專利名稱：一種秦皮提取物的制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種中藥秦皮提取物的制備方法和用途，更具體地說是由秦皮提取純化而成的總香豆素混合物，它的制備方法和制藥用途。
背景技術：
秦皮為木犀科植物苦櫪白蠟樹Fraxinus rhynchophylla Hance、白蠟樹Fraxinuschinensis Roxb.、尖葉白蠟樹Fraxinus chinensis Roxb.var.acuminataLingelsh.或宿柱白蠟樹Fraxinus stylosa Lingelsh.的干燥樹皮或枝皮，含以秦皮甲素(aesculin)、秦皮乙素(aesculetin)、秦皮苷(fraxin)、秦皮亭(fraxetin)4種成分為代表的香豆素類成分等，盡管目前已有文獻報道秦皮具有抗炎鎮(zhèn)痛與降低血尿酸的作用，臨床用于高尿酸血癥及痛風性關節(jié)炎急性發(fā)作，也有文獻報道秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷各自的抗炎鎮(zhèn)痛與排尿酸藥理活性，但對于秦皮中各種香豆素類成分的協同作用，未見有研究報道。
對于秦皮中香豆素類成分的提取分離純化，已有的文獻報道均采用水提醇沉法獲得秦皮浸膏，再將其溶于熱水中，冷藏形成沉淀，濾取沉淀即得，成都迪康藥物研究所的專利申請中采用的也是此方法。但此方法制得的所謂總香豆素實際上只是秦皮甲素，原藥材中存在的其它幾種香豆素類成分基本上損失殆盡，其藥理活性與臨床效果顯著下降。
中醫(yī)藥治病，強調藥材中各活性成分對于人體的整體協調作用，現今已有大量研究證明，原本有效的中藥經分離純化后療效大大降低。本發(fā)明人通過大量的化學與藥理篩選，證明了秦皮中各種香豆素類成分對于治療痛風和高尿酸血癥的活性貢獻與協同作用，所獲得的秦皮香豆素組合物包含一定比例的秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮亭，具有抗炎和降尿酸雙重作用，臨床用治痛風與高尿酸血癥療效確切。
本發(fā)明的目的是通過對秦皮中香豆素類成分的提取純化工藝研究，獲得一種包含秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮亭4種成分為代表的秦皮香豆素組合物，其中各組成成分的比例與其在原藥材中的存在比例基本一致，以提高其治療痛風及高尿酸血癥的臨床效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的秦皮香豆素組合物是通過以下方法得到的取秦皮，加水煎煮提取3次，每次加水10倍量，提取1.5小時，合并提取液，濾過，濾液濃縮至相對密度約1.1(60℃熱測)，加入乙醇使含醇量達80％，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇至無醇味，加水適量使溶解，加于已處理好的D101型大孔吸附樹脂柱上，先以水沖洗，棄去水洗液，再用50％乙醇洗脫至無色，收集乙醇洗脫液，回收乙醇至無醇味，濃縮至相對密度約1.38(60℃熱測)，真空干燥，粉碎，過80目篩，混勻，即得。
本發(fā)明的秦皮香豆素組合物是由一定比例的秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮亭等組成的總香豆素混合物，以紫外吸收光譜法測定，含總香豆素50％以上，以高效液相色譜法測定，秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮亭4種成分的總含量在40％以上，4種成分的比例依次為4-6∶1-3∶2-4∶1，此比例與其在原藥材中的比例基本一致。
