專利名稱：一種粘帚菌素及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種粘帚菌素及其應(yīng)用，屬醫(yī)用抗生素技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
迄今已發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于微生物的抗生素已近萬(wàn)余種之多，其中許多已廣泛用于治療各種微生物感染性疾病。近年來(lái)由于病原真菌及病原細(xì)菌的抗性、病毒的變異，原有的醫(yī)用抗菌素、抗病毒抗生素治療效果在減退，需要不斷開發(fā)新的抗生素，而發(fā)明新的抗生素活性成份是問(wèn)題的關(guān)鍵。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明相同的公開報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提拱一種其化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎的粘帚菌素，粘菌帚素可作為制備醫(yī)用抗生素的應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的1、粘帚菌素的制備(1)粘帚菌素的生產(chǎn)菌的分離篩選本發(fā)明的生產(chǎn)菌株為Gliocladium roseum Gr87，該菌株是從云南的淡水湖泊的腐木中分離得到的，已于2002年10月9日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.0807。
“Gliocladium roseum Gr87菌株”具有下述形態(tài)和培養(yǎng)特征在PDA培養(yǎng)基上于28℃生長(zhǎng)5天，其菌落可鋪滿平板，白色、粉紅色或橙紅色。顯微鏡下能夠觀察到粉紅粘帚霉有兩種分生孢子梗，主分生孢子梗是輪狀分枝，長(zhǎng)100-200μm，瓶梗3-4輪，大小為17-30X3μm，分生孢子頭狀分散；次生孢子梗(部分在菌落中心形成)，聚集成掃帚狀，瓶梗緊緊壓縮成4-7輪，大小為10-18X2-3μm。分生孢子橢圓形，無(wú)色，壁光滑，大小為10-12X3-4μm，分生孢子粘著形成覆瓦狀的柱或不規(guī)則的粘層塊。
(2)粘帚菌素的制備用Gliocladium roseum Gr87菌株，通過(guò)抗生素常規(guī)的液體或固體的發(fā)酵方法，制得本發(fā)明所述的粘帚菌素。
本發(fā)明所述的粘帚菌素對(duì)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源無(wú)特殊要求，可利用常用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源及其它營(yíng)養(yǎng)源。其中碳源可為淀粉，糊精，甘油，葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，麩皮等。氮源可為黃豆粉，黃豆餅粉，花生餅粉，棉籽餅粉，玉米漿，酵母粉，胨，銨鹽，硝酸鹽，以及其它有機(jī)或無(wú)機(jī)含氮化合物。對(duì)其它營(yíng)養(yǎng)源，可適量添加一些無(wú)機(jī)鹽類，例如，食鹽，磷酸鹽以及鉀、鈣、鐵、鎂、錳、鋅之類的金屬鹽。還可添加些動(dòng)、植、礦物油等作為消泡劑。
本發(fā)明所述的粘帚菌素對(duì)培養(yǎng)條件也沒有嚴(yán)格限制，以適于抗生素生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)和獲得抗生素粘帚菌素的最高產(chǎn)量為宜。一般培養(yǎng)溫度為20-30℃，以26℃下菌絲體生長(zhǎng)較快；培養(yǎng)基的pH范圍為4-9，以接近中性為好。其它條件如培養(yǎng)基組成、通氣量等均應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，以獲得最好的效果。
粘帚菌素由上述所得的培養(yǎng)物，通過(guò)常規(guī)提取代謝物的方法提取。例如可利用粘帚菌素與雜質(zhì)在溶解度、離子結(jié)合力、吸咐親和力及分子量等方面的差別進(jìn)行提取。具體地講，粘帚菌素存在于發(fā)酵液中時(shí)，可用陽(yáng)離子、陰離子交換樹脂進(jìn)行交換，然后用稀鹽酸或醋酸進(jìn)行解吸，也可用大孔吸咐樹脂或活性炭進(jìn)行吸咐，然后用含水丙酮進(jìn)行解吸。這樣可得到粗提物，粗提物再通過(guò)大孔吸咐樹脂或離子交換樹脂，就可制得淡黃色的半精制品。最后采用Sephedex-LH20凝膠柱層析，即可得到粘帚菌素的橙黃色結(jié)晶。而菌絲體中存在粘帚菌素時(shí)，則用任選的有機(jī)溶劑(例如甲醇、乙醇、丙醇，乙酸乙酯，四氫呋喃，乙腈)冷浸提取4次，將濃縮的粗提物吸收在固體吸收材料(例如粉碎的天然材料，如高嶺土、粘土、滑石，石英等；或粉碎的合成材料，如微粒狀硅膠，氧化鋁等)上，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，干法上樣，以氯仿/丙酮為洗脫劑進(jìn)行梯度解吸。這樣得到的粗提物再進(jìn)行類似于從發(fā)酵液中提取粘帚菌素的操作，依次通過(guò)大孔吸咐樹脂或離子交換樹脂、Sephedex-LH20凝膠柱層析，即可得到粘帚菌素的橙黃色結(jié)晶。
