專利名稱：拮抗白介素－21受體活性的制作方法
專利說明拮抗白介素-21受體活性 本申請要求于2004年8月5日申請的美國臨時專利申請順序號60/599,086和2004年12月23日申請的美國臨時專利申請順序號60/639,176的權(quán)益，這兩份臨時申請的全部公開內(nèi)容都通過引用全部結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及將IL-21受體拮抗劑用于拮抗、降低和/或抑制白介素-21(IL-21)/IL-21受體(MU-1)活性的方法和組合物。本文所公開的方法和組合物可用作免疫治療藥。
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背景技術(shù)：
人IL-21是一種細(xì)胞因子，其序列與IL-2、IL-4和IL-15同源(Parrish-Novak等(2000)Nature 40857-63)。盡管白介素細(xì)胞因子間序列同源性低，但是細(xì)胞因子全都折疊成為該家族中具有代表性的“四螺旋束(four-helix-bundle)”結(jié)構(gòu)。大多數(shù)細(xì)胞因子可與I類或II類細(xì)胞因子受體結(jié)合。II類細(xì)胞因子受體包括IL-10受體和干擾素受體，而I類細(xì)胞因子受體包括IL-2至IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13和IL-15的受體，以及造血生長因子受體、瘦蛋白受體和生長激素受體(Cosman(1993)Cytokine 595-106)。
人IL-21受體(IL-21R)是淋巴組織、尤其是NK、B和T細(xì)胞所表達(dá)的I類細(xì)胞因子受體(Parrish-Novak等(2000)，出處同上)。編碼人白介素-21(IL-21)及其受體(IL-21R)的核苷酸序列和氨基酸序列描述于WO 00/53761；WO 01/85792；Parrish-Novak等(2000)，出處同上；和Ozaki等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9711439-44。IL-21R與IL-2受體β鏈和IL-4受體α鏈具有最高同源序列(Ozaki等(2000)，出處同上)。一旦配體結(jié)合，IL-21R與共同的γ細(xì)胞因子受體鏈(γc)締合，IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13和IL-15的受體都可共享該受體鏈(Ozaki等(2000)，出處同上；Asao等(2001)J Immunol.1671-5)。IL-21R在淋巴中廣泛分布，提示IL-21在免疫調(diào)節(jié)中可能具有作用。實際上，體外研究已經(jīng)知道，IL-21明顯能調(diào)節(jié)B細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能(Parrish-Novak等(2000)，出處同上；Kasaian等(2002)Immunity.16559-69)。然而，支持IL-21體內(nèi)調(diào)節(jié)作用的證據(jù)卻很有限。
發(fā)明概述 本文公開了干擾白介素-21(IL-21)和IL-21受體(在本文中亦稱“IL-21R”或“MU-1”)活性和/或相互作用的方法和組合物，例如使用IL-21拮抗劑或IL-21R拮抗劑(在本文中亦稱“IL-21/IL-21R拮抗劑”或“拮抗劑”或“IL-21/IL-21R途徑拮抗劑”)。
例如，申請人已經(jīng)知道，通過使用IL-21拮抗劑(例如包含與Fc免疫球蛋白區(qū)融合的IL-21R胞外域的融合蛋白)，降低IL-21R活性，在一些動物模型中改善了炎性癥狀，所述模型能合理地預(yù)測炎性疾病和/或自身免疫性疾病，例如炎性腸病(EBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、移植/移植排斥、移植物抗宿主病、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)(包括腎小球腎炎形式)和銀屑病(實施例7-14)。在膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠腳爪中，IL-21R mRNA的表達(dá)被上調(diào)(實施例8)。此外，在哮喘模型中，IL-21R缺陷型小鼠表現(xiàn)出癥狀減輕(實施例12)。因此，IL-21/IL-21R拮抗劑的活性可用于在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫抑制，例如用于治療或預(yù)防炎性疾病或自身免疫性疾病。這些拮抗劑也可用于治療或預(yù)防免疫細(xì)胞相關(guān)疾病，例如與一種或多種成熟T細(xì)胞(例如成熟CD8+或成熟CD4+T細(xì)胞)、成熟NK細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和巨核細(xì)胞異常活性相關(guān)的疾病。
因此，一方面，本發(fā)明的特征在于治療(例如治愈、抑制、延遲)、改善(例如減輕、緩解、降低、減少)患者的炎性疾病或自身免疫性疾病和/或預(yù)防(例如預(yù)防其發(fā)作或預(yù)防其復(fù)發(fā)或惡化)的方法。所述方法包括給予患者IL-21/IL-21R拮抗劑，例如其用量足以治療、改善或預(yù)防該病，或者其用量足以抑制或降低免疫細(xì)胞活性和/或細(xì)胞數(shù)。
IL-21/IL-21R拮抗劑可以單獨(dú)給予患者，或者與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)用，或者與本文所述的其它治療性形式聯(lián)用。優(yōu)選患者是罹患炎性疾病或自身免疫性疾病或處于其危險之中的哺乳動物，例如人。例如，所述方法可用于治療或預(yù)防患者的炎性疾病或自身免疫性疾病。這樣的疾病的實例包括但不限于移植排斥；糖尿病(例如I型)；多發(fā)性硬化；關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎(優(yōu)選RA))；重癥肌無力；脈管炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；腎小球腎炎；自身免疫性甲狀腺炎；皮膚炎性疾病(例如皮炎(包括特應(yīng)性皮炎和濕疹性皮炎)、硬皮病或銀屑病)；紅斑狼瘡；纖維化或纖維變性病(例如肺纖維化或肝纖維化)；呼吸性疾病(例如哮喘或COPD)；特應(yīng)性疾病(例如包括變態(tài)反應(yīng))；或腸道炎性疾病(例如IBD，例如節(jié)段性回腸炎(Crohn’s disease)或潰瘍性結(jié)腸炎)。
優(yōu)選使用本發(fā)明的IL-21或IL-21R拮抗劑治療以下疾病紅斑狼瘡、皮膚炎性疾病(例如銀屑病)、腸道炎性疾病(例如IBD、節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎)、移植排斥、哮喘、特應(yīng)性疾病或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
在一個實施方案中，IL-21/IL-21R拮抗劑影響IL-21或IL-21R(例如與其結(jié)合)，優(yōu)選哺乳動物(例如人)的IL-21或IL-21R(在本文中分別稱為“IL-21拮抗劑”和“IL-21R拮抗劑”)，并且降低或抑制一種或多種IL-21和/或IL-21R活性。優(yōu)選的拮抗劑以高親和力結(jié)合IL-21或IL-21R，例如親和常數(shù)至少約107M-1，優(yōu)選約108M-1，更優(yōu)選約109M-1至1010M-1或更強(qiáng)。
例如，IL-21/TL-21R拮抗劑可通過中和IL-21而減少和/或抑制IL-21R活性。在一個實施方案中，拮抗劑可以是融合蛋白，其包含IL-21R片段與非IL-21R片段(例如免疫球蛋白Fc區(qū))。在其它實施方案中，拮抗劑是抗IL-21R抗體或抗IL-21抗體或其抗原結(jié)合片段、可溶性形式的IL-21受體、肽或小分子抑制劑。
在一個實施方案中，IL-21/IL-21R拮抗劑是抗IL-21R抗體或抗IL-21抗體或其抗原結(jié)合片段；例如抗體是單克隆抗體或單特異性抗體，所述抗體能結(jié)合IL-21(例如人IL-21)或IL-21受體(例如人IL-21受體多肽或其抗原結(jié)合片段(例如Fab、F(ab′)2、Fv或單鏈Fv片段))。優(yōu)選的抗體為針對人IL-21或人IL-21受體多肽的人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或體外產(chǎn)生的抗體。優(yōu)選的抗體是中和抗體。
在其它實施方案中，IL-21/IL-21R拮抗劑包含全長IL-21多肽或其片段，例如IL-21多肽的抑制性IL-21受體結(jié)合域，例如人IL-21多肽(例如具有示于SEQ ID NO19的氨基酸序列的本文所述的人IL-21多肽)或者與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列；或者由示于SEQ ID NO18的相應(yīng)核苷酸序列或與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列所編碼?；蛘?，拮抗劑包括全長(例如SEQ ID NO2的約氨基酸1-538或20-538；或者SEQ ID NO10的約氨基酸1-529或20-529)，或者IL-21受體多肽片段，例如IL-21受體多肽的IL-21結(jié)合域，例如IL-21R可溶性片段(例如IL-21R片段，其包含鼠或人IL-21R胞外域；例如SEQ ID NO2(人)的約氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236，或者SEQ ID NO10(鼠)的約氨基酸1-236、20-236，或者由SEQ ID NO1或SEQ ID NO9的相應(yīng)核苷酸或與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列所編碼。
在一個實施方案中，拮抗劑為融合蛋白，其包含前述IL-21或IL-21受體多肽或其片段，以及例如與其融合的第二部分，例如多肽(例如免疫球蛋白鏈、GST、Lex-A或MBP多肽序列)。在一個優(yōu)選的實施方案中，融合蛋白包含至少能夠結(jié)合IL-21的IL-21R多肽片段，例如IL-21R的可溶性片段(例如IL-21R片段，其包含鼠或人IL-21R胞外域，例如SEQ ID NO2(人)的約氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236，或者SEQ ID NO10(鼠)的約氨基酸1-236、20-236，或由SEQ ID NO1或SEQ ID NO9的相應(yīng)核苷酸或與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列所編碼)，以及例如與其融合的第二部分，例如多肽(例如不同同種型的免疫球蛋白鏈、Fc片段、重鏈恒定區(qū)，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)。例如，融合蛋白可包含人IL-21R胞外域，例如SEQ ID NO2的約氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236，以及與其融合的人免疫球蛋白Fc鏈(例如人IgG，例如人IgG1，例如天然存在的人IgG1或突變形式的人IgG1)。在一個實施方案中，人Fc序列在一個或多個氨基酸上具有突變，例如在天然存在的SEQ ID NO28序列的殘基254和257上突變，以減少Fc受體結(jié)合。在其它實施方案中，融合蛋白可包含鼠IL-21R胞外域(例如SEQ ID NO10(鼠)的約氨基酸1-236、20-235)，以及例如與其融合的鼠免疫球蛋白Fc鏈(例如鼠IgG，例如鼠IgG2a或鼠IgG2a突變形式)。
融合蛋白還可包含將第一部分(例如IL-21R片段)與第二部分(例如免疫球蛋白片段)連接的接頭序列。在其它實施方案中，另外的氨基酸序列可添加到融合蛋白的N端或C端，以便于表達(dá)、空間柔性、檢測和/或分離或純化。
可用于本發(fā)明方法的拮抗性融合蛋白的實例見圖7-15。在一個實施方案中，融合蛋白包含選自例如以下的氨基酸序列SEQID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ IDNO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37或SEQ ID NO39，或者與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。在其它實施方案中，融合蛋白包含選自例如以下的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38，或者與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。優(yōu)選的融合蛋白具有示于SEQ ID NO25或SEQ ID NO29的氨基酸序列(分別見圖8A-8C和

圖10A-10C)，或者與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。在其它實施方案中，融合蛋白包含選自例如以下的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列SEQ ID NO24或SEQ ID NO28(分別見圖8A-8C和圖10A-10C)，或與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。最優(yōu)選的融合蛋白具有示于SEQ ID NO29的氨基酸序列或者具有示于SEQ ID NO28的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列(圖10A-10C)。
本文所述的IL-21/IL-21R拮抗劑，例如本文所述的融合蛋白可以衍生或與另一功能性分子(例如另一種肽或蛋白(例如Fab′片段)連接。例如，融合蛋白或抗體或抗原結(jié)合部分可以功能性連接(例如通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價結(jié)合或其它方式)一種或多種其它分子實體，例如抗體(例如雙特異性抗體或多特異性抗體)、毒素、放射性同位素、細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞生長抑制劑等。
在一個實施方案中，本文所述的IL-21/IL-21R拮抗劑(例如其藥物組合物)在聯(lián)合療法中與其它藥物例如治療藥聯(lián)合給予，所述治療藥可用于治療例如選自以下的一種或多種炎性疾病或自身免疫性疾病關(guān)節(jié)炎(包括RA、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎)；SLE；腎小球腎炎；皮膚炎性疾病(例如銀屑病)；呼吸性疾病(例如哮喘、COPD)；特應(yīng)性疾??；纖維變性病(例如肺纖維化或肝纖維化)；腸道炎性疾病(例如IBD，例如節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎)；或移植排斥。例如，聯(lián)合療法可包含一種或多種IL-21/IL-21R拮抗劑(例如抗IL-21抗體或抗IL-21R抗體或其抗原結(jié)合片段；IL-21R融合蛋白；可溶性IL-21R受體；肽抑制劑或小分子抑制劑)與一種或多種其它治療藥一起配制和/或一起給予，所述其它治療藥例如本文所述的一種或多種細(xì)胞因子和生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗炎藥、代謝抑制劑、酶抑制劑和/或細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞生長抑制劑。
可以與一種或多種IL-21/IL-21R拮抗劑一起給予和/或一起配制的優(yōu)選的其它治療藥的實例，包括但不限于一種或多種以下藥物TNF拮抗劑(例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或體外產(chǎn)生的抗體或其抗原結(jié)合片段，它們能結(jié)合TNF；TNF受體的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kDa TNF受體-IgG融合蛋白，ENBRELTM)、p55kDa TNF受體-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗劑，例如TNFα轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑)；IL-6、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22的拮抗劑；T細(xì)胞和B細(xì)胞消耗劑(depleting agent)(例如抗CD4抗體或抗CD22抗體)；小分子抑制劑，例如甲氨蝶呤和來氟米特；西羅莫司(雷帕霉素)及其類似物，例如CCI-779；Cox-2和cPLA2的抑制劑；NSAID；p38抑制劑、TPL-2、Mk-2和NFκb的抑制劑；RAGE或可溶性RAGE；P-選擇蛋白或PSGL-1的抑制劑(例如小分子抑制劑、其抗體，例如抗P-選擇蛋白的抗體)；雌激素受體β(ERB)激動劑或ERB-NFκb拮抗劑。可以與一種或多種IL-21/IL-21R拮抗劑一起給予和/或一起配制的最優(yōu)選的其它治療藥包括一種或多種以下藥物TNF受體可溶性片段，例如p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kDa TNF受體-IgG融合蛋白，ENBRELTM)；甲氨蝶呤、來氟米特或西羅莫司(雷帕霉素)或其類似物，例如CCI-779。
另一方面，提供了用于降低例如以下一種或多種免疫細(xì)胞的活性的方法成熟T細(xì)胞(成熟CD8+、CD4+、淋巴結(jié)T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞)、成熟NK細(xì)胞、B細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞(APC)(例如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或巨核細(xì)胞)或細(xì)胞群體，例如混合或基本純化的免疫細(xì)胞群體。該方法包括使免疫細(xì)胞接觸足夠量的IL-21/IL-21R拮抗劑，例如本文所述的拮抗劑，以降低免疫細(xì)胞活性。
另一方面，本發(fā)明的特征在于融合蛋白，它包含至少能夠結(jié)合IL-21多肽的IL-21R多肽片段，例如IL-21R可溶性片段(例如包含鼠或人IL-21R胞外域的IL-21R片段；例如SEQ ID NO2(人)的約氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236，或者SEQ ID NO10(鼠)的約氨基酸1-236、20-236，或者由SEQ ID NO1或SEQ ID NO9的相應(yīng)核苷酸或與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列所編碼)，以及例如與其融合的第二部分，例如多肽(例如不同同種型的免疫球蛋白鏈、Fc片段、重鏈恒定區(qū)，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)。例如，融合蛋白可包含人IL-21R胞外域(例如SEQ ID NO2的約氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236)，以及例如與其融合的人免疫球蛋白Fc鏈(例如人IgG，例如人IgG1或人IgG1的突變形式)。在一個實施方案中，人Fc序列已在一個或多個氨基酸上帶有突變，例如在野生型序列SEQ IDNO28的殘基254和257上帶有突變，以減少Fc受體結(jié)合。在其它實施方案中，融合蛋白可包含鼠IL-21R胞外域(例如SEQ ID NO10(鼠)的約氨基酸1-236、20-236)以及例如與其融合的鼠免疫球蛋白Fc鏈(例如鼠IgG，例如鼠IgG2a或鼠IgG2a的突變形式)。融合蛋白還可包含將IL-21R片段與第二部分連接在一起的接頭序列。在其它實施方案中，另外的氨基酸序列可添加在融合蛋白的N端或C端，以便于表達(dá)、檢測和/或分離或純化。
本發(fā)明的特征還在于編碼本文所述融合蛋白的核酸序列。
另一方面，本發(fā)明的特征在于含有本發(fā)明核酸的宿主細(xì)胞和載體。優(yōu)選宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞(例如哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞)或原核細(xì)胞(例如大腸桿菌(E.coli))。例如，哺乳動物細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系。示例性的哺乳動物細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞系(例如NSO)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、COS細(xì)胞、卵母細(xì)胞和來自轉(zhuǎn)基因動物的細(xì)胞，例如乳腺上皮細(xì)胞。例如，編碼本文所述的融合蛋白的核酸可以在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)。在一個實施方案中，核酸處于組織特異性啟動子(例如乳腺特異性啟動子)的控制之下，并且抗體在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生。例如，融合蛋白分泌到轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中，例如轉(zhuǎn)基因牛、豬、馬、綿羊、山羊或嚙齒動物的乳汁中。
另一方面，本發(fā)明提供融合蛋白例如本文所述的融合蛋白的制備方法。該方法包括(a)在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞和(b)從培養(yǎng)物中純化融合蛋白。也提供了按此方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明提供組合物例如藥物組合物，它包含藥學(xué)上可接受的載體和至少一種本文所述的IL-21/IL-21R拮抗劑(例如本文所述的融合蛋白)。在一個實施方案中，組合物例如藥物組合物包含兩種以上IL-21/IL-21R拮抗劑的組合。IL-21/IL-21R拮抗劑與藥物(例如治療藥(例如一種或多種本文所述的細(xì)胞因子和生長因子的抑制劑、免疫抑制劑、抗炎藥、代謝抑制劑、酶抑制劑和/或細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長抑制劑)或抗原(例如抗原性肽)和/或抗原呈遞細(xì)胞的組合，也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在一個實施方案中，藥物組合物包含IL-21/IL-21R拮抗劑和至少一種其它治療藥以及藥學(xué)上可接受的載體?？梢耘c一種或多種IL-21/IL-21R拮抗劑一起配制在組合物例如藥物組合物中的優(yōu)選的其它治療藥的實例包括但不限于一種或多種以下藥物TNF拮抗劑(例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或體外產(chǎn)生的抗體或其抗原結(jié)合片段，它們可與TNF結(jié)合；TNF受體可溶性片段，例如p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kDa TNF受體-IgG融合蛋白、ENBRELTM)、p55kDa TNF受體-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗劑，例如TNFα轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑)；IL-6、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22的拮抗劑；T細(xì)胞和B細(xì)胞的消耗劑(例如抗CD4抗體或抗CD22抗體)；小分子抑制劑，例如甲氨蝶呤和來氟米特；西羅莫司(雷帕霉素)及其類似物，例如CCI-779；Cox-2和cPLA2抑制劑；NSAID；p38抑制劑、TPL-2、Mk-2和NFκb的抑制劑；RAGE或可溶性RAGE；P-選擇蛋白或PSGL-1的抑制劑(例如小分子抑制劑，其抗體，例如抗P-選擇蛋白的抗體)；雌激素受體β(ERB)激動劑或ERB-NFκb拮抗劑?？膳c一種或多種IL-21/IL-21R拮抗劑共同給予和/或一起配制的最優(yōu)選的其它治療藥包括一種或多種以下藥物TNF受體可溶性片段，例如p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kDa TNF受體-IgG融合蛋白，ENBRELTM)；甲氨蝶呤、來氟米特或西羅莫司(雷帕霉素)或其類似物，例如CCI-779。
另一方面，本發(fā)明的特征在于治療、改善或預(yù)防患者例如哺乳動物(例如人)的特應(yīng)性疾病的方法。該方法包括給予患者IL-21/IL-21R拮抗劑，例如其用量足以治療、改善或預(yù)防該病，或者其用量足以抑制或降低免疫細(xì)胞活性和/或細(xì)胞數(shù)。在一個實施方案中，特應(yīng)性疾病是變應(yīng)性哮喘。在另一個實施方案中，特應(yīng)性疾病是特應(yīng)性皮炎、蕁麻疹、濕疹、變應(yīng)性鼻炎或變應(yīng)性腸胃炎。在一個實施方案中，IL-21/IL-21R拮抗劑可以與其它治療藥聯(lián)合給予，所述治療藥例如細(xì)胞因子抑制劑、免疫抑制劑、抗炎藥、酶抑制劑、白三烯拮抗劑、支氣管擴(kuò)張藥、β2-腎上腺素受體激動劑、抗毒蕈堿藥或肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑。可以與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)合給予以治療、改善或預(yù)防特應(yīng)性疾病的優(yōu)選治療藥的實例包括例如TNF拮抗劑、IL-6拮抗劑、IL-12拮抗劑、IL-15拮抗劑、IL-17拮抗劑、IL-18拮抗劑、IL-22拮抗劑、T細(xì)胞消耗劑、B細(xì)胞消耗劑、甲氨蝶呤、來氟米特、西羅莫司(雷帕霉素)或其類似物、Cox-2抑制劑、cPLA2抑制劑、NSAID和p38抑制劑。
另一方面，本發(fā)明的特征在于治療、改善或預(yù)防患者的自身免疫性疾病的方法。該方法包括給予患者IL-21/IL-21R拮抗劑，例如其用量足以治療、改善或預(yù)防該病，或者其用量足以抑制或降低免疫細(xì)胞活性和/或細(xì)胞數(shù)。在一個實施方案中，自身免疫性疾病是狼瘡，例如SLE。在一個實施方案中，IL-21/IL-21R拮抗劑可以與其它治療藥聯(lián)合給予，所述治療藥例如細(xì)胞因子抑制劑、生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗炎藥、代謝抑制劑、酶抑制劑、細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長抑制劑?？梢耘cIL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)合給予以治療、改善或預(yù)防自身免疫性疾病的優(yōu)選治療藥的實例包括例如TNF拮抗劑、IL-6拮抗劑、IL-12拮抗劑、IL-15拮抗劑、IL-17拮抗劑、IL-18拮抗劑、IL-22拮抗劑、T細(xì)胞消耗劑、B細(xì)胞消耗劑、氯喹、羥氯喹、甲氨蝶呤、來氟米特、西羅莫司(雷帕霉素)或其類似物、Cox-2抑制劑、cPLA2抑制劑、NSAID和p38抑制劑。
另一方面，本發(fā)明的特征在于治療、改善或預(yù)防患者的纖維變性病的方法。該方法包括給予患者IL-21/IL-21R拮抗劑，例如其用量足以治療、改善或預(yù)防該病，或者其用量足以抑制或降低免疫細(xì)胞活性和/或細(xì)胞數(shù)。例如，患者可能罹患內(nèi)臟纖維化(例如肝纖維化、腎纖維化或肺纖維化)、皮膚纖維化疾病或眼纖維化，或者處于其危險之中。
另一方面，本發(fā)明的特征在于將器官、組織或細(xì)胞移植給患者的方法。該方法包括給予患者IL-21/IL-21R拮抗劑，例如在移植之前、期間或之后。移植的器官和組織可以包括但不限于例如心臟、腎臟、肝臟、肺、胰臟、骨髓、軟骨、角膜、神經(jīng)元組織及其細(xì)胞。在一個實施方案中，IL-21/IL-21R拮抗劑與其它治療藥聯(lián)合給予，所述治療藥例如細(xì)胞因子抑制劑、生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗炎藥、代謝抑制劑、酶抑制劑、細(xì)胞毒劑和細(xì)胞生長抑制劑。可以與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)用的優(yōu)選治療藥的實例包括例如雷帕霉素、環(huán)孢菌素、抗CTLA-4抗體、抗CD40抗體、抗CD40L抗體和抗CD154抗體。
另一方面，本發(fā)明的特征在于移植受體的移植排斥癥狀或移植排斥相關(guān)疾病(例如纖維化或移植物抗宿主病(GVHD))的評價和治療方法。該方法包括鑒別患者的移植排斥癥狀并給予IL-21/IL-21R拮抗劑，例如其用量足以治療或改善移植排斥癥狀。移植排斥癥狀包括例如炎癥、器官功能減退、異常活檢和纖維化。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供通過給予IL-21/IL-21R拮抗劑而預(yù)防(例如降低其危險)移植排斥或移植排斥相關(guān)疾病的方法。
另一方面，本發(fā)明的特征在于治療、改善或預(yù)防患者的移植排斥或移植排斥相關(guān)疾病的方法。該方法的特征在于給予患者IL-21/IL-21R拮抗劑，其用量足以治療或改善或預(yù)防(例如降低其危險)排斥，或者其用量足以抑制或降低免疫細(xì)胞活性和/或細(xì)胞數(shù)。移植器官或組織可以包括例如心臟、腎臟、肝臟、肺、胰臟和骨髓。在一個實施方案中，IL-21/IL-21R拮抗劑可以與其它治療藥聯(lián)用，所述治療藥例如細(xì)胞因子抑制劑、生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗炎藥、代謝抑制劑、酶抑制劑、細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長抑制劑?？梢耘cIL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)用以治療、改善或預(yù)防移植排斥的優(yōu)選治療藥的實例包括例如雷帕霉素、環(huán)孢菌素、抗CTLA-4抗體、抗CD40抗體、抗CD40L抗體和抗CD154抗體。
“MU-1”和“IL-21R”以及肽、多肽和蛋白質(zhì)等術(shù)語在本文中可互換使用。
除非另有說明，否則本文所用的所有科技術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員公認(rèn)的含義。盡管方法與材料都類似于或等同于本發(fā)明實踐和實驗中所用的方法與材料，但是下面描述了合適的方法與材料。所有出版物、專利申請、專利和本文所提到的其它參考文獻(xiàn)都通過引用全部結(jié)合到本文中。在有矛盾的情況下，本說明書，包括定義，將會作調(diào)整。此外，材料、方法和實施例僅為說明性的，而不是限制性的。
根據(jù)以下發(fā)明詳述和所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將會是顯而易見的。
附圖簡述 圖1表示鼠IL-21R/MU-1的全長cDNA序列。該核苷酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO9的核苷酸1-2628。
