專利名稱：生物合成竹紅菌甲素在制備抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及生物合成的竹紅菌甲素(Hypocrellin A)在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康，在各種疾病所致的死亡中，惡性腫瘤居第二位，并有進一步增高的趨勢。手術(shù)、放療和化療是治療惡性腫瘤的三大傳統(tǒng)療法。手術(shù)雖能有效地切除肉眼可見腫瘤，但無法保證所有腫瘤細胞都被切除；放化療除了有嚴重毒副反應(yīng)外，許多腫瘤對其不敏感或產(chǎn)生抗性，使得抗腫瘤的治療非常局限。
苝醌化合物是一類分布于自然界生物中的光敏色素。苝醌類光敏色素是目前已知的在可見光區(qū)內(nèi)優(yōu)良的光敏劑。這類光敏劑在光照和分子氧存在的條件下對有機體、細胞和病毒有傷害作用。苝醌類光敏活性成分在可見光照射條件下產(chǎn)生的單重態(tài)氧和半醌自由基具有化學反應(yīng)活性，即細胞殺傷能力。其作用是引起細胞膜蛋白交聯(lián)、膜脂過氧化、膜流動性改變，誘導(dǎo)DNA損傷，引起酶失活，導(dǎo)致細胞骨架損傷，使細胞周期部分阻斷于S期。用苝醌化合物研究開發(fā)光敏活性抗癌藥物有很好的前景。申請?zhí)枮?00310104164.0的中國專利文件公開了屬苝醌化合物的痂囊腔菌素在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。而已知的化合物竹紅菌甲素(HypocrllinA)也屬于苝醌化合物。1981年陳維新等人確定了竹紅菌甲素的化學結(jié)構(gòu)(Die Stu KturDes Hypocrellinsand Seines Photoxidationsprodukees Peroxypocrellin Lie bigs.Ann.Chem，1981，1880-1885)。
自然界中不同種屬的真菌能產(chǎn)生含有苝醌化合物骨架的次生代謝產(chǎn)物。由于自然資源十分有限，上世紀九十年代以來國內(nèi)外一些研究人員希望通過化學合成的方法實現(xiàn)苝醌化合物的全合成。但進行人工合成步驟煩瑣，通過十幾步反應(yīng)合成苝醌骨架化合物，只具有理論上的研究意義，通過生物合成的方法才能大量獲得苝醌化合物。迄今已有生物合成苝醌化合物的技術(shù)，如“苝醌化合物的生物催化合成”(《分子催化》，2000，14(14)，300-302)；“苝醌類化合物的生物合成”(《熱帶作物學報》，1998，19(增刊)，45)；“苝醌類化合物產(chǎn)生菌固態(tài)發(fā)酵工藝研究”(《云南大學學報》自然科學版，2000，22(5)，389-391)等文章。生物催化合成的苝醌類化合物中就包含有竹紅菌甲素，并且可分離出來。本專利申請人已向市場提供生物合成的竹紅菌甲素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供生物合成竹紅菌甲素在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
生物合成竹紅菌甲素(Hypocrellin A)的分子式C30H26O10結(jié)構(gòu)式
生物合成竹紅菌甲素的純品為紅色結(jié)晶，熔點為209～210℃，易溶于氯仿、吡啶、丙酮、二甲亞砜等有機溶劑中，微溶于石油醚，不溶于水。
按照本發(fā)明，以生物合成竹紅菌甲素作為藥物有效成分，制成醫(yī)學上可以接受的劑型，施用于癌癥患者，并進行光照。所說癌癥可以是皮膚、口腔、直腸、鼻、喉、胃等的實體瘤。對于普通光源不能照射到的部位可以用光纖光源進入人體進行照射。
以下通過試驗及其結(jié)果來說明生物合成竹紅菌甲素(以下簡稱HA)在制備抗癌藥物中的用途。
一、采用流式細胞術(shù)(FCM)檢測生物合成竹紅菌甲素對人Hce-8693盲腸癌細胞增殖及細胞凋亡的影響。
1、材料與方法把生物合成竹紅菌甲素溶于二甲基亞砜，配成10μmol/L，100μmol/L和1mmol/L，避光保存?zhèn)溆谩?br> 人Hce-8693盲腸癌細胞株(云南大學單克隆工程技術(shù)中心凍存)于10％BSC-DMEM 37℃、5％CO2中培養(yǎng)至長滿單層；擴細胞至35mm培養(yǎng)皿中，使其密度為5.0×104。
設(shè)Hce-8693盲腸癌細胞為未給生物合成竹紅菌甲素未光照空白組，未給生物合成竹紅菌甲素光照20min對照組，給生物合成竹紅菌甲素10μmol/L、100μmol/L和1mmol/L分別光照10min和20min實驗組，每孔設(shè)平行孔，將細胞密度為5.0×104的35mm培養(yǎng)皿按實驗設(shè)計要求加入生物合成竹紅菌甲素后，置37℃ 5％CO2中暗處培養(yǎng)2h；將試驗組標本置于有冰袋的容器內(nèi)，在離容器60cm處用一可見光(500W)燈光照，在可見光前置一紅外輻射熱隔離袋(防止熱輻射及溫度對細胞生長的影響)。光照畢，用PBS洗細胞三次， 加入10％BCS-DMEM培養(yǎng)液于37℃ 5％ CO2中繼續(xù)培養(yǎng)2h，再用PBS洗細胞三次后終止細胞培養(yǎng)；用胰酶消化貼壁細胞后收集、離心、洗滌細胞，制成單細胞懸液(1×109/L)，用50％冷乙醇固定后，PBS洗滌二次；碘丙烷染色后，Coulter EPICS-XL流式細胞儀進行檢測，Multicycle(美國)計算機軟件處理結(jié)果。
2、結(jié)果見表1和圖1～4。
表1人Hce-8693盲腸癌細胞增殖及凋亡峰

