專利名稱：：免疫調節(jié)的重要調控蛋白nrbp的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，更具體的，本發(fā)明涉及一種對于免疫調節(jié)及腫瘤抑制有作用的蛋白。背錄技術免疫是指機體識別和排除抗原性異物的功能，從而維持機體的生理平衡和穩(wěn)定。正常情況下，其對機體是有利的；但在某些情況下，則對機體是有害的。體內(nèi)的免疫系統(tǒng)是一個非常復雜的系統(tǒng)，免疫機制的正常與否與細胞的信號通道、基因轉錄等多種機制相關。當體內(nèi)的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生異常時，往往會引發(fā)多種多樣的疾病。因此，維持體內(nèi)免疫系統(tǒng)的正常運行是非常重要的。癌癥在人類疾病中是僅次于心血管系統(tǒng)疾病的第二大死亡原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織2003年報告，目前每年新增癌癥患者1000萬人，死亡約700萬人。與1990年相比，全球癌癥患者的發(fā)病率增長了19%,死亡率增長了1狄。因此，發(fā)展抗癌藥物一直是生物醫(yī)藥企業(yè)爭相競爭的陣地。然而由于缺乏完整的藥物開發(fā)平臺和研發(fā)體系等原因，許多生物醫(yī)藥企業(yè)在新藥的開發(fā)上存在很大的困難。因此，需要進一步找到完全鑒定的、新的藥物靶點基因，才能開發(fā)出對于腫瘤的治療有效的新藥。細胞信號轉導是指細胞通過位于胞膜或胞內(nèi)的受體，感受細胞外信息分子的刺激，經(jīng)復雜的細胞內(nèi)信號轉導系統(tǒng)的轉換，發(fā)揮生物學效應，進而幾乎調節(jié)著生命活動的所有過程，包括細胞的增殖、發(fā)育和分化，神經(jīng)活動，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發(fā)生等。人類很多疾病包括癌癥的發(fā)生都與信號轉導通路密切相關，目前許多科學家通過研究蛋白之間的相互作用來揭示信號傳遞通路的關鍵過程，其中一類無酶活性的蛋白-接頭蛋白能夠使一些調節(jié)蛋白聚集起來形成多蛋白信號復合物，以調節(jié)信號通路的傳遞。因此確切了解細胞信號通路，特別是細胞通路中一些重要的接頭蛋白的作用機制，將為腫瘤的免疫治療等提供有力的理論依據(jù)，設計和開發(fā)以重要蛋白為靶點的新藥，通過調節(jié)、控制信號轉導通路治療疾病，無疑是一種針對性強、高效的理想途徑，具有治療腫瘤的潛在前景。NRBP是一個新發(fā)現(xiàn)的接頭蛋白，大約59.8kD，廣泛存在于哺乳動物正常組織中，如心臟、腦、肺、肝、腎、脾、骨骼肌肉、前列腺、卵巢等，其中睪丸及胎盤中表達量最高。NRBP的編碼基因主要位于人類染色體2p23區(qū)域，轉錄產(chǎn)物大小約2.4kb，很多研究證明染色體2p23區(qū)域或其鄰帶的易位可能與血液失調、惡性腫瘤有關。NRBP含有多個結構域l)核受體結合域(LXXLL);2)與含SH2domain蛋白結合的結構域；3)激酶樣結構域；4)核定位信號；5)三個富含谷氨酸，絲氨酸，脯氨酸和蘇氨酸殘基(PEST)的序列。已有的研究發(fā)現(xiàn)，它與骨髄白血病因子(MLF1)相互作用，介導MLF1的磷酸化，進而影響MLF1的細胞定位及活性；它又與激活狀態(tài)的Rho家族成員-Racl共定位于細胞膜邊緣和片狀偽足(lamellipodia)，與內(nèi)質網(wǎng)向髙爾基的蛋白運輸過程有關。目前對NRBP在細胞信號通路中的其它功能機制還不了解，但作為接頭蛋白，它在組織中的廣泛分布預示其可能與很多轉錄因子作用，將不同的細胞信號通路聯(lián)系在一起。JaM(c-Jun激活區(qū)域結合蛋白-l;c-Junactivationdomainbindingprotein1)足C0P9復合物的亞基，又被稱為CSN5。它能夠與C-Jtm的激活區(qū)域結合，并增加C-Jim或JunD與特定AP-l轉錄因子結合位點形成的復合物的穩(wěn)定性，進而激活AP-1的轉錄活性。C0P9復合物大小約為450KD，其核心部分含有8個亞基，每個亞基在許多物種間都是髙度保守的。C0P9復合物在植物和動物的發(fā)育過程中均起著非常重要的作用，它是植物光控發(fā)育的抑制因子，在果蠅中—些亞基的突變也會導致發(fā)育停滯等現(xiàn)象。Jabl能夠與許多蛋白結合并影響它們的功能，它在多個細胞信號通路中都發(fā)揮作用，包括調節(jié)基因轉錄、細胞周期及通過磷酸化使蛋白降解等如Jabl是CDK抑制劑p27Kipl的負調控因子，引起p27Kipl的降解，促進細胞增殖及分裂，對腫瘤的發(fā)生有一定的促動作用；與腫瘤抑制蛋白p53結合，誘導其被COP9復合物磷酸化并降解；與組織缺氧誘導因子HIF-lci結合，增強其穩(wěn)定性，進而在組織缺氧的條件下，增加了HIF-1a的主要調節(jié)蛋白-微管上皮生長因子的表達；一些調控細胞生長、調亡的氧化酶，如巨噬細胞遷移抑制因子-MIF、硫氧還蛋白(Thioredoxin)等也與Jabl相互作用，并通過負調控Jabl的功能控制腫瘤的發(fā)生。