圖2A-2B表示鼠和人IL-21R/MU-1的氨基酸序列。圖2A表示鼠IL-21R/MU-1的氨基酸序列(對應(yīng)于SEQ ID NO10的氨基酸1-529)。在氨基酸1-19具有預(yù)測的前導(dǎo)序列(經(jīng)SPScan預(yù)測)，其得分為10.1(粗體字)。SEQ ID NO10的氨基酸237-253為預(yù)測的跨膜域(下劃線)。預(yù)測信號基序包括以下各區(qū)盒1氨基酸265-274，盒2氨基酸310-324(粗體+下劃線)；六個酪氨酸位于SEQ ID NO10的氨基酸位置281、319、361、368、397和510。WSXWS基序(SEQ IDNO8)位于氨基酸殘基214至氨基酸殘基218(大號字+粗體)。潛在的STAT泊位(docking site)包括SEQ ID NO10的氨基酸393-398和氨基酸510-513。圖2B表示人MU-1的氨基酸序列(對應(yīng)于SEQ ID NO2)。標(biāo)明了預(yù)測的信號序列(SEQ ID NO2的約氨基酸1-19)；WSXWS基序(SEQ ID NO2的約氨基酸213-217)；和跨膜域(SEQ ID NO2的約氨基酸236-252、236-253、236-254(下劃線)。也標(biāo)明了潛在的JAK結(jié)合位點(diǎn)、信號基序和STAT泊位。這些位點(diǎn)的大致位置都加了方框。
圖3表示人與鼠MU-1 cDNA序列(分別對應(yīng)于SEQ ID NO1的核酸1-2665和SEQ ID NO9的核酸1-2628)的GAP比較。HuMU-1＝人 MU-1，murMU-1＝鼠 MU-1。空位參數(shù)空位權(quán)重＝50，平均匹配＝10.000，長度權(quán)重＝3，平均錯配＝0.000，％同一性＝66.116。
圖4表示人MU-1蛋白(對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸)與鼠MU-1蛋白(對應(yīng)于SEQ ID NO10的氨基酸)的GAP比較。通過BLOSUM62氨基酸取代矩陣產(chǎn)生比對(Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8910915-19)?？瘴粎?shù)＝空位權(quán)重8，平均匹配＝2.912，長度權(quán)重＝2，平均錯配＝-2.003；％同一性＝65.267。
圖5表示人MU-1氨基酸(對應(yīng)于SEQ ID NO2)、鼠MU-1氨基酸(對應(yīng)于SEQ ID NO10)與人IL2β鏈氨基酸(GENBANK檢索號M26062)的多序列比對。前導(dǎo)序列和跨膜區(qū)帶有下劃線。保守的細(xì)胞因子受體模塊基序用粗體字表示。潛在的信號傳導(dǎo)區(qū)用下劃線+粗體字表示。
圖6表示通過MU-1的信號傳導(dǎo)。在Clone E7 EPO-MU-1嵌合體中，MU-1使STAT 5磷酸化。在實施例3的特定條件下，通過MU-1的信號傳導(dǎo)導(dǎo)致在所有測試時間點(diǎn)都使STAT 5磷酸化。用IL-3處理對照或嵌合BAF-3細(xì)胞，引起STAT 3、而不是STAT 1或5的磷酸化。
圖7A-7B表示人IL-21R單體(對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸20-235)在其氨基端與蜜蜂前導(dǎo)序列和His6標(biāo)記(SEQ ID NO23的氨基酸1-44)融合的核苷酸序列和氨基酸序列比對。該核苷酸序列和氨基酸序列分別示于SEQ ID NO22和SEQ ID NO23。
圖8A-8C表示人IL-21R胞外域(對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸1-235)在其C-端通過接頭(對應(yīng)于SEQ ID NO25的氨基酸236-243)與人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc序列(對應(yīng)于SEQ ID NO25的氨基酸244-467)融合的核苷酸序列和氨基酸序列比對。該核苷酸序列和氨基酸序列分別示于SEQ ID NO24和SEQ ID NO25。
圖9A-9C表示人IL-21R胞外域(對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸1-235)在其C-端通過接頭(對應(yīng)于SEQ ID NO27的氨基酸236-243)與人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc序列(對應(yīng)于SEQ ID NO27的氨基酸244-467)以及His6序列標(biāo)記(對應(yīng)于SEQ ID NO27的氨基酸468-492)融合的核苷酸序列和氨基酸序列比對。該核苷酸序列和氨基酸序列分別示于SEQ ID NO26和SEQ ID NO27。
圖10A-10C表示人IL-21R胞外域(對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸1-235)在其C-端通過接頭(對應(yīng)于SEQ ID NO29的氨基酸236-243)與人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc突變序列(對應(yīng)于SEQ ID NO29的氨基酸244-467)融合的核苷酸序列和氨基酸序列比對。人Fc序列在野生型序列的殘基254和257帶有突變，以減少Fc受體結(jié)合。該核苷酸序列和氨基酸序列分別示于SEQ ID NO28和SEQ ID NO29。
圖11A-11B表示人IL-21R胞外域(對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸1-235)在其C-端與視紫紅質(zhì)序列標(biāo)記融合的核苷酸序列和氨基酸序列比對。該核苷酸序列和氨基酸序列分別示于SEQ ID NO30和SEQ ID NO31。
圖12A-12C表示人IL-21R胞外域(對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸1-235)在其C-端與EK切割位點(diǎn)和突變IgG1 Fc區(qū)(對應(yīng)于SEQ ID NO33的氨基酸236-470)融合的核苷酸序列和氨基酸序列比對。該核苷酸序列和氨基酸序列分別示于SEQ ID NO32和SEQ IDNO33。
圖13A-13B表示鼠IL-21R胞外域在其C-端與小鼠免疫球蛋白G2a(IgG2a)融合的核苷酸序列和氨基酸序列比對。該核苷酸(基因組)序列和氨基酸序列分別示于SEQ ID NO34和SEQ ID NO35。
圖14A-14B表示鼠IL-21R胞外域在其C-端與Flag和His6序列標(biāo)記融合的核苷酸序列和氨基酸序列比對。該核苷酸(基因組)序列和氨基酸序列分別示于SEQ ID NO36和SEQ ID NO37。
圖15A-15B表示(蜜蜂前導(dǎo)序列)鼠IL-21R胞外域在其C-端與Flag和His6序列標(biāo)記融合的核苷酸序列和氨基酸序列比對。該核苷酸(基因組)序列和氨基酸序列分別示于SEQ ID NO38和SEQ IDNO39。
圖16為用膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型進(jìn)行實驗的預(yù)防性、治療性和半治療性治療方案的總時間表。
圖17是曲線圖，表示MuIL-21RFc(200μg/小鼠，3次/周)對半治療性CIA小鼠的效果是治療后天數(shù)的函數(shù)。用小鼠Ig(200μg/小鼠，3次/周)作為對照。
圖18A-18B是照片，表示與陰性對照(圖B)相比，CIA小鼠患有關(guān)節(jié)炎的腳爪中IL-21R mRNA表達(dá)增加(圖A)。
圖19和圖20是線狀圖，表示與IgG對照相比，用muIL-21RFc和mEnbrel治療的大鼠的IBD樣癥狀的臨床評分顯著下降。圖19中的左圖為照片，表示正常人腸道淋巴細(xì)胞和淋巴結(jié)中MU-1mRNA的原位雜交。
圖21為給予MuIL-21RFc后，大鼠IBD模型的疾病嚴(yán)重程度的組織學(xué)評分下降的統(tǒng)計表。
圖22是線狀圖，表示在注射了經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)IL-21的T細(xì)胞、muIL-21RFc或?qū)φ?GFP)的小鼠中，移植物存活百分比隨過繼轉(zhuǎn)移后(post-adoptive transfer)的天數(shù)的變化。
圖23是線狀圖，表示在給予MuIL-21RFc后，CD45RB高過繼轉(zhuǎn)移模型的銀屑病性病灶的臨床評分的改善。圖23中的左圖表示用MuIL-21RFc治療前后的小鼠照片。
圖24是折線圖，表示卵清蛋白(OVA)致敏小鼠經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)或OVA攻擊后的氣道過度反應(yīng)(AHR)水平。序貫給予小鼠漸增量的乙酰甲膽堿。Penh(停頓增加)變化是AHR的標(biāo)志。
圖25A-25D是柱狀圖，表示OVA致敏小鼠經(jīng)PBS或OVA攻擊后其支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的細(xì)胞數(shù)。圖25A表示BALF中的細(xì)胞總數(shù)。圖25B表示BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)。圖25C表示BALF中的淋巴細(xì)胞數(shù)。圖25D表示BALF中的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)。空心柱表示經(jīng)PBS攻擊的WT小鼠；實心柱表示經(jīng)OVA攻擊的WT小鼠；灰色柱表示經(jīng)PBS攻擊的IL-21R-/-小鼠；斜紋柱表示經(jīng)OVA攻擊的IL-21R-/-小鼠。*表示p＜0.05，是通過Mann-Whitney U檢驗測定的。
圖26和圖27是OVA致敏小鼠經(jīng)OVA攻擊后其BALF中細(xì)胞因子水平的柱狀圖。圖26表示TNFα和IL-5水平。圖27表示IL-13水平。空心柱表示經(jīng)PBS攻擊的WT小鼠；實心柱表示經(jīng)OVA攻擊的WT小鼠；灰色柱表示經(jīng)PBS攻擊的IL-21R-/-小鼠；斜紋柱表示經(jīng)OVA攻擊的IL-21R-/-小鼠。*表示p＜0.05，是通過Mann-Whitney U檢驗測定的。
圖28A-28B是柱狀圖，表示OVA致敏小鼠用OVA或PBS攻擊后其血清IgE水平。圖28A表示血清總IgE水平。圖28B表示抗OVA特異性IgE水平?？招闹硎窘?jīng)PBS攻擊的WT小鼠；實心柱表示經(jīng)OVA攻擊的WT小鼠；灰色柱表示經(jīng)PBS攻擊的IL-21R-/-小鼠；斜紋柱表示經(jīng)OVA攻擊的IL-21R-/-小鼠。*表示p＜0.05，是通過Mann-Whitney U檢驗測定的。
圖29A-29D是表示MRL-Faslpr小鼠經(jīng)MuIL-21RFc或?qū)φ罩委熀蟮难h(huán)dsDNA自身抗體水平的圖。圖29A表示IgG1水平。圖29B表示IgG2a水平。圖29C表示IgG2b水平。圖29D表示IgG3水平。*表示p＜0.05，是通過Mann-Whitney U檢驗測定的。
圖30A-30D是表示MRL-Faslpr小鼠經(jīng)MuIL-21RFc或?qū)φ罩委熀蟮难h(huán)總IgG水平的圖。圖30A表示IgG1水平。圖30B表示IgG2a水平。圖30C表示IgG2b水平。圖30D表示IgG3水平。*表示p＜0.05，是通過Mann-Whitney U檢驗測定的。
圖31為是表示經(jīng)山羊抗小鼠IgG-FITC染色后的小鼠腎切片的熒光水平的圖。
圖32為示意圖，表示IL-21對免疫應(yīng)答的示例性效果。
圖33為示意圖，表示抑制IL-21/IL-21R途徑的示例性策略。
圖34為示意圖，表示示例性的可溶性IL-21RFc受體融合蛋白。
圖35是曲線圖，表示MuIL-21RFc治療組和對照治療組小鼠用柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)(“Etenella”)刺激后平均銀屑病評分。
圖36為統(tǒng)計表，表示與對照治療小鼠相比，用MuIL-21RFc治療的柔嫩艾美耳球蟲刺激小鼠的銀屑病癥狀的發(fā)作延遲和減輕。
圖37是曲線圖，表示與對照治療小鼠相比，用MuIL-21RFc治療的柔嫩艾美耳球蟲刺激小鼠在體重減輕方面有所減少。體重指數(shù)定義為測量體重與起始體重的比值。
圖38A是線狀圖，表示與對照治療小鼠相比，用MuIL-21RFc治療的柔嫩艾美耳球蟲刺激小鼠的平均糞便評分下降。
圖38B是表示各治療組的每只柔嫩艾美耳球蟲刺激小鼠在轉(zhuǎn)移后77天時的糞便評分的圖。
圖39為圖38A的數(shù)據(jù)統(tǒng)計表。
圖40A是表示與對照治療小鼠相比，用MuIL-21RFc治療的柔嫩艾美耳球蟲刺激小鼠的IFN-γ血清水平的圖。
圖40B是表示與對照治療小鼠相比，用MuIL-21RFc治療的柔嫩艾美耳球蟲刺激小鼠的糞便評分的圖。
圖41是曲線圖，表示用IL-21治療后，3H-胸苷摻入到活化的CD45RBhi和CD45RBlo細(xì)胞中。
圖42A-B是柱狀圖，表示用IL-21治療后，活化的CD45RBhi細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌增加。
圖43為柱狀圖，表示用MuIL-21RFc治療后，活化的CD45RBhi細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌減少。
圖44A-B為柱狀圖(A)和散布圖(B)，表示在SLE的GVHD模型中，移植了B6 bm12脾細(xì)胞的IL-21R敲出小鼠不產(chǎn)生抗dsDNA的自身抗體(A)，而且在這些小鼠腎中也沒有觀察到IgG沉積(B)。
發(fā)明詳述 本文公開了使用IL-21或IL-21受體(“IL-21R”或“MU-1”)的拮抗劑以抑制白介素-21(IL-21)/IL-21受體(MU-1)活性的方法和組合物。IL-21/IL-21R拮抗劑可用于在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫抑制，例如用于治療或預(yù)防炎性疾病或自身免疫性疾病(例如與一種或多種成熟T細(xì)胞(成熟CD8+T細(xì)胞、成熟CD4+T細(xì)胞)、成熟NK細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和巨核細(xì)胞異常活性相關(guān)的疾病，包括移植排斥、銀屑病和自身免疫性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和IBD)。
在一個實施方案中，申請人已經(jīng)提出，通過使用中和融合蛋白(其包含與Fc免疫球蛋白區(qū)融合的IL-21R胞外域)來降低IL-21R活性，以改善膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型的炎癥癥狀(實施例7)，以及改善動物模型的IBD(實施例9和11)、移植排斥(實施例10)、銀屑病(實施例11)和狼瘡(實施例13)。在CIA小鼠腳爪中，IL-21RmRNA的表達(dá)被上調(diào)(實施例8)。IL-21R缺陷型小鼠顯示出抗原誘發(fā)的氣道炎癥減輕(實施例12)。因此，能拮抗IL-21/IL-21R活性的IL-21R結(jié)合劑可用于在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫抑制，例如用于治療或預(yù)防炎性疾病或自身免疫性疾病(例如腎小球腎炎、移植排斥、銀屑病、特應(yīng)性疾病、哮喘、自身免疫性疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和SLE)和IBD(例如節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎))。
為了便于理解本發(fā)明，首先定義一些術(shù)語。其它定義將在發(fā)明詳述中給出。
本文所用的術(shù)語“MU-1”、“MU-1蛋白”、“白介素-21受體”或“IL-21R”是指I類細(xì)胞因子家族受體，也稱為NILR(WO01/85792；Parrish-Novak等(2000)Nature 40857-63；Ozaki等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9711439-444)。MU-1與IL-2受體和IL-15受體和IL-4α共享的β鏈同源(Ozaki等(2000)，出處同上)。一旦配體結(jié)合，IL-21R/MU-1能夠影響共同的γ細(xì)胞因子受體鏈(γc)(Asao等(2001)J.Immunol.1671-5)，并誘導(dǎo)STAT1和STAT3磷酸化(Asao等(2001))或STAT5磷酸化(Ozaki等(2000))。MU-1在淋巴組織中廣泛分布。術(shù)語“MU-1”是指能夠與IL-21(優(yōu)選來自哺乳動物，例如鼠或人IL-21)相互作用(例如結(jié)合)的受體(優(yōu)選哺乳動物受體，例如來自鼠或人)，并且具有以下特征之一(i)天然存在的哺乳動物MU-1多肽IL-21R/MU-1或其片段的氨基酸序列，例如SEQ ID NO2(人)或SEQ ID NO10(鼠)所示氨基酸序列或其片段；(ii)基本上與SEQ IDNO2(人)或SEQ ID NO10(鼠)所示氨基酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列；(iii)由天然存在的哺乳動物IL-21R/MU-1核苷酸序列或其片段(例如SEQ IDNO1(人)或SEQ ID NO9(鼠)或其片段)所編碼的氨基酸序列；(iV)由與SEQ ID NO1(人)或SEQID NO9(鼠)所示核苷酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列；(v)由與天然存在的IL-21R/MU-1核苷酸序列或其片段簡并的核苷酸序列(例如SEQ ID NO.1(人)或SEQ ID NO9(鼠)或其片段)所編碼的氨基酸序列；或(vi)在嚴(yán)格性條件例如高度嚴(yán)格性條件下與前述核苷酸序列之一雜交的核苷酸序列。
IL-21R/MU-1來源于哺乳動物，優(yōu)選人。人IL-21R/MU-1的核苷酸序列和預(yù)測氨基酸序列分別示于SEQ ID NO1和SEQ IDNO2。分析人IL-21R/MU-1氨基酸序列(SEQ ID NO2；圖2B)，揭示出以下結(jié)構(gòu)特征前導(dǎo)序列(SEQ ID NO2的約氨基酸1-19(圖2B))；WSXWS基序(SEQ ID NO2的約氨基酸213-217)；跨膜域(SEQID NO2的約氨基酸236-252(圖2B))；SEQ ID NO2的約氨基酸1-235的胞外域；和SEQ ID NO2的約253-538的胞內(nèi)域。據(jù)信，成熟人IL-21R/MU-1具有SEQ ID NO2的氨基酸20-538的序列。
IL-21R/MU-1 cDNA于1998年3月10日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，保藏號ATCC98687。
短于全長的IL-21R/MU-1蛋白的任何形式都可用于本發(fā)明的方法和組合物，只要它保留結(jié)合IL-21多肽的能力。短于全長的IL-21R/MU-1蛋白，例如可溶性IL-21R，可由編碼全長MU-1蛋白的多核苷酸相應(yīng)片段在宿主細(xì)胞中表達(dá)而產(chǎn)生。這些相應(yīng)的多核苷酸片段也是本發(fā)明的組成部分。如上所述的修飾多核苷酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來制備，所述技術(shù)包括合適所需缺失突變體的構(gòu)建、定點(diǎn)誘變方法或者通過使用合適的寡核苷酸引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
本文所用的“可溶性IL-21R/MU-1多肽”是不能將自身錨定在膜上的IL-21R/MU-1多肽。這類可溶性多肽包含例如MU-1或IL-21R多肽，它們?nèi)狈﹀^定所述多肽的足夠的跨膜區(qū)部分，或者它們經(jīng)修飾使得跨膜區(qū)無功能，例如IL-21R的可溶性片段(例如IL-21R片段，其包含鼠或人IL-21R的胞外域，包括SEQ ID NO2(人)的約氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236的氨基酸序列，或者SEQID NO10(鼠)的約氨基酸1-236、20-236的氨基酸序列。可溶性IL-21R/MU-1多肽還可以包括第二部分(例如與其融合)，所述第二部分例如多肽(例如免疫球蛋白鏈、GST、Lex-A或MBP多肽序列)。例如，融合蛋白可包含與第二部分融合的至少能結(jié)合IL-21的IL-21R多肽片段，例如IL-21R可溶性片段(例如包含鼠或人IL-21R胞外域的IL-21R片段；例如SEQ ID NO2(人)的約氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236，或者SEQ ID NO10(鼠)的約氨基酸1-236、20-236；所述第二部分例如多肽(例如不同同種型的免疫球蛋白鏈、Fc片段、重鏈恒定區(qū)，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)。
術(shù)語“白介素-21”或“IL-21”是指與IL-2、IL-4和IL-15具有序列同源性的細(xì)胞因子(Parrish-Novak等(2000)Nature 40857-63)。盡管白介素細(xì)胞因子間序列同源性低，但是細(xì)胞因子全都折疊成為該家族中具有代表性的“四螺旋束”結(jié)構(gòu)。它主要在活化CD4+T細(xì)胞中表達(dá)，據(jù)報道它能影響NK、B和T細(xì)胞(Parrish-Novak等(2000)，出處同上；Kasaian等(2002)，出處同上)。IL-21結(jié)合IL-21R(在本文中也稱為MU-1和NILR)。一旦IL-21結(jié)合，IL-21R的活化就會導(dǎo)致STAT5或STAT3信號傳導(dǎo)(Ozaki等(2000)，出處同上)。術(shù)語“IL-21”或“IL-21多肽”是指能夠與IL-21R(優(yōu)選來自哺乳動物，例如鼠或人IL-21)相互作用(例如結(jié)合)的蛋白質(zhì)(優(yōu)選來自哺乳動物，例如鼠或人)，并且具有以下特征之一(i)天然存在的哺乳動物IL-21的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO19(人)所示的氨基酸序列或其片段；(ii)基本上與SEQ ID NO19(人)所示氨基酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(iii)由天然存在的哺乳動物IL-21核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO18(人)或其片段)所編碼的氨基酸序列；(iv)由與SEQ ID NO18(人)所示核苷酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列；(v)由與天然存在的IL-21核苷酸序列或其片段簡并的核苷酸序列(例如SEQ ID NO19(人)或其片段)所編碼的氨基酸序列；或(vi)在嚴(yán)格性條件例如高度嚴(yán)格性條件下與前述核苷酸序列之一雜交的核苷酸序列。
短語MU-1或IL-21R多肽的“生物活性”是指相應(yīng)的成熟MU-1蛋白的一種或多種生物活性，包括但不限于(1)與IL-21多肽(例如人IL-21多肽)相互作用(例如結(jié)合)；(2)與γc、JAK1等信號傳導(dǎo)分子締合；(3)刺激stat蛋白(例如STAT5和/或STAT3)磷酸化和/或活化；和/或(4)調(diào)節(jié)(例如刺激或降低)、增殖、分化、效應(yīng)細(xì)胞功能、細(xì)胞溶解活性、細(xì)胞因子分泌和/或免疫細(xì)胞存活，所述免疫細(xì)胞例如T細(xì)胞(CD8+、CD4+T細(xì)胞)、NK細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和巨核細(xì)胞)。
本文所用的可用于本發(fā)明方法的“IL-21/IL-21R拮抗劑”是指能夠降低、抑制或消除IL-21R/MU-1多肽的一種或多種生物活性的藥物。在一個優(yōu)選的實施方案中，拮抗劑與IL-21R/MU-1多肽相互作用(例如結(jié)合)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，拮抗劑與IL-21多肽相互作用(例如結(jié)合)。用IL-21/IL-21R的拮抗劑進(jìn)行拮抗，不一定表現(xiàn)出對IL-21R/MU-1多肽和/或IL-21多肽生物活性的完全消除。
本文所用的IL-21/IL-21R拮抗劑的“治療有效量”是指以單劑量或多劑量給予患者(例如人患者)的藥用有效量，以治愈、改善或預(yù)防該病的一種或多種癥狀或降低其嚴(yán)重程度、或使患者的生存期比未經(jīng)該治療的患者的生存期更長。
本文所用的IL-21/IL-21R拮抗劑的“預(yù)防有效量”是指以單劑量或多劑量給予患者(例如人患者)的IL-21/IL-21R拮抗劑有效量，以預(yù)防疾病，例如本文所述疾病或延遲其發(fā)作或復(fù)發(fā)。
術(shù)語“誘導(dǎo)”、“誘發(fā)”、“抑制”、“增強(qiáng)”、“提高”、“增加”、“降低”等，例如用于兩種狀態(tài)間的數(shù)量差異時，是指兩種狀態(tài)間數(shù)量上至少具有統(tǒng)計學(xué)上顯著性差異。
術(shù)語“聯(lián)用”在本文中是指基本上同時(一起或序貫)給予幾種藥物。如果是序貫給藥，在給予第二種化合物的同時，優(yōu)選這兩種化合物中的第一種在治療部位或患者體內(nèi)仍存在可檢測的有效濃度。
本文所用的“融合蛋白”是指含有兩種以上有效締合(例如連接)的部分例如蛋白質(zhì)部分的蛋白質(zhì)。優(yōu)選各部分間共價締合。各部分可以直接締合或者通過間隔區(qū)或接頭連接。
本文所用的術(shù)語“抗體”是指包含至少一個、優(yōu)選兩個重(H)鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VH)以及至少一個、優(yōu)選兩個輕(L)鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VL)的蛋白質(zhì)。VH區(qū)和VL區(qū)還可進(jìn)一步分為超變區(qū)和構(gòu)架區(qū)(FR)，前者稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”(“CDR”)，其中間插著更為保守的構(gòu)架區(qū)。已經(jīng)準(zhǔn)確定義了構(gòu)架區(qū)和CDR(參見例如Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國健康和人類服務(wù)部(U.S.Department of Health and HumanServices)，NIH公布號91-3242，和Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196901-17，所述文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到本文中)。每個VH和VL都由3個CDR和4個FR組成，按以下順序從氨基端到羧基端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗體還可包含重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)，因而分別形成免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，抗體是兩個免疫球蛋白重鏈和兩個免疫球蛋白輕鏈的四聚體，其中免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈彼此通過例如二硫鍵連接。重鏈恒定區(qū)由以下三個結(jié)構(gòu)域組成CH1、CH2和CH3。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL組成。重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)通常介導(dǎo)抗體與宿主組織或因子的結(jié)合，所述因子包含免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(C1q)。
本文所用的術(shù)語“免疫球蛋白”是指由基本上由免疫球蛋白基因所編碼的一種或多種多肽組成的蛋白質(zhì)。已鑒定的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。全長免疫球蛋白“輕鏈”(約25kD或214個氨基酸)是由NH2-端的可變區(qū)基因(約110個氨基酸)和COOH-端的κ或λ恒定區(qū)基因所編碼的。同樣，全長免疫球蛋白“重鏈”(約50kD或446個氨基酸)是由可變區(qū)基因(約116個氨基酸)和其它上述恒定區(qū)基因之一(例如γ(編碼約330個氨基酸))所編碼的。
本文所用的“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因所編碼的抗體類別(例如IgM或IgG1)。
本文所用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”(或簡稱“抗體部分”，或“片段”)是指全長抗體的一個或多個片段，其保留與抗原(例如CD3)特異性結(jié)合的能力。結(jié)合片段的實例包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”范圍內(nèi)，它包括(i)Fab片段，即由VL區(qū)、VH區(qū)、CL區(qū)和CH1區(qū)組成的單價片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含在鉸鏈區(qū)以二硫鍵相連的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH區(qū)和CH1區(qū)組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL區(qū)和VH區(qū)組成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等(1989)Nature 341544-546)，其由VH區(qū)組成；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個區(qū)即VL和VH，是由各自的基因所編碼的，但是可以用重組方法，通過合成的接頭使它們彼此連接，所述接頭能使它們成為一條蛋白單鏈，其中VL區(qū)和VH區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等(1988)Science 242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。這類單鏈抗體也包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”之內(nèi)?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲取這些抗體片段，而且這些片段經(jīng)篩選可以相同的方式用作完整抗體。
與本文所公開的序列類似或同源(例如具有至少約85％序列同一性)的序列也是本申請的組成部分。在一些實施方案中，序列同一性可以是約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高?；蛘?，當(dāng)核酸區(qū)段在選擇性雜交條件(例如高度嚴(yán)格性雜交條件)下與該鏈的互補(bǔ)鏈雜交時，即具有基本同一性。核酸可存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中，或以部分純化或基本純化形式存在。
兩個序列之間的“同源性”或“序列同一性”(這兩個術(shù)語在本文中可互換使用)的計算進(jìn)行如下。為了最佳比較目的，將序列進(jìn)行比對(例如為了進(jìn)行最佳比對，可以在第一和第二氨基酸序列或核酸序列中或兩者中引入空位，而且為了比較的目的，非同源序列可以忽略不計)。在一個優(yōu)選的實施方案中，為了進(jìn)行比較而比對的參考序列的長度為參考序列長度的至少30％、優(yōu)選至少40％、更優(yōu)選至少50％、甚至更優(yōu)選至少60％，甚至更優(yōu)選至少70％、80％、90％、100％。然后，比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，那么所述分子在該位置上是相同的(本文所用的氨基酸或核酸的“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。兩個序列間％同一性是兩個序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)，其中考慮了空位數(shù)和每個空位的長度，它們是為了兩個序列最佳比對的目的而引入的。
