專(zhuān)利名稱(chēng)：Resistin結(jié)合多肽在制備促胰島素分泌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及Resistin結(jié)合多肽在制備促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2型糖尿病是一種嚴(yán)重影響人體健康和生活質(zhì)量的疾病，目前不但累及西方國(guó)家6％的成人，而且其發(fā)病趨于年輕化，并正以6％的年增長(zhǎng)率高速增長(zhǎng)。其危害性及在兒童群體中不斷上升的發(fā)病率已引起了各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注，并成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的一個(gè)重要研究方向。
現(xiàn)已知，在2型糖尿病中主要有兩個(gè)基本變化1，胰島素抵抗。2，胰島B細(xì)胞功能受損。而肥胖則是2型糖尿病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。長(zhǎng)期以來(lái)人們一直認(rèn)為肥胖患者脂肪細(xì)胞功能異常與胰島素抵抗的形成密切相關(guān)，并試圖從脂肪組織中篩選胰島素抵抗候選基因作為2型糖尿病防治的靶標(biāo)。Resistin，正是2001年Steppan等人通過(guò)小鼠脂肪組織差減雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的一種胰島素抵抗候選基因。我們應(yīng)用噬菌體表面展示(Phagedisplay)技術(shù)，篩選出三條Resistin結(jié)合多肽的cDNA片段，根據(jù)翻譯密碼翻譯為以下氨基酸序列1.AWILLQGYPGSSS；(SEQ ID No.1)2.AWILFRAASDIAIPS；(SEQ ID No.2)3.AWILYLSFAFCIYSLITCLGVICQAWTLMHLHKFYHCSELKATE；(SEQ IDNo.3)它們均含有共有序列(AWIL)。
但現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)這些Resistin結(jié)合多肽的功能沒(méi)有報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)Resistin結(jié)合多肽功能不明的技術(shù)問(wèn)題，提供了Resistin結(jié)合多肽在制備促胰島素分泌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的
Resistin結(jié)合多肽在制備促胰島素分泌藥物中的應(yīng)用。
所述的Resistin結(jié)合多肽是SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3中的一種或多種。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過(guò)對(duì)篩選出的Resistin結(jié)合多肽的功能研究，發(fā)現(xiàn)Resistin結(jié)合多肽不影響胰島細(xì)胞株RINm5F的細(xì)胞活力，表示多肽對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。Resistin結(jié)合多肽在10-10，10-11，10-12M范圍內(nèi)對(duì)胰島細(xì)胞株的胰島素分泌能力有促進(jìn)作用，并且此作用有濃度和時(shí)間依賴(lài)趨勢(shì)。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣(胰島素分泌的始發(fā)因素)也有明顯增高。因此，Resistin結(jié)合多肽可在細(xì)胞水平能促進(jìn)胰島細(xì)胞的胰島素分泌，這些Resistin結(jié)合多肽可用于制備促胰島素分泌的藥物。


圖1是Resistin結(jié)合多肽促進(jìn)胰島素分泌的時(shí)間趨勢(shì)圖。
圖2是Resistin結(jié)合多肽促進(jìn)胰島素分泌的濃度趨勢(shì)圖。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1一、多肽序列的獲得通過(guò)噬菌體表面雜交技術(shù)篩選出三條Resistin結(jié)合多肽的cDNA序列，根據(jù)翻譯密碼翻譯為以下氨基酸序列1.AWILLQGYPGSSS(SEQ ID No.1)；2.AWILFRAASDIAIPS(SEQ ID No.2)；3.AWILYLSFAFCIYSLITCLGVICQAWTLMHLHKFYHCSELKATE(SEQ IDNo.3)；它們均含有共有序列(AWIL)。
二、多肽的合成實(shí)驗(yàn)中采用的Resistin結(jié)合多肽(N-AWILFRAASDIAIPS-C)(SEQ ID No.2)由上海生工生物公司合成，純度＞95％。
三、多肽對(duì)胰島細(xì)胞株RINm5F的安全范圍的確定將RINm5F細(xì)胞按每孔2×104個(gè)細(xì)胞的濃度接種于96孔板中，于37度5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％的密度時(shí)，使用Resistin結(jié)合多肽(終濃度0，10-8，10-9，10-10，10-11，10-12M)(1M＝1mol/L，下同)對(duì)細(xì)胞刺激3小時(shí)后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。首先在每孔中加入MTT液，使MTT終濃度達(dá)到0.5mg/ml，并在37℃孵育2小時(shí)。吸去上清，加入DMSO溶解晶體，在570nm處測(cè)吸光度值。結(jié)果為未用resistin結(jié)合多肽MTT值＝0.2467±0.01317；resistin結(jié)合多肽10-8mol/L MTT值＝0.2487±0.0814；resistin結(jié)合多肽10-9mol/L MTT值＝0.2492±0.01061；resistin結(jié)合多肽10-10mol/L MTT值＝0.2420±0.06；resistin結(jié)合多肽10-11mol/L MTT值＝0.2428±0.07414；resistin結(jié)合多肽10-12mol/L MTT值＝0.2435±0.07423。各組間沒(méi)有顯著性差異，P＞0.05說(shuō)明resistin結(jié)合多肽不影響細(xì)胞活力。結(jié)果顯示Resistin結(jié)合多肽在各個(gè)濃度不影響細(xì)胞的活力。
