專利名稱：阿糖胞苷與腺相關(guān)病毒的復(fù)合制劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種新的基因治療復(fù)合制劑及其用途和使用方法。
技術(shù)背景腺相關(guān)病毒簡(jiǎn)稱AAV，屬于細(xì)小病毒科，是一種線性單鏈DNA病毒，外包二十面 體衣殼蛋白，直徑20nm,是動(dòng)物病毒中最小的一種。可分多種不同的血清型，其中 AAV2是基因治療中最常用的--種。AAV病毒具有如下特性第--，AAV無明顯致病性。 據(jù)報(bào)道，盡管人群中8W的個(gè)體呈現(xiàn)AAV血清陽性，但未見其與任何一種疾病有明顯 相關(guān)性。第二， AAV是一種缺陷型病毒，不能獨(dú)立復(fù)制。在無輔助病毒(如腺病毒、 皰疹病毒等)感染時(shí)，AAV呈"潛伏"狀態(tài)。第三，位點(diǎn)特異性整合。MV是唯一一 種以位點(diǎn)特異性的方式整合在人類染色體上的真核病毒，現(xiàn)已明確整合位點(diǎn)為19號(hào) 染色體長(zhǎng)臂。機(jī)理尚不清楚，可能與病毒的ITRs和r印蛋白有關(guān)。第四，宿主范圍廣。 AAV可感染多種類型的組織和細(xì)胞，不僅可感染分裂期細(xì)胞，對(duì)非分裂期細(xì)胞(如神 經(jīng)元、肌細(xì)胞、造血干細(xì)胞等)也較敏感。第五，用于基因治療的AAV載體為重組AAV (稱rAAV)，由于MV的基因組容量較小，約5kb，其中ITR是AAV包裝必須的?；?治療用rAAV載體只保留了ITR，去除了腺相關(guān)病毒所有的編碼基因，給外源基因約 4. 7kb的容量。故當(dāng)重組的腺相關(guān)病毒感染細(xì)胞后僅有所攜帶的外源基因表達(dá)，不伴 隨任何病毒基因表達(dá)，免疫原性很弱，幾乎不引起免疫排斥反應(yīng)。第六，能介導(dǎo)治 療基因較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)。因此，被認(rèn)為是遺傳性疾病較好的基因傳遞載體。目前 國際上有38個(gè)方案使用rAAV作為載體。但是，單獨(dú)使用rAAV時(shí)，其感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不高，表現(xiàn)在rAAV感染后治療基因 開始表達(dá)的時(shí)間較晚、表達(dá)水平較低，故治療效果不夠理想，故目前仍然是基因治 療臨床試驗(yàn)中應(yīng)用較少的一種病毒載體。由于rAAV具有其他病毒載體不具備的優(yōu)點(diǎn)，
如果能夠改善rAAV的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，將明顯改善rAAV的治療效果，并拓展rAAV的 應(yīng)用范圍。那么，如何才能改善rAAV的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率呢？ AAV成功感染是以病毒附著在 細(xì)胞表面為第一步的多步驟的過程。隨后病毒被細(xì)胞攝取，然后在胞內(nèi)被運(yùn)輸，轉(zhuǎn) 運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，或潛伏在核內(nèi)或在某些輔助因子的作用下在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制產(chǎn)生新的 病毒基因組，類似大多數(shù)病毒感染宿主細(xì)胞的過程。以最常用的II型重組腺相關(guān)病 毒(rAAV2)為例，rAAV2首先與硫酸乙酰肝素(heparinsulfate proteoglycans, HSPG) 結(jié)合，由于所有粘附細(xì)胞表面都表達(dá)葡萄糖胺聚糖，這也為rAAV2廣泛的趨向性或親 嗜性提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的解釋。另外，還有兩種受體已被發(fā)現(xiàn)與rAAV2感染有關(guān)，它們 是a v e5整合素和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子l(FGFRl)。而針對(duì)a v e 5整合素的抗體不 能干擾病毒與細(xì)胞的結(jié)合但卻抑制了細(xì)胞對(duì)病毒的內(nèi)吞作用，故推測(cè)a v 0 5整合素 似乎是AAV2被細(xì)胞內(nèi)吞所必需的，但具體的內(nèi)吞過程和接下來的步驟目前仍然不太 清楚。Sanlioglu等證明細(xì)胞內(nèi)氧化還原調(diào)控蛋白R(shí)acl的活性能增強(qiáng)AAV2的內(nèi)吞,他 們的研究表明，經(jīng)過毗咯垸二硫代碳酸鹽(pyrrolidinedithiocarbonate, PDTC)和 具有遺傳毒性的因素(UV或H202)協(xié)同處理后,細(xì)胞對(duì)于rAAV的內(nèi)吞和吸收明顯增加， 但每一種試劑單獨(dú)處理細(xì)胞對(duì)rAAV的內(nèi)吞作用無明顯提升。rMV是一種單鏈DNA病毒(ssDNA病毒)，它所攜帶的基因要表達(dá)需要經(jīng)過單 鏈轉(zhuǎn)換成雙鏈(duble-stranded DNA dsDNA)的過程。只有雙鏈DNA才具有轉(zhuǎn)錄能力。 有研究結(jié)果表明，rAAV進(jìn)入靶細(xì)胞后，游離的單鏈狀態(tài)的rAAV基因組只能存在很短 時(shí)間，其中大部分被靶細(xì)胞的酶識(shí)為受損傷的DNA而被降解。在某些情況下，AAV脫 衣殼后其單鏈DNA可轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA。單鏈DNA轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA可能有以下二條途徑。 一條是以單鏈AAV DNA為模版合成另--條鏈，有研究報(bào)告腺病毒的E40RF6基因、UV 照射以及基因毒性化學(xué)藥品等可增強(qiáng)這個(gè)過程；另一條是來自兩個(gè)AAV病毒顆粒、極 性相反的單鏈退火形成雙鏈。由于AAV是單鏈DNA病毒，末端的ITR折疊形成發(fā)夾樣的 結(jié)構(gòu)，復(fù)制是從AAV基因組折疊的3'端以AAV基因組自身作為模版合成雙鏈DNA。雙 鏈DNA再解鏈，正、負(fù)鏈以同等的效率被包裝成新的病毒顆粒。故感染細(xì)胞后正、負(fù)