研究發(fā)現，本發(fā)明的秦皮香豆素組合物中各成分具有明顯的協同作用，同時具備抗痛風性關節(jié)炎和降低尿酸等多方面的藥理活性。從該提取物中分離純化出秦皮甲素，并與純化前比較，活性大大降低。
本發(fā)明的秦皮香豆素組合物，可以直接或配伍后采用通常的制藥方法，制成用于治療痛風及高尿酸血癥的各種劑型，包括膠囊劑、軟膠囊劑、片劑、顆粒劑、滴丸、注射劑和口服液劑型。
本發(fā)明用秦皮香豆素組合物制備的藥劑，按照相關要求進行規(guī)范的動物實驗研究及臨床試驗，證明藥劑具有如下的明顯優(yōu)點和顯著效果。
1、毒理實驗表明秦皮香豆素組合物具有無毒性本發(fā)明的秦皮香豆素組合物由中藥秦皮提取，秦皮來源于天然資源，經長期入藥使用證明，秦皮長期服用無毒副作用。用秦皮提取的秦皮香豆素組合物，富集藥物的有效成份，經毒理學研究證明，無明顯毒性。
(1)經小鼠急性毒性試驗表明，用提取的秦皮香豆素組合物，小鼠灌胃給藥的最大耐受量為24g總香豆素/kg/24h，最大耐受倍數為60kg體重成人臨床口服日用藥量的4000倍。
(2)經大鼠長期毒性試驗表明，用提取的秦皮香豆素組合物，大鼠灌胃給藥的最大耐受量為18g總香豆素/kg/24h，最大耐受倍數為60kg體重成人臨床口服日用藥量的3000倍。大鼠灌胃秦皮香豆素組合物給藥，觀察14天，大鼠無死亡，僅于給藥后15min至18h可見動物活動減少，未見其他異常癥狀。處死大鼠后，肉眼觀察重要器官(心、肝、脾、肺、腎等)均無異常發(fā)現。
(3)經Beagle犬長期毒性試驗表明，秦皮香豆素組合物按300、150和75mg/kg三個劑量，分別相當于其臨床口服劑量的50、25和12.5倍，連續(xù)對Beagle犬口服給藥180天及停藥30天，結果如下(1)對動物生長發(fā)育和行為活動等無明顯影響。(2)尿常規(guī)檢查數值均在正常范圍內。(3)肝功能檢查數值均在正常值范圍內，但有降低ALT、AST、T-Bil、ALP和/或升高ALT作用，停藥后消失。(3)腎功能檢查結果數值均在正常范圍內，但高、中劑量組有升高肌酐和尿素氮作用，停藥后消失。(4)有降低血清膽固醇作用。(5)心電圖檢查，結果數值均在正常范圍內，但給藥45天時中劑量組心率減慢；給藥180天時高劑量組Q-T間期時間顯著下降；停藥30天，高、中、低劑量組的R波電壓分別顯著、明顯和極顯著下降。(6)活體動物骨髓檢查，結果均在正常范圍內。但給藥180天，可見低劑量組早幼紅細胞明顯升高。停藥30天，高劑量組明顯升高中性粒細胞的桿狀細胞；中、低劑量組明顯降低淋巴細胞。(7)系統(tǒng)尸解和臟器指數檢查無明顯異常。(8)病理組織學檢查，僅發(fā)現在給藥180天時高劑量組有1例動物出現輕微的肝局灶性炎癥病理變化和1例動物出現輕微腎臟局灶性炎癥變化，與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)。其余均未見異常。
2、主要藥效學實驗研究證明秦皮香豆素組合物具有降低尿酸和抗痛風性關節(jié)炎作用(1)秦皮香豆素組合物對小鼠Hypoxanthine型高尿酸血癥形成的影響單獨使用，僅秦皮苷有一定強度抑制作用抑制Hypoxanthine所致小鼠血清尿酸濃度升高作用(P＞0.05)，而秦皮甲素、秦皮乙素或秦皮亭，均無明顯抑制H。而以上述工藝獲得的秦皮香豆素組合物30、60和120mg/kg分別能明顯、顯著和極顯著抑制Hypoxanthine所致小鼠血清尿酸濃度升高(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.001)，其最大尿酸生成抑制率為35.85％，在30～120mg/kg劑量范圍內呈明顯的量效關系(P＜0.05)。其實驗結果見表1。
表1秦皮香豆素組合物對小鼠Hypoxanthine型高尿酸血癥形成的影響