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，在人的垂體腫瘤、卵巢上皮腫瘤、淋巴瘤等中，Jabl的表達均有很大程度的提高，由此提示惡性腫瘤的增加是由Jabl過量表達引起的多效性表型導致的，如p27水平的降低、AP-1轉錄活性的激活及CSN介導的不同轉錄調節(jié)因子的磷酸化。因此可見Jabl在人類腫瘤發(fā)生過程中起重要的作用，對Jabl的控制將是腫瘤臨床治療的新靶點。Haxl(HSl結合蛋白,HS1bindingprotein)大約35kD，因能夠與HS1(造血系細胞特異性蛋白l;Hematopoieticlineagecellspecificproteinl)結合而命名，HS1主要表達于造血系和淋巴細胞，是Src家族酪氨酸激酶(Lyn，Blk，Lck)和激酶Syk/Zap-70的底物，在抗原受體誘導的T細胞和B細胞的增殖及調亡的信號通路中起著重要的作用。HSl在B細胞和T細胞激活和造血系細胞的凋亡有關。目前，本領域迫切需要開發(fā)藉由調節(jié)免疫相關因子和腫瘤相關因子的活性而具有調節(jié)免疫和抑制腫瘤效果的藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種NRBP蛋白或其激動劑或拮抗劑的用途，用于制備調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物。本發(fā)明的目的還在于提供一種篩選調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種NRBP蛋白或其激動劑或拮抗劑的用途用于制備(i)調節(jié)免疫的藥物；或在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的NRBP蛋白選自(a)NRBP全長蛋白或(b)含有NRBP全長蛋白中第l-的位氨基酸的NRBP蛋白片段。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的調節(jié)免疫為調節(jié)淋巴細胞的活化。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的調節(jié)淋巴細胞的活化為抑制淋巴細胞的活化。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的淋巴細胞選自T淋巴細胞、或B淋巴細胞。在本發(fā)明的第二方面，提供一種NRBP蛋白的用途，用于篩選調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物。在本發(fā)明的第三方面，提供一種篩選調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物的方法，包括步驟(a)在測試組中，向NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用的反應體系中添加待篩選的候選物，并檢測NRBP蛋白與Jabl蛋白的相互作用情況；(b)將步驟(a)測試組中NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用情況與未添加候選物的對照組中NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用情況進行比較；如果測試組中NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用在統(tǒng)計學上強于對照組(優(yōu)選顯著強于；更優(yōu)選測試組中NRBP蛋白與Jabl蛋白的相互作用比對照組強2096或更強；最優(yōu)選的測試組中NRBP蛋白與Jabl蛋白的相互作用比對照組強40劣或更強)，就表明該候選物是調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用的反應體系為含有NRBP蛋白與Jabl蛋白的溶液；或含有NRBP蛋白與Jabl蛋白的細胞。在另一方面，本發(fā)明還提供一種篩選調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物的方法，包括步驟(a)在測試組中，向NRBP蛋白與Haxl蛋白相互作用的反應體系中添加待篩選的候選物，并檢測NRBP蛋白與Haxl蛋白的相互作用情況；(b)將步驟(a)測試組中NRBP蛋白與Haxl蛋白相互作用情況與未添加候選物的對照組中NRBP蛋白與Haxl蛋白相互作用情況進行比較；如果測試組中NRBP蛋白與Haxl蛋白相互作用在統(tǒng)計學上強于對照組(優(yōu)選顯著強于；更優(yōu)選測試組中NRBP蛋白與Haxl蛋白的相互作用比對照組強2(^或.更強；最優(yōu)選的測試組中NRBP蛋白與Haxl蛋白的相互作用比對照組強4096或更強).，就表明該候選物是調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的NRBP蛋白與Haxl蛋白相互作用的反應體系為含WNRBP蛋白與Haxl蛋白的溶液、或含有NRBP蛋白與Haxl蛋白的細胞。