鏈可通過退火形成雙鏈。rAAV在細(xì)胞內(nèi)的這些特點(diǎn)導(dǎo)致了其轉(zhuǎn)導(dǎo)的延遲和偶然發(fā)生 的無效轉(zhuǎn)導(dǎo)。最近有研究表明細(xì)胞內(nèi)一稱為FKBP52的蛋白和熱休克蛋白90 (HSP90) 可以改變AAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。前者的磷酸化形式與病毒末端反向重復(fù)D-序列相互作用， 抑制病毒第二鏈的合成，限制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。后者在AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)中表現(xiàn)為FKBP52-AAV D-序列復(fù)合物的一部分，但其本身不與D-序列結(jié)合。所以KBP52和HSP90均能通過改變 AAV的第二鏈合成從而達(dá)到改變AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的作用。阿糖胞苷是一種抗腫瘤藥物，又稱胞嘧啶阿拉伯糖苷，阿糖胞甙，阿糖胞嘧 啶(外文縮寫為CAR， CA， Ara-C),為一類作用于細(xì)胞S增殖期的嘧啶類抗代謝 藥物，化學(xué)名1-e-D-阿拉伯呋喃糖基-4-氨基-2(1H)-嘧啶酮鹽酸鹽。分子式 C9H13N305 "HC1。分子量279.68。阿糖胞苷不存在于自然界，與生理性類似物胞 核苷(Cytidine)的區(qū)別在于其2'糖分子的位置上有OH基。Ara-C在細(xì)胞內(nèi)先經(jīng) 脫氧胞苷酶催化磷酸化，轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘陌⑻前账?Ara-CMP)，再轉(zhuǎn)化為二磷酸 阿糖胞苷(Ara-CDP)及三磷酸阿糖胞苷(Ara-CTP)而起作用。后者與三磷酸脫氧 胞苷競(jìng)爭(zhēng)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制DNA多聚酶，并插入到DNA鏈內(nèi)，阻止DNA鏈的延長(zhǎng)，并引 起鏈斷裂，從而抑制DNA合成。前者能抑制核苷酸還原酵，阻止核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗?核苷酸，抑制細(xì)胞DNA聚合及合成，但對(duì)RNA和蛋白質(zhì)合成無顯著作用，Ara-CTP 還可以改變細(xì)胞內(nèi)磷脂和糖蛋白的代謝，而致細(xì)胞毒性作用。Ara為細(xì)胞周期特異 性藥物，對(duì)處于S增殖期細(xì)胞的作用最為敏感，對(duì)抑制RNA及蛋白質(zhì)合成的作用較 弱。臨床上主要用于治療惡性腫瘤。但Ara在提高AAV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和表達(dá) 水平方面未曾被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。也沒有人嘗試在基因治療時(shí)特別是對(duì)變性和遺傳性疾 病基因治療時(shí)使用Ara以提高AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、基因表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的用于基因治療的復(fù)合制劑，具體涉及阿糖胞苷與 腺相關(guān)病毒的復(fù)合制劑及其用途。包括一定濃度的阿糖胞苷與腺相關(guān)病毒組成的復(fù) 合制劑，及復(fù)合制劑的基質(zhì)；以及在眼病、遺傳病及惡性腫瘤基因治療時(shí)聯(lián)合(同
時(shí)或先后)使用阿糖胞苷與腺相關(guān)病毒，包括系統(tǒng)給予阿糖胞苷和腺相關(guān)病毒或系 統(tǒng)給予阿糖胞苷局部使用腺相關(guān)病毒或局部使用阿糖胞苷與腺相關(guān)病毒，以增強(qiáng)腺 相關(guān)病毒介導(dǎo)的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間的方法和用途；以及阿糖胞 苷在提高腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、表達(dá)水平與持續(xù)時(shí)間、改善腺相關(guān)病毒 載體基因治療效果的新的藥用用途。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證實(shí)阿糖胞苷與腺相關(guān)病毒組成的的復(fù)合制劑,或在給予腺相關(guān)病 毒時(shí)聯(lián)合使用阿糖胞苷可顯著提高腺相關(guān)病毒載體的治療效果。本發(fā)明所述的復(fù)合制劑，它含以下物質(zhì)作為活性成分(1) 抗腫瘤藥物阿糖胞苷；(2) 腺相關(guān)病毒，AAV1、 AAV2、 AAV5或其他血清型如MV3、 AAV4、 AAV6、 MV7、 或AAV8。上述活性成分的劑量如下述(1) 抗腫瘤藥物阿糖胞苷的劑量為0. 001-10 ii g;(2) 在復(fù)合制劑中腺相關(guān)病毒的劑量為1X10e9-lX10el2病毒顆粒。 所述的復(fù)合制劑的基質(zhì)可以是生理鹽水、注射用水、磷酸鹽緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基。所述的復(fù)合制劑可以是凍干形式或液體形式。本發(fā)明所述的復(fù)合制劑可以采用局部注射或靜脈注射方式。其中局部注射方式包括視網(wǎng)膜下注射、玻璃體腔內(nèi)注射或前房注射；肌肉注射；腹腔注射；關(guān)節(jié)腔注 射；經(jīng)導(dǎo)管肝內(nèi)、腎內(nèi)、心臟內(nèi)灌注或腫瘤內(nèi)注射方式。還包括局部給予腺相關(guān)病 毒，同時(shí)或先后靜脈注射抗腫瘤藥物阿糖胞苷方式等。本發(fā)明提供的上述復(fù)合制劑及其中抗腫瘤藥物阿糖胞苷與腺相關(guān)病毒聯(lián)合使 用的方法可顯著改善腺相關(guān)病毒作為基因傳遞載體治療疾病的療效。聯(lián)合使用一定 劑量的抗腫瘤藥物阿糖胞苷，能明顯增加腺相關(guān)病毒對(duì)正常和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率， 使腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的外源基因的表達(dá)時(shí)間明顯提前、陽性率明顯增加、表達(dá)水平明 顯提高，同時(shí)又沒有明顯的毒副作用，有助于改善以腺相關(guān)病毒作為載體的基因治 療效果。本發(fā)明尤其適用在眼病、遺傳病以及腫瘤等疾病基因治療中的應(yīng)用。阿糖 胞苷的這一新的藥用用途對(duì)于提升腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的基因治療的效果具有十分重要 的意義，有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的目的通過下述步驟實(shí)現(xiàn)(1 )體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)阿糖胞苷可明顯提高腺相關(guān)病毒對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞和腫瘤 細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)水平。A阿糖胞苷顯著提高腺相關(guān)病毒對(duì)體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表 達(dá)水平RPE細(xì)胞(APRE-19或原代培養(yǎng)的RPE)培養(yǎng)采用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種2X 1()5RPE細(xì)胞，或2X1(T成人視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中聯(lián)合加入阿糖胞苷和rAAV2—GFP。