注①模型對照組與正常對照組^^^P＜0.001②給藥組與模型對照組比較 *P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
(2)大鼠尿酸排泄試驗表2顯示，單獨使用秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷或秦皮亭60～240mg/kg，均無明顯促進大鼠尿液尿酸排泄作用(P＞0.05)。而秦皮香豆素組合物60和120mg/kg能顯著促進大鼠尿酸經尿液的排泄(P＜0.01)。
表2秦皮香豆素組合物對大鼠尿液尿酸排泄的影響(x±SD)

注給藥組與蒸餾水對照組比較 *P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001(3)尿酸鈉誘發(fā)大鼠痛風性關節(jié)炎模型試驗表3顯示，單獨使用秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷或秦皮亭60～240mg/kg，均無明顯抑制尿酸鈉所致大鼠痛風性關節(jié)腫脹作用(P＞0.05)。而以上四個成分按比例依次為4-6∶1-3∶2-4∶1為主要組成成分的秦皮香豆素組合物能顯著抑制尿酸鈉所致大鼠痛風性關節(jié)腫脹(P＜0.01)，給藥后1小時就有顯著抑制作用(P＜0.01)，維持6h；30mg/kg給藥后3h仍有顯著抑制作用(P＜0.01)。在120～30mg/kg劑量范圍內呈明顯的量效關系(P＜0.05)。
表3秦皮香豆素組合物對尿酸鈉誘發(fā)大鼠痛風性關節(jié)炎的影響

注給藥組與對照組比較 *P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
(4)尿酸鈉誘發(fā)家兔痛風性關節(jié)炎模型試驗表4秦皮香豆素組合物對尿酸鈉誘發(fā)家兔痛風性關節(jié)炎的影響

注給藥組與模型對照組比較 *P＜0.05 **P＜0.01
表4顯示，單獨使用秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷或秦皮亭，僅240mg/kg劑量組有明顯抑制尿酸鈉所致家兔痛風性關節(jié)腫脹作用(P＜0.05)，120～60mg/kg劑量組均無明顯作用(P＞0.5)。而以上四個成分按比例依次為4-6∶1-3∶2-4∶1為主要組成成分的秦皮香豆素組合物120mg/kg劑量組給藥后1小時出現明顯抑制尿酸鈉所致家兔痛風性關節(jié)腫脹作用(P＜0.05)，作用維持5h以上；30mg/kg仍有明顯抑制作用(P＜0.05)，在120～30mg/kg劑量范圍內呈明顯的量效關系(P＜0.05)。
表5秦皮香豆素組合物抑制尿酸鈉刺激家兔滑膜液生成的作用

注①模型對照組與正常對照組比較^^^P＜0.001②給藥組與模型對照組比較 *P＜0.05 **P＜0.01表5顯示，單獨使用秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷或秦皮亭，僅240mg/kg劑量組有明顯抑制尿酸鈉刺激家兔滑膜液的生成作用(P＜0.05)，120～60mg/kg劑量組均無明顯作用(P＞0.05)。而以上四個成分按比例依次為4-6∶1-3∶2-4∶1為主要組成成分的秦皮香豆素組合物120和60mg/kg分別能顯著和明顯抑制尿酸鈉刺激家兔滑膜液的生成(P＜0.01和P＜0.05)，30～120mg/kg范圍內呈明顯的量效關系。
表6秦皮香豆素組合物抑制尿酸鈉刺激家兔滑膜液中WBC數升高的作用(x±SD)

注①模型對照組與正常對照組比較^^^P＜0.001②各給藥組與模型對照組比較 **P＜0.01 ***P＜0.001表6顯示，單獨使用秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷或秦皮亭，僅240mg/kg劑量組有明顯抑制尿酸鈉刺激家兔滑膜液的生成作用(P＜0.05)，120～60mg/kg劑量組均無明顯作用(P＞0.05)。而以上四個成分按比例依次為4-6∶1-3∶2-4∶1為主要組成成分的秦皮香豆素組合物120和60mg/kg組分別能極顯著和顯著抑制尿酸鈉刺激家兔滑膜液中WBC的游走(P＜0.001和P＜0.05)，30～120mg/kg范圍內呈明顯的量效關系。
表7秦皮香豆素組合物對尿酸鈉所致家兔滑膜病理的影響