在本發(fā)明的第四方面，提供一種用所述的方法獲得的調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物。在本發(fā)明的第五方面，提供一種藥物組合物，含有0.0001-20wt。/。的NRBP蛋白或其激動劑或拮抗劑，以及藥學上可接受的載體。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了在293T細胞中，通過免疫共沉淀試驗驗證NRBP與Haxl的相互作用；證明在293細胞中瞬時轉染的NRBP及Haxl能夠相互作用。圖2顯示了在293T細胞中，通過免疫共沉淀試驗驗證NRBP和Jabl的相互作用；證明在293細胞中瞬時轉染的NRBP及Jabl能夠相互作用。圖3顯示了293T細胞中，通過免疫共沉淀試驗驗證外源的NRBP和內(nèi)源的Jabl的相互作用；證明外源的NRBP與293T細胞中內(nèi)源的Jabl存在相互作用。圖4顯示了NRBP能夠抑制由Jabl介導的AP-l報告基因的激活。圖5顯示了NRBP能夠抑制TCR介導的NFAT轉錄因子的激活。圖6顯示了NRBP各截短體的結構示意圖。圖7顯示了NRBP及其截短體在293T細胞中的表達。圖8顯示了NRBP的N端l-99Aa能夠抑制TCR介導的NFAT轉錄因子的激活。圖9顯示了NRBP的N端1-99Aa能夠抑制TCR及PMA介導的AP-l轉錄因子的激活。具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和試驗，首次發(fā)現(xiàn)核受體結合蛋白(NRBP蛋白)能夠與Haxl(HSl相關蛋白，HSl-associatingproteinX-l)和Jabl(c-Jun激活區(qū)域結合蛋白-l;c-Junactivationdomainbindingprotein-l)相互作用，進一步的研究還證實，NRBP蛋白還能夠抑制活化蛋白-1(AP-1)的活化以及抑制活化T細胞核因子(NuclearFactorofActivatedTcells,NFAT)的活化。因此證實NRBP蛋白是一種對于免疫調節(jié)以及腫瘤抑制有用的物質?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。本發(fā)明人利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以NRBP作為誘佴對Hela、淋巴組織文庫進行了大規(guī)模篩選，分別獲得了Jabl和Haxl的陽性克隆，從而證實了NRBP與Jabl及Haxl之間存在相互作用。隨后，通過免疫共沉淀實驗，進一步在哺乳動物中驗證NRBP與Jabl及Haxl的作用關系。并且，本發(fā)明人利用了以熒光素酶作為報告基因的檢測哺乳動物細胞AP-l活性的篩選平臺以及以熒光素酶作為報告基因的檢測哺乳動物細胞NFAT活性的篩選平臺，證明NRBP全長蛋白或其活性片段(其中含有NRBP全長蛋白的第l-99位氨基酸)對于信號傳導通路有明顯的影響作用。NRBP能夠抑制TCR(T細胞受體)介導的NFAT的激活，提示NRBP在免疫調節(jié)，特別是淋巴細胞的活化等途徑中起作用。并且NRBP能夠負調控Jabl的功能，且在極大程度上抑制由Jabl引起的AP-1報告基因的激活。因此可見NRBP作為Jabl信號通路的負調控因子，對高表達Jabl的腫瘤發(fā)生具有調節(jié)作用。對NRBP的深入研究，將為開發(fā)出治療腫瘤及免疫疾病的新的藥物靶點帶來突破性進展。在本發(fā)明中，所述的腫瘤優(yōu)選為Jabl過量表達的腫瘤。更優(yōu)選的，所述的腫瘤包括但不限于垂體腫瘤、卵巢上皮腫瘤、淋巴瘤、募咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、或肺癌等。本發(fā)明提供了一種NRBP蛋白或其激動劑或拮抗劑的用途，用于制備(i)調節(jié)免疫的藥物；或(ii)抑制腫瘤的藥物。所述的NRBP蛋白可以施用于個體，從而達到調節(jié)免疫或抑制腫瘤的目的。所述的個體為免疫異常或腫瘤患者。更優(yōu)選的，所述的免疫異常為淋巴細胞(包括T淋巴細胞和B淋巴細胞)的過度活化；或者，所述的腫瘤為由Jab過量表達引起的腫瘤。NRBP是一種接頭蛋白，大約59.8kD,廣泛存在于哺乳動物(如人)的正常組織中，如心臟、腦、肺、肝、腎、脾、骨骼肌肉、前列腺、卵巢等。在本發(fā)明中，所用的NRBP蛋白可以是天然存在的，比如其可被純化和分離自哺乳動物。優(yōu)選的，所述天然存在的NRBP的氨基酸序列可以與GenBank登錄號NPJ)37524所示的序列基本上相同。此外，所述的NRBP蛋白也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因重組技術來生產(chǎn)重組的NRBP蛋白。優(yōu)選的，本發(fā)明采用重組的NRBP蛋白。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的NRBP蛋白，比如，可采用為了促進其半衰期、有效性、代謝、和域蛋白的效力而加以修飾或改良的NRBP蛋白。