2000，60(1)51-55)。本實施例對不同劑量的HcA的SFV復(fù)制子載體(3-100μg)免疫小鼠后的免疫應(yīng)答反應(yīng)進(jìn)行了評價，同時以HcA的傳統(tǒng)DNA真核表達(dá)載體為對照。具體方法為分別用3μg、30μg和100μg的SFV復(fù)制子載體pSCARSHe和傳統(tǒng)DNA載體pcDNASHc分別免疫Balb/c小鼠(6-8周齡，雌性，SPF級，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)，每個劑量組6只小鼠，免疫途徑為腿部肌肉注射，共免疫4次，間隔2周，以pSCAR空載體免疫組為對照。免疫結(jié)束后28天，用ELISA法檢測小鼠的體液免疫水平，用免疫后小鼠血清為一抗，用以HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(購自Sigma公司)為二抗測定血清抗體。淋巴細(xì)胞的增殖能力是細(xì)胞免疫應(yīng)答的一個重要指標(biāo)，還用MTS法測定淋巴細(xì)胞的增殖能力，方法為最后一次免疫后第4周取脾細(xì)胞，制備濃度為106個/mL的脾細(xì)胞懸液，在體外用抗原HcA進(jìn)行刺激，4天后用MTS法檢測T細(xì)胞增殖能力。
ELISA法檢測結(jié)果為3μg和30μg SFV復(fù)制子載體pSCARSHc免疫小鼠的體液抗體水平高于100μg免疫組的抗體水平(P＜0.05，說明差異顯著)，是后者的6-7倍，達(dá)到12800-25600，表明DNA復(fù)制子疫苗在較低劑量時能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，而在較高的劑量(100μg)時反而不能產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，這種表現(xiàn)正是復(fù)制子疫苗的特點，也與大多數(shù)已報道的試驗結(jié)果一致。而與傳統(tǒng)DNA載體相比，復(fù)制子載體在低劑量時產(chǎn)生更高的抗體水平(P＜0.01，說明差異極顯著)，在3μg時提高了近50倍，30μg提高了13倍以上，體現(xiàn)了DNA復(fù)制子疫苗用量少，效果好的優(yōu)點。
MTS測定結(jié)果表明HcA的SFV復(fù)制子載體pSCARSHc和傳統(tǒng)DNA載體pcDNASHc疫苗的各免疫組均誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異的T細(xì)胞免疫反應(yīng)(P＜0.05，與空載體對照相比)，與100μg免疫組相比，復(fù)制子疫苗在3μg和30μg時可誘導(dǎo)較高T細(xì)胞增殖反應(yīng)(P＜0.01)，復(fù)制子疫苗各免疫組顯著地高于傳統(tǒng)DNA疫苗免疫組(P＜0.05)，尤其是在低劑量時前者極顯著地高于后者(P＜0.01)。
上述檢測結(jié)果表明，HcA的SFV復(fù)制子載體pSCARSHc和傳統(tǒng)DNA載體pcDNASHc免疫小鼠后都能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，經(jīng)多次加強(qiáng)免疫后可達(dá)到一個相當(dāng)高的水平，高于國外Hc核酸疫苗的同劑量報道水平，并且與傳統(tǒng)DNA載體相比，SFV復(fù)制子載體在低劑量時可誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生更高的抗體水平和細(xì)胞免疫水平，說明SFV復(fù)制子疫苗具有更好的免疫效果。
實施例8、檢測HcA的SFV復(fù)制子載體疫苗免疫小鼠后對A型肉毒毒素保護(hù)作用將30μg的HcA的SFV復(fù)制子載體pSCARSHc免疫Balb/c小鼠(6-8周齡，雌性，SPF級，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)，共免疫3次，間隔兩周，免疫結(jié)束后用ELISA法檢測體液免疫水平。結(jié)果攻毒試驗前免疫組抗體滴度為1600-3200。然后進(jìn)行攻毒試驗，方法為以pSCAR空載體免疫的小鼠為對照，統(tǒng)計抗體滴度及存活率，首先對上述經(jīng)30μg的HcA的SFV復(fù)制子載體pSCARSHc免疫3次的Balb/c小鼠用102LD50A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，國際標(biāo)準(zhǔn)株，購自蘭州生物制品研究所)進(jìn)行攻毒，結(jié)果如表2所示，表明SFV復(fù)制子載體pSCARSHc免疫小鼠3次即可完全保護(hù)102LD50A型肉毒毒素的攻擊，但對照組小鼠用102LB50A型肉毒毒素進(jìn)行攻毒，小鼠均發(fā)生肉毒毒素中毒癥狀，在5小時內(nèi)死亡；隨后加大劑量，分別用103、106LD50A型肉毒毒素對3次免疫的小鼠進(jìn)行攻毒，結(jié)果如表2所示，免疫組小鼠可保護(hù)103LD50A型肉毒毒素攻擊，并且免疫組小鼠無異常癥狀，但106LD50A型肉毒毒素攻擊組小鼠發(fā)生肉毒毒素中毒癥狀(與對照組相比，其中毒較輕，死亡時間延后)。以上試驗結(jié)果表明，本發(fā)明的HcA的SFV復(fù)制子載體疫苗具有良好的免疫原性，以30μg劑量免疫3次即可保護(hù)103LD50A型肉毒毒素的攻擊，故可用于制備A型肉毒毒素核酸疫苗，以預(yù)防A型肉毒毒素中毒。
表2 HcA的SFV復(fù)制子核酸疫苗免疫小鼠對保護(hù)A型肉毒毒素攻毒試驗結(jié)果

實施例9檢測HcA的SFV復(fù)制子核酸疫苗和HcA亞單位疫苗聯(lián)合應(yīng)用免疫小鼠后的體液和細(xì)胞免疫水平及對A型肉毒毒素的保護(hù)作用實施例7和實施例8的實驗結(jié)果表明HcA的SFV復(fù)制子核酸疫苗經(jīng)多次免疫后誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生了較高的抗體水平，但與重組蛋白HcA免疫組相比，還是有很大的差距，故其可能產(chǎn)生的保護(hù)作用不夠高，為了進(jìn)一步提高HcA的SFV復(fù)制子核酸疫苗的免疫原性，將HcA復(fù)制子核酸疫苗和HcA亞單位疫苗聯(lián)合應(yīng)用免疫小鼠檢測體液和細(xì)胞免疫水平及對A型肉毒毒素的保護(hù)作用，具體方法為將Balb/c小(6-8周齡，雌性，SPF級，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)隨機(jī)分為4組，每組6或8只，組1、組2和組3先用30μg的HcA的SFV復(fù)制子載體pSCARSHc免疫2次，間隔兩周，再將重組蛋白HcA溶于200μl PBS，然后與相同劑量的福氏完全佐劑(Sigma公司)按1∶1比例混合完全，皮下多點注射免疫1次，同時組4為對照組，用相同劑量的pSCARSHc免疫3次。