注與模型對照組比較 *P＜0.05 **P＜0.01表7顯示，單獨使用秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷或秦皮亭，僅240mg/kg劑量組有明顯抑制尿酸鈉所致兔膝關節(jié)滑膜充血水腫、結晶沉著和滑膜纖維化病理變化作用(P＜0.05)，120～60mg/kg劑量組均無明顯作用(P＞0.05)。而以上四個成分按比例依次為4-6∶1-3∶2-4∶1為主要組成成分的秦皮香豆素組合物120～60mg/kg劑量組具有顯著抑制尿酸鈉所致兔膝關節(jié)滑膜充血水腫、結晶沉著和滑膜纖維化病理變化作用(P＜0.01)，在30～120mg/kg范圍內呈明顯的量效關系。
下面給出最佳實施例進一步說明本發(fā)明但并不對本發(fā)明限制。
實施例1
取秦皮枝皮100公斤，切成絲狀，加水煎煮提取3次，每次加水1000升，煎煮1.5小時，合并提取液，濾過，合并三次提取液，濃縮至相對密度約1.1(60℃熱測)，加入乙醇使含醇量達80％，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇至無醇味，加水100升使溶解，加于已處理好的D101型大孔吸附樹脂柱上，先以水300升沖洗，棄去水洗液，再用50％乙醇600升洗脫，收集50％乙醇洗脫液，回收乙醇至無醇味，濃縮至相對密度約1.38(60℃熱測)，真空干燥，粉碎，過80目篩，混勻，即得秦皮香豆素組合物7.12公斤，按生藥材計，得率為7％。該秦皮香豆素組合物中各組分含量為總香豆素57.5％(紫外分光光度法)，秦皮甲素22％，秦皮乙素8％，秦皮苷13％，秦皮亭4％，其組成比例與其在藥材中的組成比例一致(HPLC色譜圖見附圖)。
取以上所得秦皮香豆素組合物5217g(含總香豆素3000g)，加淀粉適量稀釋并調整總量至15000g，攪拌混勻，過80目篩，加入滑石粉，混勻，裝入膠囊，制成50000粒，即得秦皮香豆素組合物膠囊制劑。經臨床研究證明，治療痛風及高尿酸血癥的療效明顯優(yōu)于秦皮甲素制劑。


圖1秦皮香豆素組合物樣品HPLC2秦皮香豆素組合物樣品HPLC三維圖譜(1.秦皮甲素；2.秦皮苷；3.秦皮乙素；4.秦皮亭)。
權利要求
1.一種制備秦皮香豆素組合物的方法，其特征在于，它包括如下步驟a.秦皮切片或絲后水煎煮提取，提取液濃縮后加乙醇沉淀，濾取乙醇液，回收乙醇，加水溶解；b.水溶液經聚乙烯型大孔樹脂吸附并用水洗除去雜質；c.吸附于聚乙烯型大孔樹脂上的香豆素用30-90％的含水乙醇洗脫，含水乙醇的用量為生藥量的3-10倍；d.洗脫液回收乙醇并濃縮，干燥，粉碎得秦皮香豆素組合物。
2.一種用權利要求1所述的方法制備的秦皮香豆素組合物，其特征在于a.該秦皮香豆素組合物是由一定比例的秦皮甲素(aesculin)、秦皮乙素(aesculetin)、秦皮苷(fraxin)、秦皮亭(fraxetin)等組成的總香豆素混合物，以紫外吸收光譜法測定，含總香豆素50％以上；b.該秦皮香豆素組合物中主要含有秦皮甲素(aesculin)、秦皮乙素(aesculetin)、秦皮苷(fraxin)、秦皮亭(fraxetin)4種成分，以高效液相色譜法測定，4種成分的總含量在40％以上，4種成分的比例依次為4-6∶1-3∶2-4∶1。
3.一種用權利要求1所述的方法制備的秦皮香豆素組合物的制藥用途，其特征在于所說的制藥用途是在制備用于治療痛風及高尿酸血癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種秦皮香豆素組合物的制備方法，采用水煎煮提取，大孔樹脂分離純化制備秦皮香豆素組合物。該秦皮香豆素組合物是由一定比例的秦皮甲素(aesculin)、秦皮乙素(aesculetin)、秦皮苷(fraxin)、秦皮亭(fraxetin)等組成的總香豆素混合物，其總香豆素含量超過50％，秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷秦皮亭4種成分含量在40％以上，4種成分的比例依次為4－6∶1－3∶2－4∶1。本發(fā)明還提供該秦皮香豆素組合物的制藥用途。
文檔編號A61K31/7042GK1923194SQ200510098808
公開日2007年3月7日 申請日期2005年9月1日 優(yōu)先權日2005年9月1日
發(fā)明者楊奎 申請人:成都恩威藥業(yè)有限公司