專利名稱：含有依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種含有依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液(水包油乳劑)的制備工藝及配方。
背景技術(shù)：
癌癥是人類最難以治愈而又常見的病癥之一，攻克癌癥這個頑固的堡壘，造福人類，是當(dāng)前世界上的一個極其迫切的重大課題。目前，癌癥患者逐年增加，而且癌癥的死亡率在不斷上升，我國近年來統(tǒng)計(jì)，每年大約有80萬人死于癌癥，全國平均每分鐘有1.5人死于癌癥。大量事實(shí)證明癌癥治療的進(jìn)展甚微，癌癥越來越嚴(yán)重的威脅人類的生命。所以尋找抗癌的新藥，改變劑型提高其抗癌的療效，降低其毒副作用，已成當(dāng)務(wù)之急。
依托泊苷(etoposide，4-去甲基表鬼臼毒素-β-D-乙吡喃葡萄糖苷，簡稱Vp16-213)為鬼臼毒素的糖代謝產(chǎn)物，屬于細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥物，具有廣譜抗癌活性和相當(dāng)高的治療指數(shù)，尤其對早期擴(kuò)散、預(yù)后惡劣的小細(xì)胞癌癥效果良好，是治療小細(xì)胞癌和睪丸癌的最強(qiáng)活性單體。依托泊苷通過抑制哺乳類動物DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，是拓?fù)洚悩?gòu)酶的嵌入型抑制劑，它作用于DNA拓?fù)涿?，使單鏈或雙鏈DNA斷裂，雙鏈DNA斷裂數(shù)是單鏈斷裂數(shù)的2～3倍，這表明細(xì)胞毒性機(jī)制是該藥的作用機(jī)制，這使該藥的毒副作用也很大，其主要毒性為骨髓抑制嗜中性白細(xì)胞的減少，且該藥在水中溶解度極小，有待于改進(jìn)劑型。
依托泊苷臨床上常用的劑型為注射液和口服軟膠囊，劑量為每支50-100mg和每粒50-100mg。血管給藥的劑量是每3-5天300-600mg/m2(相當(dāng)于體重為70kg的成人450-900mg)。目前，臨床上使用的注射劑型屬于非水溶液系統(tǒng)，靜脈給藥時，一般先用生理鹽水稀釋，而在5％葡萄糖液中不穩(wěn)定，可形成微細(xì)沉淀，注射血管處引起較強(qiáng)的局部刺激?？诜苿┑膽?yīng)用限于非急癥患者，其絕對生物利用度低，只有50％，血中濃度僅為靜脈注射的52±8％，不同患者之間口服生物利用度差異很大(25％-74％)，其主要原因是依托泊苷的水溶性差及在酸性和堿性介質(zhì)中分解為無活性產(chǎn)物。在pH2-6的水溶液中，依托泊苷37℃的水中溶解度僅為148.5-167.25μg/ml。而且依托泊苷的水溶液化學(xué)穩(wěn)定性差，在pH1.3和10的溶液中，依托泊苷迅速降解，降解半衰期分別為2.88和3.83小時；pH7.30的水溶液中，降解半衰期為27.72天；在pH5-6.15的范圍相對最為穩(wěn)定，降解半衰期分別為63天和49.5天。依托泊苷臨床應(yīng)用的不良反應(yīng)主要是骨髓抑制較明顯，最快2～3周才能恢復(fù)，可產(chǎn)生消化道反應(yīng)和脫發(fā)癥狀，快速滴注時可能出現(xiàn)位置性低血壓。
鑒于上述特性，為使依托泊苷更好地發(fā)揮臨床療效，提高依托泊苷的穩(wěn)定性，研究和開發(fā)新劑型，以新劑型的高效、低毒的優(yōu)勢充分發(fā)揮依托泊苷抗腫瘤活性并降低毒副作用，這無疑將對進(jìn)一步促進(jìn)和推廣依托泊苷在臨床中的應(yīng)用具有重要意義。