rAAV2—GFP用量均為每一 個(gè)細(xì)胞1乂104病毒顆粒。阿糖胞苷濃度范圍為O. 0028-4. 2 ug/ml (終濃度)。對(duì)于感染rAAV2-GFP的細(xì)胞，通過GFP的表達(dá)反映rAAV2的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)效率。根 據(jù)GFP熒光出現(xiàn)的時(shí)間、表達(dá)GFP熒光的細(xì)胞數(shù)量、以及GFP熒光強(qiáng)度來判斷rAAV2載 體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和所攜帶基因的表達(dá)水平。GFP陽性細(xì)胞數(shù)量及GFP熒光強(qiáng)度的檢測(cè)通 過熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞儀分析完成。單獨(dú)應(yīng)用1X101 rAAV:.—GFP感染人RPE細(xì)胞，到感染后第5天(120小時(shí))觀察 到少量細(xì)胞表達(dá)GFP熒光，并且熒光很弱。隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，GFP陽性細(xì)胞數(shù)量增 加但較緩慢，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)不明顯。結(jié)果表明，單獨(dú)用rAAV2—GFP時(shí)GFP陽性細(xì)胞數(shù) 量少，熒光弱。若在使用rAAV2—GFP感染人RPE細(xì)胞時(shí)，同時(shí)加入阿糖胞苷，GFP的表達(dá)明顯提 前、表達(dá)量也明顯增加。當(dāng)阿糖胞苷終濃度為0.0028ug/ml(0.0028yg)、 0, 014 ug/ml (0.014 u g) 、 0. 028 "g/ml (0.028 u g) 、 0. 14 y g/ml (0. 14 u g)、 0.28ixg/ml(0.28ug)、0. 56 u g/ml (0. 56 u g)、1.4u g/ml (1. 4u g)、 2.8 w g/ml (2. 8 u g) 、 4. 2 u g/ml (4. 2 u g)時(shí)，均能使GFP在RPE細(xì)胞的表達(dá)時(shí)間提前， 并且表達(dá)量增加。阿糖胞苷濃度越高，GFP陽性細(xì)胞數(shù)量越多，熒光越亮。隨感染時(shí) 間延長(zhǎng)，表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 好，未見細(xì)胞病變，Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡與對(duì)照無明顯差異。Western blot分析以上各組GFP蛋白表達(dá)量，單獨(dú)應(yīng)用rAAV廣GFP感染人RPE細(xì) 胞時(shí)，GFP陽性信號(hào)很弱。聯(lián)合應(yīng)用阿糖胞苷后細(xì)胞內(nèi)GFP蛋白含量明顯增加，而且 增加的程度與阿糖胞苷的劑量有關(guān)。當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用的阿糖胞苷濃度為1.4ug/ml、 2. 8u g/ml和4. 2u g/ml時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GFP蛋白含量髙,所述三個(gè)濃度的條帶差別不明顯。 其中條帶最弱的是當(dāng)阿糖胞苷濃度為O. 0028u g/ml (0. 0028y g)、 0. 014 u g/ml (0. 014 w g)時(shí)，但即便此時(shí)也明顯好于單獨(dú)應(yīng)用rAAV2感染RPE細(xì)胞時(shí)的 結(jié)果。上述結(jié)果表明，所采用的9個(gè)不同濃度的阿糖胞苷均可不同程度的提高和加快 rAAV對(duì)RPE細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)水平，其中以O(shè). 028y g/ml到4. 2u g/ml的濃度 最為有效，在感染后第7天可使GFP陽性率上升到98.5%,平均亮度達(dá)到137.7，遠(yuǎn)遠(yuǎn) 高于單獨(dú)應(yīng)用rAAV時(shí)的效率，阿糖胞苷顯示出強(qiáng)大的加快和提高rAAV2所攜帶的基因 表達(dá)效率的作用。同時(shí)，在rMV感染細(xì)胞后第7天，各濃度間對(duì)提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的 作用差別不明顯，細(xì)胞也都表現(xiàn)出很好的生長(zhǎng)狀況和形態(tài)，未見細(xì)胞數(shù)量較少、變 圓及凋亡等現(xiàn)象。證明了采用阿糖胞苷提高rAAV對(duì)RPE細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率時(shí)，其安全有效 劑量范圍較廣，這--特點(diǎn)將在臨床實(shí)際應(yīng)用時(shí)成為一種優(yōu)勢(shì)。除了上述建株的RPE細(xì)胞外本發(fā)明單獨(dú)使用rAA^—GFP或聯(lián)合阿糖胞苷感染原 代培養(yǎng)的成人RPE細(xì)胞、虹膜色素上皮細(xì)胞和人視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞均獲得了與建株的 RPE細(xì)胞相同的結(jié)果。B阿糖胞苷顯著提離腺相關(guān)病毒對(duì)體外細(xì)胞培養(yǎng)的腫痏細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表 達(dá)水平。對(duì)于多種腫瘤細(xì)胞阿糖胞苷也顯示相同的作用，將rAA^—GFP單獨(dú)或聯(lián)合終濃 度為0.56ug/ml (0.56ug)、 1.4ug /ml (1.4ug)、 2.8ug/ml (2.8ug)阿糖胞 苷分別感染人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH446 、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCIH460、人肝癌細(xì) 胞株SMMC7721、人胃癌細(xì)胞株SGC7901和人肺腺癌細(xì)胞株A549。熒光顯微鏡觀察表達(dá) GFP熒光的細(xì)胞數(shù)量及熒光亮度，并拍照記錄。