PI為細胞增殖指數(shù)G1為DNA合成前期S為DNA合成期G2為DNA合成后期M為DNA分裂期3、結(jié)果分析流式細胞術(shù)(FCM)可用于腫瘤化療藥物的研究開發(fā)。誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤的主要機制之一。本試驗給予不同濃度生物合成竹紅菌甲素光照10min后，G1期細胞最高達40.8％，S期細胞最小值為43.6％，G2/M期細胞最小值為13.5％，說明生物合成竹紅菌甲素主要使細胞阻斷于G1期；給藥組細胞增殖指數(shù)(PI)均低于空白組及對照組，顯示給藥組細胞增殖活力降低；當給予不同濃度生物合成竹紅菌甲素光照20min時，在FCM-DNA圖型G1期峰前均出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，其DNA指數(shù)(DI)為0.745～0.767，明顯低于0.9，表明生物合成竹紅菌甲素具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞增殖的作用。
二、采用四氮唑藍法(MTT法)檢測生物合成竹紅菌甲素對人Hce-8693盲腸癌細胞和人B-16黑色素瘤細胞的作用。
1.材料主要試劑生物合成竹紅菌甲素HA由云南大學應(yīng)用化學系提供，實用前用10％DMEM溶解配成不同工作濃度并避光保存。二甲亞砜(DMSO)，四氮唑藍(MTT)購自Sigma公司。
主要儀器二氧化碳細胞培養(yǎng)箱Forma Scientiffic Inc，3110.酶標儀Bio-Rad公司，Microplate Reader-Modle 550.電子天平Sartorius公司，BP211D.超凈工作臺上海力申科學儀器有限公司。1300W新聞燈國產(chǎn)儀器。
細胞株人Hce-8693盲腸癌細胞和人B-16黑色素瘤細胞由云南大學單克隆抗體研究中心提供。
2.方法細胞培養(yǎng)以含10％小牛血清的DMEM溶液為培養(yǎng)液，將Hce-8693細胞和B-16細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期(5％CO2，37℃).
實驗組設(shè)計2株細胞分別設(shè)空白組、正常對照組、實驗組。其中空白組不加細胞，正常對照組不加HA。2株細胞各取5塊96孔板，每板分6個小組，分別為對照0.1，1，10，100，1000μmol/L，每組10個孔，第1孔作空白.按0，5，6，10，20min分別光照5塊板。
細胞接種將對數(shù)生長期的Hce-8693和B-16細胞用培養(yǎng)液制成2×105mL的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100μL；同時設(shè)空白組(不加細胞僅加培養(yǎng)液)。培養(yǎng)24h使細胞貼壁。
加入HA及光照處理將不同濃度(0.1，1，10，100，1000μmol/L)的HA溶液加人相應(yīng)孔中，每孔100μL。正常對照組不加HA，加人等體積培養(yǎng)液。避光培養(yǎng)2h。PBS洗滌后用1300W的新聞燈按實驗設(shè)計時間即0，5，6，10，20min進行光照(光照距離70cm)。然后棄去上清，用PBS洗板2次，加培養(yǎng)液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)2h。
加MTT棄去培養(yǎng)液，每孔加5mg/mLMT T20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。
MT Tformaza的溶解棄去孔中液體，用PBS洗板2次，傾干孔內(nèi)液體，每孔加100μLDMSO，振蕩溶解。
光密度測定酶聯(lián)儀在波長570nm時測定各孔光密度，以無細胞空白組調(diào)零計算各組OD570值。
細胞存活率計算各組OD570值取均值后，以下列公式計算存活細胞百分數(shù)細胞存活率(％)＝(OD實驗/OD對照)×100％.
2.結(jié)果及分析結(jié)果見表2～5及圖5和6。
表2 HA作用于Hce-8693細胞株OD570均值統(tǒng)計表