免疫結(jié)束后2周，小鼠尾部或眼球采血，分離血清，用ELISA法檢測體液免疫水平。ELISA檢測結(jié)果表明，HcA亞單位疫苗加強(qiáng)免疫后能夠大幅度地提高體內(nèi)抗體水平，聯(lián)合應(yīng)用組產(chǎn)生的抗體水平與亞單位疫苗免疫組的水平相當(dāng)，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SFV復(fù)制子核酸疫苗組(P＜0.01)，顯著提高了SFV復(fù)制子核酸疫苗的抗體水平，另外細(xì)胞免疫水平也得到了增強(qiáng)。然后進(jìn)行攻毒試驗，方法為統(tǒng)計抗體滴度及存活率，首先對上述經(jīng)3次免疫的4組Balb/c小鼠用102、104、105和106LD50A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，國際標(biāo)準(zhǔn)株，購自蘭州生物制品研究所)進(jìn)行攻毒，結(jié)果如表3所示，表明HcA亞單位疫苗加強(qiáng)免疫后能夠大幅度地提高免疫小鼠對A型肉毒毒素的保護(hù)作用，聯(lián)合免疫組小鼠可保護(hù)104LD50A型肉毒毒素攻擊，但對照組組4的小鼠用102LD50A型肉毒毒素進(jìn)行攻毒，小鼠即發(fā)生肉毒毒素中毒癥狀，在5小時內(nèi)死亡；隨后加大劑量，分別用105、106LD50A型肉毒毒素對3次免疫的聯(lián)合免疫組小鼠進(jìn)行攻毒，結(jié)果如表3所示，免疫組小鼠對105、106LD50A型肉毒毒素攻擊均可保護(hù)，并且免疫小鼠無異常癥狀。上述實驗結(jié)果表明，HcA的SFV復(fù)制子核酸疫苗初次免疫和HcA亞單位疫苗加強(qiáng)免疫策略(DNA-primeprotein-booster)能夠大幅度提高核酸疫苗的特異性體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平，并能提高核酸疫苗的保護(hù)能力，故在提高A型肉毒毒素保護(hù)效果和減少核酸疫苗的免疫次數(shù)，以及豐富免疫應(yīng)答途經(jīng)等方面是一種良好的免疫策略，可用于研制A型肉毒毒素疫苗。
表3 HcA的SFV復(fù)制子核酸疫苗和HcA亞單位疫苗聯(lián)合應(yīng)用免疫小鼠后保護(hù)A型肉毒毒素攻毒試驗結(jié)果

序列表<160>8<210>1<211>1287<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gaatacatca agaacatcat caatacctcc atcctgaacc tgcgttacga atccaatcac60ctgatcgacc tgtctcgtta cgcttccaaa atcaacatcg gttctaaagt taacttcgat120ccaatcgaca agaatcagat ccagctgttc aatctggaat cttccaaaat cgaagttatc180ctgaagaatg ctatcgtata caactctatg tacgaaaact tctccacctc cttctggatt240cgtatcccaa aatacttcaa ctccatctct ctgaacaatg aatacaccat catcaactgc300atggaaaaca attctggttg gaaagtatct ctgaactacg gtgaaatcat ctggactctg360caggacactc aggaaatcaa acagcgtgtt gtattcaaat actctcagat gatcaacatc420tctgactaca tcaatcgttg gatcttcgtt accatcacca acaatcgtct gaataactcc480aaaatctaca tcaacggccg tctgatcgac cagaaaccaa tctccaatct gggtaacatc540cacgcttcta ataacatcat gttcaaactg gacggttgcc gtgacactca ccgttacatc600tggatcaaat acttcaatct gttcgacaaa gaactgaacg aaaaagaaat caaagatctg660tacgacaacc agtccaattc tggtatcctg aaagacttct ggggtgacta cctgcagtac720gacaaaccat actacatgct gaatctgtac gatccaaaca aatacgttga cgtcaacaat780gtaggtatcc gtggttacat gtacctgaaa ggtccacgtg gttctgttat gactaccaac840atctacctga actcttccct gtaccgtggt accaaattca tcatcaagaa atacgcgtct900ggtaacaagg acaatatcgt tcgtaacaat gatcgtgtat acatcaatgt tgtagttaag960aacaaagaat accgtctggc taccaatgct tctcaggctg gtgtagaaaa aatcttgtct1020gctctggaaa tcccagacgt tggtaatctg tctcaggtag ttgtaatgaa atccaagaac1080gaccagggta tcactaacaa atgcaaaatg aatctgcagg acaacaatgg taacgatatc1140ggtttcatcg gtttccacca gttcaacaat atcgctaaac tggttgcttc caactggtac1200aatcgtcaga tcgaacgttc ctctcgtact ctgggttgct cttgggagtt catcccagtt1260gatgacggtt ggggtgaacg tccactg1287
<210>2<211>429<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400> 2Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr1 5 10 15Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn20 25 30Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln35 40 45Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala50 55 60Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile65 70 75 80Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr85 90 95Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn100 105 110Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln115 120 125Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile130 135 140Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser145150 155 160Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn165 170 175Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly180 185 190
Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe195 200 205Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln210 215 220Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr225 230 235 240Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val245 250 255Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro260 265 270Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr275 280 285Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp290 295 300Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys305 310 315 320Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu325 330 335Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln340 345 350Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys355 360 365Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly370 375 380Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr385 390 395 400Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu405 410 415Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu420 425<210>3<211>484<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gaatacatca agaacatcat caatacctcc atcctgaacc tgcgttacga atccaatcac60ctgatcgacc tgtctcgtta cgcttccaaa atcaacatcg gttctaaagt taacttcgat120ccaatcgaca agaatcagat ccagctgttc aatctggaat cttccaaaat cgaagttatc180ctgaagaatg ctatcgtata caactctatg tacgaaaact tctccacctc cttctggatt240cgtatcccaa aatacttcaa ctccatctct ctgaacaatg aatacaccat catcaactgc300atggaaaaca attctggttg gaaagtatct ctgaactacg gtgaaatcat ctggactctg360caggacactc aggaaatcaa acagcgtgtt gtattcaaat actctcagat gatcaacatc420tctgactaca tcaatcgttg gatcttcgtt accatcacca acaatcgtct gaataactcc480aaaa 484<210>4<211>413<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4tctacatcaa cggccgtctg atcgaccaga aaccaatctc caatctgggt aacatccacg60cttctaataa catcatgttc aaactggacg gttgccgtga cactcaccgt tacatctgga120tcaaatactt caatctgttc gacaaagaac tgaacgaaaa agaaatcaaa gatctgtacg180acaaccagtc caattctggt atcctgaaag acttctgggg tgactacctg cagtacgaca240aaccatacta catgctgaat ctgtacgatc caaacaaata cgttgacgtc aacaatgtag300gtatccgtgg ttacatgtac ctgaaaggtc cacgtggttc tgttatgact accaacatct360acctgaactc ttccctgtac cgtggtacca aattcatcat caagaaatac gcg 413<210>5
<211>390<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5tctggtaaca aggacaatat cgttcgtaac aatgatcgtg tatacatcaa tgttgtagtt60aagaacaaag aataccgtct ggctaccaat gcttctcagg ctggtgtaga aaaaatcttg120tctgctctgg aaatcccaga cgttggtaat ctgtctcagg tagttgtaat gaaatccaag180aacgaccagg gtatcactaa caaatgcaaa atgaatctgc aggacaacaa tggtaacgat240atcggtttca tcggtttcca ccagttcaac aatatcgcta aactggttgc ttccaactgg300tacaatcgtc agatcgaacg ttcctctcgt actctgggtt gctcttggga gttcatccca360gttgatgacg gttggggtga acgtccactg 390<210>6<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6atggagacag