比如所述經(jīng)過修飾或改良的NRBP蛋白可以是一種NRBP蛋白的共軛物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述經(jīng)過修飾或改良的NRBP蛋白可以是天然存在的NRBP蛋白的活性片段，但也具有調節(jié)免疫或抑制腫瘤的效果，且不會帶來其它不良影響或毒性。也就是說，任何不影響NRBP蛋白的生物活性的變化形式都可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明一種方式中，可將所述的NRBP蛋白直接施用于哺乳動物(比如人)，或者，可將編碼NRBP蛋白的基因通過常規(guī)的方法克隆到適當?shù)妮d體中，將所述的載體導入到可表達所述NRBP蛋白的細胞中，使所述的細胞表達NRBP蛋白。可通過將適量的所述細胞引入到所需治療的靶點，以實現(xiàn)體內(nèi)NRBP蛋白的表達?；诒景l(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，NRBP蛋白與Jabl蛋白或者NRBP蛋白與Haxl蛋白相互作用的研究有著多方面的用途，所述的用途包括(但不限于)篩選調節(jié)(促進或抑制)NRBP蛋白與Jabl蛋白或者NRBP蛋白與Haxl蛋白相互作用的調節(jié)劑(促進劑或抑制劑)、從而用于制備調節(jié)免疫(如抑制淋巴細胞的活化)、抑制腫瘤的藥物等。本發(fā)明還提供了一種篩選調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物的方法，通過向NRBP蛋白與Jabl蛋白(或NRBP蛋白與Haxl蛋白)相互作用的反應體系中添加待篩選的候選物，并觀察NRBP蛋白與Jabl蛋白(或NRBP蛋白與Haxl蛋白)的相互作用情況來進行篩選。如果在加入候選物后，NRBP蛋白與Jabl蛋白(或NRBP蛋白與Haxl蛋白)的相互作用在統(tǒng)計學上強于對照組，就表明該候選物是對于調節(jié)免疫或抑制腫瘤有用的藥物。這些初步篩選出的物質可構成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠對于調節(jié)免疫、抑制腫瘤有用的藥物。所述的NRBP蛋白與Jabl或者NRBP蛋白與Haxl相互作用的促進劑或抑制劑，可以施用于個體，調節(jié)細胞的凋亡。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下給藥。本發(fā)明還提供了一種組合物(如藥物組合物)，它含有安全有效量的(a)NRBP蛋白，以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。這些組合物可以用于調節(jié)免疫、或抑制腫瘤。本發(fā)明還提供了一種組合物(如藥物組合物)，它含有安全有效量的(a)調節(jié)NRBP蛋白與Jabl或者NRBP蛋白與Haxl相互作用的調節(jié)劑(如促進劑)，以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。這些組合物可以用于調節(jié)免疫、或抑制通常，這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。目前，已知DNA序列，將該目的DNA序列引入到各種已知DNA分子(如載體)和細胞中是本領域中的常規(guī)技術，一般人員只要根據(jù)本發(fā)明的提示，都可以方便的進行操作。此外，將各種形式的突變引入到各種DNA分子中也是本領域熟知的技術。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞也是本領域技術人員熟知的常規(guī)技術。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知?？晒┻x擇的是用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達目的多肽。在本發(fā)明中，檢測蛋白與蛋白之間相互作用以及相互作用的強弱可采用多種本領域技術人員熟知的技術，比如GST沉降技術、噬菌體展示技術、酵母雙雜交系統(tǒng)或免疫共沉淀技術。其中，酵母雙雜交是一種大規(guī)?？焖傺芯康鞍?蛋白間相互作用的方法，具有簡單、穩(wěn)定的優(yōu)點。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，釆用了酵母雙雜交系統(tǒng)來篩選與NRBP蛋白相互作用的蛋白。更具體的，在酵母細胞中，一種與DNA-結構域融合的誘餌蛋白與一種與活化域融合的獵物蛋白相互作用，所述獵物蛋白可以是已知的，也可以是從cDNA文庫中選出來的。相互作用的成對分子結合于專一的序列模式，從而活化兩個獨立的報道基因的轉錄。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，采用免疫沉淀技術來驗證蛋白與蛋白之間的特異性相互作用。