表3HA作用于Hce-8693細胞株存活率(％)統(tǒng)計表

表4 HA作用于B-16細胞株OD570均值統(tǒng)計表

表5HA作用于B-16細胞株存活率(％)統(tǒng)計表

從以上圖表可以看出，未經(jīng)光照時，隨著HA-濃度的增加，細胞存活率下降，說明HA本身有一定的細胞毒性作用。經(jīng)光照后，HA的細胞毒性作用加強，在光照時間為10min時細胞存活率最低。在光照時間相同的條件下，HA濃度越高，細胞存活率超低，說明HA殺傷腫瘤細胞的光敏活性作用存在劑量依賴關(guān)系。
MTT法快速，簡便，適用面廣。在適當?shù)脑囼灄l件下，結(jié)果重復(fù)性好，可用于大規(guī)模篩選藥物。試驗結(jié)果表明，HA本身具有細胞毒性作用，經(jīng)可見光照射激活后，其毒性作用明顯加強，在光照時間為10min時此作用最為顯著。HA對腫瘤細胞的生長抑制作用與其濃度呈正相關(guān)。因此，HA是一種利用光敏活性殺傷腫瘤細胞的藥物。
本發(fā)明的有益效果是對已有化合物生物合成的竹紅菌甲素發(fā)掘了作為制備抗癌藥物的醫(yī)療用途，開拓了重要的應(yīng)用領(lǐng)域。


圖1為流式細胞術(shù)檢測空白組。
圖2為流式細胞術(shù)檢測對照組。
圖3為流式細胞術(shù)檢測給HA光照10min組。
圖4為流式細胞術(shù)檢測給HA光照20min組。
圖5為四氮唑藍法檢測中HA對Hce-8693細胞存活率的影響。
圖6為四氮唑藍法檢測中HA對B16細胞存活率的影響。
具體實施例方式
見以下實施例用生物合成竹紅菌甲素制成抗癌藥物治療外陰白色病變。外陰白色病變?yōu)槠つw癌。將市售的生物合成竹紅菌甲素用醫(yī)用凡士林配成6％的軟膏(含HA的重量比)，涂抹于患者的外陰白色病變部位，并用100瓦的白織燈照射10分鐘，每天一次，每個療程30次。經(jīng)臨床治療29例，有效率為97％。
以上實施例僅對發(fā)明做進一步的說明，而本發(fā)明的范圍不受所舉實施例的局限。
權(quán)利要求
1.生物合成竹紅菌甲素在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所說的在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征是以生物合成竹紅菌甲素作為藥物有效成分，制成醫(yī)學上可以接受的劑型，施用于癌癥患者，并進行光照。
全文摘要
本發(fā)明屬制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及生物合成的竹紅菌甲素(Hypocrellin A)在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。以生物合成竹紅菌甲素作為藥物有效成分，制成醫(yī)學上可以接受的劑型，施用于癌癥患者，并進行光照。本發(fā)明的有益效果是對已有化合物生物合成的竹紅菌甲素發(fā)掘了作為制備抗癌藥物的醫(yī)療用途，開拓了重要的應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號A61K31/122GK1686092SQ20051001072
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月4日
發(fā)明者李聰, 臺虹, 陳遠騰, 馬嵐, 歐靈澄, 荷嚴萍 申請人:云南大學