2、粘帚菌素的理化及生物性質(zhì)a.分子式為C21H16N6O2，分子量為384(FAB法測(cè)定)，結(jié)構(gòu)式為
b.物化特征為外觀橙黃色粉未狀物質(zhì)；溶解性溶于丙酮、甲醇、二甲亞砜等，不溶于氯仿和水等；高分辨正離子FAB質(zhì)譜實(shí)測(cè)值為385.1402，計(jì)算值為385.1413；紫外吸收UV(pyridine)λmax(ε)為289.4(0.1818)，238.8(0.2925)，217.4(0.7205)，203.4(0.7806)nm；紅外吸收IR(film)vmax為3409，1734，1682，1634，1605，1547，1482，1458，1428，1345，1303，1246，1142，1114，744；核磁譜特征見表1，其溶解溶劑為pyridine-d6，500MHz，TMS為內(nèi)標(biāo)，δppm.
表1粘帚菌素的核磁譜特征(吡啶，500MHz)

c.生物活性目前經(jīng)實(shí)驗(yàn)已證明在紙片法抑菌活性的測(cè)定試驗(yàn)中，當(dāng)粘帚菌素溶液濃度為200ppm時(shí)，處理時(shí)間為12小時(shí)時(shí)，其對(duì)宋氏痢疾桿菌(Shigellla flexneri)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、志氏痢疾桿菌(Shigella dysenteriae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、溶血性鏈球菌(Streptococcus haemolyticus)、副氏痢疾桿菌(Bacteriumparadysenteriae)等八種病原細(xì)菌的抑菌圈分別為1.60、2.13、1.37、1.80、2.17、2.20、1.53、1.80cm。
本發(fā)明的積極效果在于粘帚菌素對(duì)病原細(xì)菌的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，在科研及相關(guān)藥物的開發(fā)利用中具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1從粉紅粘帚霉的固體發(fā)酵物中提取分離得到本發(fā)明化合物粘帚菌素，具體步驟如下a.真菌粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)Gr87的種子培養(yǎng)改良的PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，酵母提取物1.0g，甘油6.0g，瓊脂17g，水1000mL，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，28℃培養(yǎng)5天；b.真菌粉紅粘帚霉的固體發(fā)酵培養(yǎng)麥子培養(yǎng)基(制備過(guò)程為將麥子浸于自來(lái)水中48h，然后洗凈，瀝干清水，分別裝入500cm的三角瓶中，用棉布包扎瓶口15psi下滅菌兩次，每次40min)。
將斜面培養(yǎng)好的菌株挑入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25℃靜置培養(yǎng)30天；c.將上述培養(yǎng)好的粉紅粘帚霉的菌絲體凍干，再用任選的有機(jī)溶劑(例如甲醇、乙醇、丙醇，乙酸乙酯，四氫呋喃，乙腈)冷浸提取4次，將濃縮的粗提物吸收在固體吸收材料(例如粉碎的天然材料，如高嶺土、粘土、滑石，石英等；或粉碎的合成材料，如微粒狀硅膠，氧化鋁等)上，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，干法上樣，以氯仿/丙酮＝0-50％為洗脫劑梯度洗脫。
d.收集1％-10％的氯仿/丙酮洗脫液，減壓濃縮。
e.將上述濃縮液再次在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，干法上樣，以石油醚/丙酮＝10-80％為洗脫劑梯度洗脫。
f.收集TLC板上硫酸顯色為橙黃色的20-30％的石油醚/丙酮洗脫液，濃縮得褚黃色結(jié)晶，即為結(jié)構(gòu)式所示的混合物。再經(jīng)Sephedex-LH20多次分離，即可獲得粘帚菌素。