所述的免疫共沉淀技術的原理是在保持蛋白-蛋白相互作用的條件下，收獲和裂解細胞，從細胞提取液中特異性地免疫沉淀目的蛋白，然后通過電泳等方法分離免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗該蛋白的抗體，通過比如Western印跡來檢測。此外，如果細胞在裂解前已經(jīng)用標記物進行過標記，則可通過放射自顯影或其它免疫學技術來觀察共沉淀的蛋白。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于本發(fā)明首次證明NRBP蛋白能夠與Haxl蛋白和Jabl蛋白相互作用，以及能夠抑制AP-1的活化和抑制NFAT的活化，從而證實NRBP蛋白是一種對于免疫調節(jié)以及腫瘤抑制有用的物質。本發(fā)明為人們開發(fā)治療腫瘤及免疫疾病的新藥物靶點,了新的途徑。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例lNRBP基因的獲得應用PCR技術，通過下面的引物，在人的JurkatcDNA文庫(購自Clonetech公司)中獲得大約1.6kb的DNA片段，回收PCR產(chǎn)物，并連接到T-easy載體(購自Promega公司)中。.正向引物(SEQIDNO:1):5，敘cc朋tcc敘ccatgtcggagggggagtcccagacagtac3，反向引物(SEQIDNO:2):5，欲c""朋從ccctaagaggagacggtgacagcggcggctga3，其中斜體部分是為了下游克隆方便而使用的5^'I酶切接頭序列。經(jīng)測序，獲得一個1608bp的片段，進行Blast序列對比后，確認該片段為NRBP的開放閱讀框(ORF)部分的序列。實施例2酵母雙雜交篩選與NRBP相互作用的蛋白如實施例1所述的方法用PCR技術獲得NRBP基因全長，通過SfiI克隆位點穿梭轉移到與含有BD功能的改造過的融合質粒pGBKT7-BD載體(pGBKT7-BD載體購自Clontech公司，在其多克隆位點中添加了SfiI酶切位點)相連作為誘餌，通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選冊LAcDNA文庫(購自Clonetech公司)和淋巴細胞cDNA文庫(購自Clonetech公司)，得到的陽性克隆進行測序鑒定，分別是Jabl和Haxl，其中得到Jabl韻兩個克隆。用常規(guī)PCR技術獲得J廟l和Haxl基因全長(Jabl:GenBank登錄號，NM_006837;Haxl，GenBank登錄號，NM_006118)，分別通過Sfil克隆位點穿梭轉移到與含有AD功能的改造過的融合質粒pGADT7-AD(pGADT7-AD質粒購自Clontech公司，在其多克隆位點中添加了SfiI酶切位點)連接；同上將NRBP基因與pGBKT7-BD載體連接，然后共轉染酵母細胞Y190(購自Clonetech公司)。實驗結果證實，在酵母雙雜交體系中，NRBP可分別與Jabl、Haxl發(fā)生相互作用。實施例3在哺乳動物細胞中驗證NRBP與Haxl的相互作用用PCR技術獲得NRBP及Haxl基因全長，通過Sfil克隆位點將它們分別與含F(xiàn)lag、HA等tag的改造過的真核表達載體pCDEF(pCDEF質粒購自Clontech，所述的改造為用常規(guī)方法在pCDEF的多克隆位點中添加Sfil位點)連接，得到的質粒用磷酸鈣法共轉染哺乳動物293T細胞(購自ATCC)，24小時后，破碎細胞，收集裂解液上清，用抗Flag、HAtag的抗體(anti-Flag、anti-HA;購自Roche公司)確定它們是否共沉淀。免疫沉淀(IP)的結果見圖1。本發(fā)明人的實驗結果證明，在293細胞中瞬時轉染的NRBP及Haxl能夠相互作用。由于Haxl本身能夠與HSl發(fā)生結合，而NRBP能夠與Haxl相互作用，因而NRBP在一定程度上抑制了Haxl與HSl的結合。并且，由于HS1主要表達于造血系和淋巴細胞且在抗原受體介導的細胞(T細胞和B細胞)增殖及調亡信號通路中起著重要的作用，缺失HS1蛋白的淋巴細胞能夠阻抗抗原受體誘導的調亡，因此可知NRBP能夠間接調節(jié)HS1參與的細胞增殖及凋亡的信號通路，即NRBP具有調節(jié)免疫系統(tǒng)的功能(主要是抑制免疫)。實施例4在喻乳動物細胞中驗證NRBP與Jabl的相互作用1.在哺乳動物細胞中，外源的NRBP與Jabl存在相互作用用常規(guī)的PCR技術獲得NRBP及Jabl基因全長，通過Sfil克隆位點將它們分別與含F(xiàn)lag、HAtag的改造過的真核表達載體pCDEF(其中含SfiI位點)中，得到的質粒用磷酸鈣法共轉染哺乳,293T細胞，24小時后，破碎細胞，收集裂解液上清，采用抗Flag、HAtag的抗體(anti-Flag、anti-HA)確定它們是有否共沉淀。免疫共沉淀實驗結果見圖2。本發(fā)朋人的實驗結果證明，在293細胞中瞬時轉染的NRBP及Jabl能夠相互作用。2.