專利名稱：生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架及其制備方法，尤指一種含有針對原癌基因c-myc的反義核酸的可生物降解的高分子支架及其制備方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
經(jīng)導(dǎo)管介入治療是血管阻塞性疾病最常用的治療手段之一，尤其是經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)是冠狀動脈阻塞性疾病非常有效的治療方法。目前臨床使用的金屬支架對人體來講是一種異物，可引起人體的炎癥反應(yīng)，令人對其長期的安全性有疑慮。而且金屬支架對動脈管壁也可造成損傷，引起炎癥反應(yīng)。后者激發(fā)人體的免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞在支架部位堆積，引起再狹窄。
為解決上述問題，發(fā)明人曾發(fā)明過一種生物可降解的藥物復(fù)合高分子支架材料，其制備方法見中國專利ZL02104071.0。將高分子聚乳酸、聚己內(nèi)酯和抗再狹窄藥物溶于溶劑中；將制備的溶液倒入容器中，成膜，制成細(xì)絲；再將細(xì)絲在由L-乳酸和乙交酯共聚物、溶劑及抗再狹窄藥物制備的混合溶液中浸蘸晾干，或冷凍干燥；然后在抗凝血溶液中浸泡，晾干；將細(xì)絲纏繞于模具上，熱固成型。其中溶劑為氯仿、1，4二氧六環(huán)及二甲基亞砜；抗再狹窄藥物為紫杉醇、紫杉特爾、芳維甲酸乙酯、普羅布考、地塞米松、西羅莫司；抗凝血溶液由羧基化硫酸酯化殼聚糖水溶液或肝素鈉水溶液與丙酮混合配制?？山到飧叻肿又Ъ苡休^好的生物相容性，并可最終在體內(nèi)降解消失，避免對人體的長期影響。高分子材料可以方便的通過吸附接枝等手段攜帶緩釋藥物，達(dá)到防止凝血和再狹窄的目的。該支架的使用效果良好，但是制備工藝相對復(fù)雜，比如為了使吸附藥物的含量增加，需要通過凍干工藝在支架上造孔。
原癌基因c-myc(命名v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog；GENEBANK中ID號4609；基因序列號NM-002467)也被稱為早期快速反應(yīng)基因，在平滑肌細(xì)胞周期的啟動與維持中起重要作用，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子為DNA結(jié)合蛋白，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)與肌細(xì)胞增殖相關(guān)的基因的激活，產(chǎn)生大量的生長因子樣物質(zhì)，刺激平滑肌細(xì)胞由靜止的G0期進(jìn)入增殖的G1期，從而誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖。
反義技術(shù)的基礎(chǔ)是根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計(jì)針對特定靶序列的反義核酸，進(jìn)入細(xì)胞與靶序列特異性結(jié)合，從而抑制特定基因的表達(dá)，該技術(shù)主要應(yīng)用于腫瘤及增生性疾病(如瘢痕)的治療領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠從分子水平有效防止血管再狹窄和凝血栓塞出現(xiàn)的新型生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架。
本發(fā)明的另一個目的是提供這種新型生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架的制備方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架，由高分子支架材料和原癌基因c-myc的反義核苷酸序列制成，其中高分子材料選自聚乳酸(PLLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)和L-乳酸/乙交酯共聚物(PLGA)中的兩種或三種；原癌基因c-myc的反義核苷酸序列選擇引導(dǎo)mRNA啟動子周圍的序列，以針對mRNA的次級結(jié)構(gòu)區(qū)域發(fā)揮效應(yīng)，長度為12-15個堿基，例如aacgttgaggggcat。
所述PLLA的分子量為10萬至30萬，PCL的分子量為10萬至30萬。