脂肪乳劑作為腸外能量的重要補(bǔ)給方式應(yīng)用于臨床已近半個世紀(jì)。1920～1930年間，日本學(xué)者曾用蓖麻油為原料、卵磷脂為乳化劑，首先人工合成脂肪乳劑試用于動物；美國50年代推出了以棉花籽油為基礎(chǔ)的Lipomul應(yīng)用于病人但均因嚴(yán)重毒性而未能推廣。1964年，美國停止生產(chǎn)和應(yīng)用脂肪乳劑。但在歐洲，以Wretling為代表的一批學(xué)者不懈地研究和應(yīng)用以大豆油為基礎(chǔ)、以卵黃磷脂為乳化劑、以甘油為等張劑的脂肪乳劑Introlipid。1962年，Introlipid在瑞典被正式批準(zhǔn)用于臨床。1967年，由Hallberg等發(fā)表的文章“脂肪乳劑應(yīng)用于完全靜脈營養(yǎng)”全面總結(jié)了Introlipid的實(shí)驗(yàn)和臨床研究，證明它應(yīng)用于臨床是安全、可靠的，并提出了Introlipid臨床應(yīng)用的準(zhǔn)則。此文與1968年Dudrick等發(fā)表的“長期完全腸外營養(yǎng)下獲生長、發(fā)育和正氮平衡”一文，被公認(rèn)為是對腸外營養(yǎng)發(fā)展為常規(guī)臨床應(yīng)用有重大影響的兩篇經(jīng)典著作。此后20多年，Introlipid在世界各地得到了廣泛應(yīng)用，德、法、日、美等發(fā)達(dá)國家相繼發(fā)展了本國的脂肪乳劑。1976年，美國有關(guān)當(dāng)局又批準(zhǔn)了脂肪乳劑可在臨床常規(guī)應(yīng)用。目前，全世界至少已有20余種脂肪乳劑面市。我國亦于80年代末與瑞典Kabi公司合資，大量生產(chǎn)Introlipid供臨床應(yīng)用。1973年，Solassol等首先介紹了三合一(All-in-one，AIO)溶液的概念，證明脂肪乳劑和所有其它營養(yǎng)液可混合于一個瓶內(nèi)或袋內(nèi)，在一定條件和時間內(nèi)可保持穩(wěn)定和營養(yǎng)支持效果。此后推廣了AIO輸液塑料袋，這一簡單但又有重大意義的改進(jìn)大大簡化了腸外營養(yǎng)液的配制和輸注，為脂肪乳劑的臨床廣泛應(yīng)用拓寬了道路。到目前為止，通常的脂肪乳劑是指以脂肪酸甘油酯作為分散相，以蛋黃卵磷脂為乳化劑的水包油型(oil in water，o/w)亞微乳劑。由于脂肪乳劑乳滴的組成及粒徑與口服脂肪類食物后在血液內(nèi)存在的乳糜微粒十分類似，因此通常認(rèn)為脂肪乳劑的乳滴在人體內(nèi)的行為同乳糜微粒亦相似。隨著對脂肪乳劑的深入研究，其在制藥領(lǐng)域也正發(fā)揮著越來越重要的作用。
脂肪乳劑的特殊的理化特性和低毒性決定了其可以作為脂溶性藥物，特別是抗癌藥物、麻醉藥物及抗炎藥物的良好載體。常采用的方法是將藥物包裹于脂肪乳劑的脂質(zhì)核心部分，由于該結(jié)構(gòu)亦類似于微球，因此脂質(zhì)微球(Lipid Microsphere，LM)的名稱也應(yīng)運(yùn)而生。一般認(rèn)為脂質(zhì)微球是通過將藥物溶于脂肪油中，并經(jīng)磷脂乳化分散于水相后制成，是一種以脂肪油為軟基質(zhì)而被磷脂膜包封的微粒分散體系，平均粒徑在200nm左右。
LM具有許多物理化學(xué)及生物學(xué)上的優(yōu)點(diǎn)1.是脂溶性藥物的良好載體。臨床不少藥物水溶性差，必須依靠有機(jī)溶劑才能發(fā)揮作用，而有機(jī)溶劑不僅本身有一定毒性，還可能干擾藥物效果。
2.可有效增加藥物的穩(wěn)定性。含藥脂質(zhì)微球中，有相當(dāng)一部分藥物分布在油相或油水界面膜中，避免了直接與水接觸。對于易水解或?qū)H變化敏感的藥物，這種“隔離”起到了增加穩(wěn)定性的作用。
3.LM中藥物部分包裹于油相或界面膜中，避免了與體液的直接接觸，因而降低了藥物自身可能產(chǎn)生的局部及血管刺激性。另外，藥物在體內(nèi)是由油相中緩慢釋放，可避免藥物在注射用時由于初期濃度過高而引起的不良反應(yīng)。