實(shí)施例2采用紙片法檢測(cè)粘帚菌素對(duì)宋氏痢疾桿菌，結(jié)核分枝桿菌，綠膿桿菌，志氏痢疾桿菌，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，溶血性鏈球菌，副氏痢疾桿菌等八種病原細(xì)菌的拮抗活性試驗(yàn)。
1.試驗(yàn)用藥劑將試驗(yàn)用樣品先溶于少量有機(jī)試劑DMSO，再加入一定濃度的吐溫水溶液分別制備濃度為200ppm的樣品測(cè)試溶液。在該溶液中，DMSO的終濃度＜3％、吐溫的終濃度＜5‰。另將相同濃度的DMSO溶解于含有0.5％(V/V)的吐溫-20的水溶液作為對(duì)照。
2.病原細(xì)菌的培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為常規(guī)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL，pH7.5)，將待測(cè)試病原細(xì)菌菌種接種到250mL三角瓶中(每瓶裝50mL)，37℃下?lián)u床(轉(zhuǎn)速為220rpm)培養(yǎng)24小時(shí)，病原細(xì)菌含量大于1×1010/mL。
制備混菌平板將直徑9cm培養(yǎng)皿來(lái)菌后，倒入20mL45℃的前述常規(guī)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和0.1mL的病原細(xì)菌發(fā)酵菌液，充分混勻，制成混菌平板。
3.試驗(yàn)方法紙片測(cè)定法。使用的紙片直徑為2mm，進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，將蘸有測(cè)試樣品溶液的紙片放在混菌平板中間，于37℃下培養(yǎng)12小時(shí)，測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)三個(gè)樣品。
4.試驗(yàn)結(jié)果表3粘帚菌素(200ppm)對(duì)病原細(xì)菌的抑菌作用

結(jié)果表明培養(yǎng)12小時(shí)后，對(duì)照未出現(xiàn)抑菌圈，而粘帚菌素對(duì)所測(cè)試的八種病原細(xì)菌的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，抑菌圈最大的為2.20cm，最小的也為1.37cm，顯示了其對(duì)病原細(xì)菌的較好抗性。
權(quán)利要求
1.一種粘帚菌素，由生產(chǎn)菌株，通過(guò)液體或固體發(fā)酵及提取代謝物的方法得到，其特征在于a.生產(chǎn)菌株是粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)Gr87，該菌株于2002年10月9日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)，保藏號(hào)為CGMCCNo.0807；b.粘帚菌素的分子式為C21H16N6O2，分子量為384，結(jié)構(gòu)式為 c.粘帚菌素的物化特征為外觀橙黃色粉未狀物質(zhì)；溶解性溶于丙酮、甲醇、二甲亞砜等，不溶于氯仿和水等；高分辨正離子FAB質(zhì)譜實(shí)測(cè)值為385.1402，計(jì)算值為385.1413；紫外吸收UV(pyridine)λmax(ε)為289.4(0.1818)，238.8(0.2925)，217.4(0.7205)，203.4(0.7806)nm；紅外吸收IR(film)νmax為3409，1734，1682，1634，1605，1547，1482，1458，1428，1345，1303，1246，1142，1114，744。
2.權(quán)利要求1所述粘帚菌素可作為制備防治宋氏痢疾桿菌，結(jié)核分枝桿菌，綠膿桿菌，志氏痢疾桿菌，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，溶血性鏈球菌，副氏痢疾桿菌的抗生素應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種粘帚菌素及其應(yīng)用，屬醫(yī)用抗生素技術(shù)領(lǐng)域。該粘帚菌素由生產(chǎn)菌株通過(guò)常規(guī)的液體或固體發(fā)酵及提取代謝物的方法得到。生產(chǎn)菌株為Gliocladium roseum Gr87，該菌株于2002年10月9日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)，保藏號(hào)為CGMCC No.0807；粘帚菌素的分子式為C
文檔編號(hào)A61P31/06GK1683546SQ20051001069
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月16日
發(fā)明者董錦艷, 張克勤 申請(qǐng)人:云南大學(xué)