四、多肽的胰島細(xì)胞分泌功能的影響RINm5F細(xì)胞接種到6孔板中，在細(xì)胞達(dá)到3×105個(gè)/孔時(shí)，吸去上清并用PBS洗三遍，使用KRB緩沖液(128.8mM NaCl，4.8mM KCl，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，1.0mM CaCl2，5.0mM NaHCO3，10mM HEPES，0.1％胎牛血清，2.8mM葡萄糖)，在緩沖液中加入Resistin結(jié)合多肽10-12M刺激，0、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)；以及加入Resistin結(jié)合多肽0，10-10，10-11，10-12M刺激2小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取上清，離心去除上清中細(xì)胞后使用胰島素ELISA檢測(cè)試劑盒(Mercodia AB Sweden)檢測(cè)上清中的胰島素。結(jié)果顯示Resistin結(jié)合多肽刺激胰島素的分泌有時(shí)間和濃度依賴(lài)趨勢(shì)，分別見(jiàn)圖1，2。其中圖1未用Resistin結(jié)合多肽刺激，胰島素19.54±1.51；10-12M Resistin結(jié)合多肽刺激30分鐘，胰島素28.34±1.80；10-12M Resistin結(jié)合多肽刺激1小時(shí)，胰島素32.61±2.01；10-12M Resistin結(jié)合多肽刺激2小時(shí)，胰島素36.31±2.21這四組之間都有顯著性差異，P＜0.05。
圖2未用Resistin結(jié)合多肽刺激，胰島素19.54±1.51；10-12M Resistin結(jié)合多肽刺激2小時(shí)，胰島素3631±2.21；10-11M Resistin結(jié)合多肽刺激2小時(shí)，胰島素40.72±2.77；10-10M Resistin結(jié)合多肽刺激2小時(shí)，胰島素52.55±3.82這四組之間都有顯著性差異，P＜0.05。
五、胞內(nèi)鈣的測(cè)定胞內(nèi)鈣是刺激胰島素分泌的始發(fā)因素，胞內(nèi)鈣增加能代表胰島素分泌增加。RINm5F細(xì)胞接種到6孔板中，在細(xì)胞達(dá)到3×105個(gè)/孔時(shí)，吸去上清并用PBS洗三遍，使用KRB緩沖液(128.8mM NaCl，4.8mM KCl，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，1.0mM CaCl2，5.0mM NaHCO3，10mM HEPES，0.1％胎牛血清，2.8mM葡萄糖)，在緩沖液中加入Resistin結(jié)合多肽0M，10-12M(mol/L)刺激2小時(shí)，移去上清并PBS洗三次。FURA-3/AM(Sigma)鈣探針4μM加入板中37℃孵育半小時(shí)后用PBS洗去鈣探針，在激光共聚焦顯微鏡下測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示使用Resistin結(jié)合多肽刺激能顯著提高細(xì)胞胞內(nèi)鈣的水平。對(duì)照組(0M)熒光強(qiáng)度35.2±2.8，n＝6；Resisitin結(jié)合多肽刺激組(10-12M)熒光強(qiáng)度，48.7±3.5 n＝6。
序列表<110>郭錫熔 劉峰 倪毓輝 龔海霞 辜楠 范紅旗 陳榮華 彭宇竹 邱潔<120>Resistin結(jié)合多肽在制備促胰島素分泌藥物中的應(yīng)用<160>3<210>1<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>采用噬菌體表面雜交技術(shù)篩選出的Resistin結(jié)合多肽<400>1Ala Trp Ile Leu Leu Gln Gly Tyr Pro Gly Ser Ser Ser15 10<210>2<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>采用噬菌體表面雜交技術(shù)篩選出的Resistin結(jié)合多肽<400>2Ala Trp Ile Leu Phe Arg Ala Ala Ser Asp Ile Ala Ile Pro Ser15 10 15<210>3<211>44<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>采用噬菌體表面雜交技術(shù)篩選出的Resistin結(jié)合多肽<400>3Ala Trp Ile Leu Tyr Leu Ser Phe Ala Phe Cys Ile Tyr Ser Leu15 10 15Ile Thr Cys Leu Gly Val Ile Cys Gln Ala Trp Thr Leu Met His20 25 30Leu His Lys Phe Tyr His Cys Ser Glu Leu Lys Ala Thr Glu35 40
權(quán)利要求
1.Resistin結(jié)合多肽在制備促胰島素分泌藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于Resistin結(jié)合多肽是SEQ ID No.1、SEQID No.2或SEQ ID No.3中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開(kāi)了Resistin結(jié)合多肽在制備促胰島素分泌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明針對(duì)Resistin結(jié)合多肽功能不明的技術(shù)問(wèn)題，提出了Resistin結(jié)合多肽在制備促胰島素分泌藥物中的應(yīng)用的技術(shù)方案。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案可利用Resistin結(jié)合多肽制備促胰島素分泌藥物。
文檔編號(hào)A61P3/00GK1907495SQ20061004115
公開(kāi)日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2006年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月9日
發(fā)明者郭錫熔, 劉峰, 倪毓輝, 龔海霞, 辜楠, 范紅旗, 陳榮華, 彭宇竹, 邱潔, 張敏, 王玢, 池霞, 費(fèi)莉, 潘曉勤, 郭梅, 錢(qián)玲梅, 夏黎, 顧筱琪, 韓樹(shù)萍, 劉茹, 童梅玲 申請(qǐng)人:郭錫熔, 劉峰, 倪毓輝, 龔海霞, 辜楠, 范紅旗, 陳榮華, 彭宇竹, 邱潔