acacactcct gctctgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt60gac 63<210>7<211>21<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp20<210>8<211>327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8agcgataaaa ttattcacct gactgacgac agttttgaca cggatgtact caaagcggac60ggggcgatcc tcgtcgattt ctgggcagag tggtgcggtc cgtgcaaaat gatcgccccg120attctggatg aaatcgctga cgaatatcag ggcaaactgg ccgttgcaaa actgaacatc180gatcaaaacc ctggcactgc gccgaaatat ggcatccgtg gtatcccgac tctgctgctg240ttcaaaaacg gtgaagtggc ggcaaccaaa gtgggtgcac tgtctaaagg tcagttgaaa300gagttcctcg acgctaatct ggcggga32權(quán)利要求
1.A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激發(fā)機(jī)體對A型肉毒毒素產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白，其特征在于所述蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO2；2)將序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有激發(fā)機(jī)體對A型肉毒毒素產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述含有權(quán)利要求1所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因的重組原核表達(dá)載體中所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因的上游還連接有硫氧還蛋白Trx基因；用于構(gòu)建所述含有A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因的重組原核表達(dá)載體的出發(fā)載體為pET-22b(+)、pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a；以pET-22b(+)為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因和硫氧還蛋白基因的重組原核表達(dá)載體為pTIG-Trx-Hc。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于用于構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因的傳統(tǒng)真核表達(dá)載體的出發(fā)載體為pcDNA、pCMV5、pSilence1.0-U6、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo、pTEF1、pPICZα、pAM82或pAAh5；以pcDNA3.1(+)為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因的重組真核表達(dá)載體為pcDNASHc。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述含有權(quán)利要求1所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因的重組原核表達(dá)載體中所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因的5’端還連接有分泌信號肽S編碼序列，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO6，編碼序列表中SEQ ID NO7的氨基酸序列；用于構(gòu)建含有所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因的復(fù)制子表達(dá)載體的出發(fā)載體為pSCAR；以pSCAR為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因和分泌信號肽S編碼序列的復(fù)制子表達(dá)載體為pSCARSHc。
8.一種表達(dá)權(quán)利要求2或3所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼蛋白的方法，是將含有權(quán)利要求1所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼蛋白。
9.權(quán)利要求1所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因在制備A型肉毒毒素核酸疫苗中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2或3所述A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼蛋白在制備A型肉毒毒素亞單位疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。其目的是提供一個A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因及其編碼蛋白與其在制備A型肉毒毒素疫苗中的應(yīng)用。該基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激發(fā)機(jī)體對A型肉毒毒素產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因及其編碼蛋白將在制備A型肉毒毒素疫苗中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N15/66GK101054582SQ200710089588
公開日2007年10月17日 申請日期2007年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月23日
發(fā)明者俞煒源, 余云舟, 孫志偉, 劉志剛, 王雙 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所