結(jié)果表明，當(dāng)阿糖胞苷與rAAV2-GFP 共同感染5種腫瘤細(xì)胞時(shí)，可以不同程度的提高rAAV2-GFP對(duì)每一種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo) 效率及基因表達(dá)水平，其中以SMMC7721、 SGC7901和NCIH446效果最為明顯，這可能 與rAAV2-GFP本身對(duì)所述的3種腫瘤細(xì)胞的親嗜性高有關(guān)，阿糖胞苷在此基礎(chǔ)上進(jìn)一 步提升了外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)速度和表達(dá)水平。同時(shí)，阿糖胞苷還對(duì)腫瘤細(xì)胞 產(chǎn)生了明顯的凋亡作用。結(jié)果提示，根據(jù)阿糖胞苷這一特點(diǎn)，可以在腫瘤治療過程 中，將化學(xué)治療與基因治療相結(jié)合，同時(shí)發(fā)揮阿糖胞苷的抗腫瘤作用，又充分利用 其提高基因治療載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的特性，從而改善惡性腫瘤的治療效果。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗腫瘤藥物阿糖胞苷在一定劑量濃度時(shí)可顯著加快和提高 rAAV所介導(dǎo)的外源基因在視網(wǎng)膜細(xì)胞和RPE細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),對(duì)細(xì)胞無明顯毒、副作用。對(duì)于改善眼底病基因治療的效果有明顯作用。此外，阿糖胞苷在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡 的同時(shí)，還可以明顯提高rAAV2所介導(dǎo)的外源基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。對(duì)于提高惡性腫瘤的治療效果有明顯作用。(2 )體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)阿糖胞苷可明顯提高腺相關(guān)病毒對(duì)活體視網(wǎng)膜細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及 多種組織的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)水平。A阿糖胞苷顯著提髙腺相關(guān)病毒對(duì)活體視網(wǎng)膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)水平，提 高治療效果選取8周齡Balb/c小鼠，麻醉后分別在視網(wǎng)膜下腔注射AAV2-Luc和AAV廠Luc+ Ara-c。于注射后24、 48、 72小時(shí)和6天、9天、21天、28天后將小鼠麻醉經(jīng)小動(dòng) 物活體成像觀察報(bào)告基因Uc在小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果表明單獨(dú)應(yīng)用AAVfLuc 進(jìn)行視網(wǎng)膜下注射時(shí)，直到第6天才可見視網(wǎng)膜內(nèi)Luc的表達(dá)；而聯(lián)合應(yīng)用化療藥 物Ara-c，在注射24小時(shí)后便可通過Luc生物素?zé)晒馀袛嘁暰W(wǎng)膜內(nèi)己有Luc基因的 表達(dá)，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，報(bào)告基因Luc在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)增強(qiáng)，而聯(lián)合應(yīng)用化 療藥物Ara-c的眼內(nèi)熒光始終比單獨(dú)應(yīng)用AAV,.-GFP的眼內(nèi)熒光強(qiáng)、范圍大。HE切片 觀察視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞，未見明顯壞死、凋亡及炎癥反應(yīng)。取3周齡RCS大鼠隨機(jī)分成3組，分別在視網(wǎng)膜下注射生理鹽水、AAV2-CNTF、 AAV「CNTF+Ara-c 。注射后5周取眼球制成HE切片后OLYMPAS顯微鏡下觀察計(jì)數(shù) RCS大鼠外核層細(xì)胞數(shù)量。視網(wǎng)膜下注射生理鹽水組外核層細(xì)胞僅剩一層甚至消 失，單純注射AAV2-CNTF組外核層細(xì)胞層數(shù)大約有3-4層，聯(lián)合應(yīng)用AAV廠CNTF和 Ara-c時(shí)外核層細(xì)胞層數(shù)在5-6層。B阿糖胞苷顯著提高腺相關(guān)病毒對(duì)活體內(nèi)的多種組織和腫瘤中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因 表達(dá)水平。將阿糖胞苷與腺相關(guān)病毒聯(lián)合注射到小鼠腹腔內(nèi)，，腺相關(guān)病毒為MVfLuc， 用量為l-3Xl(T個(gè)病毒顆粒，阿糖胞苷用量分別為lug和10ug?；铙w成像顯示阿 糖胞苷可明顯增加腺相關(guān)病毒在腹腔內(nèi)的表達(dá)效率和持續(xù)時(shí)間。腫瘤模型選用人肺癌NCIH460裸小鼠模型，先將人肺癌NCIH460細(xì)胞接種到 Balb/c裸小鼠后肢皮下，4周后腫瘤生長(zhǎng)至8-10mm直徑。分別將AAV廠Luc lX10'n 或3X10'Q個(gè)病毒顆粒與0.01ug、 0. lug、 lug、 2ug、 5ug及10ug阿糖胞苷 混合后，用PBS調(diào)整體積至50ul，然后直接注射到腫瘤內(nèi)，或分別將AAV廠Luc注射 到腫瘤內(nèi)，lwg、 2ug、 5ug、 10ug、 50yg及100ixg阿糖胞苷注射到腹腔內(nèi)。 f注射后48小時(shí)、96小時(shí)活體熒光成像檢測(cè)腫瘤內(nèi)熒光強(qiáng)度。檢測(cè)結(jié)果表明阿糖 胞苷可明顯增加腺相關(guān)病毒在腫瘤內(nèi)的表達(dá)效率。本發(fā)明所涉及的病毒與藥物的來源如下 1帶GFP報(bào)告基因的2型腺相關(guān)病毒AAV2—GFP和帶Luc報(bào)告基因的2型腺相關(guān)病毒AAV「Luc，由本元正陽基因技術(shù)有限公司提供。 2抗腫瘤藥物阿糖胞苷為哈爾濱博萊制藥有限公司生產(chǎn)的注射用鹽酸阿糖胞苷，生產(chǎn)批號(hào)為06010702。本發(fā)明所涉及的各種細(xì)胞的來源和培養(yǎng)方法如下 所涉及的各種細(xì)胞有成人RPE細(xì)胞(APRE-19)為ATCC產(chǎn)品。 原代培養(yǎng)的成人RPE細(xì)胞、原代培養(yǎng)的成人視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞具體培養(yǎng)方法如下: 角膜移植后廢棄眼球用75%酒精消毒，慶大霉素及PBS反復(fù)沖洗。然后仔細(xì)修剪去除 眼球周圍的脂肪組織，從赤道部將眼球剪成兩部分。棄去含有角膜的部分眼球；另 外一部分含有視網(wǎng)膜，小心剪除玻璃體腔中的玻璃體；在解剖鏡下將視網(wǎng)膜小心取 出放入盛有PBS的刻度離心管中，PBS洗3次，加入一倍體積的0.25WTry-EDTA37C消 化60分鐘。成人RPE細(xì)胞直接在眼杯內(nèi)用0.25WTry-EDTA消化60分鐘。然后分別吸出 ().25WTry-EDTA后加入含有15XFBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen Inc)吹打細(xì) 胞成細(xì)胞懸液。顯微鏡下計(jì)數(shù)。以每孔2X105的細(xì)胞數(shù)量分至6孔板中。在37'C、 C02 體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天觀察一次。神經(jīng)細(xì)胞7天換液一次，RPE細(xì)胞3 天換液一次。還涉及多種腫瘤細(xì)胞株，包括人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCIH446、人小細(xì)胞肺癌細(xì) 胞株NCIH460、人肺腺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株SMMC7721和人胃癌細(xì)胞株 SGC7901。