所述L-乳酸/乙交酯共聚物的分子量為5萬至15萬。
本發(fā)明使用的高分子材料的安全性和可靠性均經(jīng)過醫(yī)療實(shí)踐證明。PLLA具有良好的硬度強(qiáng)度性能，加入一定量的PCL則可以提高支架的彈性，所以在支架的骨架中使用PLLA和PCL的混合物。隨著高分子材料的降解，原癌基因c-myc的反義核苷酸序列或藥物在局部被緩釋到血液中，既可以發(fā)揮長時間的療效，省去多次體外注射，也可以使藥物對身體其他部分的副作用降到最小。
為了減少反義核酸失活和控制緩釋的速度，支架表面還可設(shè)有L-乳酸/乙交酯共聚物緩釋涂層。將反義核酸序列添加該材料中，涂敷在支架材料的表面，通過調(diào)整L-乳酸和乙交酯在共聚物中比例，可以調(diào)整聚合物的降解速率，控制反義核酸序列釋放的速度。
一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架的制備方法，PLLA和PCL用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為1-20％，加入原癌基因c-myc的反義核苷酸序列，使其濃度為0.01-1mol/ml，除去溶液中氣泡，成膜并制成直徑為0.1-0.6mm的細(xì)絲，于30-100℃下用模具固定成型。
一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架的制備方法，溶液1為PLLA和PCL用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為1-20％，除去溶液中氣泡，成膜并制成直徑為0.1-0.6mm的細(xì)絲，用模具固定成型；溶液2為PLGA用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為0.01-15％，加入原癌基因c-myc的反義核苷酸序列，使其濃度為0.01-10mol/ml；固定成型后的細(xì)絲浸蘸溶液2后，取出于0-30℃下晾干。
所述所述PLLA的分子量為10萬至30萬，PCL的分子量為10萬至30萬，L-乳酸/乙交酯共聚物的分子量為5萬至15萬。
原癌基因c-myc的反義核苷酸序列為aacgttgaggggeat。
所述制成直徑為0.1-0.6mm的細(xì)絲的方法為模具成型或擠壓成型。
所述用模具固定成型為用模具將成膜后的細(xì)絲固定為Z形或螺旋構(gòu)形。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是支架由降解速率可控的多種高分子材料與防止再狹窄的基因結(jié)合制成，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性，防治在血管再狹窄效果明顯，使用安全。制備方法簡單、可控性強(qiáng)，便于實(shí)施。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一.材料和來源PLLA分子量為30萬，購自成都有機(jī)化學(xué)有限公司PCL分子量為10萬，購自成都有機(jī)化學(xué)有限公司氯仿，購自成都有機(jī)化學(xué)有限公司原癌基因c-myc的反義核苷酸序列，委托上海生工公司合成，序列為acgttgaggggcat。
二.制備方法PLLA和PCL(質(zhì)量比為50％∶50％)用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為10％，攪拌，充分溶解；加入原癌基因c-myc的反義核苷酸序列，使其濃度為0.01mol/ml，充分?jǐn)嚢璨㈧o置除去溶液中氣泡；將溶液倒在條形模具中，在30℃下讓溶液揮發(fā)成膜并制成寬度和厚度為0.1mm的細(xì)絲，將細(xì)絲纏繞于模具上，于37℃下用固定為Z形構(gòu)形。
實(shí)施例2一.材料和來源PLLA分子量為20萬，購自成都有機(jī)化學(xué)有限公司PCL分子量為30萬，購自成都有機(jī)化學(xué)有限公司其余同實(shí)施例1
二.制備方法PLLA和PCL(質(zhì)量比為70％∶20％)用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為20％，攪拌，充分溶解；加入原癌基因c-myc的反義核苷酸序列，使其濃度為0.1mol/ml，充分?jǐn)嚢璨㈧o置除去溶液中氣泡；將溶液倒在條形模具中，在30℃下讓溶液揮發(fā)成膜并制成寬度和厚度為0.6mm的細(xì)絲，將細(xì)絲纏繞于模具上，于37℃下用固定為螺旋構(gòu)形。