在哺乳動物細胞中，外源的NRBP與內(nèi)源的Jabl存在相互作用為進一步證明NRBP及Jabl能夠相互作用，本發(fā)明人用磷酸鈣法將含有Flag-taggedNRBP的載體轉染至哺乳動物293T細胞，24小時后，破碎細胞，收集裂解液上清，先用鼠的IgG抗體(購自santacruz公司)免疫沉淀，與珠(beads)結合的沉淀作為對照，同時取免疫沉淀后的上清并加入Jabl的抗體(anti-Jabl;購自santacruz公司)再進行免疫沉淀，確定外源的NRBP與內(nèi)源的Jabl是否相互作用。免疫沉淀的結果見圖3。結果表明，外源的NRBP與293T細胞中內(nèi)源的Jabl存在相互作用。由于Jabl能夠與許多蛋白結合并影響它們的功能，在多個細胞信號通路中都發(fā)揮作用，包括調節(jié)基因轉錄、細胞周期及通過磷酸化使蛋白降解等，因此可見NRBP能夠負調控Jabl介導的基因轉錄、細胞周期及通過磷酸化使蛋白降解等途徑。并且，由于在許多腫瘤(如垂體腫瘤、卵巢上皮腫瘤、淋巴瘤等)中都發(fā)現(xiàn)Jabl的表達有很大程度的提髙，因此NRBP可it過與Jabl結合，來抑制Jabl的功能，從而達到抑制腫瘤的目的。實施例5NRBP對AP-1信號通路的影響本發(fā)明人將AP-l報告基因質粒(pAP-l-Luc，購自Clonetech公司)轉入哺乳動物細胞后，熒光素酶的表達及活性就會依賴于細胞內(nèi)AP-1轉錄因子的激活或抑制。選用JurkatT細胞株(購自美國ATCC)，建立了應用熒光素酶作為報告基因檢測哺乳動物細胞AP-l活性的篩選平臺，利用報告基因與銜基因共轉染途徑，檢測報告基因熒光素酶活性，以發(fā)現(xiàn)對篩選通路有影響的功能基因，發(fā)現(xiàn)與腫瘤及自身免疫病的相關基因。其中熒光素酶的褎達及活性就會依賴于細胞內(nèi)AP-1轉錄因子的激活或抑制。首先用PCR技術分別獲得NRBP及Jabl等基因的全長，PCR產(chǎn)物回收后進行酶切，再與真核表達載體pCDEF(含SfiI位點)連接，獲得含NRBP或Jabl等基因的重組pCDEF質粒，利用電擊法，將構建好的質粒按一定比例轉染進入JurkatT細胞，48小時后加入1XPBLbuffer裂解液裂解，生物發(fā)光檢測儀上檢測報告基因活性。結果見圖4。結果顯示，NRBP能夠抑制由Jabl引起的AP-l報告基因的激活，并且根據(jù)其轉染的濃度的不同抑制程度也不同(濃度越大，抑制程度越大)，由此可知NRBP是Jabl功能的負調控蛋白。并且，由于AP-1可激活許多與免疫相關的基因的表達，從而可知NRBP可通過抑制AP-1的功能來調節(jié)免疫(為免疫抑制)。實施例6NRBP對NFAT信號通路的影響本發(fā)明人將NFAT報告基因質粒(pNFAT-Luc，購自Stratagene)轉入哺乳動物細胞后，熒光素酶的表達及活性就會依賴于細胞內(nèi)NFAT轉錄因子的激活或抑制。選用JurkatT細胞株(購自美國ATCC),建立了應用熒光素酶作為報告基因檢測哺乳動物細胞NFAT活性的篩選平臺，利用報告基因與耙基因共轉染途徑，檢測報告基因熒光素酶活性，以發(fā)現(xiàn)對篩選通路有影響的功能基因，發(fā)現(xiàn)與腫瘤及自身免疫病的相關基因。其中熒光素酶的表達及活性就會依賴于細胞內(nèi)NFAT轉錄因子的激活或抑制。利用電擊法，將構建好的質粒(同實施例5)按一定比例轉染進入JurkatT細胞，40小時后分別加入抗T細胞抗原受體的抗體(anti-TCR，購自Pharmingen，或可獲自ATCC)孵育8小時-IO小時，加入1XPBLbuffer裂解液裂解，生物發(fā)光檢測儀上檢測報告基因活性。結果見圖5。結果顯示，NRBP能夠抑制TCR介導的NFAT轉錄因子的激活，與對照相比，其可以抑制599b由TCR誘導的NFAT轉錄因子的活性。NFAT在免疫反應中對誘導基因轉錄起重要作用。NFAT蛋白在T細胞及其它類型的免疫細胞中如B細胞、NK細胞、肥大細胞、單核細胞和碓酸性粒細胞上表達。NFAT蛋白因那些與Ca2+動員連接受體的激活而被活化，如T和B細胞的抗原識別受體、肥大細胞和嗜堿性粒細胞的FceR等。由于NRBP能夠抑制NFAT的活化，因此可見其具有調節(jié)免疫系統(tǒng)的功能(為免疫抑制)。實施例7NRBP截短體的構建為了更進一步的研究NRBP的功能，本發(fā)明人應用PCR技術，通過下面的引物，構建了NRBP的四個截短體。全長正向引物(SEQIDNO:3):5，ggcc加tecggccatgtcggagggggagtcccagacagtac3，；全長反向引物(SEQIDNO:4):5,ggccteto。ggccctaagaggagacggtgacagcggcggctga3，；D1正向引物(SEQIDNO:5):5'ggccflfl/ccggrcgaggtacagttctctgaacgcaag3，；D2反向引物(SEQIDNO:6〉5'ggc"c/aaggccctatgtcagaggatagatcccattcctg3';D3正向引物(SEQIDNO:7):5，ggcc加化cggccgcattgtttgaagtgccctcgctc3，；D4反向引物(SEQIDNO:8):5，ggccfcfaaggccctgtacctcattccacacaac3'o其中斜體部分是為了下游克隆方便而使用的S/j'I酶切接頭序列。