圖1一3:突光顯微鏡照相，分別被MV2—GFP或AAV2—GFP聯(lián)合不同濃度的阿糖胞 苷感染的RPE細(xì)胞中GFP表達(dá)情況，其中，圖l單獨(dú)應(yīng)用AAV「GFP 1X10e9感染RPE細(xì)胞后第5天，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，熒 光顯微鏡下可見表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)量少，散在分布，GFP熒光強(qiáng)度弱。A和B為同一視 野下RPE細(xì)胞的熒光照片和黑白照片，X50; C和D為同一視野下RPE細(xì)胞的熒光照片 和黑白照片，xioo。圖2 AAV2 — GFP 1X10e9與0.0028ug/mi阿糖胞苷同時(shí)感染RPE細(xì)胞后第5 天，細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)好，部分細(xì)胞表達(dá)GFP熒光。A和B為同一視野下RPE細(xì)胞的熒光照 片和黑白照片，X50; C和D為同一視野下RPE細(xì)胞的熒光照片和黑白照片，X100。圖3 AAV2—GFP 1X 10e9與l. 4n g/ml阿糖胞苷同時(shí)感染RPE細(xì)胞后第5天，絕 大部分細(xì)胞表達(dá)GFP， (;FP熒光強(qiáng)。細(xì)胞形態(tài)好，未見凋亡細(xì)胞存在。A和B為同一視 野下RPE細(xì)胞的熒光照片和黑白照片，X50; C和D為同一視野下RPE細(xì)胞的熒光照片 和黑白照片，xioo。
圖4:熒光顯微鏡照相，分別被AAV2—GFP或AAV2—GFP聯(lián)合O. 56ug/ml阿糖胞苷感 染的腫瘤細(xì)胞SGC7901中GFP表達(dá)情況，其中，AAV2—GFP 1X 10e9與0. 56 u g/ml阿糖胞苷同時(shí)感染7901細(xì)胞后48小時(shí)， 絕大部分細(xì)胞表達(dá)GFP， GFP熒光強(qiáng)。但部分細(xì)胞變圓凋亡，漂浮。A和B為同一視野 下7901細(xì)胞的熒光照片和黑白照片，X50; C和D為同一視野下RPE細(xì)胞的熒光照片和 黑白照片，X400。圖5:流式細(xì)胞儀分析，AAV2—GFP單獨(dú)或AAV2—GFP聯(lián)合不同濃度阿糖胞苷感染的 KPE細(xì)胞7天后GFP表達(dá)情況。圖6:流式細(xì)胞儀分析，AAVa—GFP單獨(dú)或AA、一GFP聯(lián)合0. 54 u g/ml阿糖胞苷 感染腫瘤細(xì)胞72小時(shí)后GFP表達(dá)情況。圖7: Westernblot檢測(cè)，被AAV2—GFP單獨(dú)或AAV2—GFP聯(lián)合不同濃度阿糖胞苷感 染RPE細(xì)胞后GFP表達(dá)情況，其中，AAV2-GFP lX10e9聯(lián)合不同濃度的阿糖胞苷同時(shí)感染RPE細(xì)胞后第7天， Westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)量。隨著阿糖胞苷濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)GFP含量也在 逐漸增高。阿糖胞苷濃度為1.4ug/ml、 2.8118/1111和4.2118/1111時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GFP蛋白 含量髙，各濃度間條帶大小差別不明顯。然后是阿糖胞苷濃度為0.56wg/ml時(shí)，再 次為阿糖胞苷濃度分別為O. 28u g/ml、 0. 14y g/ml和0. 028u g/ral時(shí)，這三個(gè)濃度的 條帶差別也不明顯。條帶最弱的是當(dāng)阿糖胞苷濃度為O. 0028u g/ml(0. 0028n g)、 ().014lig/ml(0.014ug)時(shí)。單獨(dú)應(yīng)用AAV2-GFP時(shí)因條帶微弱，以至于無法觀察到。圖8小動(dòng)物活體成像觀察MV2—Luc (右眼)或MV2—Luc聯(lián)合0.1 ix g/ml阿糖胞 苷(左眼)視網(wǎng)膜下注射后對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的感染情況， 其中，聯(lián)合應(yīng)用阿糖胞苷顯著增加AAV2—Luc對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的感染效率。圖9單獨(dú)應(yīng)用AAV2—CNTF lxlOe-10或聯(lián)合應(yīng)用AAV2—CNTF lxl0e10與阿糖 胞苷1 y g，經(jīng)內(nèi)路法注射入3周齡RCS大鼠視網(wǎng)膜下間隙后第5周，HE切片觀察聯(lián) 合應(yīng)用AAV2—CNTF lxlOelO與阿糖胞苷時(shí)視網(wǎng)膜內(nèi)外核層存留的細(xì)胞數(shù)目較單獨(dú)應(yīng) 用AAV2—CNTF lxlOelO時(shí)多，其中，A未經(jīng)治療時(shí)RCS大鼠視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞幾乎全部發(fā)生凋亡，喪失；X400，B視網(wǎng)膜下注射生理鹽水時(shí)RCS大鼠視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞幾乎全部發(fā)生凋亡，喪失；X400C單獨(dú)應(yīng)用AAV2—CNTF lxl0e10時(shí)RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)可見有3-4層外核層 細(xì)胞存留；X400D聯(lián)合應(yīng)用AAV2—CNTF lxl0e10與阿糖胞苷1 W g時(shí)RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)可見 有5-6層外核層細(xì)胞存留；X400具體實(shí)施方式