4.粒徑在200nm左右的小微粒能被機(jī)體的網(wǎng)狀組織系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞所吞噬而滯留在網(wǎng)狀組織系統(tǒng)(如肝臟、肺等)中，具有靶向性，這種特點(diǎn)對于抗腫瘤藥物提高藥效、降低毒副作用尤為重要。
Takahashi等人的有關(guān)文獻(xiàn)報道用博萊霉素試制成LM，并用水劑作對照，以荷瘤大鼠作試驗(yàn)。進(jìn)行靜脈或腫瘤內(nèi)給藥，然后分別測定腫瘤大小和腫瘤中藥物濃度，結(jié)果顯示LM組的腫瘤縮小50％以上，給藥后10小時仍可檢出藥物；而水劑組的腫瘤無明顯縮小，30分鐘到1小時后已檢測不出藥物。以上說明藥物的劑型不同，效果也不同，表明了LM具有選擇性分布并緩慢釋放的特點(diǎn)，對肝臟、淋巴組織系統(tǒng)的疾病和癌癥化療都是一個較適宜的載體劑型。研究證明這種特點(diǎn)對于抗腫瘤藥物提高藥效、降低毒副作用尤為重要。
近幾年來，以LM作為藥物載體的靶向轉(zhuǎn)移作用逐漸受到人們的重視。藥物脂肪乳劑一經(jīng)開發(fā)，便在臨床上廣泛應(yīng)用，收到了良好的效益。日本的水島裕研制的Lipo PGE1和Lipo PGI2等一系列載藥脂肪乳劑產(chǎn)品的開發(fā)上市預(yù)示了此類制劑廣闊的前景。尤其是已臻成熟的乳劑生產(chǎn)工藝和合成的或天然的表面活性劑的應(yīng)用以及乳劑生產(chǎn)技術(shù)的提高，促進(jìn)了具有商業(yè)價值、穩(wěn)定外形的乳劑產(chǎn)品的發(fā)展(穩(wěn)定期大約為2年)，為含藥脂肪乳的開發(fā)生產(chǎn)創(chuàng)造了更好的條件。如依托米酯、異丙酚、棕櫚酸地塞米松脂肪乳劑、氟比洛芬乙氧基α-乙酯脂質(zhì)乳劑、前列腺素E1脂質(zhì)乳等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種含有依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液(水包油型乳劑的組合物)。并提供制備方法。旨在提高依托泊苷的穩(wěn)定性、臨床使用的方便性、改善患者的順應(yīng)性、降低其對血管的刺激性，更好發(fā)揮臨床療效。
該組合物包含依托泊苷，脂溶性介質(zhì)，水和表面活性劑。
此處使用術(shù)語“油”指示一大類生理可接受性物質(zhì)，為礦物油，植物油，動物油，精油或合成油，或其混合物。因此，此處使用術(shù)語“油”用以指一個寬范圍的具有十分不同化學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)。在以類型或功能分類油時，如礦物油源自石油并包含脂肪或蠟基烴，芳香烴或混合的脂肪與芳香基烴。在礦物油類別中也包含石油衍生的油如精制石蠟油等。在植物油類別中，油主要來源于種子或堅(jiān)果，并包含干性油如亞麻子和桐油；半干性油如紅花油和大豆油；不干性油如蓖麻油、棉籽油和椰子油和可用作的皂料如棕櫚油和椰子油。在動物油類別中，油通常來自作為牛羊脂，豬油和硬脂酸的脂肪。液狀動物油包含魚油，油酸，鯨蠟油等。它們通常含大量脂肪酸。包含一些植物油，如橄欖油，棉籽油，谷物油和花生油，也包含一些特殊的魚油，它們由于富含維生素而被廣泛的用作藥物，如鱈魚肝，鯊魚肝油等。液狀脂肪油如單、雙、三甘油酯，或其混合物為優(yōu)選的油。根據(jù)本發(fā)明，中等鏈長的三甘油酯也為有用的油。優(yōu)選為長鏈脂肪酸甘油酯、中鏈脂肪酸甘油酯，及其混合物。
所用表面活性劑可為任何表面活性劑，通常為磷脂，吐溫(Tween)，普朗尼克(poloxamer)，油酸鈉，油酸，膽酸，去氧膽酸及其混合物。所述磷脂選自卵磷脂，豆磷脂，及其混合物。所述吐溫選自吐溫20，吐溫40，吐溫60，吐溫80，吐溫85，及其混合物。優(yōu)選為卵磷脂，豆磷脂，油酸鈉，油酸，吐溫80，普朗尼克F68，及其混合物。所選用的滲透壓調(diào)節(jié)劑為甘油、乙二醇、異丙醇及氯化鈉等藥學(xué)上允許的鹽。