實(shí)施例3一.材料和來源PLLA分子量為10萬，購自成都有機(jī)化學(xué)有限公司PCL分子量為30萬，購自成都有機(jī)化學(xué)有限公司其余同實(shí)施例1二.制備方法PLLA和PCL(質(zhì)量比為40％∶60％)用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為20％，攪拌，充分溶解；加入原癌基因c-myc的反義核苷酸序列，使其濃度為1.0mol/ml，充分?jǐn)嚢璨㈧o置除去溶液中氣泡；將溶液倒入一具有小孔的容器中，在30℃下讓溶液揮發(fā)到一定程度后從小孔中擠出，控制擠出速率和孔徑，制成直徑為0.6mm的細(xì)絲，將細(xì)絲纏繞于模具上，于37℃下用固定為螺旋構(gòu)形。
實(shí)施例4一.材料和來源PLLA分子量為10萬，購自成都有機(jī)化學(xué)有限公司PCL分子量為10萬，購自成都有機(jī)化學(xué)有限公司PLGA分子量為5萬，購于成都有機(jī)化學(xué)有限公司其余同實(shí)施例1二.制備方法溶液1為PLLA和PCL(質(zhì)量比為50％∶50％)用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為1％，靜置除去溶液中氣泡，將溶液倒在條形模具中，在30℃下讓溶液揮發(fā)成膜并制成厚度和寬度為0.1mm的細(xì)絲，在40℃下用模具固定為Z形構(gòu)形；溶液2為PLGA(L-乳酸∶乙交酯＝50％∶50％)用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為0.01％，加入原癌基因c-myc的反義核苷酸序列，使其濃度為0.01mol/ml充分?jǐn)嚢璨㈧o置除去氣泡；固定成型后的細(xì)絲浸蘸溶液2后，取出于0℃下晾干。
實(shí)施例5一.材料和來源PLLA分子量為30萬，購于成都有機(jī)化學(xué)有限公司PCL分子量為30萬，購于成都有機(jī)化學(xué)有限公司PLGA分子量為15萬，購于成都有機(jī)化學(xué)有限公司其余同實(shí)施例1二.制備方法溶液1為PLLA和PCL(質(zhì)量比為20％∶80％)用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為20％，靜置除去溶液中氣泡，將溶液倒入一有孔容器中，在30℃下讓溶液揮發(fā)一段時間后從小孔中擠出，控制擠出速率和孔徑，制成直徑為0.6mm的細(xì)絲，在100℃下用模具固定為螺旋構(gòu)形；溶液2為PLGA(L-乳酸∶乙交酯＝10％∶90％)用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為15％，加入原癌基因c-myc的反義核苷酸序列，使其濃度為10mol/ml充分?jǐn)嚢璨㈧o置除去氣泡；固定成型后的細(xì)絲浸蘸溶液2后，取出于30℃下晾干。
實(shí)施例6一.材料試驗(yàn)用小型豬40頭；中國人民解放軍總醫(yī)院動物試驗(yàn)中心提供。
生物可降解基因釋放支架40支，按照實(shí)施例4制備。
生物可降解裸支架40支，清華大學(xué)材料工程系提供。
二.方法將生物可降解基因釋放支架與裸支架分別置入試驗(yàn)小型豬的兩側(cè)腎動脈內(nèi)，定期處死實(shí)驗(yàn)動物，觀察兩側(cè)腎動脈支架置入段內(nèi)膜增生情況。
三.結(jié)果生物可降解基因釋放支架置入段血管光鏡觀察結(jié)果支架置入后1周，支架桿部可見少許纖維組織和少量血小板沉著；置入后2周，于支架桿部周圍可見少量新生內(nèi)膜生成，偶見炎性細(xì)胞浸潤，多為淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，未見中性粒細(xì)胞；裸支架周圍也可見炎細(xì)胞浸潤；置入后4周，基因支架桿大部分被新生內(nèi)膜覆蓋；裸支架部分被內(nèi)膜覆蓋；8周時支架完全被內(nèi)膜覆蓋，未見明顯內(nèi)膜增生，管壁光整，管腔通暢，炎性細(xì)胞消退；裸支架仍未完全被內(nèi)皮覆蓋；12周時基因支架血管標(biāo)本經(jīng)手壓迫觸摸，支架段血管彈性顯著，仍有較強(qiáng)的支撐力與裸支架相似。支架置入后6個月可見支架不完全降解，9個月后支架幾乎完全降解，支架段血管彈性顯著，管腔通暢。
電鏡觀察結(jié)果置入4周后，覆蓋于支架表面的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育成熟，排列規(guī)則緊密，形態(tài)與鄰近血管內(nèi)膜相似。