兩個序列間的序列比較和確定％同一性，可以采用數(shù)學(xué)算法而完成。在一個優(yōu)選的實施方案中，兩個氨基酸序列間的％同一性采用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48444-453)算法而得出，所述算法結(jié)合到GCG軟件包(可得自http://www.gcg.com)的GAP程序中，用BLOSUM 62矩陣或PAM250矩陣，空位權(quán)重為16、14、12、10、8、6或4，而長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。在再一個優(yōu)選的實施方案中，兩個核苷酸序列間的％同一性運(yùn)用GCG軟件包(可得自http://www.gcg.com)的GAP程序而得出，用NWSgapdna.CMP矩陣，其空位權(quán)重為40、50、60、70或80，而長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。一組特別優(yōu)選的參數(shù)(和應(yīng)當(dāng)采用的參數(shù)，如果技術(shù)人員不知道用什么參數(shù)來確定某分子是否是在本發(fā)明的序列同一性或同源性限制范圍內(nèi)的話)是BLOSUM62打分矩陣，其空位罰分為12，空位延伸罰分為4，移碼空位罰分為5。兩個氨基酸或核苷酸序列間的％同一性也可用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，411-17)的算法而得出，該算法結(jié)合到ALIGN程序(2.0版)中，用PAM120權(quán)重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。
本文所用的術(shù)語“在嚴(yán)格性條件下雜交”是指雜交和洗滌條件。嚴(yán)格性條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可在以下文獻(xiàn)中找到Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。有水方法和無水方法描述于該參考文獻(xiàn)中，兩種方法都可采用。嚴(yán)格性雜交條件的一個優(yōu)選實例是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，在約45℃進(jìn)行雜交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于50℃洗滌一次或多次。嚴(yán)格性雜交條件的另一個實例是在6X SSC中，在約45℃進(jìn)行雜交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于55℃洗滌一次或多次。嚴(yán)格性雜交條件的再一個實例是在6X SSC中，在約45℃進(jìn)行雜交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于60℃洗滌一次或多次。優(yōu)選的嚴(yán)格性雜交條件是在6X SSC中，在約45℃進(jìn)行雜交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于65℃洗滌一次或多次。特別優(yōu)選的嚴(yán)格性雜交條件(和應(yīng)當(dāng)采用的條件，如果技術(shù)人員不知道用什么條件來確定某分子是否是在本發(fā)明的雜交限制范圍內(nèi)的話)是在0.5M磷酸鈉、7％SDS中，于65℃雜交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于65℃洗滌一次或多次。本發(fā)明分離的多核苷酸可用作雜交探針和引物，以鑒定和分離與編碼本發(fā)明公開的多核苷酸具有序列同一性或相似性的核酸。用于鑒定和分離核酸的雜交方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、DNA雜交、原位雜交和RNA雜交，這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。本文提供有關(guān)雜交條件和反應(yīng)的更多公開內(nèi)容。
可在不同嚴(yán)格性條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性包括任兩個核酸分子彼此雜交的難度。優(yōu)選每個雜交的多核苷酸在降低的嚴(yán)格性條件下與其相應(yīng)的多核苷酸雜交，更優(yōu)選嚴(yán)格性條件，最優(yōu)選高度嚴(yán)格性條件。嚴(yán)格性條件的實例見下表1高度嚴(yán)格性條件是至少與例如條件A-F一樣嚴(yán)格的條件；嚴(yán)格性條件是至少與例如條件G-L一樣嚴(yán)格的條件；而降低的嚴(yán)格性條件是至少與例如條件M-R一樣嚴(yán)格的條件。
表1


1雜交長度是雜交多核苷酸的雜交區(qū)。當(dāng)多核苷酸與未知序列的靶多核苷酸雜交時，雜交長度假定為雜交多核苷酸的長度。當(dāng)已知序列的多核苷酸雜交時，可通過多核苷酸序列比對并鑒定最佳序列互補(bǔ)區(qū)而確定雜交長度。
2SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl，10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)在雜交和洗滌緩沖液中可替代SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)，雜交完成后15分鐘可進(jìn)行洗滌。
TB*-TR*對于長度小于50個堿基對的雜合體的雜交溫度應(yīng)比雜合體的解鏈溫度(Tm)低5-10℃，其中根據(jù)以下公式求出Tm。對于長度小于18個堿基對的雜合體，Tm(℃)＝2(A+T堿基數(shù))+4(G+C堿基數(shù))。對于長度介于18-49個堿基對的雜合體，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10Na+)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是雜合體堿基數(shù)，Na+是雜交緩沖液中的鈉離子濃度(1X SSC的Na+＝0.165M)。
多核苷酸雜交的嚴(yán)格性條件的其它實例參見Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual，第9和11章，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，和Ausubel等(編著)，Current Protocols in Molecular Biology，第2.10&6.3-6.4節(jié)，John Wiley & Sons，Inc(1995)，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明分離的多核苷酸可用作雜交探針和引物，以鑒定和分離具有編碼本文公開的多核苷酸等位變異體的序列的DNA。等位變異體是本文公開的多核苷酸的天然存在的替代形式，它所編碼的多肽與本文公開的多核苷酸所編碼的多肽具有同一性或顯著的相似性。優(yōu)選等位變異體與本文公開的多核苷酸具有至少90％序列同一性(更優(yōu)選至少95％同一性；最優(yōu)選至少99％同一性)。
本發(fā)明分離的多核苷酸也可用作雜交探針和引物，以鑒定和分離具有與本文公開的多核苷酸同源的編碼多肽的序列的DNA。這些同源序列是從與本文所公開的多肽和多核苷酸不同的物種中分離得到的多核苷酸和多肽，或者盡管是從同一物種中分離，但具有與本文所公開的多核苷酸和多肽明顯的序列相似性。優(yōu)選多核苷酸同源序列與本文公開的多核苷酸具有至少50％序列同一性(更優(yōu)選至少75％同一性；最優(yōu)選至少90％同一性)，而多肽同源序列與本文公開的多肽具有至少30％序列同一性(更優(yōu)選至少45％同一性；最優(yōu)選至少60％同一性)。優(yōu)選本文公開的多核苷酸和多肽的同源序列是從哺乳動物中分離的。
本發(fā)明分離的多核苷酸也可用作雜交探針和引物，以鑒定表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞和組織以及它們表達(dá)的條件。
人們知道，本發(fā)明的IL-21/IL-21R拮抗劑可具有其它保守或非必需氨基酸取代，這些取代對其功能基本上沒有影響?！氨Ｊ匕被崛〈笔沁@樣的取代其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代。本領(lǐng)域已經(jīng)確定具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括帶有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，帶有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不帶電荷的極性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，帶非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，帶β支鏈側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和帶芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
本文所用的術(shù)語“重組宿主細(xì)胞”(或簡稱“宿主細(xì)胞”)是指其中導(dǎo)入重組表達(dá)載體的細(xì)胞。可以理解，該術(shù)語不僅是指具體的受試細(xì)胞，而且是指所述細(xì)胞的子代。因為突變或環(huán)境影響，某些修飾可在以后的后代中發(fā)生，所以這樣的后代實際上與親代細(xì)胞并不相同，但是這樣的細(xì)胞仍然包括在本文所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍之內(nèi)。
IL-21/IL-21R拮抗劑 在一個實施方案中，IL-21R/MU-1多肽或其活性片段可以與第二部分例如免疫球蛋白或其片段(例如其Fc結(jié)合片段)融合。例如，IL-21R/MU-1的可溶性形式可以通過“接頭”序列與免疫球蛋白的Fc部分融合。也可使用其它融合蛋白，例如與GST、Lex-A或MBP融合的蛋白。
融合蛋白還可包含將IL-21或IL-21R片段與第二部分連接的接頭序列。例如，融合蛋白可包含肽接頭，例如長度約4-20個氨基酸的肽接頭，更優(yōu)選5-10個氨基酸的肽接頭；在一個實施方案中，肽接頭長度為8個氨基酸。肽接頭中的每個氨基酸都選自Gly、Ser、Asn、Thr和Ala；在一個實施方案中，肽接頭包括Gly-Ser元件。在其它實施方案中，融合蛋白包含肽接頭，肽接頭包含具有式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y的序列，其中y為1、2、3、4、5、6、7或8。
在其它實施方案中，融合蛋白的N端或C端還可添加另外的氨基酸序列，以便于表達(dá)、檢測和/或分離或純化。例如，IL-21/IL-21R融合蛋白可以與一種或多種額外部分連接，所述額外部分例如GST、His6標(biāo)記、FLAG標(biāo)記。例如，融合蛋白還可以與GST融合蛋白連接，其中融合蛋白序列與GST(即谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)序列的C-端融合。這樣的融合蛋白有利于MU-1融合蛋白的純化。
在另一個實施方案中，融合蛋白在其N-端包含異源信號序列(即在MU-1核酸所編碼的多肽上并不存在的多肽序列)。例如，天然MU-1信號序列可以被去除，并且被另一種蛋白質(zhì)的信號序列取代。在某些宿主細(xì)胞(例如哺乳動物宿主細(xì)胞)中，可以使用異源信號序列來增加MU-1的表達(dá)和/或分泌。
可以通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合蛋白或融合蛋白。例如，按照常規(guī)技術(shù)例如使用平端或粘端進(jìn)行連接，將編碼不同多肽序列的DNA片段符合讀框地連接在一起，經(jīng)限制酶消化，提供合適末端，如需要的話，補(bǔ)平粘端，用堿性磷酸酶處理以避免不想要的連接，再進(jìn)行酶促連接。在另一個實施方案中，可以通過自動DNA合成儀等常規(guī)技術(shù)合成融合基因?；蛘?，使用錨定引物可以進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，這可產(chǎn)生兩個連續(xù)基因片段之間的互補(bǔ)突出端(overhang)，其隨后可以退火并重新擴(kuò)增以產(chǎn)生嵌合基因序列(參見例如Ausubel等(編著)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，1992)。此外，許多表達(dá)載體是市售的，它們可編碼融合部分(例如免疫球蛋白重鏈Fc區(qū))。MU-1編碼核酸可克隆到這樣的表達(dá)載體中，使融合部分與免疫球蛋白蛋白符合讀框地連接在一起。在某些實施方案中，MU-1融合多肽以寡聚體例如二聚體或三聚體形式存在?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知方法，構(gòu)建第一多肽和/或編碼第一多肽的核酸。
在某些實施方案中，提供在天然存在的MU-1序列(野生型)中具有突變的變異型MU-1多肽的MU-1多肽部分，它可產(chǎn)生MU-1多肽與IL-21結(jié)合的更高的親和性(相對于未突變的序列來說)。
在某些實施方案中，提供在天然存在的MU-1序列(野生型)中具有突變的變異型MU-1多肽的MU-1多肽部分，它可使MU-1序列對蛋白水解具有更高的抗性(相對于未突變的序列來說)。在某些實施方案中，第一多肽包含全長MU-1多肽?；蛘?，第一多肽包含小于全長MU-1多肽。
融合蛋白中可包含的信號肽是MPLLLLLLLLPSPLHP(SEQ ID NO21)。如需要的話，還可將一個或多個氨基酸插入到含有MU-1部分的第一多肽部分和第二多肽部分之間。
第二多肽優(yōu)選是可溶的。在某些實施方案中，第二多肽延長了所連接多肽的半壽期(例如血清半壽期)。在某些實施方案中，第二多肽包含有利于將融合多肽與第二MU-1多肽締合的序列。在優(yōu)選的實施方案中，第二多肽至少包含免疫球蛋白多肽區(qū)。免疫球蛋白融合多肽是本領(lǐng)域已知的，參見例如美國專利號5,516,964、5,225,538、5,428,130、5,514,582、5,714,147和5,455,165。
在一些實施方案中，第二多肽包含全長免疫球蛋白多肽?；蛘撸诙嚯陌∮谌L免疫球蛋白多肽，例如重鏈、輕鏈、Fab、Fab2、Fv或Fc。優(yōu)選的第二多肽包含免疫球蛋白多肽重鏈。更優(yōu)選的第二多肽包含免疫球蛋白多肽Fc區(qū)。
在本發(fā)明的另一方面，第二多肽具有比野生型免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)更少的效應(yīng)子功能。Fc效應(yīng)子功能包括例如Fc受體結(jié)合，補(bǔ)體結(jié)合和T細(xì)胞消耗活性(參見例如美國專利第6,136,310號)。T細(xì)胞消耗活性、Fc效應(yīng)子功能和抗體穩(wěn)定性的測定方法是本領(lǐng)域已知的。在一個實施方案中，第二多肽對Fc受體僅有低親和性或沒有親和性。在一個替代實施方案中，第二多肽對補(bǔ)體蛋白C1q僅有低親和性或沒有親和性。
優(yōu)選的第二多肽序列包含SEQ ID NO17的氨基酸序列。該序列包含F(xiàn)c區(qū)。具有下劃線的氨基酸不同于野生型免疫球蛋白序列相應(yīng)位置上的氨基酸
HTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO17) 可用于本發(fā)明方法的拮抗性融合蛋白的實例見圖7-15。在一個實施方案中，融合蛋白包含選自例如以下的氨基酸序列SEQID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ IDNO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37或SEQ ID NO39、或與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。在其它實施方案中，融合蛋白包含選自例如以下的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38，或與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。優(yōu)選的融合蛋白具有氨基酸序列示于SEQ ID NO25或SEQ ID NO29(分別見圖8A-8C和圖10A-10C)，或與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。在其它實施方案中，融合蛋白包含選自例如以下的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列SEQ ID NO24或SEQ ID NO28(分別見圖8A-8C和圖10A-10C)，或與它們具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。最優(yōu)選的融合蛋白具有SEQ ID NO29所示的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO28所示核苷酸序列所編碼的氨基酸序列(圖10A-10C)。
在其它實施方案中，IL-21/IL-21R拮抗劑是抗體或其抗原結(jié)合片段，它們能結(jié)合IL-21或IL-21R，優(yōu)選能結(jié)合哺乳動物(例如人或鼠)IL-21或IL-21R。
本發(fā)明的MU-1蛋白也可用于免疫動物，以獲得多克隆抗體和單克隆抗體，這樣的抗體可與MU-1蛋白特異性反應(yīng)，可抑制配體與受體的結(jié)合?？梢允褂猛暾鸐U-1作為免疫原，或者通過使用MU-1片段，得到這樣的抗體。較小片段的MU-1也可用于免疫動物。肽免疫原還可在羧基端含有半胱氨酸殘基，并且與半抗原綴合，所述半抗原例如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)?？赏ㄟ^用硫酸化酪氨酸殘基替代酪氨酸殘基而制備其它肽免疫原。這些肽的合成方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
能結(jié)合MU-1蛋白的中和抗體或非中和抗體(優(yōu)選單克隆抗體)，也可用于治療上述疾病。這些中和單克隆抗體能阻斷配體與MU-1受體鏈的結(jié)合。
本發(fā)明還提供組合物，它包含與IL-21或IL-21R特異性反應(yīng)的抗體。
用攜帶人免疫球蛋白基因(而不是小鼠系統(tǒng))的轉(zhuǎn)基因小鼠，可產(chǎn)生針對IL-21或IL-21R的人單克隆抗體(mAb)。這些來自經(jīng)目標(biāo)抗原免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞，用于產(chǎn)生雜交瘤，該雜交瘤分泌對人蛋白表位具有特異性親和力的人mAb(參見例如Wood等，國際公布號WO91/00906，Kucherlapati等，國際公布號WO 91/10741；Lonberg等，國際公布號WO92/03918；Kay等，國際公布號92/03917；Lonberg，N.等1994 Nature 368856-859；Green，L.L.等(1994)NatureGenet.713-21；Morrison，S.L.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.816851-6855；Bruggeman等(1993)Year Immunol 733-40；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.903720-3724；Bruggeman等(1991)Eur J Immunol 211323-1326)。
也可通過重組DNA技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法產(chǎn)生單克隆抗體。已經(jīng)開發(fā)了一個替代方法，稱為“組合抗體展示(combinatorial antibody display)”方法，鑒定并分離具有特定抗原特異性的抗體片段，該方法可用于產(chǎn)生單克隆抗體；該方法是本領(lǐng)域眾所周知的。用免疫原免疫動物后，克隆所得B細(xì)胞庫的所有抗體。通過使用寡聚引物混合物和PCR以獲取免疫球蛋白分子各群體可變區(qū)的DNA序列的方法，通常是已知的。例如，對應(yīng)于5′前導(dǎo)(信號肽)序列和/或構(gòu)架1(FR1)序列的混合寡核苷酸引物，以及針對保守的3′恒定區(qū)引物的引物，可用于PCR擴(kuò)增，以便從各種鼠抗體擴(kuò)增重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)(Larrick等(1991)，Biotechniques 11152-156)。類似的策略也可用于從人抗體擴(kuò)增人重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)(Larrick等(1991)，MethodsCompanion to Methods in Enzymology 2106-110)。
嵌合抗體，包括嵌合免疫球蛋白鏈，可通過本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)而制備。例如，用限制酶消化編碼鼠(或其它物種)單克隆抗體分子Fc恒定區(qū)的基因，以去除鼠Fc編碼區(qū)，并且用人Fc恒定區(qū)編碼基因的等同部分來取代(參見Robinson等，國際專利申請?zhí)朠CT/US86/02269；Akira等，歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrison等，歐洲專利申請173,494；Neuberger等，國際公布號WO 86/01533；Cabilly等，美國專利第4,816,567號；Cabilly等，歐洲專利申請125,023；Better等(1988)Science 2401041-1043)；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.843439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84214-218；Nishimura等(1987)Canc.Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature 314446-449；和Shaw等(1988)J.Natl CancerInst.801553-1559)。
可以通過本領(lǐng)域已知方法，使抗體或免疫球蛋白鏈人源化?？赏ㄟ^用人Fv可變區(qū)等同序列取代不直接參與抗原結(jié)合的Fv可變區(qū)的序列，而產(chǎn)生人源化抗體(包括人源化免疫球蛋白鏈)。產(chǎn)生人源化抗體的通用方法由以下文獻(xiàn)提供Morrison，S.L.(1985)Science2291202-1207，Oi等(1986)BioTechniques 4214，和Queen等，美國專利第5,585,089、5,693,761和5,693,762號，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用全部結(jié)合到本文中。這些方法包括編碼至少一個重鏈或輕鏈的全部或部分免疫球蛋白Fv可變區(qū)的核酸序列的分離、操縱和表達(dá)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，所述核酸的來源是眾所周知的，例如可得自產(chǎn)生針對預(yù)先確定的靶標(biāo)的抗體的雜交瘤。然后，編碼人源化抗體或其片段的重組DNA可以克隆到合適的表達(dá)載體中。
可通過CDR移植或CDR取代，制備人源化或CDR移植抗體分子或免疫球蛋白，其中一個、兩個或所有免疫球蛋白鏈的CDR都可以被取代(參見例如美國專利第5,225,539號；Jones等(1986)Nature 321552-525；Verhoeyan等(1988)Science 2391534；Beidler等(1988)J.Immunol.1414053-4060；Winter，美國專利第5,225,539號，所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用全部結(jié)合到本文中。Winter描述了CDR移植方法，所述方法可用于制備本發(fā)明的人源化抗體(1987年3月26日申請的英國專利申請GB 2188638A；Winter，美國專利第5,225,539號，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。特定人抗體的所有CDR都可以被至少一部分非人類CDR取代，或者僅有部分CDR可以被非人類CDR取代。僅有必要取代人源化抗體與預(yù)先確定的抗原結(jié)合所需的CDR的數(shù)量。
通過缺失、添加或取代抗體其它部分(例如恒定區(qū))而修飾的單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體，也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，抗體可以通過以下方法修飾(i)缺失恒定區(qū)；(ii)用另一個恒定區(qū)取代原有恒定區(qū)，所述另一個恒定區(qū)例如能增加抗體半壽期、穩(wěn)定性或親和性的恒定區(qū)，或者所述恒定區(qū)來自另一物種或抗體類別；或(iii)修飾恒定區(qū)內(nèi)的一個或多個氨基酸，以改變例如糖基化位點(diǎn)的數(shù)目、效應(yīng)細(xì)胞功能、Fc受體(FcR)結(jié)合、補(bǔ)體固定等。
改變抗體恒定區(qū)的方法是本領(lǐng)域已知的?？梢酝ㄟ^在抗體恒定部分用一個不同的殘基取代至少一個氨基酸殘基，產(chǎn)生具有功能改變(例如對細(xì)胞上的FcR或補(bǔ)體C1組分等效應(yīng)配體的親和性發(fā)生改變)的抗體(參見例如E.P.388,151A1、U.S.5,624,821和U.S.5,648,260，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容全都通過引用結(jié)合到本文中)。當(dāng)用于鼠或其它物種的免疫球蛋白時，類似的改變形式可降低或消除這些功能。
例如，可通過用側(cè)鏈上具有合適官能團(tuán)的殘基取代指定殘基，或者通過引入帶電荷的官能團(tuán)(例如谷氨酸或天冬氨酸，或許芳族非極性殘基，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸)，來改變抗體(例如IgG，例如人IgG)的Fc區(qū)對FcR(例如FcγR1)或?qū)1q結(jié)合的親和性(參見例如U.S.5,624,821)。
IL-21多肽的氨基酸序列是公知的。例如，人IL-21的核苷酸序列和氨基酸序列可得自GENBANK檢索號X_011082。所公開的人IL-21核苷酸序列如下1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc61 tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc ttcttgggga cactggtcca121 caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat181 tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga241 agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa301 gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag361 gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg421 tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca481 aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc541 taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg601 tattccaagt ggaggag(SEQ ID NO18) 所公開的人IL-21多肽的氨基酸序列如下MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ ID NO19) 本發(fā)明也包括這樣的核酸所述核酸在高度嚴(yán)格性條件(例如0.1X SSC，65℃)下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38所示的核苷酸雜交。本發(fā)明也包括編碼MU-1蛋白或融合蛋白的分離的多核苷酸，但是所述多核苷酸因遺傳密碼簡并性而不同于SEQ ID NO1、SEQ IDNO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38所示的核苷酸序列。本發(fā)明也包括因點(diǎn)突變或引入修飾所導(dǎo)致的在以下序列所示的核苷酸序列中的變化SEQ ID NO1、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38。
本發(fā)明分離的多核苷酸可以與表達(dá)控制序列(例如Kaufman等(1991)Nucleic Acids Res.19，4485-4490中公開的pMT2表達(dá)載體或pED表達(dá)載體)操作性連接，以便產(chǎn)生重組MU-1蛋白。許多合適的表達(dá)控制序列是本領(lǐng)域已知的。表達(dá)重組蛋白的通用方法也是已知的，例如參見R.Kaufman(1990)Methods in Enzymology 185，537-566。本文所定義的“操作性連接”是指本發(fā)明分離的多核苷酸和表達(dá)控制序列經(jīng)酶促連接或化學(xué)連接形成共價鍵，其方式使得MU-1蛋白由宿主細(xì)胞表達(dá)，所述細(xì)胞已經(jīng)用所連接的多核苷酸/表達(dá)控制序列轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)染)。
本文所用的術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一核酸分子的核酸分子。一類載體是“質(zhì)粒”，它是環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其中可連接其它DNA區(qū)段。另一類載體是病毒載體，其中其它DNA區(qū)段可連接到病毒基因組中。某些載體在導(dǎo)入它們的宿主細(xì)胞后能自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，可整合到宿主細(xì)胞基因組中，因而可隨宿主基因組復(fù)制而復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)與其操作性連接的基因的表達(dá)。這類載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或簡稱“表達(dá)載體”)。一般而言，用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)載體通常呈質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”可互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明包括其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們行使相同的功能。