典型地，以制劑質(zhì)量計(jì)本發(fā)明的配方組成為油相 5％～30％依托泊苷 0.001％～0.5％表面活性劑 0.5％～5％滲透壓調(diào)節(jié)劑 0.5％～5％其余為注射用水如果需要，組合物中也可以添加多種添加劑。如可能含有金屬螯合劑。一般金屬螯合劑為依地酸二鈉(乙二胺四乙酸二鈉鹽)，依地酸鈉鈣(乙二胺四乙酸鈣二鈉鹽)，及其混合物。金屬螯合劑以制劑質(zhì)量計(jì)用量為0％至1％。也可以含有抗氧劑，一般抗氧劑為維生素E，維生素C，亞硫酸鈉，焦亞硫酸鈉，半胱氨酸，一種或兩種以上混合注射液常用的抗氧劑。抗氧劑以制劑質(zhì)量計(jì)用量為0.001％至0.2％。pH調(diào)節(jié)劑為氯化鈉，氫氧化鈉，常用緩沖鹽等，一種或兩種以上混合pH調(diào)節(jié)劑。pH調(diào)節(jié)劑以制劑質(zhì)量計(jì)用量為0.005％至2％。
本發(fā)明也涉及含有依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液(水包油乳劑)的制備方法。具體包含以下操作步驟的一種或幾種1.將依托泊苷溶液或粉末加入至不含依托泊苷的空白乳劑經(jīng)混合制得依托泊苷脂質(zhì)微球注射液和水包油乳劑。
2.或者將依托泊苷溶液或粉末加入至含有部分依托泊苷的乳劑中經(jīng)混合制得依托泊苷脂質(zhì)微球注射液和水包油乳劑。
3.或者將依托泊苷加入至含有表面活性劑的水溶性介質(zhì)中，然后與油相混合，經(jīng)過高速攪拌制備初乳。
4.或者將依托泊苷溶液或粉末加入至含有表面活性劑的油溶性介質(zhì)中，然后與水相混合，經(jīng)過高速攪拌制備初乳。
5.鑒于依托泊苷的水溶液化學(xué)穩(wěn)定性差，制備過程應(yīng)控制水相pH值始終保持在4-8之間。
6.制劑的制備方法主要包括高速攪拌過程及高壓均質(zhì)過程或超聲分散和乳化過程。
7.制劑的滅菌采用蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌法。
依托泊苷為超微顆?；鞈乙夯蛘呤浅⒌姆勰?。
本發(fā)明所述制劑應(yīng)用界面膜載藥的原理，把依托泊苷包裹于油相和界面膜中，降低其血管刺激性及毒性，增強(qiáng)其療效。由于依托泊苷是油水均難溶解的藥物，且在水中幾乎不溶，經(jīng)過高壓均質(zhì)，高速的氣流撞擊形成一種超音速攪拌，使藥物迅速溶解并以分子形式滲透到油水界面膜中。其中，依托泊苷在油水兩相的界面膜中有一定的分布(約20～80％)。本制劑為一種抗腫瘤藥物的制劑，經(jīng)注射給藥后在體內(nèi)的特征主要表現(xiàn)為較高的化學(xué)物理穩(wěn)定性、低毒性、低刺激性和高效性。
本發(fā)明制備的依托泊苷脂質(zhì)微球注射液(水包油乳劑)，降低了依托泊苷的血管刺激性，提高了藥物化學(xué)穩(wěn)定性和療效并降低毒副作用，因而具有一定的創(chuàng)新性和較強(qiáng)的實(shí)用性。


圖1為LM結(jié)構(gòu)示意2為實(shí)施例6中大鼠血漿中藥物濃度-時間曲線圖3為實(shí)施例7中大鼠肝中藥物濃度-時間曲線圖4為實(shí)施例7中大鼠脾中藥物濃度-時間曲線圖5為實(shí)施例7中大鼠腎中藥物濃度-時間曲線圖6為實(shí)施例7中大鼠肺中藥物濃度-時間曲線圖7為實(shí)施例7中大鼠心中藥物濃度-時間曲線圖8為實(shí)施例7中大鼠腦中藥物濃度-時間曲線■依托泊苷脂質(zhì)微球；○依托泊苷普通注射液■依托泊苷脂質(zhì)微球；◆依托泊苷普通注射液