經(jīng)測序，分別獲得四個片段，并通過5^'I酶切位點構建到改造過的含F(xiàn)lagtag的真核表達載體pCDEF中，經(jīng)Blast序列對比后，證明序列正確。所構建的各截短體結構如表1或圖6所示。表l各截短體結構<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>其中，根據(jù)分析，1-99Aa為SH2domain蛋白結合的結構域，能夠介導信號通路中的一些蛋白，從而影響信號通路。本發(fā)明人將上述質粒用磷酸鈣法轉染哺乳動物293T細胞，24小時后，破碎細胞，收集裂解液上清，采用抗Flagtag的抗體(anti-Flag)來確定它們是否有表達。結果顯示，各截短體在哺乳細胞中可以得到很好的表達，具體見圖7。實施例8NRBP各截短體對NFAT及AP-1信號通路的影響本發(fā)明人選用JurkatT細胞株，建立了應用熒光素酶作為報告基因檢測哺乳動物細胞NFAT及AP-l活性的篩選平臺(同實施例5，實施例6)。利用電擊法，將構建好的質粒(見實施例7)按一定比例轉染進入JurkatT細胞，40小時后分別加入anti-TCR，或者PMA(佛波醇乙酯(PhorbolMyristateAcetate),—種小分子化學藥物)，孵育8小時-IO小時，加入1XPBLbuffer裂解液裂解，生物發(fā)光檢測儀上檢測報告基因活性。結果顯示，含有NRBP的N端l-99Aa部分的截短體D2、D4及全長均在不同程度上抑制TCR介導的NFAT及AP-1轉錄因子的激活，及PMA介導的AP-1轉錄因子的激活；而不含有這一部分的截短體D1、D3不具有這種抑制作用。結果見表2、圖8及圖9。因此可見，NRBP的N端l-99Aa能夠抑制TCR介導的NFAT及AP-l轉錄因子的激活，并能夠抑制PMA介導的AP-1轉錄因子的激活。表2NRBP及—其截短體對FAT及AP-l報告基因活性的影響總結<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例9篩選抑制腫痛的藥物1.采用酵母雙雜交技術的藥物篩選反應體系為如實施例2所述的方法建立酵母雙雜交系統(tǒng)，將Jabl基因與酵母雙雜交系統(tǒng)中含有AD功能域的載體連接；將NRBP基因與酵母雙雜交系統(tǒng)中含有BD功能域的載體連接，然后共轉染酵母細胞Y190。設立對照組添加待篩選的候選物的NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用的反應體系。設立對照組未添加待篩選的候選物的NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用的反應體系。觀察酵母細胞中NRBP可分別與Jabl發(fā)生相互作用的情況。將添加候選物的測試組中NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用情況與未添加候選物的對照組中NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用情況進行比較；如果測試組中NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用在統(tǒng)計學上強于對照組(比如比對照組強30%)，就表明該候選物是抑制腫瘤的藥物。2.采用免疫共沉淀技術的藥物篩選反應體系為如實施例4所述的方法建立的驗證外源的NRBP與Jabl的相互作用的免疫共沉淀系統(tǒng)。設立測試組添加待篩選的候選物的NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用的反應體系。設立對照組未添加待篩選的候選物的NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用的反應體系。將添加候選物的測試組中NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用情況與未添加候選物的對照組中NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用情況進行比較；如果測試組中NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用在統(tǒng)計學上強于對照組(比如比對照組強30。/c0,就表明該候選物是抑制腫瘤的藥物。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海眘星基因技術有限公司<120>免疫調節(jié)的重要調控蛋白NRBP<130>054237<160>8<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature<223>引物<400>1ggccaatccggccatgtcggagggggagtcccagacagtac41<210>2<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature<223>引物<400>2ggcctctaaggccct卿aggagacggtgacagcggcggctga43<210>3<