再狹窄發(fā)生率，基因支架組為10％，裸支架組為30％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
四.結(jié)論生物可降解基因釋放支架可有效抑制血管再狹窄的發(fā)生。
權(quán)利要求
1.一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架，其特征在于由高分子支架材料和原癌基因c-myc的反義核苷酸序列制成，其中高分子材料選自聚乳酸、聚己內(nèi)酯和L-乳酸/乙交酯共聚物中的兩種或三種；原癌基因c-myc的反義核苷酸序列為acgttgaggggcat。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架，其特征在于所述聚乳酸的分子量為10萬至30萬，聚己內(nèi)酯的分子量為10萬至30萬，L-乳酸/乙交酯共聚物的分子量為5萬至15萬。
3.一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架的制備方法，其特征在于聚乳酸和聚己內(nèi)酯用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為1-20％，加入原癌基因c-myc的反義核苷酸序列，使其濃度為0.01-1mol/ml，除去溶液中氣泡，成膜并制成直徑為0.1-0.6mm的細(xì)絲，于30-100℃下用模具固定成型。
4.一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架的制備方法，其特征在于溶液1為聚乳酸和聚己內(nèi)酯用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為1-20％，除去溶液中氣泡，成膜并制成直徑為0.1-0.6mm的細(xì)絲，用模具固定成型；溶液2為L-乳酸/乙交酯共聚物，用氯仿溶解至質(zhì)量體積濃度為0.01-15％，加入原癌基因c-myc的反義核苷酸序列，使其濃度為0.01-10mol/ml；固定成型后的細(xì)絲浸蘸溶液2后，取出于0-30℃下晾干。
5.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架的制備方法，其特征在于所述聚乳酸的分子量為10萬至30萬，聚己內(nèi)酯的分子量為10萬至30萬，L-乳酸/乙交酯共聚物的分子量為5萬至15萬。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架的制備方法，其特征在于所述原癌基因c-myc的反義核苷酸序列為acgttgaggggcat。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架的制備方法，其特征在于所述制成直徑為0.1-0.6mm的細(xì)絲的方法為模具成型或擠壓成型。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架的制備方法，其特征在于所述用模具固定成型為用模具將成膜后的細(xì)絲固定為Z形或螺旋構(gòu)形。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物可降解性基因釋放血管內(nèi)支架，由高分子支架材料和原癌基因c－myc的反義核苷酸序列制成，其中高分子材料選自聚乳酸、聚己內(nèi)酯和L－乳酸/乙交酯共聚物中的兩種或三種；原癌基因c－myc的反義核苷酸序列為acgttgaggggcat。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是支架由降解速率可控的多種高分子材料與防止再狹窄的基因結(jié)合制成，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性，防治在血管再狹窄效果明顯，使用安全；本發(fā)明制備方法簡單、可控性強(qiáng)，便于實(shí)施。
文檔編號A61L27/50GK1724082SQ20051008006
公開日2006年1月25日 申請日期2005年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月28日
發(fā)明者張金山, 崔福齋, 肖越勇, 孟波, 劉江濤, 賈楠 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院