術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如聚腺苷酸化信號)，其控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。這類調(diào)節(jié)序列例如參見Goeddel(1990)Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，表達(dá)載體的設(shè)計，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，都取決于待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、所需蛋白的表達(dá)水平等因素。對于哺乳動物宿主細(xì)胞的表達(dá)來說，優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包括在哺乳動物細(xì)胞中指導(dǎo)蛋白高水平表達(dá)的病毒元件，例如來自以下的啟動子和/或增強(qiáng)子FF-1a啟動子和BGH poly A、巨細(xì)胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強(qiáng)子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動子/增強(qiáng)子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒。有關(guān)病毒調(diào)節(jié)元件及其序列的進(jìn)一步描述可參見例如Stinski的美國專利第5,168,062號、Bell等的美國專利第4,510,245號和Schaffner等的美國專利第4,968,615號。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可攜帶額外序列，例如在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)載體復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點(diǎn))和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因有利于選擇其中導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞(參見例如Axel等的美國專利第4,399,216、4,634,665和5,179,017號)。例如，在導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞中的選擇性標(biāo)記基因通常具有抗藥性，所述藥物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包含二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主細(xì)胞，用甲氨蝶呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418選擇)。
許多類型的細(xì)胞可作為合適的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)MU-1蛋白或其融合蛋白。能表達(dá)功能性MU-1蛋白的任何細(xì)胞類型都可使用。合適的哺乳動物宿主細(xì)胞包括例如猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人腎293細(xì)胞、人表皮A431細(xì)胞、人Colo205細(xì)胞、3T3細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、其它轉(zhuǎn)化的靈長類細(xì)胞系、正常二倍體細(xì)胞、來自原代體外組織培養(yǎng)物的細(xì)胞株、原代外植體、HeLa細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、BHK、HL-60、U937、HaK、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、M1x或C2C12細(xì)胞。
也可通過在一種或多種昆蟲表達(dá)載體中，將本發(fā)明分離的多核苷酸與合適的控制序列操作性連接，使用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)生MU-1蛋白或其融合蛋白。用于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料與方法是以試劑盒形式市售的，得自例如Invitrogen，San Diego，Calif.U.S.A.(MAXBAC試劑盒)，所述方法是本領(lǐng)域眾所周知的，描述于Summers和Smith，Texas Agricultural Experiment StationBulletin No.1555(1987)，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。MU-1蛋白的可溶性形式也可用如上所述的合適的分離的多核苷酸，在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生。
或者，MU-1蛋白或其融合蛋白可以在酵母等低等真核生物或細(xì)菌等原核生物中產(chǎn)生。合適的酵母菌株包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)菌株、假絲酵母屬(Candida)或能表達(dá)異源蛋白的任何酵母菌株。合適的細(xì)菌菌株包括大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或能表達(dá)異源蛋白的任何細(xì)菌菌株。
在細(xì)菌中表達(dá)，導(dǎo)致形成含有重組蛋白的包涵體。因此，需要對重組蛋白進(jìn)行重折疊，以便產(chǎn)生有活性或活性更高的材料。從細(xì)菌包涵體中正確獲取折疊的異源蛋白的一些方法是本領(lǐng)域已知的。這些方法通常包括從包涵體中溶出所述蛋白，然后用離液劑使蛋白完全變性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的一級氨基酸序列中存在半胱氨酸殘基時，它通常需要在允許正確形成二硫鍵的環(huán)境(氧化還原系統(tǒng))中完成重折疊。重折疊的通用方法公開于Kohno(1990)Meth.Enzym.，185187-195；E.P.0433225和美國專利第5,399,677號描述了其它合適的方法。
MU-1蛋白或其融合蛋白也可表達(dá)為轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)物，例如表達(dá)為轉(zhuǎn)基因母牛、山羊、豬或綿羊的乳汁成分，所述轉(zhuǎn)基因動物的特征是體細(xì)胞或生殖細(xì)胞中含有編碼MU-1蛋白或其融合蛋白的多核苷酸序列。
可通過在表達(dá)所需蛋白必需的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，制備MU-1蛋白或其融合蛋白。所得的表達(dá)蛋白然后可以從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中純化出來。MU-1蛋白或其融合蛋白的可溶形式可從條件培養(yǎng)基中純化出來。可通過從表達(dá)細(xì)胞中制備總膜成分并用非離子型去垢劑(例如TRITONX-100)提取膜，純化本發(fā)明的MU-1蛋白的膜結(jié)合形式。
可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，純化MU-1蛋白或融合蛋白。例如，本發(fā)明的MU-1蛋白可用市售的蛋白濃縮濾器(例如AMICON或PELLICON超濾單元，Millipore，Billerica，MA)進(jìn)行濃縮。濃縮步驟之后，濃縮液可加到純化基質(zhì)例如凝膠過濾介質(zhì)上?；蛘撸墒褂藐庪x子交換樹脂，例如，具有二乙氨基乙基(DEAE)或聚亞乙基亞胺(polyetheyleneimine，PEI)側(cè)基的基質(zhì)或襯底。這些基質(zhì)可以是丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或通常用于蛋白質(zhì)純化的其它種類?；蛘撸梢圆捎藐栯x子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括含磺基丙基或羧基甲基的各種不溶性基質(zhì)。優(yōu)選磺基丙基(例如S-SEPHAROSE柱)。從培養(yǎng)上清液中純化MU-1蛋白或融合蛋白，也可以包括一個或多個過柱步驟，例如伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖、肝素-TOYOPEARL或Cibacron blue 3GA SEPHAROSE等親和樹脂；或通過疏水作用層析，用苯基醚、丁基醚或丙基醚等樹脂；或通過免疫親和層析。最后，可以使用一個或多個反相高效液相層析(RP-HPLC)步驟，用疏水RP-HPLC介質(zhì)，例如具有甲基或其它脂族側(cè)基的硅膠，進(jìn)一步純化MU-1蛋白。包含抗MU-1蛋白抗體的親和柱也可用于按照已知方法進(jìn)行純化。上述純化步驟的部分步驟或全部步驟，以不同組合或與其它已知方法組合，也可用于提供基本上純化的分離的重組蛋白。優(yōu)選分離的MU-1蛋白是純化的，使它基本上不含其它哺乳動物蛋白。
本發(fā)明的MU-1蛋白或融合蛋白也可用于篩選能與MU-1結(jié)合的藥物。用所需結(jié)合蛋白(無論是否固定化)的結(jié)合測定是本領(lǐng)域眾所周知的，可用于使用本發(fā)明MU-1蛋白的該目的。基于純化細(xì)胞或基于蛋白(無細(xì)胞)的篩選試驗可用于鑒定所述藥物。例如，MU-1蛋白可以純化形式固定到載體上，可以測定純化MU-1蛋白的結(jié)合配體或潛在配體。
藥物組合物 IL-21/IL-21R-拮抗劑當(dāng)與藥物可接受的載體混合后，可用作藥物組合物。除了IL-21/IL-21R-拮抗劑和載體之外，所述組合物還可含有各種稀釋劑、填充劑、鹽類、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和本領(lǐng)域眾所周知的其它材料。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指無毒材料，其不干擾活性成分的生物學(xué)活性的功效。載體的特性取決于給藥途徑。
本發(fā)明的藥物組合物可以呈脂質(zhì)體形式，其中IL-21/IL-21R-拮抗劑除了與其它藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用外，還與兩親性物質(zhì)(例如以聚集形式存在成為膠束、不溶性單層的脂質(zhì)、液晶或在水溶液中呈片層形式)聯(lián)用。用于脂質(zhì)體制劑的合適脂質(zhì)包括但不限于甘油單酯、甘油二酯、硫腦苷酯、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、膽汁酸等。這類脂質(zhì)體制劑的制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員水平范圍內(nèi)，并在以下文獻(xiàn)中公開例如美國專利第4,235,871、4,501,728、4,837,028和4,737,323號，所有這些文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到本文中。
本文所用的術(shù)語“治療有效量”是指足以給患者帶來有用的益處的藥物組合物或方法的各活性成分的總有效量，所述益處例如改善癥狀、治愈所述疾病或提高其治愈率。當(dāng)用于單一活性成分單獨(dú)給予時，該術(shù)語是指產(chǎn)生療效的單一組分的用量。當(dāng)用于聯(lián)用時，該術(shù)語是指產(chǎn)生療效的活性成分的總量，無論是聯(lián)合、序貫還是同時給予。
在本發(fā)明的治療方法或用途的實踐中，將治療有效量的IL-21/IL-21R-拮抗劑給予患者，例如哺乳動物(例如人)。IL-21/IL-21R-拮抗劑可以按照本發(fā)明的方法單用或與以下詳述的其它療法聯(lián)合給予。當(dāng)與一種或多種藥物聯(lián)合給予時，IL-21-和/或IL-21R-拮抗劑可以與第二藥物同時或序貫給予。如果是序貫給藥的話，主治醫(yī)師將會決定給予IL-21/IL-21R-拮抗劑以及其它藥物的合適順序。
可以按各種常規(guī)途徑，給予用于藥物組合物或?qū)嵤┍景l(fā)明的方法所用的IL-21/IL-21R-拮抗劑，所述途徑例如口服攝入、吸入或皮膚、皮下或靜脈內(nèi)注射。優(yōu)選靜脈內(nèi)給予患者。
當(dāng)治療有效量的IL-21/IL-21R-激動劑或拮抗劑是經(jīng)口服給藥時，所述結(jié)合劑將呈片劑、膠囊劑、粉劑、溶液劑或酏劑的形式。當(dāng)以片劑給藥時，本發(fā)明的藥物組合物還可含有固體載體，例如明膠或輔料。片劑、膠囊劑和粉劑含有約5-95％的結(jié)合劑，優(yōu)選含有約25-90％的結(jié)合劑。當(dāng)以液體形式給藥時，可加入液體載體，例如水、石油、動物油或植物油，例如花生油、礦物油、大豆油或芝麻油，或合成油。藥物組合物的液體形式還可含有生理鹽水、葡萄糖或其它糖溶液，或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。當(dāng)以液體形式給藥時，藥物組合物含有約0.5-90％(重量)的結(jié)合劑，優(yōu)選約1-50％的結(jié)合劑。
當(dāng)治療有效量的IL-21/IL-21R-拮抗劑是經(jīng)靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射給予時，所述結(jié)合劑將呈無熱源、胃腸外可接受的水溶液形式。具有適當(dāng)?shù)膒H、等滲性、穩(wěn)定性等的所述胃腸外可接受的蛋白溶液劑的制備在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。除了結(jié)合劑外，供靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射用的優(yōu)選藥物組合物還應(yīng)含有等滲溶媒，例如氯化鈉注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、乳酸林格注射液或本領(lǐng)域已知的其它溶媒。本發(fā)明的藥物組合物也可含有穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖劑、抗氧化劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它添加劑。
本發(fā)明藥物組合物中IL-21/IL-21R-拮抗劑的用量將取決于所治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，以及該患者以前曾接受過的治療的性質(zhì)。最終，主治醫(yī)師將會決定用于治療每個患者的結(jié)合劑的用量。開始，主治醫(yī)師將給予低劑量的結(jié)合劑，并觀察患者的反應(yīng)?？山o予更大劑量的結(jié)合劑，直到所述患者達(dá)到最佳治療效果，而且在該點(diǎn)通常不再繼續(xù)增加劑量。用于本發(fā)明方法的實踐的不同藥物組合物應(yīng)含有約0.1μg至約100mg IL-21/IL-21R-拮抗劑/千克體重。
用本發(fā)明藥物組合物進(jìn)行靜脈內(nèi)治療的持續(xù)時間將會不同，取決于所治療疾病的嚴(yán)重程度和每個患者的情況和潛在的特異反應(yīng)。每次應(yīng)用IL-21/IL-21R-拮抗劑的持續(xù)時間范圍將在12-24小時連續(xù)靜脈內(nèi)給藥。最后，主治醫(yī)師將會決定本發(fā)明藥物組合物的靜脈內(nèi)治療的合適持續(xù)時間。
本發(fā)明的多核苷酸和蛋白質(zhì)表現(xiàn)出本文所鑒定的一種或多種用途或生物活性(包括與本文引用的試驗相關(guān)的那些用途或生物活性)。通過給予或使用所述蛋白質(zhì)或者給予或使用編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸(例如在基因療法或適于導(dǎo)入DNA的載體中)，可提供本發(fā)明蛋白質(zhì)的用途或活性。
使用IL-21/IL-21R拮抗劑以降低免疫細(xì)胞活性 在又一方面，本發(fā)明的特征在于抑制免疫細(xì)胞活性的方法，所述免疫細(xì)胞例如成熟T細(xì)胞(成熟CD8+T細(xì)胞、成熟CD4+T細(xì)胞)、成熟NK細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和巨核細(xì)胞或其群體，所述方法包括使T細(xì)胞群體接觸足夠量的IL-21/IL-21R拮抗劑，以抑制免疫細(xì)胞或群體的活性。也可將IL-21和/或IL-21R的拮抗劑(例如本文所述的融合蛋白或中和抗體)給予希望能抑制免疫應(yīng)答的患者。這些病癥或疾病包括例如自身免疫性疾病(例如關(guān)節(jié)炎、RA、IBD)、SLE、哮喘、腎小球腎炎、銀屑病或移植物/器官移植(及其相關(guān)排斥)。
申請人:已經(jīng)知道，通過使用中和融合蛋白(例如包含與Fc免疫球蛋白區(qū)融合的IL-21R胞外域的融合蛋白)降低IL-21R活性，在一些動物模型中改善了炎性癥狀，所述模型例如膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型(實施例7)，以及節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎和IBD的動物模型(實施例9和11)，移植排斥(實施例10)、銀屑病(實施例11)和狼瘡的動物模型(實施例13)。在CIA小鼠腳爪中，IL-21R mRNA的表達(dá)被上調(diào)(實施例8)。在抗原誘發(fā)的氣道炎癥中，IL-21R缺陷型小鼠表現(xiàn)出癥狀較輕(實施例12)。因此，拮抗IL-21/IL-21R活性的IL-21R結(jié)合劑可用于在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫抑制，例如用于治療或預(yù)防免疫細(xì)胞相關(guān)的病理，包括自身免疫性疾病(例如關(guān)節(jié)炎、RA、IBD)、SLE、腎小球腎炎、哮喘、銀屑病或移植物/器官移植。
也將IL-21R DNA作圖到節(jié)段性回腸炎的染色體基因座上，因此對于使用IL-21/IL-21R拮抗劑來治療節(jié)段性回腸炎和其它炎性腸病來說，提供了額外的支持。
所述方法也可用于調(diào)節(jié)(例如抑制)免疫細(xì)胞活性(例如增殖、分化、存活)，因此可用于治療或預(yù)防各種免疫性疾病。可治療或預(yù)防的疾病的非限制性實例包括但不限于移植物排斥、自身免疫性疾病(包括例如糖尿病、關(guān)節(jié)炎(包括RA、青少年RA、骨關(guān)節(jié)炎(OA)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎)、多發(fā)性硬化、腦脊髓炎、重癥肌無力、SLE、腎小球腎炎、自身免疫性甲狀腺炎、皮炎(包括特應(yīng)性皮炎和濕疹性皮炎)、銀屑病及相關(guān)皮膚病(例如UV損傷相關(guān)病癥，例如光衰老、特應(yīng)性皮炎、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤例如蕈樣肉芽腫病、過敏性和刺激性接觸性皮炎、扁平苔蘚、斑禿、白癜風(fēng)、眼部疤痕性類天皰瘡和蕁麻疹)、斯耶格倫綜合征(Sjgren′s syndrome)、節(jié)段性回腸炎、口瘡性潰瘍、虹膜炎、潰瘍性結(jié)腸炎、椎關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、內(nèi)源性哮喘、變應(yīng)性哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、間質(zhì)性肺纖維化、皮膚性紅斑狼瘡、硬皮病、藥疹、自身免疫性葡萄膜炎、變應(yīng)性腦脊髓炎、韋格納肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)、肝炎、史蒂文斯-約翰遜綜合征(Stevens-Johnson syndrome)、特發(fā)性口炎性腹瀉、格雷夫斯病(Graves′disease)、結(jié)節(jié)病、肝纖維化、原發(fā)性膽汁性肝硬化、后葡萄膜炎(uveitis posterior)、移植物抗宿主病和變態(tài)反應(yīng)，例如特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)。可用IL-21/IL-21R拮抗劑進(jìn)行治療的疾病優(yōu)選包括關(guān)節(jié)炎(例如RA、青少年RA、OA、銀屑病性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎(優(yōu)選類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎))、多發(fā)性硬化、I型糖尿病、狼瘡(SLE)、IBD(節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎)、哮喘、脈管炎、變態(tài)反應(yīng)、硬皮病、腎小球腎炎和銀屑病。
在另一個實施方案中，IL-21/IL-21R拮抗劑單用或與本文所述的其它治療藥(例如TNF拮抗劑)聯(lián)用，可用于治療多發(fā)性骨髓瘤和相關(guān)的B淋巴細(xì)胞性惡性腫瘤(Brenne等(2002)Blood 99(10)3756-3762)。
使用IL-21/IL-21R拮抗劑可以多種方式調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。下調(diào)可以是抑制或阻斷已經(jīng)開始進(jìn)行的免疫應(yīng)答的方式，或者可參與預(yù)防對免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)?？梢酝ㄟ^抑制T細(xì)胞應(yīng)答或通過誘T細(xì)胞特異性耐受性或這兩者，來抑制活化T細(xì)胞的功能。T細(xì)胞應(yīng)答的免疫抑制通常是活性的、非抗原特異性的過程，該過程需要使T細(xì)胞持續(xù)暴露給抑制劑。耐受性(即誘導(dǎo)T細(xì)胞無應(yīng)答或無反應(yīng)性)與免疫抑制的不同之處在于耐受性通常是抗原特異性的，并且在停止暴露給耐受劑后仍然能持久存在。從操作上看，在耐受劑不存在時再次暴露給特異性抗原后，仍缺乏T細(xì)胞應(yīng)答，由此可證明耐受性。
下調(diào)或阻止免疫功能，例如用IL-21/IL-21R拮抗劑，將用于組織、皮膚和器官移植和移植物抗宿主病(GVHD)的情況下。例如，抑制T細(xì)胞功能，在組織移植中會減少組織破壞。通常在組織移植中，移植物排斥是因T細(xì)胞將移植物識別成外源物而開始的，接著就是破壞移植物的免疫反應(yīng)。給予IL-21/TL-21R拮抗劑，無論是在移植之前、期間或之后單獨(dú)使用還是與抑制或阻斷其他免疫效應(yīng)物相互作用的分子聯(lián)用，都可用于降低免疫應(yīng)答。
可用動物模型評價IL-21/IL-21R拮抗劑在預(yù)防器官移植排斥或GVHD中的功效，這樣的動物模型能用于預(yù)測在人體內(nèi)的功效和劑量?？墒褂玫暮线m系統(tǒng)的實例包括大鼠的同種異體心臟移植和小鼠的異種胰島細(xì)胞移植，這兩者都用于在體內(nèi)檢測CTLA4 Ig融合蛋白的免疫抑制效應(yīng)，參見Lenschow等(1992)Science 257789-92和Turka等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，8911102-05。也可在血管化心臟同種異體移植物和全厚度皮膚同種異體移植物的其它動物模型例如在鼠模型中評價IL-21/IL-21R拮抗劑。這些模型可測定組織排斥(所述組織具有完全MHC錯配)并且可將IL-21阻斷與供體特異性淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)輸結(jié)合起來。另外，GVHD的鼠模型(參見例如Paul(編著)，F(xiàn)undamental Immunology，Raven Press，New York(1989)第846-47頁)可用于確定IL-21/IL-21R拮抗劑在體內(nèi)對GVHD或SLE發(fā)展的影響。也可評價IL-21/IL-21R拮抗劑與其它治療藥聯(lián)用于預(yù)防器官移植排斥或GVHD中的功效，所述治療藥例如免疫抑制劑，例如雷帕霉素、環(huán)孢菌素或CTLA4Ig。
IL-21/IL-21R拮抗劑也可治療性用于治療自身免疫性疾病。許多自身免疫性疾病的起因是T細(xì)胞異?；罨瘡亩c自身組織反應(yīng)并促進(jìn)產(chǎn)生參與疾病病理的細(xì)胞因子和自身抗體。防止自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化，可減少或消除疾病癥狀。給予IL-21/IL-21R拮抗劑，單獨(dú)或與其它藥物(例如本文所述的藥物)聯(lián)用，可用于抑制T細(xì)胞活化并預(yù)防產(chǎn)生自身抗體或T細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子，這些抗體或細(xì)胞因子可參與疾病進(jìn)程。此外，IL-21/IL-21R拮抗劑單用或與其它藥物(例如本文所述的藥物)聯(lián)用，增加了自身反應(yīng)性T細(xì)胞的抗原特異性耐受性并能長期緩解疾病?？梢允褂酶鞣N明確表征的人自身免疫性疾病的動物模型，來測定這些藥物在預(yù)防或緩解自身免疫性疾病中的功效。實例包括MRL/lpr/lpr小鼠或NZB雜交小鼠的鼠實驗性自身免疫性腦炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，NOD小鼠和BB大鼠的鼠自身免疫性膠原性關(guān)節(jié)炎、糖尿病，以及鼠實驗性重癥肌無力(參見例如Paul(編著)，F(xiàn)undamental Immunology，Raven Press，New York(1989)第840-56頁)。
在一個實施方案中，IL-21/IL-21R拮抗劑，例如其藥物組合物，在聯(lián)合療法中給予，即與其它藥物例如治療藥聯(lián)用，所述藥物用于治療病理性病癥或疾病，例如免疫性疾病和炎性疾病。術(shù)語“聯(lián)用”在本文中是指基本上同時(一起或序貫)給藥。如果是序貫給藥，在給予第二種化合物的同時，優(yōu)選兩種化合物中的第一種在治療部位或患者體內(nèi)仍具有可檢測的有效濃度。
例如，聯(lián)合療法可以包括一種或多種IL-21/IL-21R拮抗劑(例如針對IL-21或IL-21受體的抗體或其抗原結(jié)合片段(例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或體外產(chǎn)生的抗體或其抗原結(jié)合片段)、IL-21融合蛋白、可溶性IL-21受體、肽抑制劑或小分子抑制劑)，與一種或多種其它治療藥一起配制和/或一起給藥，所述其它治療藥例如在本文中更詳細(xì)描述的一種或多種細(xì)胞因子抑制劑和生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗炎藥、代謝抑制劑、酶抑制劑和/或細(xì)胞毒劑或細(xì)胞抑制劑。此外，本文所述的一種或多種IL-21/IL-21R拮抗劑可用于與本文所述的兩種以上治療藥聯(lián)用。所述聯(lián)合療法可有利地用于給予低劑量治療藥，從而避免可能的毒性或各單一療法相關(guān)的并發(fā)癥。此外，本文所公開的治療藥作用途徑與IL-21/IL-21R受體途徑不同，因而有望增強(qiáng)IL-21/IL-21R拮抗劑的作用和/或與IL-21/IL-21R拮抗劑產(chǎn)生協(xié)同作用。
與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)用的優(yōu)選的治療藥是那些干擾自身免疫和隨后炎癥反應(yīng)不同時相的藥物。在一個實施方案中，本文所述的一種或多種IL-21/IL-21R拮抗劑可與一種或多種其它治療藥一起配制和/或一起給藥；所述治療藥例如其它細(xì)胞因子拮抗劑或生長因子拮抗劑(例如可溶性受體、肽抑制劑、小分子、配體融合物)；或與其它靶標(biāo)結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段(例如與其它細(xì)胞因子或生長因子、其受體或其它細(xì)胞表面分子結(jié)合的抗體)；和抗炎細(xì)胞因子或其激動劑?？膳c本文所述IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)用的藥物的非限制性實例包括但不限于一種或多種白介素(IL)或其受體的拮抗劑，例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18和IL-22的拮抗劑；細(xì)胞因子或生長因子或其受體的拮抗劑，例如腫瘤壞死因子(TNF)、LT、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的拮抗劑。IL-21/IL-21R拮抗劑也可與針對以下細(xì)胞表面分子的抗體等的抑制劑聯(lián)用CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或它們的配體，包括CD154(gp39或CD40L)或LFA-1/ICAM-1和VLA-4/VCAM-1(Yusuf-Makagiansar等(2002)Med.Res.Rev.22(2)146-67)。可與本文所述的IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)用的優(yōu)選拮抗劑包括IL-1、IL-6、IL-12、TNFα、IL-15、IL-17、IL-18和IL-22的拮抗劑。
這些藥物的實例包括IL-12拮抗劑，例如與IL-12(優(yōu)選人IL-12)結(jié)合的嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或體外產(chǎn)生的抗體(或其抗原結(jié)合片段)，所述抗體例如在WO 00/56772，GeneticsInstitute/BASF中公開的抗體；IL-12受體抑制劑，例如抗人IL-12受體的抗體；和IL-12受體(例如人IL-12受體)的可溶性片段。IL-6拮抗劑的實例包括針對IL-6或其受體的抗體(或其抗原結(jié)合片段)，例如針對人IL-6或其受體的嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或體外產(chǎn)生的抗體，IL-6受體的可溶性片段和IL-6結(jié)合蛋白。IL-15拮抗劑的實例包括這樣的抗體針對IL-15或其受體的抗體(或其抗原結(jié)合片段)，例如針對人IL-15或其受體的嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或體外產(chǎn)生的抗體，IL-15受體的可溶性片段和IL-15結(jié)合蛋白。IL-18拮抗劑的實例包括這樣的抗體例如針對人IL-18的嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或體外產(chǎn)生的抗體(或其抗原結(jié)合片段)，IL-18受體的可溶性片段和IL-18結(jié)合蛋白(IL-18BP，Mallat等(2001)Circ.Res.89e41-45)。IL-1拮抗劑的實例包括白介素-1轉(zhuǎn)化酶(ICE)抑制劑例如Vx740、IL-1拮抗劑例如IL-1RA(ANIKINRATM，Amgen)、sIL1RII(Immunex)和抗IL-1受體抗體(或其抗原結(jié)合片段)。