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>3ggccaatccggccatgtcggagggggagtcccagacagtac41<210>4<211>43<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400>4ggcctctaaggccctaagaggagacggtgacagcggcggctga43<210>5<211>37<2.12>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400>5ggccaatccggccg鄉(xiāng)tacagttctctgaacgc鄉(xiāng)37<210>6<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400>6ggcctctaaggccctatgtcagaggatagatcccattcctg41<210>7<211>37<212>DNA<213〉人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>7ggccaatccggccgcattgtttg助gtgccctcgctc37<210>8<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>邁isc—feature<223>引物<400>8ggcctct助ggccctgtacctcattccacacaac3權利要求1.一種NRBP蛋白或其激動劑或拮抗劑的用途，其特征在于，用于制備(i)調節(jié)免疫的藥物；或(ii)抑制腫瘤的藥物。2.如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述的NRBP蛋白選自(a)NRBP全長蛋白；或(b)含有NRBP全長蛋白中第1-99位氨基酸的NRBP蛋白片段。3.如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述的調節(jié)免疫為調節(jié)淋巴細胞的活化。4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的調節(jié)淋巴細胞的活化為抑制淋巴細胞的活化。5.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的淋巴細胞選自T淋巴細胞、或B淋巴細胞。6.—種NRBP蛋白的用途，其特征在于，所述的NRBP蛋白用于篩選調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物。7.—種篩選調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物的方法，其特征在于，包括步驟(a)在測試組中，向NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用的反應體系中添加待篩選的候選物，并檢測NRBP蛋白與Jabl蛋白的相互作用情況；(b)將步驟(a)測試組中NRBP蛋白與Jab1蛋白相互作用情況與未添加候選物的對照組中NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用情況進行比較；如果測試組中NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用在統(tǒng)計學上強于對照組，就表明該候選物是調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物。8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的NRBP蛋白與Jabl蛋白相互作用的反應體系為含有NRBP蛋白與Jabl蛋白的溶液；或含有NRBP蛋白與Jabl蛋白的細胞。9.一種用權利要求7所述的方法獲得的調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物。10.—種藥物組合物，其特征在于，含有0.0001-20wt。/。的NRBP蛋白或其激動劑或拮抗劑，以及藥學上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，公開了一種NRBP蛋白或其激動劑或拮抗劑的用途，用于制備調節(jié)免疫的藥物或抑制腫瘤的藥物。本發(fā)明還公開了一種篩選調節(jié)免疫或抑制腫瘤的藥物的方法。本發(fā)明首次證明NRBP蛋白能夠與Hax1和Jab1相互作用，以及能夠抑制AP-1的活化和抑制NFAT的活化，從而證實NRBP蛋白是一種對于免疫調節(jié)以及腫瘤抑制有用的物質。本發(fā)明為開發(fā)治療腫瘤及免疫疾病的新藥物靶點提供了新的途徑。文檔編號A61P37/02GK101112614SQ200610029329公開日2008年1月30日申請日期2006年7月25日優(yōu)先權日2006年7月25日發(fā)明者駿吳,孫筱清,暉王,楹羅申請人:上海睿星基因技術有限公司