實(shí)施例l阿糖胞苷加快和提高rAAV-GFP對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)水平按每孔2X1()5將RPE (APRE-19， ATCC)細(xì)胞接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24小時(shí) 后細(xì)胞貼壁，分別將1X10" rAAVrGFP單獨(dú)或聯(lián)合O. 0028 u g/ml (0. 0028 u g)、 0. 014 y g/ml (0. 014 y g) 、 0. 028 " g/ml (0. 028 w g) 、 0. 14 " g/ml (0.14 y g)、 0. 28u g/ral (0, 28u g)、0. 56u g/ml (0. 56u g)、1. 4y g/ml (1. 4u g)、 2.8 ii g/ml (2. 8 u g) 、 4. 2 y g/ml (4. 2 w g)濃度的阿糖胞苷加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中。然 后每天用熒光顯微鏡觀察并照相記錄被感染的細(xì)胞GFP熒光的亮度、細(xì)胞形態(tài)與病變 狀態(tài)。7天后胰蛋白酶消化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽性細(xì)胞數(shù)及GFP熒光強(qiáng)度、Western blot檢測(cè)GFP表達(dá)量。上述檢測(cè)結(jié)果如下，若單獨(dú)使用rAAVa—GFP感染細(xì)胞，第5天(120小時(shí))起 才能觀察到GFP表達(dá)，總體上講GFP陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量少、亮度弱，7天時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)， 細(xì)胞數(shù)量為2.25乂10'\流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽性率為13.594,平均亮度2.75見圖1。 若同時(shí)加入 0. 028 u g/ml (0. 028 u g) 、0.14 y g/ml (0.14 n g) 、 0.28ug/ml(0.28"g)、0. 56 u g/ml (0. 56 u g)、1.4u g/ml(1. g)、 2,8ug/ml(2.8iig) 、 4.2ug/ml(4,2ug)濃度的阿糖胞苷，GFP表達(dá)時(shí)間明顯提前， 表達(dá)量顯著增加。感染后18小時(shí)便可觀察到有較多的RPE細(xì)胞表達(dá)GFP熒光，并且此 時(shí)表達(dá)GFP熒光的細(xì)胞數(shù)量和熒光強(qiáng)度明顯髙于單獨(dú)應(yīng)用rAAV2—GFP感染細(xì)胞時(shí)第7 天的情況。隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，被感染細(xì)胞內(nèi)GFP陽性細(xì)胞數(shù)繼續(xù)增加，GFP的平均 亮度也隨之增高，同時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)好，無變圓及凋亡的細(xì)胞。感染后7天計(jì)數(shù)細(xì)胞，
細(xì)胞數(shù)量按上述阿糖胞苷的濃度次序分別為2. 17X 10s、 2. 21X 10s、 2. 05X 105、 2. 09 X105、2. 12X105、2. 18Xl()5和2. 03X 10%流式細(xì)胞儀分析顯示GFP陽性率分別為97. 1 %、 97. 3%、 97. 3%、 98. 0%、 97. 9%、 98. 2%、 98. 5%。 GFP的平均亮度分別為94. 8、 93.6 、 98.6、 104.3、 110.5、 126.6、 137,2。當(dāng)聯(lián)合使用的阿糖胞苷濃度為 0. 0028 u g/ml (0. 0028 u g) 、 0. 014 y g/ml (0. 014 u g)時(shí)，rAAV廠GFP感染細(xì)胞后24小 時(shí)，可通過熒光顯微鏡觀察到少量GFP熒光。7天時(shí)計(jì)數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量分別為2.21 X1(T和2.20X105。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果GFP陽性率分別為70.3X和74.51)4。 GFP 的平均亮度分別為44. 1和49. 7。此時(shí)，細(xì)胞形態(tài)好，無變圓及凋亡的細(xì)胞。見圖2、 3、 5、 7。實(shí)施例2阿糖胞苷加快和提髙rAAV-GFP對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)水平按每孔1X1()5將腫瘤細(xì)胞(7721、 7901、 NCIH446、 NCIH460、 A549)接種在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24小時(shí)后細(xì)胞貼壁，分別將lXl(^rAAVfGFP單獨(dú)或與終濃度為 0.56ng/ml (0.56ng)、 1.4ug /ml (1.4ug)、 2.8wg/ml (2.8ug)的阿糖胞苷 同時(shí)加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中。感染后24小時(shí)熒光顯微鏡觀察，感染后24小時(shí)，單獨(dú)應(yīng) 用rAAV2-GFP感染的5種腫瘤細(xì)胞內(nèi)均未見明顯熒光；在聯(lián)合應(yīng)用不同濃度阿糖胞苷 的腫瘤細(xì)胞中，SMMC7721、SGC7901和NCIH446內(nèi)部分細(xì)胞出現(xiàn)GFP突光，細(xì)胞形態(tài)好， 未見細(xì)胞變圓。48小時(shí)后，單獨(dú)使用rAAV廠GFP感染的SGC7901、 NCIH446和SMMC7721 細(xì)胞內(nèi)可見有少量表達(dá)GFP突光的細(xì)胞，其余2種腫瘤細(xì)胞內(nèi)仍未見明顯熒光，5種腫 瘤細(xì)胞形態(tài)好，未見細(xì)胞變圓。而在r AAVrGFP與阿糖胞苷共同感染的細(xì)胞中， SGC7901和NCIH446中GFP陽性細(xì)胞進(jìn)一步增多，熒光更亮，并且GFP陽性細(xì)胞數(shù)量和 熒光強(qiáng)度隨著使用阿糖胞苷濃度增高而增加。另外2種腫瘤細(xì)胞NCIH460和A549內(nèi)也 可見少量細(xì)胞出現(xiàn)GFP突光。此外，凡是加入阿糖胞苷的腫瘤細(xì)胞在感染后48小時(shí)觀 察，均見到有部分細(xì)胞變圓，阿糖胞苷的濃度越髙，變圓細(xì)胞的數(shù)量越多。其中以 聯(lián)合加入2.81^/1111 (2.8ng)阿糖胞苷的SMMC7721細(xì)胞最為明顯。感染后72小時(shí)， 與單獨(dú)使用r AAV2-GFP感染的腫瘤細(xì)胞相比，'5種聯(lián)合應(yīng)用0. 56 n g/ml阿糖胞苷感染
的腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP熒光的細(xì)胞數(shù)量明顯多且亮。但加入阿糖胞苷的腫瘤細(xì)胞均有 不同程度的凋亡和漂浮，而單獨(dú)應(yīng)用rAAVfGFP感染的腫瘤細(xì)胞則生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無 凋亡和漂浮現(xiàn)象。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果如下單獨(dú)應(yīng)用rAAV2-GFP感染NCIH446、 NCIH460、 SGC7901、 SMMC7721和A549細(xì)胞72小時(shí)后，GFP陽性率分別為30. 1%、 26. 1%、 31.8%、 34.4%和23.6%，平均亮度分別為21.4、 12.9、 28.1、 27.2和16.3;聯(lián)合應(yīng)用 0.56lig/ml阿糖胞苷后GFP陽性率分別為72.31)()、 52.5%、 80.5%、 85.1%和47. 4%，平 均亮度為57.4、48.1、62. 5、60. 5和31. 5。當(dāng)阿糖胞苷的濃度為l. 4 u g /m1(1. " g)、 2.8ng/ml (2.8ug)時(shí)，因細(xì)胞變圓、漂浮嚴(yán)重，無法測(cè)得流式結(jié)果。按照GFP陽 性率和熒光亮度來反映rAAV2的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，則單獨(dú)用rAAV2-GFP感染腫瘤細(xì)胞時(shí)，r AAV2在SGC7901細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較其他4種腫瘤細(xì)胞略高一些，總體上來看，都偏低。 當(dāng)rAAV2"GFP與0. 56u g/ral阿糖胞苷共同感染細(xì)胞后，5種腫瘤細(xì)胞內(nèi)GFP陽性細(xì)胞數(shù) 量及亮度明顯提高，最為明顯的是SMMC7721細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞，GFP陽性率分別由 34. 4條高至ij85.1%、 31， 8先提髙至ij80. 5%，平均亮度分別由27. 2上升至60. 5、 28. l上 升至62.5。然后依次是NCIH446、 NCIH460和A549細(xì)胞。見圖4、 6。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)應(yīng)用rAAV2作為基因傳遞載體對(duì)視網(wǎng)膜和腫瘤等細(xì)胞的 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低，基因表達(dá)水平也較低，而且基因開始表達(dá)所需要的時(shí)間較長(zhǎng)?？鼓[ 瘤藥物阿糖胞苷在一定劑量范圍內(nèi)可以安全有效地加快和提高rAAV2在視網(wǎng)膜細(xì)胞 內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)水平。當(dāng)阿糖胞苷濃度為0.028 ii g/m1(0. 028 ug)、 0. 14 w g/ml (0. 14 u g) 、 0. 28 " g/ml (0. 28 U g) 、 0. 56 y g/ml (0. 56 u g)、 1.4ug/ml(1.4iig) 、 2.8wg/ml(2.8ug) 、 4. 2jx g/ml(4. 2u g)時(shí)，既可以顯著加 快和提髙GFP的表達(dá)，又不產(chǎn)生明顯的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等副作用。因此, 對(duì)于采用阿糖胞苷來提高rAAV2在視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率這一新方法來說,阿糖胞苷 的安全有效劑量范圍比較廣泛。此外，阿糖胞苷在使腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也能顯 著提高rAAV2在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)。實(shí)施例3體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)阿糖胞苷可明顯提高腺相關(guān)病毒對(duì)活體視網(wǎng)膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因
表達(dá)水平，提高治療效果A阿糖胞苷提高AAV介導(dǎo)的基因在活體視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平選取8周齡Balb/c小鼠，麻醉后分別在視網(wǎng)膜下腔注射AAVfLuc和AAV2-Luc+ Ara-c各2ul。具體劑量左眼AAV廠GFP 2X10" (2ul)個(gè)病毒顆粒，右眼AAV廠GFP 2X10"個(gè)病毒顆粒聯(lián)合Ara-c0.001ug。分別于視網(wǎng)膜下注射24、 48、 72小時(shí)和6 天、9天、21天、28天后將小鼠麻醉經(jīng)小動(dòng)物活體成像觀察報(bào)告基因Luc在小鼠視 網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果表明單獨(dú)應(yīng)用AAV2-Luc進(jìn)行視網(wǎng)膜下注射時(shí)，直到第6天才可 見視網(wǎng)膜內(nèi)Luc的表達(dá);而聯(lián)合應(yīng)用化療藥物Ara-c，在注射24小時(shí)后便可通過Luc 生物素突光判斷視網(wǎng)膜內(nèi)已有Luc基因的表達(dá)，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，報(bào)告基因Luc 在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)增強(qiáng)，而聯(lián)合應(yīng)用化療藥物Ara-c的眼內(nèi)熒光始終比單獨(dú)應(yīng)用 AAV2-GFP的眼內(nèi)熒光強(qiáng)、范圍大。視網(wǎng)膜下注射1周和2周后多聚甲醛灌注后取眼 球，5%冰醋酸后固定24小時(shí)，石蠟包埋后連續(xù)切片，切片厚度約6um， HE染色后 觀察視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞，未見明顯壞死、凋亡及炎癥反應(yīng)。見圖8。B.腺病毒提髙AAV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的治療效果取3周齡RCS大鼠，雌雄不限，隨機(jī)分成3組，分別在視網(wǎng)膜下注射生理鹽水 (2ul)、 AAV2-CNTF 1X10'" (2ul)個(gè)病毒顆粒、AAV廠CNTF 1乂10'°個(gè)病毒顆粒+ Ara-c O,OOlug (共2ul)。注射后5周多聚甲醛灌注后取眼球，5%冰醋酸后固定， 石蠟包埋，HE染色后觀察切片。OLYMPAS顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)RCS大鼠外核層細(xì)胞數(shù) 量。視網(wǎng)膜下注射生理鹽水組外核層細(xì)胞僅剩一層甚至消失，單純注射AAV2-CNTF 組外核層細(xì)胞層數(shù)大約有3-4層，聯(lián)合應(yīng)用AAV2-CNTF和Ara-c lug時(shí)外核層細(xì) 胞層數(shù)在5-6層，三組之間p值均小于0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖9。