TNF拮抗劑的實例包括針對TNF(例如人TNFα)的嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或體外產(chǎn)生的抗體(或其抗原結(jié)合片段)，例如D2E7(人TNFα抗體，U.S.6,258,562；BASF)、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗體；Celltech/Pharmacia)、cA2(嵌合抗TNFα抗體；REMICADETM，Centocor)；抗TNF抗體片段(例如CPD870)；TNF受體的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白，ENBRELTM；Immunex；參見例如Arthritis & Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med.(1996)第44卷，235A)，p55kdTNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白(Lenercept))；酶拮抗劑，例如TNFα轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑(例如α-磺?；惲u肟酸衍生物，WO 01/55112，和N-羥基甲酰胺TACE抑制劑GW 3333、-005或-022)；和TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF結(jié)合蛋白；參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S284；Amer.J.Physiol.-Heart and CirculatoryPhysiology(1995)第268卷，第37-42頁)。優(yōu)選的TNF拮抗劑是TNF受體的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG和TNFα轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑。
在其它實施方案中，本文所述的IL-21-/IL-21R拮抗劑可與一種或多種以下藥物聯(lián)用IL-13拮抗劑，例如可溶性IL-13受體(sIL-13)和/或抗IL-13抗體；IL-2拮抗劑，例如DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白；Seragen；參見例如Arthritis &Rheumatism(1993)第36卷，1223)，和/或抗IL-2R抗體，例如抗Tac(人源化抗IL-2R；Protein Design Labs，Cancer Res.1990年3月1日；50(5)1495-502)。另一種聯(lián)合療法包括IL-21拮抗劑與非消耗性抗CD4抑制劑(IDEC-CE9.1/SB 210396(非消耗性致敏性(primatized)抗CD4抗體；IDEC/SmithKline)的聯(lián)用。再一些優(yōu)選的聯(lián)合藥物包含共刺激途徑拮抗劑CD80(B7.1)或CD86(B7.2)，所述拮抗劑包括抗體、可溶性受體或拮抗性配體；以及p-選擇蛋白糖蛋白配體(PSGL)、抗炎細(xì)胞因子，例如IL-4(DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000；重組IL-10DNAX/Schering)；IL-13和TGF，及其激動劑(例如激動劑抗體)。
在其它實施方案中，一種或多種IL-21/IL-21R拮抗劑可以與一種或多種抗炎藥、免疫抑制劑或代謝抑制劑或酶抑制劑一起配制和/或一起給予?？膳c本文所述的IL-21拮抗劑聯(lián)合使用的藥物或抑制劑的非限制性實例包括但不限于一種或多種以下藥物非甾體抗炎藥(NSAID)，例如布洛芬、替尼達(dá)普(參見例如Arthritis &Rheumatism(1996)，第39卷，第9期(增刊)，S280))、奈普生(參見例如Neuro Report(1996)第7卷，第1209-1213頁)、美洛昔康、吡羅昔康、雙氯芬酸和吲哚美辛；柳氮磺吡啶(參見例如Arthritis &Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S281)；皮質(zhì)類固醇，例如潑尼松龍；細(xì)胞因子抑制性抗炎藥(CSAID)；核苷酸生物合成抑制劑，例如嘌呤生物合成抑制劑、葉酸拮抗劑(例如甲氨蝶呤(N-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基]苯甲?；鵠-L-谷氨酸)；和嘧啶生物合成抑制劑，例如二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)抑制劑(例如來氟米特(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S131；Inflammation Research(1996)第45卷，第103-107頁)。用于與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)用的優(yōu)選治療藥包括NSAID、CSAID、(DHODH)抑制劑(例如來氟米特)和葉酸拮抗劑(例如甲氨蝶呤)。
其它抑制劑的實例包括一種或多種以下藥物皮質(zhì)類固醇(口服、吸入和局部注射)；免疫抑制藥，例如環(huán)孢菌素、他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制劑，例如西羅莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如可溶性雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物，例如CCI-779(Elit.(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(8)1249-53；Huang等(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(2)295-304)；干擾促炎細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥物，所述促炎細(xì)胞因子例如TNFα或IL-1(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)；COX2抑制劑，例如塞來考昔及其變體，MK-966，參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S81)；磷酸二酯酶抑制劑，例如R973401(磷酸二酯酶IV型抑制劑；參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S282))；磷脂酶抑制劑，例如胞質(zhì)磷脂酶2(cPLA2)抑制劑(例如三氟甲酮類似物(U.S.6,350,892))；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子或生長因子受體的抑制劑，例如VEGF抑制劑和/或VEGF-R抑制劑；和血管生成抑制劑。與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)用的優(yōu)選的治療藥包括免疫抑制藥，例如環(huán)孢菌素、他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制劑，例如西羅莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如可溶性雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物，例如CCI-779；COX2抑制劑，例如塞來考昔及其變體；和磷脂酶抑制劑，例如胞質(zhì)磷脂酶2(cPLA2)抑制劑(例如三氟甲酮類似物)。
可與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)合使用的其它治療藥的實例包括一種或多種以下藥物6-巰基嘌呤(6-MP)；硫唑嘌呤柳氮磺吡啶(sulphasalazine)；美沙拉秦；奧沙拉秦氯喹/羥氯喹；青霉胺；金硫丁鹽(aurothiornalate)(肌內(nèi)和口服)；硫唑嘌呤；秋水仙堿(colchicine)；β-2腎上腺素受體激動劑(沙丁胺醇、特布他林、沙美特羅(salmeteral))；黃嘌呤(茶堿、氨茶堿)；色甘酸鹽；奈多羅米；酮替芬；異丙阿托銨和氧托銨；麥考酚酸嗎乙酯；腺苷激動劑；抗血栓藥；補(bǔ)體抑制劑；和腎上腺素能藥。
下面進(jìn)一步詳細(xì)討論本文所公開的IL-21/IL-21R拮抗劑與其它治療藥聯(lián)合用于治療或預(yù)防具體免疫性疾病。
可以與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)用以治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎(例如RA、炎性關(guān)節(jié)炎、青少年RA、OA和銀屑病性關(guān)節(jié)炎)的藥物的非限制性實例，包括一種或多種以下藥物本文所述的IL-12拮抗劑，NSAID；CSAID；TNF拮抗劑例如本文所述的TNFα拮抗劑；本文所述的非消耗性抗CD4抗體；本文所述的IL-2拮抗劑；抗炎細(xì)胞因子，例如IL-4、IL-10、IL-13和TGFα，或其激動劑；本文所述的IL-1拮抗劑或IL-1受體拮抗劑)；本文所述的磷酸二酯酶抑制劑；本文所述的COX-2抑制劑；伊洛前列素(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S82)；甲氨蝶呤；沙利度胺(參見例如Arthritis& Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S282)和沙利度胺相關(guān)藥物(例如Celgen)；來氟米特；血纖蛋白溶酶原激活抑制劑，例如氨甲環(huán)酸(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S284)；細(xì)胞因子抑制劑，例如T-614；參見例如Arthritis &Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S282)；前列腺素E1(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S282)；硫唑嘌呤(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S281)；白介素-1轉(zhuǎn)化酶(ICE)抑制劑；zap-70和/或lck抑制劑(酪氨酸激酶zap-70或lck抑制劑)；本文所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子抑制劑或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體抑制劑；本文所述的血管生成抑制劑；皮質(zhì)類固醇抗炎藥(例如SB203580)；TNF轉(zhuǎn)化酶抑制劑；白介素-11(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S296)；白介素-13(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S308)；白介素-17抑制劑(參見例如Arthritis &Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S120)；金；青霉胺；氯喹；羥氯喹；苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺；環(huán)孢菌素；總淋巴輻射；抗胸腺細(xì)胞球蛋白；CD5-毒素；口服肽和膠原；氯苯扎利二鈉；細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑(CRA)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals，Inc.)；ICAM-1反義硫代磷酸寡聚脫氧核苷酸(ISIS 2302；IsisPharmaceuticals，Inc.)；可溶性補(bǔ)體受體1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；潑尼松；奧古蛋白；聚硫酸糖胺聚糖；二甲胺四環(huán)素；抗IL2R抗體；海洋魚油和植物脂質(zhì)(魚和植物種子脂肪酸；參見例如DeLuca等(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21759-777)；金諾芬；保泰松；甲氯芬那酸；氟芬那酸；靜脈內(nèi)免疫球蛋白；齊留通；麥考酚酸(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西羅莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(therafectin)；克拉曲濱(2-氯脫氧腺苷)；和阿扎立平。優(yōu)選的聯(lián)合藥物包括一種或多種IL-21拮抗劑與甲氨蝶呤或來氟米特的組合，以及在中度或重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的情況下與環(huán)孢菌素聯(lián)用。
與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)合用于治療關(guān)節(jié)炎的優(yōu)選抑制劑的實例，包括TNF拮抗劑(例如與TNF結(jié)合的嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或體外產(chǎn)生的抗體或其抗原結(jié)合片段；TNF受體的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白、ENBRELTM)、p55kDTNF受體-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗劑，例如TNFα轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑)；IL-6、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22的拮抗劑；T細(xì)胞和B細(xì)胞消耗劑(depleting agent)(例如抗CD4抗體或抗CD22抗體)；小分子抑制劑，例如甲氨蝶呤和來氟米特；西羅莫司(雷帕霉素)及其類似物，例如CCI-779；Cox-2和cPLA2抑制劑；NSAID；p38抑制劑、TPL-2抑制劑、Mk-2抑制劑和NFκb抑制劑；RAGE或可溶性RAGE；P-選擇蛋白或PSGL-1抑制劑(例如小分子抑制劑，其抗體，例如抗P-選擇蛋白的抗體)；雌激素受體β(ERB)激動劑或ERB-NFkb拮抗劑?？梢耘c一種或多種IL-21/IL-21R拮抗劑一起配制和/或一起給予的最優(yōu)選的其它治療藥，包括一種或多種以下藥物TNF受體的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白，ENBRELTM)；甲氨蝶呤、來氟米特或西羅莫司(雷帕霉素)或其類似物，例如CCI-779。
可以與IL-21-/IL-21R拮抗劑聯(lián)用以治療或預(yù)防多發(fā)性硬化的藥物的非限制性實例包括以下藥物干擾素，例如干擾素-α1a(例如AVONEXTM；Biogen)和干擾素-1b(BETASERONTM；Chiron/Berlex)；共聚物1(Cop-1；COPAXONETM；Teva PharmaceuticalIndustries，Inc.)；高壓氧；靜脈內(nèi)免疫球蛋白；克拉曲濱(clabribine)；本文所述的TNF拮抗劑；皮質(zhì)類固醇；潑尼松龍；甲潑尼龍；硫唑嘌呤；環(huán)磷酰胺；環(huán)孢菌素；甲氨蝶呤；4-氨基吡啶；和替扎尼定?？膳cIL-21聯(lián)合使用的其它拮抗劑包括其它人細(xì)胞因子或生長因子的抗體或其它人細(xì)胞因子或生長因子的拮抗劑，所述細(xì)胞因子或生長因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-11、GM-CSF、FGF和PDGF。本文所述的IL-21拮抗劑可以與抗體聯(lián)用，所述抗體是針對以下細(xì)胞表面分子的例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配體。IL-21拮抗劑也可以與以下藥物聯(lián)用例如如上所述的甲氨蝶呤、環(huán)孢菌素、FK506、雷帕霉素、麥考酚酸嗎乙酯、來氟米特、NSAID，例如布洛芬、皮質(zhì)類固醇例如潑尼松龍、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷激動劑、抗血栓藥、補(bǔ)體抑制劑、腎上腺素能藥、干擾本文所述的促炎細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥物、IL-1b轉(zhuǎn)化酶抑制劑(例如Vx740)、抗P7s、PSGL、TACE抑制劑、T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑例如激酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤(azathloprine)、6-巰基嘌呤、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、可溶性細(xì)胞因子受體及其衍生物和抗炎細(xì)胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13和TGF)。
可以與IL-21拮抗劑聯(lián)合用于多發(fā)性硬化的治療藥的優(yōu)選實例包括干擾素-β、例如IFNβ-1a和IFNβ-1b；克帕松(copaxone)、皮質(zhì)類固醇、IL-1抑制劑、TNF抑制劑、針對CD40配體和CD80的抗體、IL-12拮抗劑。
可以與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)合用于治療或預(yù)防炎性腸病(節(jié)段性回腸炎；潰瘍性結(jié)腸炎)的藥物的非限制性實例包括以下藥物布地奈德(budenoside)；表皮生長因子；皮質(zhì)類固醇；環(huán)孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水楊酸鹽；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制劑；美沙拉秦；奧沙拉秦；巴柳氮；抗氧化劑；血栓烷抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-1單克隆抗體；抗IL-6單克隆抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；本文所述的TNF拮抗劑；IL-4、IL-10、IL-13和/或TGFb細(xì)胞因子或其激動劑(例如激動劑抗體)；IL-11；葡糖苷酸或葡聚糖-綴合的潑尼松龍、地塞米松或布地奈德的前體藥物；ICAM-1反義硫代磷酸寡聚脫氧核苷酸(ISIS2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性補(bǔ)體受體1(TP10；T CellSciences，Inc.)；緩釋型美沙拉秦；甲氨蝶呤；血小板活化因子(PAF)拮抗劑；環(huán)丙沙星；和利多卡因。
在一個實施方案中，IL-21/IL-21R拮抗劑可以與一種或多種抗體聯(lián)用，所述抗體針對參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的其它靶標(biāo)，所述免疫應(yīng)答例如移植物排斥、移植物抗宿主病或其它免疫應(yīng)答相關(guān)疾病?？梢耘c本發(fā)明IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)合用于治療或預(yù)防免疫應(yīng)答的藥物的非限制性實例包括以下藥物針對細(xì)胞表面分子或其配體的抗體，包括但不限于CD25(IL-2受體-a)、CD11a(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD40、CD40L、CD45、CD28/CTLA4、CD80(B7-1)和/或CD86(B7-2)。在又一個實施方案中，IL-21/IL-21R拮抗劑可與以下藥物聯(lián)用皮質(zhì)類固醇；西羅莫司(雷帕霉素)和其類似物，例如CCI-779；環(huán)孢菌素A；FK506；FTY720；硫唑嘌呤；環(huán)磷酰胺；甲氨蝶呤；抗IL-2R抗體，例如巴利昔單抗、達(dá)昔單抗；cA2(嵌合抗TNFα抗體；REMICADETM，Centocor)；抗CD3抗體(例如莫羅單抗-CD3)；共聚物1(Cop-1；COPAXONETM；Teva Pharmaceutical Industries，Inc.)；脫氧精胍菌素；和麥考酚酸嗎乙酯。
可與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)合用于治療或預(yù)防銀屑病和其它皮膚病的藥物的非限制性實例包括一種或多種以下藥物CD2或LFA-3相互作用抑制劑(例如可溶性CD2-或LFA-多肽，例如Fc融合物，或針對CD2或LFA-3的抗體)、環(huán)孢菌素A、潑尼松、FK506、甲氨蝶呤、PUVA、UV線、甾體、類視色素、干擾素或氮芥?？膳cIL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)用的優(yōu)選藥物的實例包括環(huán)孢菌素A和甲氨蝶呤。
可與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)合用于治療或預(yù)防哮喘的藥物的非限制性實例包括一種或多種以下藥物吸入用支氣管擴(kuò)張藥，例如吡布特羅、比托特羅、奧西那林；β2-腎上腺素受體激動劑，例如沙丁胺醇、特布他林、沙美特羅、福莫特羅；抗毒蕈堿藥，例如異丙托銨、氧托銨；系統(tǒng)性皮質(zhì)類固醇，例如潑尼松、潑尼松龍、地塞米松；吸入用皮質(zhì)類固醇，例如氟替卡松、布地奈德、倍氯米松、莫米松；白三烯拮抗劑，例如孟魯司特鈉、扎魯司特；肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑，例如色甘酸二鈉、奈多羅米；omalizumab(XOLAIRTM；Genentech/Novartis)；或本文所述的COX-2抑制劑。
可與IL-21/IL-21R拮抗劑聯(lián)合用于治療或預(yù)防狼瘡(例如SLE)的藥物的非限制性實例包括一種或多種以下藥物IL-6/IL-6R拮抗劑，例如抗IL-6抗體或抗IL-6R抗體；NSAID；皮質(zhì)類固醇，例如地塞米松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松；硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、羥基氯喹或氯喹。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及藥盒，所述藥盒用于聯(lián)合給予IL-21/IL-21R拮抗劑和其它治療性化合物。在一個實施方案中，藥盒包含配制在藥物載體中的一種或多種結(jié)合劑和至少一種藥物例如治療藥，其配制為合適的一種或多種獨(dú)立的藥物制劑。
示例性的疾病 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬和功能減退的自身免疫性炎性疾病。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎通常對稱存在。該病累及腕關(guān)節(jié)和接近手的指關(guān)節(jié)。它也可累及關(guān)節(jié)之外的其它部位。另外，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人可有疲勞、偶爾發(fā)熱和全身不適。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷的陽性因子包括“類風(fēng)濕因子”血抗體和瓜氨酸抗體。IL-21/IL-21R拮抗劑可用于治療、預(yù)防或緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或一種或多種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是導(dǎo)致不同身體組織炎癥和損傷的自身免疫性疾病。SLE由針對自身DNA的自身抗體所介導(dǎo)。狼瘡可累及許多身體部位，包括關(guān)節(jié)、皮膚、腎臟、心臟、肺、血管和大腦。盡管可出現(xiàn)不同癥狀，但是最常見的癥狀包括極度疲勞、關(guān)節(jié)疼痛或腫脹(關(guān)節(jié)炎)、不明發(fā)熱、皮疹和腎臟問題(例如腎小球腎炎)。示例性的狼瘡癥狀包括關(guān)節(jié)疼痛或腫脹、不明發(fā)熱和極度疲勞。特征性的紅色皮疹可在鼻子和臉頰上出現(xiàn)。皮疹也可在臉和耳朵、上肢、肩膀、胸和手上出現(xiàn)。狼瘡的其它癥狀包括胸痛、脫發(fā)、貧血、口腔潰瘍、手指和腳趾因寒冷和應(yīng)激而蒼白或紫紅。某些人也會有頭痛、眩暈、抑郁、精神錯亂或癲癇。SLE診斷的陽性因子包括循環(huán)抗核抗體、抗DNA抗體和抗Sm抗體。IL-21/IL-21R拮抗劑可用于治療、改善(緩解)或預(yù)防SLE或一種或多種SLE癥狀。
關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎是自身免疫性疾病，它不僅累及脊椎、而且累及臀部、肩膀，而且膝(作為骨和關(guān)節(jié)周圍的肌腱和韌帶)也發(fā)炎，導(dǎo)致疼痛和僵硬。關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎傾向于累及大齡青少年和剛成年的人。IL-21/IL-21R拮抗劑可用于治療、預(yù)防或緩解關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎或其一種或多種癥狀。
炎性腸病(IBD)是引起腸道炎癥的疾病的統(tǒng)稱。炎性腸病的兩個實例是節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎。IL-21/IL-21R拮抗劑可用于治療、預(yù)防或緩解炎性腸病或一種或多種炎性腸病癥狀。
節(jié)段性回腸炎引起小腸炎癥。節(jié)段性回腸炎通常在小腸下段(回腸)發(fā)生，但是它也累及從口到肛門的消化道的任何部位。其炎癥可發(fā)展至深達(dá)受累器官內(nèi)襯，引起疼痛并使腸道頻繁排空，導(dǎo)致腹瀉。節(jié)段性回腸炎最常見癥狀是腹痛(通常在右下腹)和腹瀉。也可出現(xiàn)直腸出血、體重減輕和發(fā)熱。出血可以是嚴(yán)重而持續(xù)的，導(dǎo)致貧血。對腸道進(jìn)行直接目測，可確定炎癥范圍。
潰瘍性結(jié)腸炎為在大腸內(nèi)襯引起炎癥和潰瘍的疾病。該炎癥通常在直腸和結(jié)腸下段發(fā)生，但也可累及整個結(jié)腸。除了小腸末段(稱為回腸末端)以外，潰瘍性結(jié)腸炎較少累及小腸。炎癥使結(jié)腸頻繁排空，引起腹瀉。在炎癥殺傷結(jié)腸細(xì)胞內(nèi)襯的部位形成潰瘍；潰瘍會出血并產(chǎn)生膿液。潰瘍性結(jié)腸炎的最常見癥狀是腹痛和血性腹瀉?；颊咭矔衅?、體重減輕、食欲減退、直腸出血以及體液和營養(yǎng)損失。約半數(shù)患者具有輕度癥狀。其它則頻繁發(fā)熱、血性腹瀉、惡心和嚴(yán)重腹部痙攣。潰瘍性結(jié)腸炎也可引起關(guān)節(jié)炎、眼部炎癥、肝病(肝炎、肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎)、骨質(zhì)疏松癥、皮疹和貧血等問題。潰瘍性結(jié)腸炎的診斷通常取決于血性糞便的鑒別和結(jié)腸直接目測。
銀屑病為鱗屑剝落(scaling)和炎癥的慢性皮膚病。當(dāng)皮膚細(xì)胞從皮膚表面以下的來源處快速產(chǎn)生并在成熟之前就堆積在表面上，即可發(fā)生銀屑病。通常這樣的過程(也稱為更新)需要約一個月時間，但是在銀屑病中，僅需幾天就發(fā)生。典型形式的銀屑病導(dǎo)致銀色鱗屑覆蓋的增厚、發(fā)炎的皮膚斑塊。這些斑塊(有時也稱為噬斑)通常會瘙癢或感覺疼痛。它們通常發(fā)生在肘、膝、腿的其它部位、腰背部、臉、手掌和腳底，但是它們也可發(fā)生在身體任何部位的皮膚上。銀屑病的診斷主要根據(jù)是這些特征性癥狀。皮膚活檢可用于診斷。IL-21/IL-21R拮抗劑可用于治療、預(yù)防或緩解銀屑病或一種或多種銀屑病癥狀。銀屑病性關(guān)節(jié)炎發(fā)生于某些銀屑病(一種鱗屑脫落的皮膚病)患者。銀屑病性關(guān)節(jié)炎通常累及手指和腳趾遠(yuǎn)端的關(guān)節(jié)，并伴有指甲和趾甲的變化。如累及脊柱時則會發(fā)生背痛。IL-21/IL-21R拮抗劑可用于治療、預(yù)防或緩解銀屑病或一種或多種銀屑病或銀屑病性關(guān)節(jié)炎癥狀。
腎小球病包括增殖和非增殖性疾病。腎小球腎炎為具有腎小球內(nèi)炎癥和細(xì)胞增殖的疾病(參見例如Hricik等(1998)New Eng.J.Med.339888-99。非增殖性和硬化性腎小球病包括膜性腎小球病、糖尿病性腎病、局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥、薄基底膜病、淀粉樣變性、輕鏈腎病、HIV腎病、家族性出血性腎炎(Alport′s syndrome)、藥物誘發(fā)的腎小球病和微小病變(minimal-change disease)。伴隨腎小球病的炎癥的發(fā)生主要是因為自身免疫所致的抗體介導(dǎo)的腎小球損傷。體液免疫活化可導(dǎo)致產(chǎn)生針對腎小球細(xì)胞表面(例如基底膜)抗體，而且循環(huán)抗原-抗體復(fù)合物沉積在腎小球上，據(jù)報道能引起腎小球腎炎。因此，腎小球損傷和腎小球腎炎通常是由較大的系統(tǒng)性自身免疫性疾病(例如SLE、肝炎和纖維變性病)所致。腎小球腎炎也與以下疾病有關(guān)IgA腎病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、感染(由細(xì)菌、病毒、原生動物等引起)、脈管炎、冷球蛋白血癥、遺傳性腎炎、肉芽腫病(例如韋格納肉芽腫病、鏡下多血管炎(microscopicpolyan gitis)和丘-施綜合征(Churg-Strauss syndrome))、腎小球基底膜病、古德帕斯徹綜合征(Goodpasture′s syndrome)、腎炎綜合征(發(fā)生于例如糖尿病、狼瘡(例如SLE)、淀粉樣變性、藥物使用、癌癥和感染)、脂肪營養(yǎng)不良、鐮刀形細(xì)胞病、補(bǔ)體缺乏癥、膜增殖性腎小球腎炎、狼瘡性腎炎和狼瘡膜性腎病。IL-21/IL-21R拮抗劑可用于治療、改善或預(yù)防腎小球腎炎或一種或多種腎小球腎炎和其它腎小球病的癥狀。
IL-21/IL-21R拮抗劑可用于預(yù)防或治療組織/移植排斥或排斥相關(guān)癥狀，例如在器官、組織或細(xì)胞(例如心臟、肺、肝臟、腎臟、胰腺或骨髓)移植之前、期間或之后。當(dāng)宿主生物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對移植組織(例如同種同體、同種異體或異種異體組織)中的非自身抗原的免疫應(yīng)答時，會發(fā)生移植排斥。排斥可由例如抗體、淋巴細(xì)胞介導(dǎo)或同時由這兩種介導(dǎo)，排斥可表現(xiàn)為不同方式，包括例如超急性排斥(例如在移植后的早期)、急性排斥和慢性排斥(通常是緩慢發(fā)展的過程，使移植物功能逐漸減退)。排斥通常伴隨炎癥，并可導(dǎo)致移植組織或器官損傷和/或失敗，例如血管病、纖維化或器官功能減退。在排斥期間，宿主會有全身不適、移植部位疼痛或腫脹和/或發(fā)熱。可以通過活體檢查排斥體征或者通過評價器官功能，來監(jiān)控器官和組織移植物的排斥現(xiàn)象。排斥的組織病理學(xué)體征包括例如II類HLA抗原表達(dá)增加，例如在腎移植后在腎小管細(xì)胞中?？梢酝ㄟ^例如測定膽紅素和肝酶(例如堿性磷酸酶)血清水平來評價肝功能；可以通過例如測定血清肌酸水平來評價腎功能。
骨關(guān)節(jié)炎(OA)的特征是關(guān)節(jié)軟骨破壞。這使骨在軟骨下彼此摩擦，引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和運(yùn)動減退。隨時間延長，關(guān)節(jié)可失去正常形狀，在關(guān)節(jié)邊緣長出骨刺或骨贅。另外，少數(shù)骨或軟骨會破碎并漂浮在關(guān)節(jié)間隙中，引起更多疼痛和損傷。OA病人通常都有關(guān)節(jié)痛和運(yùn)動受限。與其它類型的關(guān)節(jié)炎不同，OA僅累及關(guān)節(jié)，并不累及內(nèi)臟。OA診斷的陽性因子包括經(jīng)X光可見的軟骨丟失。IL-21/IL-21R拮抗劑可用于治療、預(yù)防或緩解OA或一種或多種OA的癥狀。
呼吸性疾病 IL-21/IL-21R拮抗劑可用于治療呼吸性疾病，包括但不限于哮喘(例如變應(yīng)性和非變應(yīng)性哮喘)；支氣管炎(例如慢性支氣管炎)；慢性阻塞性肺病(COPD)(例如肺氣腫，例如香煙誘發(fā)的肺氣腫)；涉及氣道炎癥的病癥、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、纖維化和產(chǎn)生過多粘液，例如囊性纖維化、肺纖維化和變應(yīng)性鼻炎。
治療或預(yù)防哮喘的方法包括治療或預(yù)防外源性哮喘(也稱為變應(yīng)性哮喘或特應(yīng)性哮喘)、內(nèi)源性哮喘(也稱為非變應(yīng)性哮喘或非特應(yīng)性哮喘)或這兩者的組合(稱為混合型哮喘)的方法。外源性或變應(yīng)性哮喘包括由變應(yīng)原引起或與變應(yīng)原相關(guān)的疾病，所述變應(yīng)原例如花粉、孢子、稻草或雜草、寵物鱗屑、灰塵、螨蟲等。因為一年中的不同時間點(diǎn)存在特有的變應(yīng)原和其它刺激物，所以這類疾病也稱為季節(jié)性哮喘。外源性哮喘也包括支氣管哮喘和變應(yīng)性支氣管肺曲霉病。
本發(fā)明方法可治療或緩解的哮喘包括由感染因子引起的哮喘，所述感染因子例如病毒(例如感冒和流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副粘病毒、鼻病毒和流感病毒)。RSV、鼻病毒和流感病毒感染常見于兒童，病毒感染是嬰幼兒呼吸道疾病的主要原因。病毒性細(xì)支氣管炎兒童可發(fā)展成慢性喘鳴和哮喘，這些病可用本發(fā)明的方法進(jìn)行治療。還包括某些哮喘患者在運(yùn)動和/或遇冷空氣時會導(dǎo)致的哮喘。這些方法可用于吸煙暴露相關(guān)哮喘(例如香煙誘發(fā)的和工業(yè)煙霧)，以及工業(yè)和職業(yè)暴露，例如煙霧；臭氧；有害氣體；二氧化硫；一氧化二氮；煙塵，包括異氰酸鹽，來自油漆、塑料、聚氨酯、清漆等；木頭、植物或其它有機(jī)灰塵等。所述方法也可用于食品添加劑、防腐劑或藥理學(xué)試劑相關(guān)的哮喘。也包括治療、抑制或緩解無癥狀哮喘(silent asthma)或咳嗽變體哮喘(cough variant asthma)等哮喘類型的方法。
本文公開的方法也可用于治療和緩解胃食管反流(GERD)相關(guān)哮喘，這樣的反流可刺激支氣管收縮。GERD(伴隨持續(xù)體液分泌、鎮(zhèn)咳和暴露給臥室內(nèi)的變應(yīng)原和刺激物)能導(dǎo)致哮喘性病癥，統(tǒng)稱為夜間哮喘。在治療、抑制或緩解GERD相關(guān)哮喘的方法中，可按本文所述將藥用有效量的IL-21/TL-21R拮抗劑與藥用有效量的GERD治療藥聯(lián)用。這些藥物包括但不限于質(zhì)子泵抑制藥，例如PROTONIX牌延遲釋放的泮托拉唑鈉片劑、PRILOSEC牌奧美拉唑(omeprazole)延遲釋放膠囊劑、ACIPHEX牌雷貝拉唑鈉(rebeprazolesodium)延遲釋放片劑或PREVACID牌延遲釋放的蘭索拉唑(lansoprazole)膠囊劑。
特應(yīng)性疾病及其癥狀 “特應(yīng)性”是指具有發(fā)展成變態(tài)反應(yīng)的固有趨勢的一組疾病。特應(yīng)性疾病的實例包括變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎和枯草熱?？山o予IL-21/IL-21R途徑拮抗劑，以改善特應(yīng)性疾病或其一種或多種癥狀。
變應(yīng)性鼻炎(枯草熱)的癥狀包括瘙癢、流涕、打噴嚏或鼻塞以及眼睛發(fā)癢?？山o予IL-21/IL-21R途徑拮抗劑，以改善一種或多種這些癥狀。
特應(yīng)性皮炎為累及皮膚的慢性疾病。有關(guān)特應(yīng)性皮炎的信息來自例如NIH Publication No.03-4272。在特應(yīng)性皮炎中，皮膚變得很癢，導(dǎo)致充血、腫脹、皸裂、滲出透明液體，最終導(dǎo)致結(jié)痂和鱗屑脫落。在許多情況下，當(dāng)疾病變壞(稱為惡化或突發(fā))一段時間，再一段時間是皮膚改善或完全變好(稱為緩解)。特應(yīng)性皮炎常稱為“濕疹”，該術(shù)語是幾類皮膚炎癥的統(tǒng)稱。特應(yīng)性皮炎是多種濕疹中最常見的。特應(yīng)性皮炎的實例包括變應(yīng)性接觸性濕疹或皮炎(例如有時表現(xiàn)為紅、癢、流淚反應(yīng)，當(dāng)皮膚接觸外源物質(zhì)例如毒葛或者乳膏和洗劑中的某些防腐劑時)；接觸性濕疹(例如包括發(fā)紅、瘙癢和灼燒感等局部反應(yīng)，當(dāng)皮膚接觸變應(yīng)原或刺激物(例如酸、清潔劑或其它化學(xué)品)時；出汗障礙性濕疹(例如對手掌和腳底皮膚的刺激，特征是透明的、深的水泡，具有癢感和燒灼感)；神經(jīng)性皮炎(例如頭、小腿、腕部或前臂上因局部發(fā)癢(例如蟲咬)導(dǎo)致的皮膚鱗屑斑塊(當(dāng)抓撓時更會刺激它們))；錢幣狀濕疹(例如受刺激的皮膚表現(xiàn)為錢幣狀斑決，通常在手臂、背、臀部和小腿，可能有硬皮、鱗屑，而且特別癢)；脂溢性濕疹(例如在頭皮、臉、偶爾在身體的其它部位表現(xiàn)為黃色、油狀、具有鱗屑的皮膚斑塊)。其它具體癥狀還包括淤滯性皮炎、特應(yīng)性褶皺(例如Dennie-Morgan褶)、唇炎、hyperlinear palms、色素沉著過多眼瞼(眼瞼因炎癥或枯草熱所致顏色變深)、魚鱗病、毛發(fā)角化病、苔蘚樣變、丘疹和蕁麻疹?？梢越o予IL-21/IL-21R途徑拮抗劑，以改善一種或多種這些癥狀。
纖維變性病 盡管膠原的產(chǎn)生是高度受控過程，但是其紊亂會導(dǎo)致組織纖維化發(fā)展。纖維狀材料的異常積累最終將導(dǎo)致器官衰竭(Border等(1994)New Engl.J.Med.3311286-92)。任何器官損傷都會導(dǎo)致刻板癥(stereotypical)生理反應(yīng)血小板誘發(fā)的止血，接著是炎性細(xì)胞流入并活化成纖維細(xì)胞。來自這些細(xì)胞類型的細(xì)胞因子驅(qū)動形成新的胞外基質(zhì)和血管(肉芽組織)。肉芽組織的產(chǎn)生是一個謹(jǐn)慎而復(fù)雜的過程，其中蛋白酶抑制劑和胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)被上調(diào)，而蛋白酶的表達(dá)減少會導(dǎo)致胞外基質(zhì)的積累。
纖維變性癥狀的發(fā)展，無論是誘發(fā)的還是自發(fā)的，至少都是由成纖維細(xì)胞活性刺激而引起的。炎性細(xì)胞和活化成纖維細(xì)胞流入受損傷器官，依賴于這些細(xì)胞類型與間質(zhì)基質(zhì)的相互影響的能力，所述間質(zhì)基質(zhì)主要含有膠原。纖維組織增殖相關(guān)的許多疾病是慢性的，通常使皮膚病例如硬皮病惡化。包括肺纖維化在內(nèi)的某些纖維化可能致命，這部分因為這一事實該病的現(xiàn)有治療具有明顯副作用，通常對減緩或終止纖維化進(jìn)程無效(Nagler等(1996)Am.J.Respir.Crit.Care Med.1541082-86)。
纖維變性病包括以纖維化為特征的疾病，例如內(nèi)臟纖維化、皮膚纖維變性病和眼纖維變性病。內(nèi)臟(例如肝臟、肺、腎臟、心血管、胃腸道)纖維變性在以下疾病中發(fā)生例如肺纖維化、骨髓纖維變性、肝硬化、系膜增殖性腎小球腎炎、新月體性腎小球腎炎、糖尿病性腎病、腎間質(zhì)纖維化、接受環(huán)孢菌素的患者的腎纖維化和HIV相關(guān)腎病。
皮膚纖維化疾病包括例如硬皮病、硬斑病、疤痕疙瘩、肥大性疤痕、家族性皮膚膠原瘤和膠原型結(jié)締組織痣。眼纖維變性病包括例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、術(shù)后疤疤形成(例如青光眼過濾手術(shù)后和斜視眼手術(shù)后)和增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病。
本發(fā)明方法可治療的其它纖維變性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、延長的關(guān)節(jié)痛和惡化關(guān)節(jié)相關(guān)疾病、系統(tǒng)性硬化病(包括進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化病)、多肌炎、皮肌炎、嗜酸性粒細(xì)胞性筋膜炎、硬斑病(局限性硬皮病)、雷諾綜合征(Raynaud′s syndrome)和鼻息肉病。
可給予IL-21/IL-21R途徑拮抗劑，以治療或預(yù)防纖維變性病，或改善一種或多種這些疾病的癥狀。
測定IL-21/IL-21R拮抗劑作為細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞增殖/分化調(diào)節(jié)劑的活性的試驗 可以使用任一種常規(guī)因子依賴性細(xì)胞增殖試驗，對包括但不限于以下的細(xì)胞系，測定IL-21/IL-21R拮抗劑作為細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞增殖/分化調(diào)節(jié)劑的活性32D、DA2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preB M+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF-1、Mo7e和CMK。
T細(xì)胞或胸腺細(xì)胞增殖的測定法包括但不限于以下文獻(xiàn)中描述的方法Current Protocols in Immunology，J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober(編著)，Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(第3章，In vitroassays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19；第7章，Immunologicstudies in Humans)；Takai等(1986)J.Immunol.1373494-500；Bertagnolli等(1990)J.Immunol.1451706-12；Bertagnolli等(1991)Cellular Immunology 133327-341；Bertagnolli等(1992)J.Immunol.1493778-3783；Bowman等(1994)J.Immunol.1521756-61。細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞或胸腺細(xì)胞增殖的測定方法包括但不限于以下文獻(xiàn)中介紹的方法Polyclonal T cell stimulation，Kruisbeek，A.M.和Shevach，E.M.載于Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan(編著)，第1卷，第3.12.1-3.12.14頁，John Wiley and Sons，Toronto.1994；和Measurement of mouse and human Interferon gammma，Schreiber，R.D.載于Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan(編著)，第1卷，第6.8.1-6.8.8頁，John Wiley and Sons，Toronto.1994。
造血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞生成細(xì)胞增殖和分化的測定方法包括但不限于以下文獻(xiàn)中描述的方法Measurement of Human andMurine Interleukin 2 and Interleukin 4，Bottomly，K.，Davis，L.S.和Lipsky，P.E.載于Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan(編著)，第1卷，第6.3.1-6.3.12頁，John Wiley and Sons，Toronto.1991；deVries等(1991)J.Exp.Med.1731205-11；Moreau等(1988)Nature336690-92；Greenberger等(1983)Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.802931-38；Measurement of mouse and human interleukin 6，Nordan，R.載于Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan(編著)，第1卷，第6.6.1-6.6.5頁，John Wiley and Sons，Toronto.1991；Smith等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.831857-61；Measurement of humanInterleukin 11，Bennett，F(xiàn).，Giannotti，J.，Clark，S.C.和Turner，K.J.載于Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan(編著)，第1卷，第6.15.1頁，John Wiley and Sons，Toronto.1991；Measurement of mouseand human interleukin 9，Ciarletta，A.，Giannotti，J.，Clark，S.C.和Turner，K.J.載于Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan(編著)，第1卷，第6.13.1頁，John Wiley and Sons，Toronto.1991。
用于響應(yīng)抗原的T細(xì)胞克隆測定法(鑒定其中影響APC-T細(xì)胞相互作用的蛋白并通過測定增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生而指導(dǎo)T細(xì)胞效應(yīng))包括但不限于以下文獻(xiàn)中描述的方法Current Protocols inImmunology，J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober(編著)，Pub.Greene Publishing Associates和Wiley-Interscience(第3章，In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function；第6章，Cytokines and their cellular receptors；第7章，Immunologicstudies in Humans)；Weinberger等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.776091-95；Weinberger等(1981)Eur.J.Immun.11405-11；Takai等(1986)J.Immunol.1373494-500；Takai等(1988)J.Immunol.140508-12。
實施例 本發(fā)明由以下非限制性實施例進(jìn)一步說明。
實施例1鼠MU-1 cDNA的分離和表征 通過PCR，使用來自人序列的寡核苷酸，分離出MU-1受體鼠同源物的部分片段。從17日齡鼠胸腺和鼠2D6 T細(xì)胞系中分離RNA，并由它制備cDNA。通過PCR，從cDNA擴(kuò)增約300個核苷酸的DNA片段，用以下寡核苷酸分別對應(yīng)于圖1的人cDNA序列(對應(yīng)于SEQ ID NO1)的584-603和876-896的區(qū)域AGCATCAAGCCGGCTCCCCC(5p)(SEQ ID NO11)CTCCATTCACTCCAGGTCCC(3p)(SEQ ID NO12)用Taq聚合酶/1X Taq緩沖液(含有1.5mM氯化鎂)進(jìn)行擴(kuò)增，30次循環(huán)，94℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃1分鐘。測定該片段的DNA，兩個寡核苷酸都來自該片段的內(nèi)部，其序列如下TTGAACGTGACTGRGGCCTT(5P)(SEQ ID NO13)TGAATGAAGTGCCTGGCTGA(3P)(SEQ ID NO14) 寡核苷酸用于擴(kuò)增原PCR產(chǎn)物的內(nèi)部262個核苷酸的片段(對應(yīng)于圖1的鼠cDNA序列的核苷酸781-1043，以及SEQ ID NO9)，以便用作雜交探針，來篩選從2D6T細(xì)胞系分離的cDNA文庫。用標(biāo)準(zhǔn)5X SSC雜交條件，在65℃使濾膜(Filters)雜交，并在SSC中在65℃洗滌。在426,000克隆中篩選并分離與探針雜交的20個克隆。用兩個單獨(dú)的克隆測定DNA序列?？寺?6全長序列證實，它確實是人MU-1的全長鼠同源序列(SEQ ID NO9)。
鼠MU-1的全長核苷酸序列見圖1(對應(yīng)于SEQ ID NO9)。該核苷酸序列在核苷酸407-464具有預(yù)測的前導(dǎo)序列，在核苷酸407-1993具有編碼序列，在核苷酸1994-1996具有終止密碼子。核苷酸1-406對應(yīng)于5′非翻譯區(qū)，而核苷酸1997-2628對應(yīng)于3′非翻譯區(qū)(SEQ ID NO9)。
鼠MU-1的預(yù)測蛋白質(zhì)序列見圖2(對應(yīng)于SEQ ID NO10)。這個鼠MU-1蛋白經(jīng)SPScan測定含有預(yù)測的前導(dǎo)序列(得分＝10.1)(對應(yīng)于SEQ ID NO10的氨基酸1-19)和預(yù)測跨膜域(對應(yīng)于SEQ IDNO10的氨基酸237-253)。預(yù)測信號基序包括圖2B中的以下各區(qū)盒1SEQ ID NO10的氨基酸265-274；盒2SEQ ID NO10的氨基酸310-324，六個酪氨酸位于SEQ ID NO10的氨基酸位置281、319、361、368、397和510。潛在的STAT泊位包括STAT5EDDGYPA(SEQ ID NO20)；STAT3YLQR。
實施例2人和鼠MU-1的比較 GAP算法用于比較人和鼠MU-1氨基酸。用人IL-5受體的70個氨基酸區(qū)(SEQ ID NO3)搜索GenBank數(shù)據(jù)庫，用PCR引物(SEQ ID NO4和5)和雜交寡核苷酸(SEQ ID NO6和7)克隆人MU-1。鼠和人預(yù)測蛋白質(zhì)序列的比較見圖4。用GAP算法，其氨基酸具有65.267％同一性。通過BLOSUM62氨基酸取代矩陣產(chǎn)生比對(Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8910915-19)?？瘴粎?shù)＝空位權(quán)重8，平均匹配＝2.912，長度權(quán)重＝2，平均錯配＝-2.003；％相似性＝69.466。
人和鼠cDNA核苷酸序列的比較見圖3。DNA序列具有66.116％的同一性，當(dāng)用GAP進(jìn)行比對時?？瘴粎?shù)空位權(quán)重＝50，平均匹配10.000，長度權(quán)重＝3，平均錯配＝0.000，％相似性＝66.198。
人和小鼠MU-1蛋白質(zhì)都是I型細(xì)胞因子受體超家族成員。對鼠和人MU-1序列進(jìn)行評價，揭示出潛在的盒-1和盒-2信號基序的存在。六個酪氨酸殘基存在于胞質(zhì)區(qū)，它在MU-1信號傳導(dǎo)功能上具有重要作用。將MU-1的序列與該家族其它成員進(jìn)行比較，表明STAT 5和STAT 3的潛在泊位的存在。
實施例3人MU-1所用的STAT信號傳導(dǎo)途徑的測定 BAF-3細(xì)胞經(jīng)基因工程改造以表達(dá)嵌合細(xì)胞因子受體，該受體由人EPO受體胞外域和MU-1受體胞內(nèi)域組成。表達(dá)huEPORJMU-1(cyto)嵌合受體的BAF-3細(xì)胞響應(yīng)人可溶性EPO而增殖。分析這些細(xì)胞以確定哪種STAT分子在響應(yīng)EPO信號傳導(dǎo)后發(fā)生磷酸化。簡而言之，在含有IL-3的生長培養(yǎng)基中，對照未修飾親代BAF-3細(xì)胞和EPOR/MU嵌合BAF-3細(xì)胞是靜息的，用IL-3或EPO重新刺激0分鐘、15分鐘、30分鐘和60分鐘。沉淀細(xì)胞，重懸于含有原礬酸鹽的冰冷的裂解緩沖液中，以保存磷酸化酪氨酸。等量的細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。通過使用對磷酸化和非磷酸化形式的STAT分子具有特異性的抗體，將磷酸化和非磷酸化形式的STAT 1、3、5和6雙份印跡進(jìn)行染色。未活化的和用α-干擾素活化的HELA細(xì)胞用作陽性對照。
這些結(jié)果表明在這些具體情況下，通過MU-1的信號傳導(dǎo)導(dǎo)致所有測試時間點(diǎn)(T＝0′，T＝15′，T＝30′，T＝60′)的STAT 5磷酸化。用IL-3處理對照或嵌合BAF-3細(xì)胞，引起STAT 3、而不是STAT1或5的磷酸化。
實施例4鼠和人MU-1的組織表達(dá)實施例4.1RNA分析 按照制造商(Clonetech，PaloAlto，CA)推薦的方法，對來自不同組織的polyA+RNA進(jìn)行RNA印跡。對于鼠印跡，對應(yīng)于圖1的核苷酸781-1043和SEQ ID NO9的262個核苷酸片段用于雜交。
在成年鼠的脾、肺和心臟組織中檢測到一種鼠MU-1轉(zhuǎn)錄物。在人組織中觀察到的更大的轉(zhuǎn)錄物在小鼠組織中未見。
在成人淋巴組織、PBL、胸腺、脾和淋巴結(jié)以及胎兒肺中檢測到人MU-1的兩種轉(zhuǎn)錄物。
實施例4.2原位雜交 由Phylogency Inc.(Columbus，OH)進(jìn)行原位雜交研究(按照Lyons等(1990)J.Cell.Biol.1112427-36所述方法)。簡而言之，將連續(xù)的5-7微米石蠟切片脫蠟，固定，用蛋白酶K消化，用三乙醇胺處理并脫水。從線狀cDNA模板制備cRNA，產(chǎn)生反義和有義探針。按照制造商的條件(Ambion)合成cRNA轉(zhuǎn)錄物并用35S-UTP標(biāo)記。將片段雜交過夜，在嚴(yán)格性條件下洗滌，再用RNA酶A處理，然后浸泡在核示蹤乳液(nuclear track emulsion)中暴露2-3周。對照片段與有義探針雜交，以標(biāo)明該過程的背景水平。鼠探針由對應(yīng)于核苷酸860-1064的186-bp片段(SEQ ID NO9)組成。人探針是來自人MU-1DNA的23-bp PCR產(chǎn)物。
在成年小腸生發(fā)中心的淋巴結(jié)中觀察到鼠MU-1的表達(dá)。特化的淋巴結(jié)和派氏結(jié)(Peyers patches)也顯示出鼠MU-1的表達(dá)。
在皮層淋巴結(jié)生發(fā)中心檢測到人MU-1的表達(dá)。含有巨噬細(xì)胞的髓質(zhì)(medulla)是人MU-1陰性。在人脾臟的白髓區(qū)(而不是紅髓區(qū))檢測到人MU-1的表達(dá)。
實施例5人MU-1在細(xì)胞和細(xì)胞系中的表達(dá) 在靜息和活化人T細(xì)胞和B細(xì)胞系Raji和RPMI 8866，以及T細(xì)胞系Jurkat上，進(jìn)行RNA酶保護(hù)分析。人T細(xì)胞用抗CD3和抗CD28活化。細(xì)胞系用佛波醇酯和伊屋諾霉素活化。通過將23-bp PCR產(chǎn)物插入到pGEM3zf(-)(Promega，Madison，WI)載體的BamHI和HindIII位點(diǎn)，構(gòu)建產(chǎn)生MU-1核糖核酸探針的質(zhì)粒(用5′引物CACAAAGCTTCAGTATGAGCTGCAGTACAGGAACCGGGGA(SEQ ID NO15)和3′引物CACAGGATCCCTTTAACTCCTCTGACTGGGTCTGAAAGAT(SEQID NO16)，進(jìn)行PCR)。為了制備核糖核酸探針，將產(chǎn)生核糖核酸的質(zhì)粒用HindIII線性化。所得DNA經(jīng)苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。按照銷售商(PharMingen，San Diego，CA)建議的方案，用T7 RNA聚合酶制備核糖核酸探針。用PharMingen的RIBOQUANTTMMulti-ProbeRibonuclease Protection Assay系統(tǒng)進(jìn)行RNA酶保護(hù)測定。每次RPA反應(yīng)含有2.0μg總RNA，RNA酶消化后，受保護(hù)的核糖核酸探針用于QUICKPOINTTM快速核酸分離系統(tǒng)(Novex，San Diego，CA)。按照銷售商的說明，干燥凝膠并暴露。
與未刺激的細(xì)胞群體相比，在抗CD3+抗CD28刺激的人純化CD3+細(xì)胞中，人MU-1 RNA被上調(diào)。在Th1和Th2-skewed T細(xì)胞群體中，經(jīng)再次刺激后，MU-1也被上調(diào)。B細(xì)胞系RPMI 8866和Raji組成型地表達(dá)MU-1，而Jurkat T細(xì)胞系卻不是這樣。
實施例6人MU-1與已知細(xì)胞因子的結(jié)合 構(gòu)建人和鼠Ig融合蛋白并固定到Biacore芯片上，試圖鑒定MU-1的配體。評價各種細(xì)胞培養(yǎng)用條件培養(yǎng)基以及一組已知細(xì)胞因子對MU-1的結(jié)合能力。也測定了一些細(xì)胞因子與該家族的其它受體鏈的組合，以便考慮MU-1需要第二受體鏈用于配體結(jié)合的可能性。測定了以下細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)它們對MU-1結(jié)合呈陰性mIL-2、hIL-2、hTL-15、mIL-7、TSLP、TSLP+IL-7、TSLP+IL-7R、TSLP+IL-7g、TSLP+IL-2、TSLP+IL-2+IL-2Rβ、IL2-Rβ、IL-2Rγ、IL-7R、IL-2+IL-2Rβ、IL-2+IL-2Rγ、BL-15+IL-2Rβ、IL-15+IL-2Rγ、IL-7+IL-2Rγ、IL-2+IL-7R、IL-15+IL-7R、IL-7+IL-7R。已知受體也被固定并檢測MUFc結(jié)合，得到陰性結(jié)果。IL-15可與IL-2Rb結(jié)合，但不與IL-2Rg或MUFc結(jié)合。
實施例7在膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠中，抑制IL-21/IL-21R活性能改善癥狀的嚴(yán)重程度 該實施例表明，在CIA鼠模型中，IL-21R拮抗劑，例如IL-21R-Ig融合蛋白(鼠IL-21RFc蛋白或“muIL-21RFc”)或抗IL-21R抗體改善其癥狀。
所有實驗均使用雄性DBA/1(Jackson Laboratories，BarHarbor，ME)小鼠。關(guān)節(jié)炎是用II型牛膠原(Chondrex，Redmond，WA)誘發(fā)的。將II型牛膠原(Chondrex)溶于0.1M乙酸中，且在等體積的含有1mg/ml結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)菌株H37RA的完全弗氏佐劑(Sigma)中乳化。第0天，在尾端部皮下注射100μg牛膠原。第21天，給小鼠的尾端部皮下注射用與等體積的不完全弗氏佐劑(Sigma)混合的含有100μg牛膠原的0.1M乙酸溶液。首次用于實驗的動物接受相同組的注射，只是沒有膠原。給藥方案見圖16的示意圖。將MuIL-21RFc預(yù)防性或治療性給予DBA小鼠。在治療方案中，如果連續(xù)兩天都觀察小鼠得病，則開始進(jìn)行治療。
每周監(jiān)控小鼠至少三次，觀察疾病進(jìn)程。根據(jù)以下指數(shù)，給四肢進(jìn)行臨床評分0＝正常，無腫脹；1＝可見紅斑，伴有1-2個腫大趾頭，或在踝部有輕度腫脹；2＝明顯紅斑，特征是腳爪腫脹和/或兩個趾頭輕度至中度腫脹；3＝整個腳爪大范圍腫脹，延伸到踝關(guān)節(jié)或腕關(guān)節(jié)；4＝腫脹消退，腳爪關(guān)節(jié)僵硬；四肢使用困難或關(guān)節(jié)僵硬。因此，任一給定小鼠四肢評分之和，得出的最大總身體評分為16。
在疾病的不同階段，給動物實施安樂死，切取組織，將腳爪在10％福爾馬林中固定(供組織學(xué)分析用)，或者在4％低聚甲醛(pH 7.47)固定，用20％EDTA(pH 8.0)脫鈣，然后石蠟包埋(供原位雜交用)。用光學(xué)顯微鏡及5級評分方法(0-4)對腳爪進(jìn)行評分，以表征關(guān)節(jié)炎的強(qiáng)度和范圍。除了其它炎性相關(guān)變化用于評分外，炎性浸潤也用于評分，所述炎性相關(guān)變化例如關(guān)節(jié)翳形成、滑膜纖維化、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕和/或軟骨下骨破壞。組織學(xué)分級用每個腳爪的讀數(shù)來確定NAD＝0或未發(fā)現(xiàn)異常；1輕微至中度；2輕度至中度；3明顯；4大量。
從膠原再次刺激前一天開始，經(jīng)腹膜內(nèi)(IP)隔天給予CIA小鼠muIL-21RFc(100μg或200μg)進(jìn)行預(yù)防性治療，治療后，觀察到癥狀的嚴(yán)重程度下降(數(shù)據(jù)未顯示)。
muIL-21RFc(200μg)小鼠，3次/周)對半治療性CIA小鼠的效果是治療后天數(shù)的函數(shù)，見圖17。用小鼠Ig(200μg/小鼠，3次/周)作為對照。從治療后7天開始，可見嚴(yán)重程度評分下降。
這些實驗證明，將IL-21R拮抗劑例如IL-21R-Fc融合蛋白給予CIA小鼠，無論是預(yù)防性還是半治療性，都顯著改善了關(guān)節(jié)炎癥狀。
實施例8IL-21R轉(zhuǎn)錄物的原位雜交 測定CIA小鼠的患有關(guān)節(jié)炎的腳爪中IL-21R mRNA的表達(dá)。使用反義鼠IL-21R核糖核酸探針(圖18A)；有義探針用作陰性對照(圖18B)。按照制造商的說明，使用DIG RNA標(biāo)記混合物(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)，制備洋地黃毒苷標(biāo)記的探針。在巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群、滑膜細(xì)胞和表皮中檢測到IL-21受體mRNA的表達(dá)(圖18A)。在對照腳爪中或使用有義探針可觀察到染色減少(圖18B)。mIL-21R mRNA陽性細(xì)胞是嗜中性粒細(xì)胞(N)和巨噬細(xì)胞(M)。原位雜交表明在關(guān)節(jié)炎小鼠的腳爪中IL-21R的表達(dá)增加。
實施例9在HLA-B27大鼠模型中，對IL-21/IL-21R活性的抑制，改善了IBD樣癥狀的嚴(yán)重程度 該實施例表明，在HLA-B27大鼠模型中，IL-21R拮抗劑，例如IL-21R-Ig融合蛋白(鼠IL-21RFc蛋白或“muIL-21RFc”)或抗IL-21R抗體，改善了IBD樣癥狀。
如本文所述，產(chǎn)生鼠IL-21受體-Fc融合多肽(MuIL-21RFc)，并在HLA-B27大鼠模型中評價其緩解腸道炎癥的能力。HLA-B27大鼠模型已廣泛用于評價IBD療法，因為該模型中觀察道的腸道炎癥的某些臨床、組織學(xué)和免疫特征與人類IBD的相同(有關(guān)綜述參見例如Elson等(1995)Gastroenterology，1091344-67；Blanchard等(2001)European Cytokine Network 12111-18；Kim等(1999)Arch.Pharm.Res.22354-60)。例如，HLA-B27大鼠過量表達(dá)人類主要組織相容性復(fù)合體I等位B27和B2微球蛋白基因產(chǎn)物。這樣的基因產(chǎn)物與慢性炎性疾病例如IBD的發(fā)展有關(guān)。
用于研究的大鼠已經(jīng)患有慢性胃腸道(GI)炎癥，證據(jù)是持續(xù)腹瀉的臨床體征。根據(jù)以下指數(shù)對糞便進(jìn)行臨床評分(0-3)0＝正常，具有成形糞便；1＝軟，具有成形糞便；2＝松散，沒有成形糞便；和3＝水樣腹瀉(參見圖19)。在疾病進(jìn)程中評價糞便期間，對大鼠進(jìn)行監(jiān)測達(dá)18天。臨床評分為3表明持續(xù)腹瀉(顯示為IgG對照)。將MuIL-21RFc給予(6mg/kg IP，3次/周)5只HLA-B27轉(zhuǎn)基因大鼠/組，達(dá)18天。另一組給予6mg/ml mEnbrel(可溶性TNF-受體Fc融合物)，即陽性對照。按相同的方式和劑量將IgG給予小鼠數(shù)目相同的第三組，作為對照。
與IgG對照相比，在用MuIL-21RFc和mEnbrel治療的各組中，檢測到臨床評分明顯下降(參見圖19和圖20)。在緩解EBD樣癥狀方面，給予MuIL-21RFc顯示出與給予mEnbrel類似功效。該研究結(jié)果證明，在HLA-B27大鼠模型中，與給予對照IgG的大鼠相比，給予MuIL-21RFc降低了腸道炎癥，其功效類似于mEnbrel(參見圖19和圖20)。