權(quán)利要求
1、一種阿糖胞苷與腺相關(guān)病毒的復(fù)合制劑，包括活性成分和基質(zhì)，其特征在于所述的活性成分是以下物質(zhì)(1)抗腫瘤藥物阿糖胞苷；(2)腺相關(guān)病毒，包括AAV1、AAV2、AAV5或其他血清型如AAV3、AAV4、AAV6、AAV7和/或AAV8。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合制劑，其特征是所述的腺相關(guān)病毒的用量為IX 109 1 X1013 AAV病毒顆粒。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合制劑，其特征是所述的阿糖胞苷的用量為0.001~ 10ug。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合制劑，其特征是所述的復(fù)合制劑中的基質(zhì)是注射 用水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合制劑，其特征所述的制劑是凍干形式或液體形式。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合制劑，其特征是其給藥方式采用局部注射或靜脈 注射方式。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的復(fù)合制劑，其特征是所述的給藥方式是阿糖胞苷與腺 相關(guān)病毒混合后以混合物形式給藥，或分別給予阿糖胞苷與腺相關(guān)病毒包括在 局部分別注射阿糖胞苷與腺相關(guān)病毒，或同時(shí)靜脈注射阿糖胞苷與腺相關(guān)病毒； 或局部注射腺相關(guān)病毒或靜脈注射阿糖胞苷。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的復(fù)合制劑，其特征是所述的給藥方式其中給藥的 時(shí)間順序是提前注射阿糖胞苷然后再注射腺相關(guān)病毒，或同時(shí)注射阿糖胞苷與腺 相關(guān)病毒，或先注射腺相關(guān)病毒后再注射阿糖胞苷。
9、 權(quán)利要求1所述的復(fù)合制劑在制備提高腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、表 達(dá)水平與持續(xù)時(shí)間和/或改善腺相關(guān)病毒載體基因治療效果藥物中的用途。
10、 按權(quán)利要求1的用途，其特征是所述的用途是制備眼病基因治療、遺傳病基 因治療、惡性腫瘤基因治療、治療各種類型的關(guān)節(jié)炎、治療各種類型的心臟病、 治療肝臟的各種代謝性疾病和/或治療肌肉或神經(jīng)系統(tǒng)退性變藥物中的用途。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征是其中眼病基因治療，其劑量為0.001-1 Hg阿糖胞苷1X10MX10。AAV病毒顆粒；采用視網(wǎng)膜下注射、玻璃體腔內(nèi) 注射或前房注射方式。
12、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征是其中遺傳病基因治療，其劑量為 0.01-10Ug阿糖胞苷1X10IQ-1X1013 AAV病毒顆粒；采用肌肉注射腹腔注 射或經(jīng)導(dǎo)管肝內(nèi)、腎內(nèi)灌注方式。
13、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征是其中惡性腫瘤基因治療，其劑量為 O.Ol-lOlig阿糖胞苷1X10IQ-1X1013 AAV病毒顆粒；采用腫瘤內(nèi)注射或腹腔 注射方式。
14、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征是其中治療各種類型的關(guān)節(jié)炎，其劑 量為O.OO卜lug阿糖胞苷；1X1(T-1X1(^AAV病毒顆粒；采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)或其 周圍注射方式。
15、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征是其中治療各種類型的心臟病，其劑 量為0.01-10ug阿糖胞苷；1X10'、1X1()UAAV病毒顆粒；采用經(jīng)導(dǎo)管心臟內(nèi) 灌注方式。
16、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征是其中治療肝臟的各種代謝性疾病， 其劑量為0.01-10 ii g阿糖胞苷；1X1(^-1X10"AAV病毒顆粒；采用經(jīng)導(dǎo)管肝 內(nèi)灌注方式。
17、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征是其中治療肌肉或神經(jīng)系統(tǒng)退性變， 其劑量為0.01-10ug阿糖胞苷；1X10'G-1X10UAAV病毒顆粒；采用腫瘤內(nèi)注 射方式。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及新的基因治療復(fù)合制劑及其用途和使用方法。公開了在使用腺相關(guān)病毒作為基因傳遞載體時(shí)，聯(lián)合使用一定劑量的阿糖胞苷，可以明顯增加腺相關(guān)病毒對(duì)正常和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，使腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的外源基因的表達(dá)時(shí)間明顯提前、陽性率明顯增加、表達(dá)水平明顯提高，從而改善以腺相關(guān)病毒作為載體的基因治療效果，特別是在眼底病、遺傳病以及腫瘤等疾病基因治療中的應(yīng)用。在腫瘤基因治療中具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，和明顯增加腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和表達(dá)水平的作用。
文檔編號(hào)A61K31/7068GK101116747SQ20061002966
公開日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2006年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月1日
發(fā)明者吳小兵, 吳繼紅, 張圣海, 李川源, 董小巖, 倩 黃 申請(qǐng)人:上海市第一人民醫(yī)院