組織學(xué)分析證實了以改善的糞便評分為代表的癥狀改善。就潰瘍、炎癥、病灶深度和纖維化而言，經(jīng)MuIL-21RFc治療大鼠的評分，比用對照IgG治療大鼠的評分明顯更低(參見圖21)。如上所述，進(jìn)行組織學(xué)分析，臨床評分0-2或0-3，其中更高評分表明在大鼠IBD模型中嚴(yán)重程度升高。相對于對照而言，在用MuIL-21RFc和mEnbrel治療的所有組別中，都檢測到腸道炎癥的明顯減少。在改善疾病嚴(yán)重程度的組織學(xué)體征方面，MuIL-21RFc表現(xiàn)出與mEnbrel類似的功效。為了支持將以上結(jié)果擴(kuò)大到人類，圖19(右圖)顯示在正常人腸道的淋巴細(xì)胞和淋巴結(jié)中MU-1 mRNA的原位雜交，表明MU-1 mRNA在與疾病有關(guān)的器官中的表達(dá)。
實施例10抑制IL-21/IL-21R活性，能延遲小鼠的同種異體皮膚移植排斥 該實施例表明，IL-21R拮抗劑，例如IL-21R-Ig融合蛋白(鼠IL-21RFc蛋白或“muIL-21RFc”)或抗IL-21R抗體，延遲小鼠同種異體皮膚移植排斥，因此延長了移植物的存活期。
在注射了逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的小鼠中，給予MuIL-21RFc可延遲同種異體皮膚移植排斥。圖22是線狀圖，表明移植物存活百分比隨過繼轉(zhuǎn)移后的天數(shù)的變化。在該模型中，裸小鼠顯示康復(fù)同種異體皮膚移植，因為小鼠沒有可檢測的T細(xì)胞。當(dāng)給裸小鼠注射活化B6 T細(xì)胞(經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒工程化以分泌對照GFP或IL-21)，移植物就會被排斥(參見圖22)。如果T細(xì)胞經(jīng)基因工程改造以分泌MuIL-21RFc(其可望中和這些細(xì)胞產(chǎn)生的IL-21)的話，移植物存活更長時間，見圖22(由IL-21R-Fc所示，與GFP和IL-21對照相比)。10只小鼠分別用于GFP和MuIL-21RFc；15只小鼠用于IL-21對照。這些結(jié)果證明了IL-21R拮抗劑在延長移植物存活期上的作用。
實施例11在CD45RBhi過繼轉(zhuǎn)移模型中，抑制IL-21/TL-21R活性會減少疾病癥狀 該實施例表明，在銀屑病和炎性腸病(IBD)小鼠模型中，IL-21R拮抗劑例如IL-21R-Ig融合蛋白(鼠IL-21RFc蛋白或“muIL-21RFc”)或抗IL-21R抗體能改善癥狀。
將CD45RBhiCD4+幼稚T細(xì)胞轉(zhuǎn)移給重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠，可導(dǎo)致結(jié)腸炎和/或皮膚損害類銀屑病，這取決于籠養(yǎng)條件。首先，通過在選擇CD4+T細(xì)胞的柱子上進(jìn)行陰性選擇，從脾細(xì)胞中分選出BALBc CD45RBhiCD4+T細(xì)胞(幼稚群體)，然后在通過選擇高CD45表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分選。將4×105細(xì)胞的該群體轉(zhuǎn)移給雌性C.B-17 SCID小鼠，對小鼠的銀屑病和IBD的臨床體征進(jìn)行評分達(dá)幾周。在靜態(tài)籠養(yǎng)條件下的小鼠發(fā)生炎性腸?。欢趲в锌諝饬魍ㄗ兓某Ｒ?guī)條件下關(guān)養(yǎng)的小鼠也發(fā)生銀屑病。根據(jù)1-6的量表，對小鼠的銀屑病進(jìn)行評分1＝輕中度紅斑(通常是眼瞼和耳朵)＜2％的身體；2＝輕度鱗屑和中重度紅斑(通常是耳朵和臉)2-10％的身體；3＝嚴(yán)重紅斑和鱗屑(耳朵、臉和軀干)10-20％的身體；4＝非常嚴(yán)重紅斑，占整個身體的20-40％；5＝非常嚴(yán)重紅斑，占整個身體的40-60％；6＝非常嚴(yán)重紅斑，占整個身體的60-100％。通過體重減輕和糞便評分對小鼠的IBD進(jìn)行評分0＝正常；1＝軟；2＝腹瀉；3＝帶有血和粘液的腹瀉。
用muIL-21RFc進(jìn)行治療，對改善銀屑病樣癥狀有效。在患有皮膚炎癥的小鼠中，與用抗柔嫩艾美耳球蟲Ig治療的對照小鼠相比，在CD45RBhi細(xì)胞轉(zhuǎn)移后8周開始，通過腹膜內(nèi)注射200μgmuIL-21RFc(3次/周)進(jìn)行治療，結(jié)果紅斑、鱗屑和脫發(fā)都減少(圖23)。與對照相比，在細(xì)胞轉(zhuǎn)移的同時，用200μg muIL-21RFc(3次/周)治療的CD45RBhi受體小鼠，結(jié)果在整個實驗過程中，銀屑病延遲發(fā)作而且臨床疾病的嚴(yán)重程度降低(圖35)。實驗結(jié)果歸納在圖36。
用muIL-21RFc進(jìn)行治療，對改善炎性腸到癥狀也有效。與Ig對照治療小鼠相比，在細(xì)胞轉(zhuǎn)移的同時，用200μg或400μgmuIL-21RFc治療CD45RBhi受體小鼠，每周3次，結(jié)果通過體重減輕(圖37)和糞便評分(圖38)確定，結(jié)腸炎的臨床體征明顯減少。結(jié)果歸納在圖39。對對照治療的CD45RBhi受體的結(jié)腸進(jìn)行肉眼評價，顯示嚴(yán)重增厚和腫脹，而這些現(xiàn)象在用muIL-21RFc治療的小鼠中幾乎被完全抑制。從顯微上看，與muIL-21RFc治療的小鼠相比，對照治療的小鼠的固有層/粘膜下層也顯示出更大程度的上皮細(xì)胞增生和白細(xì)胞浸潤。另外，測定對照治療小鼠和muIL-21RFc治療小鼠的血清細(xì)胞因子。在幾種所測細(xì)胞因子中，僅可檢出血清γ干擾素(IFN-γ)。與Ig對照治療小鼠相比，用200μg或400μg劑量的muIL-21RFc進(jìn)行治療，結(jié)果顯著降低了IFN-γ的血清水平(圖40)。IFN-γ可用作IL-21R拮抗劑在IBD中的功效的生物標(biāo)記。
通過增殖測定，檢測CD45RBhi(幼稚)亞群和CD45RBlo(記憶)亞群對IL-21的響應(yīng)。在IBD轉(zhuǎn)移模型中，僅幼稚細(xì)胞導(dǎo)致疾病，并且疾病可以通過加入記憶群體而得以抑制。在該試驗中，用與平板結(jié)合的抗CD3刺激純化群體并測定為響應(yīng)IL-21而摻入的3H-胸苷。與記憶群體相比，幼稚群體表現(xiàn)出響應(yīng)IL-21的反應(yīng)明顯增加(圖41)。這表明，IL-21對于該群體的體內(nèi)擴(kuò)增來說是重要的細(xì)胞因子。
將IL-21加入到培養(yǎng)物中的活化CD4+CD45RBhi細(xì)胞中，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的分泌?？笴D3刺激的CD45RBhiCD4+T細(xì)胞用100單位/ml IL-2或1ng/ml、10ng/ml或100ng/ml IL-21處理。為了響應(yīng)IL-21，CD45RBhi細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IL-18、IL-22、IFN-γ和TNFα的水平升高(圖42)。與用Ig對照處理的培養(yǎng)物相比，通過加入50μg/ml或100μg/ml muIL-21RFc，阻斷內(nèi)源性IL-21，結(jié)果這些培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子水平下降(圖43)。
總之，這些結(jié)果表明，IL-21在該模型的炎癥響應(yīng)中具有強(qiáng)效的潛在作用，IL-21R拮抗劑在Th1介導(dǎo)的疾病(例如節(jié)段性回腸炎和銀屑病)中可起到治療性益處。
實施例12缺乏IL-21R的小鼠表現(xiàn)出抗原誘發(fā)的氣道炎癥減輕 該實施例表明，缺乏IL-21受體的轉(zhuǎn)基因敲出小鼠(IL-21R-/-)對抗原誘發(fā)的氣道炎癥和氣道過度反應(yīng)具有明顯減少的反應(yīng)。
第0天和第14天，IL-21R-/-和野生型(WT+/+)C57BL/6小鼠(8-12周齡)經(jīng)腹膜內(nèi)注射用2.25mg硫酸鉀鋁(Alum Inject；Pierce)乳化的20μg OVA。第26、27和28天，氣道用5％OVA/PBS的氣溶膠攻擊30分鐘。最后一次OVA攻擊后48小時，評價氣溶膠化的醋甲膽堿對動物在肺阻力和動態(tài)順應(yīng)性上的變化。與OVA致敏的PBS攻擊的WT+/+小鼠相比，在OVA致敏和攻擊WT+/+小鼠中，當(dāng)給予醋甲膽堿氣溶膠后，導(dǎo)致氣道過度反應(yīng)明顯增加(圖24)。然而，OVA-致敏/OVA攻擊的IL-21R-/-小鼠與OVA致敏/OVA攻擊的WT+/+小鼠相比，對所有劑量范圍的氣溶膠化的醋甲膽堿的氣道過度反應(yīng)都沒有差異(圖24)。
然后處死動物，收集血液和支氣管肺泡灌洗液(BALF)，用于分析肺部炎癥、細(xì)胞因子水平以及總效價和抗OVA IgE效價。用3×0.7ml PBS進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，收集BALF。與IL-21R-/-動物的PBS-攻擊的對照相比，OVA攻擊后，WT+/+小鼠的總BALF細(xì)胞數(shù)增加約36倍，相比之下，PBS-攻擊的對照增加3倍(圖25A)。此外，OVA致敏/OVA攻擊的IL-21R-/-小鼠的BALF內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，明顯低于在OVA致敏/OVA攻擊的WT+/+動物中所觀察到的細(xì)胞總數(shù)。OVA致敏/PBS攻擊的IL-21R-/-和WT+/+小鼠的BALF細(xì)胞總數(shù)沒有差異(圖25A)。與同樣致敏但經(jīng)PBS攻擊的對照相比，在WT+/+和IL-21R-/-小鼠中，OVA攻擊導(dǎo)致BALF嗜酸性粒細(xì)胞明顯上升。與OVA致敏/OVA攻擊的WT+/+動物相比，在IL-21-/-動物中，BALF嗜酸性粒細(xì)胞的絕對數(shù)量顯著下降(圖25B)。缺失IL-21R，在OVA攻擊后也會明顯減少BALF淋巴細(xì)胞數(shù)(圖25C)和嗜中性粒細(xì)胞數(shù)(圖25D)上的增加。
與PBS-攻擊的對照相比，OVA致敏/攻擊的WT+/+小鼠的BALF中IL-5、IL-13和TNFα水平明顯升高(圖26和27)。相比之下，與PBS-攻擊的對照相比，OVA致敏和攻擊在IL-21R-/-小鼠中誘發(fā)BALF內(nèi)這些細(xì)胞因子水平的非常少量的升高，而且其水平要比在OVA致敏/OVA攻擊的WT動物中所觀察到的水平明顯偏低(圖26和27)。BALF中TNFα和IL-5水平用細(xì)胞計數(shù)珠陣列試劑盒(cytometricbead array kit)(小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子CBA，BD Biosciences，San Diego，CA)定量測定。BALF中的IL-13水平通過ELISA定量測定。
如圖28A-B所示，在OVA致敏/OVA攻擊后，IL-21R-/-的血清總IgE和抗OVA IgE水平與相同治療的WT+/+小鼠相比要低很多。然而，當(dāng)PBS攻擊后比較總IgE或OVA特異性IgE水平時，在IL-21R-/-和WT+/+小鼠中卻沒有顯著性差異。
這些結(jié)果表明，抑制IL-21介導(dǎo)的反應(yīng)，在治療變態(tài)反應(yīng)和哮喘中具有治療價值。
實施例13在MRL-Faslpr狼瘡模型中，抑制IL-21/IL-21R活性能改善癥狀的嚴(yán)重程度 該實施例表明，在MRL-Faslpr小鼠模型中，IL-21R拮抗劑例如IL-21R-Ig融合蛋白(鼠IL-21RFc蛋白或“muIL-21RFc”)或抗IL-21R抗體能改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)樣癥狀。
所有實驗都使用雄性MRL-Faslpr小鼠。這些小鼠具有類似于人SLE的多種癥狀，包括DNA自身抗體，多組織的破壞，以及免疫復(fù)合物性腎小球腎炎。在10周齡，開始將400μg MuIL-21RFc或同種型對照經(jīng)腹膜內(nèi)注射，每周3次，每周分析小鼠的疾病發(fā)展。在第15周處死小鼠用于進(jìn)一步分析。各治療組有10只小鼠。
在MRL-Faslpr小鼠中，經(jīng)ELISA檢測，MuIL-21RFc治療能明顯降低循環(huán)抗dsDNA自身抗體水平(圖29)和血清總IgG水平(圖30)。簡而言之，對于抗dsDNA自身抗體的檢測，將dsDNA包被在滴定板上，加入血清抗體，再用抗小鼠的第二抗體來檢測所述抗體。對于總IgG的檢測，將血清吸附到滴定板上，再用抗小鼠的第二抗體進(jìn)行檢測。
用MuIL-21RFc進(jìn)行治療，也能減少IgG沉積物在MRL-Faslpr小鼠腎臟中的積累。第15周，處死小鼠，將冷凍腎切片(5μm)用山羊抗小鼠IgG-FITC染色。按照從0-3的量表記錄熒光強(qiáng)度。圖31表明在治療和對照小鼠腎臟中測定的總熒光強(qiáng)度。
這些結(jié)果表明，用IL-21R拮抗劑進(jìn)行治療性治療可緩解狼瘡樣癥狀。
實施例14狼瘡和GVHD動物模型在移植B6 bm12脾細(xì)胞的IL-21R缺陷型小鼠腎臟中，缺乏自身抗體形成和IgG沉積 進(jìn)行實驗，研究IL-21R敲出(KO)小鼠在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的慢性移植物抗宿主病(GVHD)模型中的反應(yīng)(Chen等(1998)J.Immunol.1615880-85)。該模型包括SLE和GVHD的代表性方面。
所用的動物是B6.C-H2<bm12>/KhEG(bm12)，JacksonLabs(脾細(xì)胞)；IL-21R-2 KO小鼠，Charles River Labs(CRL)；C57/B6野生型(WT)小鼠，Charles River Labs；和C57/B6野生型小鼠，Taconic(TAC)(Germantown，NY)。
在誘發(fā)疾病的當(dāng)天，通過CO2暴露處死合適的供體小鼠。收獲脾臟并蓋好。每個脾臟用0.16M NH4Cl∶0.17M TrisCl(9∶1)的1ml裂解液裂解紅細(xì)胞，共裂解5分鐘，偶爾混合一下。用錐蟲藍(lán)對細(xì)胞懸液計數(shù)，并用無菌磷酸緩沖鹽溶液調(diào)節(jié)至終濃度為2×108細(xì)胞/ml。再給合適的受體小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射0.5ml合適細(xì)胞懸液(見下表2)。然后，每周監(jiān)測受體小鼠的尿蛋白和體重增減。每隔兩周，給每只小鼠通過眼眶竇后(retro-orbital sinus)放血，貯存血清用于進(jìn)一步分析。對各時間點(diǎn)收集的所有血清進(jìn)行ELISA測定(如Zouali和Stollar(1986)J.Immunol.Methods 90105-10所述)，測定針對雙鏈DNA的自身抗體。
疾病誘發(fā)后的第12周，使每組的半數(shù)動物安樂死，收集脾和腎。左腎保存(完整)在10％非緩沖福爾馬林中，用H&E染色。按照Chen等(出處同上)所述方法，對染色進(jìn)行評分。評分參數(shù)包括血管周圍淋巴細(xì)胞性浸潤，間質(zhì)淋巴細(xì)胞性浸潤，細(xì)胞過多(hypercellularity)和基底膜增厚。右腎縱向切片，每一半都將剖面向下放在組織封閉盒中。再用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析右腎中的免疫沉積物，尤其是IgG、IgM和C3的存在。
表2
這些實驗結(jié)果見圖44。在任何IL-21R敲出小鼠的任何時間點(diǎn)，都沒有檢出抗dsDNA自身抗體(圖44A)。另外，圖44B表明，疾病誘發(fā)后的20周，與GVHD小鼠相比，在IL-21R缺陷型小鼠腎臟中未見IgG沉積。因此，在GVHD-SLE模型中，缺乏IL-21R的小鼠不產(chǎn)生自身抗體，在腎臟中也不形成IgG沉積物。因此，用IL-21/IL-21R拮抗劑治療個體，對SLE和GVHD都可提供有效療法。
本說明書全文引用的所有參考文獻(xiàn)、待審專利申請(包括2004年8月5日申請的60/599,086和2004年12月23日申請的60/639,176)、已公布的專利申請(包括2002年10月4日申請的2003/0108549)和已公布的專利的內(nèi)容都通過引用結(jié)合到本文中。等同實施方案 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解或者只要使用常規(guī)實驗就能夠確定本文所述發(fā)明具體實施方案的許多等同實施方案。所附權(quán)利要求書中包括所述等同實施方案。
序列表<110>惠氏公司(Wyeth)<120>拮抗白介素-21受體活性<130>01997.043400<150>US 60/599,086<151>2004-08-05<150>US 60/639,176<151>2004-12-23<160>39<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2665<212>DNA<213>人<400>1gtcgactgga ggcccagctg cccgtcatca gagtgacagg tcttatgaca gcctgattgg60tgactcgggc tgggtgtgga ttctcacccc aggcctctgc ctgctttctc agaccctcat120ctgtcacccc cacgctgaac ccagctgcca cccccagaag cccatcagac tgcccccagc180acacggaatg gatttctgag aaagaagccg aaacagaagg cccgtgggag tcagcatgcc240gcgtggctgg gccgccccct tgctcctgct gctgctccag ggaggctggg gctgccccga300cctcgtctgc tacaccgatt acctccagac ggtcatctgc atcctggaaa tgtggaacct360ccaccccagc acgctcaccc ttacctggca agaccagtat gaagagctga aggacgaggc420cacctcctgc agcctccaca ggtcggccca caatgccacg catgccacct acacctgcca480catggatgta ttccacttca tggccgacga cattttcagt gtcaacatca cagaccagtc540tggcaactac tcccaggagt gtggcagctt tctcctggct gagagcatca agccggctcc600ccctttcaac gtgactgtga ccttctcagg acagtataat atctcctggc gctcagatta660cgaagaccct gccttctaca tgctgaaggg caagcttcag tatgagctgc agtacaggaa720
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Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro385 390 395 400Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp405 410 415Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser420 425 430Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg435 440 445Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro450 455 460Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser465 470 475 480Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly485 490 495Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp500 505 510Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro515 520 525Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser530 535<210>3<211>70<212>PRT<213>人<400>3Leu Met Thr Asn Ala Phe Ile Ser Ile Ile Asp Asp Leu Ser Lys Tyr1 5 10 15Asp Val Gln Val Arg Ala Ala Val Ser Ser Met Cys Arg Glu Ala Gly20 25 30Leu Trp Ser Glu Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Gly Asn Asp Glu His35 40 45Lys Pro Leu Arg Glu Trp Phe Val Ile Val Ile Met Ala Thr Ile Cys50 55 60
Phe Ile Leu Leu Ile Leu65 70<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>4gagtccgagg agaaagctga tctca 25<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>5gaaagatgac cgggtcactc catt 24<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述標(biāo)記的雜交寡核苷酸<400>6actcgagcta tgagctgcag gtgcgggca 29<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述NN14-1b(MU-1)標(biāo)記的雜交寡核苷酸
<400>7actcgagcta tgagctgcag gtgcgggca 29<210>8<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述紅細(xì)胞生成素受體家族的基序特征<220>
<221>其他特征<222>(3)..(3)<223>其中Xaa為任何氨基酸。
<400>8Trp Ser Xaa Trp Ser1 5<210>9<211>2628<212>DNA<213>小鼠<400>9gtcgacgcgg cggtaccagc tgtctgccca cttctcctgt ggtgtgcctc acggtcactt60gcttgtctga ccgcaagtct gcccatccct ggggcagcca actggcctca gcccgtgccc120caggcgtgcc ctgtctctgt ctggctgccc cagccctact gtcttcctct gtgtaggctc180tgcccagatg cccggctggt cctcagcctc aggactatct cagcagtgac tcccctgatt240ctggacttgc acctgactga actcctgccc acctcaaacc ttcacctccc accaccacca300ctccgagtcc cgctgtgact cccacgccca ggagaccacc caagtgcccc agcctaaaga360atggctttct gagaaagacc ctgaaggagt aggtctggga cacagcatgc cccggggccc420actggctgcc ttactcctgc tgattctcca tggagcttgg agctgcctgg acctcacttg480ctacactgac tacctctgga ccatcacctg tgtcctggag acacggagcc ccaaccccag540
catactcagt ctcacctggc aagatgaata tgaggaactt caggaccaag agaccttctg600cagcctacac aggtctggcc acaacaccac acatatatgg tacacgtgcc atatgcgctt660gtctcaattc ctgtccgatg aagttttcat tgtcaatgtg acggaccagt ctggcaacaa720ctcccaagag tgtggcagct ttgtcctggc tgagagcatc aaaccagctc cccccttgaa780cgtgactgtg gccttctcag gacgctatga tatctcctgg gactcagctt atgacgaacc840ctccaactac gtgctgaggg gcaagctaca atatgagctg cagtatcgga acctcagaga900cccctatgct gtgaggccgg tgaccaagct gatctcagtg gactcaagaa acgtctctct960tctccctgaa gagttccaca aagattctag ctaccagctg caggtgcggg cagcgcctca1020gccaggcact tcattcaggg ggacctggag tgagtggagt gaccccgtca tctttcagac1080ccaggctggg gagcccgagg caggctggga ccctcacatg ctgctgctcc tggctgtctt1140gatcattgtc ctggttttca tgggtctgaa gatccacctg ccttggaggc tatggaaaaa1200gatatgggca ccagtgccca cccctgagag tttcttccag cccctgtaca gggagcacag1260cgggaacttc aagaaatggg ttaatacccc tttcacggcc tccagcatag agttggtgcc1320acagagttcc acaacaacat cagccttaca tctgtcattg tatccagcca aggagaagaa1380gttcccgggg ctgccgggtc tggaagagca actggagtgt gatggaatgt ctgagcctgg1440tcactggtgc ataatcccct tggcagctgg ccaagcggtc tcagcctaca gtgaggagag1500agaccggcca tatggtctgg tgtccattga cacagtgact gtgggagatg cagagggcct1560gtgtgtctgg ccctgtagct gtgaggatga tggctatcca gccatgaacc tggatgctgg1620ccgagagtct ggccctaatt cagaggatct gctcttggtc acagaccctg cttttctgtc1680ttgcggctgt gtctcaggta gtggtctcag gcttggaggc tccccaggca gcctactgga1740caggttgagg ctgtcatttg caaaggaagg ggactggaca gcagacccaa cctggagaac1800tgggtcccca ggagggggct ctgagagtga agcaggttcc ccccctggtc tggacatgga1860cacatttgac agtggctttg caggttcaga ctgtggcagc cccgtggaga ctgatgaagg1920accccctcga agctatctcc gccagtgggt ggtcaggacc cctccacctg tggacagtgg1980
agcccagagc agctagcata taataaccag ctatagtgag aagaggcctc tgagcctggc2040atttacagtg tgaacatgta ggggtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg2100tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtcttgggt tgtgtgttag cacatccatg ttgggatttg2160gtctgttgct atgtattgta atgctaaatt ctctacccaa agttctaggc ctacgagtga2220attctcatgt ttacaaactt gctgtgtaaa ccttgttcct taatttaata ccattggtta2280aataaaattg gctgcaacca attactggag ggattagagg tagggggctt ttgagttacc2340tgtttggaga tggagaagga gagaggagag accaagagga gaaggaggaa ggagaggaga2400ggagaggaga ggagaggaga ggagaggaga ggagaggaga ggagaggaga ggctgccgtg2460aggggagagg gaccatgagc ctgtggccag gagaaacagc aagtatctgg ggtacactgg2520tgaggaggtg gccaggccag cagttagaag agtagattag gggtgacctc cagtatttgt2580caaagccaat taaaataaca aaaaaaaaaa aaaagcggcc gctctaga 2628<210>10<211>529<212>PRT<213>小鼠<400>10Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu His Gly1 5 10 15Ala Trp Ser Cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr20 25 30Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser35 40 45Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe50 55 60Cys Ser Leu His Arg Ser Gly His Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr65 70 75 80Cys His Met Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp Glu Val Phe Ile Val85 90 95Asn Val Thr Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
100 105 110Val Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Leu Asn Val Thr Val115 120 125Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu130 135 140Pro Ser Asn Tyr Val Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr145 150 155 160Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile165 170 175Ser Val Asp Ser Arg Asn Val Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys180 185 190Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln Val Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr195 200 205Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln210 215 220Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu225 230 235 240Leu Leu Ala Val Leu Ile Ile Val Leu Val Phe Met Gly Leu Lys Ile245 250 255His Leu Pro Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Pro Val Pro Thr260 265 270Pro Glu Ser Phe Phe Gln Pro Leu Tyr Arg Glu His Ser Gly Asn Phe275 280 285Lys Lys Trp Val Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Val290 295 300Pro Gln Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro305 310 315 320Ala Lys Glu Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu325 330 335Glu Cys Asp Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu340 345 350Ala Ala Gly Gln Ala Val Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro355 360 365
Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Gly Asp Ala Glu Gly370 375 380Leu Cys Val Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met385 390 395 400Asn Leu Asp Ala Gly Arg Glu Ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu405 410 415Leu Val Thr Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Gly Ser420 425 430Gly Leu Arg Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg435 440 445Leu Ser Phe Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg450 455 460Thr Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro465 470 475 480Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys485 490 495Gly Ser Pro Val Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg500 505 510Gln Trp Val Val Arg Thr Pro Pro Pro Val Asp Ser Gly Ala Gln Ser515 520 525Ser<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>11agcatcaagc cggctccccc20<210>12<211>20
<212>DNA<213>人工引物<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>12ctccattcac tccaggtccc20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>13ttgaacgtga ctgrggcctt20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述鼠MU-1 cDNA內(nèi)部寡核苷酸<400>14tgaatgaagt gcctggctga20<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5’PCR引物<400>15cacaaagctt cagtatgagc tgcagtacag gaaccgggga 40<210>16<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述3’PCR引物<400>16cacaggatcc ctttaactcc tctgactggg tctgaaagat 40<210>17<211>224<212>PRT<213>未知生物<220>
<221>未知生物<222>(1)..(224)<223>未知生物的描述包含F(xiàn)c區(qū)的第二多肽<400>17His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser1 5 10 15Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg20 25 30Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro35 40 45Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala50 55 60Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val65 70 75 80Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr85 90 95Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr100 105 110Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu115 120 125Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser145 150 155 160Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp165 170 175Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser180 185 190Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala195 200 205Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215 220<210>18<211>617<212>DNA<213>人<400>18gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc60tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc ttcttgggga cactggtcca120caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat180tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga240agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa300gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag360gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg420tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca480aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc540taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg600tattccaagt ggaggag 617<210>19<211>162<212>PRT
<213>人<400>19Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met1 5 10 15Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln20 25 30Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln35 40 45Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro50 55 60Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln65 70 75 80Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile85 90 95Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala100 105 110Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr115 120 125Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu130 135 140Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu145 150 155 160Asp Ser<210>20<211>7<212>PRT<213>人<400>20Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala1 5
<210>21<211>16<212>PRT<213>人<400>21Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ser Pro Leu His Pro1 5 10 15<210>22<211>786<212>DNA<213>人<400>22atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tgtacatttc ttacatctat60gccggcagcg gacaccacca tcatcaccac ggtagcggcg actataaaga cgatgacgat120aagggttccg gatgccccga cctcgtctgc tacaccgatt acctccagac ggtcatctgc180atcctggaaa tgtggaacct ccaccccagc acgctcaccc ttacctggca agaccagtat240gaagagctga aggacgaggc cacctcctgc agcctccaca ggtcggccca caatgccacg300catgccacct acacctgcca catggatgta ttccacttca tggccgacga cattttcagt360gtcaacatca cagaccagtc tggcaactac tcccaggagt gtggcagctt tctcctggct420gagagcatca agccggctcc ccctttcaac gtgactgtga ccttctcagg acagtataat480atctcctggc gctcagatta cgaagaccct gccttctaca tgctgaaggg caagcttcag540tatgagctgc agtacaggaa ccggggagac ccctgggctg tgagtccgag gagaaagctg600atctcagtgg actcaagaag tgtctccctc ctccccctgg agttccgcaa agactcgagc660tatgagctgc aggtgcgggc agggcccatg cctggctcct cctaccaggg gacctggagt720gaatggagtg acccggtcat ctttcagacc cagtcagagg agttaaagga aggctggaac780taatga 786<210>23<211>260<212>PRT
<213>人<400>23Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile15 10 15Ser Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gly His His His His His His Gly Ser20 25 30Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly Cys Pro Asp Leu35 40 45Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Val Ile Cys Ile Leu Glu Met50 55 60Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr65 70 75 80Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala85 90 95His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys His Met Asp Val Phe His100 105 110Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly115 120 125Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys130 135 140Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn145 150 155 160Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys165 170 175Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp180 185 190Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser Arg Ser Val195 200 205Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln210 215 220Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser225 230 235 240
Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys245 250 255Glu Gly Trp Asn260<210>24<211>1426<212>DNA<213>人<400>24gcggccgcac caccatgccg cgtggctggg ccgccccctt gctcctgctg ctgctccagg60gaggctgggg ctgccccgac ctcgtctgct acaccgatta cctccagacg gtcatctgca120tcctggaaat gtggaacctc caccccagca cgctcaccct tacctggcaa gaccagtatg180aagagctgaa ggacgaggcc acctcctgca gcctccacag gtcggcccac aatgccacgc240atgccaccta cacctgccac atggatgtat tccacttcat ggccgacgac attttcagtg300tcaacatcac agaccagtct ggcaactact cccaggagtg tggcagcttt ctcctggctg360agagcatcaa gccggctccc cctttcaacg tgactgtgac cttctcagga cagtataata420tctcctggcg ctcagattac gaagaccctg ccttctacat gctgaagggc aagcttcagt480atgagctgca gtacaggaac cggggagacc cctgggctgt gagtccgagg agaaagctga540tctcagtgga ctcaagaagt gtctccctcc tccccctgga gttccgcaaa gactcgagct600atgagctgca ggtgcgggca gggcccatgc ctggctcctc ctaccagggg acctggagtg660aatggagtga cccggtcatc tttcagaccc agtcagagga gttaaaggaa ggctggaacg720gctccggctc tagagacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg780ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga840cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca900actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt960acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg1020gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agtccccatc gagaaaacca1080
tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg1140aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg1200acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc1260ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca1320ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact1380acacgcagaa gagcctctcc ctgtccccgg gtaaatgagt gaattc 1426<210>25<211>467<212>PRT<213>人<400>25Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly1 5 10 15Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr20 25 30Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr35 40 45Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser50 55 60Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr65 70 75 80Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val85 90 95Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe100 105 110Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val115 120 125Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp130 135 140Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr145 150 155 160
Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile165 170 175Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys180 185 190Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser195 200 205Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln210 215 220Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Gly Ser Gly Ser Arg225 230 235 240Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly245 250 255Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met260 265 270Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His275 280 285Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val290 295 300His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr305 310 315 320Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly325 330 335Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile340 345 350Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 365Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395 400Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val420 425 430Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met435 440 445His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser450 455 460Pro Gly Lys465<210>26<211>1499<212>DNA<213>人<400>26gcggccgcac caccatgccg cgtggctggg ccgccccctt gctcctgctg ctgctccagg60gaggctgggg ctgccccgac ctcgtctgct acaccgatta cctccagacg gtcatctgca120tcctggaaat gtggaacctc caccccagca cgctcaccct tacctggcaa gaccagtatg180aagagctgaa ggacgaggcc acctcctgca gcctccacag gtcggcccac aatgccacgc240atgccaccta cacctgccac atggatgtat tccacttcat ggccgacgac attttcagtg300tcgacatcac agaccagtct ggcaactact cccaggagtg tggcagcttt ctcctggctg360agagcatcaa gccggctccc cctttcaacg tgactgtgac cttctcagga cagtataata420tctcctggcg ctcagattac gaagaccctg ccttctacat gctgaagggc aagcttcagt480atgagctgca gtacaggaac cggggagacc cctgggctgt gagtccgagg agaaagctga540tctcagtgga ctcaagaagt gtctccctcc tccccctgga gttccgcaaa gactcgagct600atgagctgca ggtgcgggca gggcccatgc ctggctcctc ctaccagggg acctggagtg660aatggagtga cccggtcatc tttcagaccc agtcagagga gttaaaggaa ggctggaacg720gctccggctc tagagacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaaotcctgg780ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga840cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca900
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1.一種治療、改善或預(yù)防哺乳動物患者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括給予所述患者選自以下的IL-21/IL-21R拮抗劑抗IL-21R抗體、抗IL-21抗體、抗IL-21R抗體的抗原結(jié)合片段、抗IL-21抗體的抗原結(jié)合片段和IL-21R可溶性片段，其用量足以治療、改善或預(yù)防所述疾病。
2.一種治療、改善或預(yù)防哺乳動物患者的疾病的方法，所述疾病選自關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性疾病、呼吸性疾病、皮膚炎性疾病、腸道炎性疾病、纖維變性病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植排斥和移植排斥相關(guān)疾?。凰龇椒òńo予所述患者選自以下的IL-21/IL-21R拮抗劑抗IL-21R抗體、抗IL-21抗體、抗IL-21R抗體的抗原結(jié)合片段、抗IL-21抗體的抗原結(jié)合片段和IL-21R可溶性片段，其用量足以治療、改善或預(yù)防所述疾病。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗IL-21R抗體能夠結(jié)合IL-21R，并且由與SEQ ID NO2所示序列至少具有90％同一性的氨基酸序列組成，而且其中所述IL-21R能夠結(jié)合IL-21。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述關(guān)節(jié)炎選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述關(guān)節(jié)炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述呼吸性疾病是哮喘或慢性阻塞性肺病。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述纖維變性病選自內(nèi)臟纖維化、皮膚纖維變性病、眼纖維變性病、系統(tǒng)性硬化、多肌炎、皮肌炎、嗜酸性粒細(xì)胞性筋膜炎、雷諾綜合征、腎小球腎炎和鼻息肉病。
8.權(quán)利要求3的方法，其中所述腸道炎性疾病選自炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎。
9.權(quán)利要求3的方法，其中所述皮膚炎性疾病是銀屑病。
10.權(quán)利要求3的方法，其中所述特應(yīng)性疾病選自變應(yīng)性哮喘、特應(yīng)性皮炎、蕁麻疹、濕疹、變應(yīng)性鼻炎和變應(yīng)性腸胃炎。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述特應(yīng)性疾病是變應(yīng)性哮喘。
12.權(quán)利要求3的方法，其中所述移植排斥相關(guān)疾病是移植物抗宿主病。
13.權(quán)利要求3的方法，其中所述疾病是移植排斥。
14.權(quán)利要求3的方法，其中所述疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
15.權(quán)利要求2的方法，其中所述哺乳動物患者為人。
16.權(quán)利要求2的方法，其中所述IL-21R可溶性片段由IL-21R胞外域和Fc免疫球蛋白片段組成。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述IL-21R胞外域包含SEQ ID NO2的約氨基酸1-235。
18.權(quán)利要求2的方法，其中所述IL-21R可溶性片段由與SEQ IDNO29所示序列至少具有90％同一性的氨基酸序列組成。
19.權(quán)利要求2的方法，其中所述IL-21/IL-21R拮抗劑是抗IL-21R抗體或其抗原結(jié)合片段。
20.權(quán)利要求2的方法，其中所述IL-21/IL-21R拮抗劑是抗IL-21抗體或其抗原結(jié)合片段。
21.一種融合蛋白，它由IL-21R胞外域和Fc免疫球蛋白片段組成，其中所述IL-21R的氨基酸序列與SEQ ID NO2所示序列具有至少90％同一性，而且其中所述融合蛋白能夠結(jié)合IL-21。
22.權(quán)利要求21的融合蛋白，它由與SEQ ID NO29所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列組成。
23.一種載體，它具有編碼權(quán)利要求21的融合蛋白的核苷酸序列。
24.一種重組宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求23的載體。
25.一種制備融合蛋白的方法，所述方法包括(a)在能表達(dá)所述融合蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求24的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述融合蛋白。
26.一種藥物組合物，它包含IL-21/IL-21R拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體。
27.權(quán)利要求26的藥物組合物，其中所述IL-21/IL-21R拮抗劑選自抗IL-21R抗體、抗IL-21抗體、抗IL-21R抗體的抗原結(jié)合片段、抗IL-21抗體的抗原結(jié)合片段和IL-21R可溶性片段。
28.權(quán)利要求27的藥物組合物，其中所述IL-21R可溶性片段由IL-21R胞外域和Fc免疫球蛋白片段組成。
29.一種將器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞群移植給哺乳動物患者的方法，所述方法包括如下步驟(a)給予所述患者選自以下的IL-21/IL-21R拮抗劑抗IL-21R抗體、抗IL-21抗體、抗IL-21R抗體的抗原結(jié)合片段、抗IL-21抗體的抗原結(jié)合片段和IL-21R可溶性片段，其用量足以降低移植排斥的危險；和(b)將器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞群移植給所述患者，其中所述移植步驟(b)在給藥步驟(a)之前、期間或之后進(jìn)行。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述移植的器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞群選自心臟、腎臟、肝臟、肺、胰腺、骨髓、軟骨、角膜、神經(jīng)元組織及其細(xì)胞。
31.一種治療、預(yù)防或改善哺乳動物移植受體的移植排斥的方法，所述方法包括(a)檢測移植受體的移植排斥癥狀；和(b)給予所述移植受體選自以下的IL-21/IL-21R拮抗劑抗IL-21R抗體、抗IL-21抗體、抗IL-21R抗體的抗原結(jié)合片段、抗IL-21抗體的抗原結(jié)合片段和IL-21R可溶性片段。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述移植排斥癥狀選自炎癥、器官功能減退、活檢中的排斥體征和纖維化。
全文摘要
公開了使用白介素－21(IL－21)或IL－21受體(“IL－21R”或“MU－1”)拮抗劑來抑制IL－21/IL－21受體(MU－1)活性的方法和組合物。IL－21/IL－21R拮抗劑可用于在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫抑制，例如用于治療、改善或預(yù)防自身免疫性疾病或炎性疾病，包括例如炎性腸病(IBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、移植排斥、銀屑病、哮喘、纖維化和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。
文檔編號A61K38/17GK101052419SQ200580033595
公開日2007年10月10日 申請日期2005年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月5日
發(fā)明者D·A·楊, M·科林斯, K·杜努西－約安諾普洛斯, R·M·小奧哈拉, M·T·卡塞安, M·J·懷特斯 申請人:惠氏公司