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1依托泊苷制劑的處方制備工藝處方1注射用紅花油 20g依托泊苷 0.2g卵磷脂 1.8g甘油 2.5g注射用水加至100ml制備方法1(1)將處方量的甘油與預(yù)熱至40-100℃的適量注射用水進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至各成份溶解，得水相；同時將卵磷脂加至處方量紅花油中40-100℃加熱溶解，得油相；(2)將油相加入水相中，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至油相均勻分散，得初乳，調(diào)pH值至4-8；(3)將依托泊苷藥物粉末加入此初乳中，攪拌10分鐘，加入預(yù)熱至40-100℃的注射用水至全量；(4)轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)中，高壓均質(zhì)1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(5)灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中滅菌。
處方2注射用大豆油 20g依托泊苷 0.2g豆磷脂 1.2g甘油 2.5g
Tween-80 0.02g油酸鈉 0.05g注射用水加至100ml制備方法2(1)將處方量的Tween-80、油酸鈉、甘油與預(yù)熱至40-100℃的適量注射用水進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至各成份溶解，得水相；同時將豆磷脂加至處方量大豆油中40-100℃加熱溶解，得油相；(2)將油相加入水相中，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至油相均勻分散，得初乳，調(diào)pH值至4-8；(3)將依托泊苷藥物粉末加入此初乳中，攪拌10分鐘，加入預(yù)熱至40-100℃的注射用水至全量；(4)轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)中，高壓均質(zhì)1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(5)灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中滅菌。處方3油相(大豆油/MCT) 20g依托泊苷 0.1g卵磷脂 1.8g甘油 2.5g油酸 0.03gTween-80 0.02gEDTA 0.05g注射用水加至100ml制備方法3(1)將處方量的Tween-80、EDTA、甘油與預(yù)熱至40-100℃的適量注射用水進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至各成份溶解，得水相；同時將卵磷脂、油酸、依托泊苷加至處方量大豆油中40-100℃加熱溶解，得油相；(2)將油相加入水相中，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至油相均勻分散，得初乳，調(diào)pH值至4-8；(4)將初乳加入高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(6)取依托泊苷亞微乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌。處方4油相(大豆油/MCT) 30g依托泊苷 0.1g卵磷脂 1.8g甘油 2.5g油酸 0.06gEDTA 0.05g注射用水加至100mL制備方法4(1)將處方量的EDTA、甘油與預(yù)熱至40-100℃的適量注射用水進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至各成份溶解，得水相；同時將卵磷脂、油酸、依托泊苷加至處方量大豆油中40-100℃加熱溶解，得油相；(2)將油相加入水相中，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至油相均勻分散，得初乳，調(diào)pH值至4-8；(4)將初乳加入高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(6)取依托泊苷亞微乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌。處方5油相(大豆油/MCT) 20g依托泊苷 0.1g卵磷脂 1.5g甘油 2.5g油酸 0.06gEDTA 0.05g司盤20 0.02g注射用水加至100mL制備方法5(1)將處方量的EDTA、甘油與預(yù)熱至40-100℃的適量注射用水進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至各成份溶解，得水相；同時將卵磷脂、油酸、司盤20、依托泊苷加至處方量大豆油中40-100℃加熱溶解，得油相；(2)將油相加入水相中，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至油相均勻分散，得初乳，調(diào)pH值至4-8；(4)將初乳加入高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(6)取依托泊苷亞微乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于高壓旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌。
除以上所列處方中組合物外，按以上方法另外制備4個制劑，它們的組成如下

實(shí)施例2 依托泊苷脂質(zhì)微球穩(wěn)定性的考察根據(jù)文獻(xiàn)報道實(shí)驗(yàn)方法將依托泊苷脂質(zhì)微球樣品分別以重蒸水、緩沖鹽(Na2HPO4，0.017M；KH2PO4，0.0014M；NaCl，0.1370M，pH7.4)和甘油(2.21％w/w)稀釋，測定稀釋后1h，2h，4h，24h，和48h后的粒徑、ζ-電位及藥物包裹率。依托泊苷脂質(zhì)微球分別于4-8℃和25℃貯藏6個月，不同時間點(diǎn)測定樣品的粒徑及包裹率，試驗(yàn)結(jié)果顯示，依托泊苷脂質(zhì)微球的粒徑未受重蒸水、緩沖鹽(pH7.4)和甘油(2.21％w/w)稀釋的影響。48h后，重蒸水和甘油中的粒徑幾乎沒有改變，而在緩沖鹽(pH7.4)中粒徑增加了50nm。4-8℃和25℃留樣六個月實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，依托泊苷脂質(zhì)微球的粒徑和藥物包封率沒有顯著改變。
實(shí)施例3 依托泊苷脂質(zhì)微球注射液刺激性試驗(yàn)(1)血管刺激性實(shí)驗(yàn)將依托泊苷注射液的兩種不同劑型按臨床用藥量(100mg/次)進(jìn)行體表面積換算得出實(shí)驗(yàn)兔用劑量(5.2mg/kg)。試驗(yàn)前按2ml/kg的給藥量用無菌的生理鹽水注射液新鮮配制。選用體重2.5-3.0kg的健康新西蘭白兔6只，雌雄兼有。注射部位用碘酊和乙醇消毒后，3只白兔于右耳耳緣靜脈注射依托泊苷水針注射液(Cs)，左耳注射相同劑量無菌的生理鹽水注射液作為對照；另3只白兔于右耳耳緣靜脈注射依托泊苷脂質(zhì)微球注射液(Cz)，左耳注射相同劑量無菌的生理鹽水注射液作為對照，注射速度為2.8ml/min(相當(dāng)于人臨床注射速度)。每日一次，連續(xù)三天，末次給藥24小時后，由耳緣靜脈注入空氣處死白兔，肉眼觀察注射部位的反應(yīng)情況，并解剖兔耳血管及周圍組織做石蠟切片(注射部位下向心端1cm及5cm處)，HE染色，光鏡檢查。肉眼觀察注射部位反應(yīng)情況的結(jié)果如表-1所示，病理切片由遼寧省疾病預(yù)防控制中心檢查，并呈遞檢查報告。
結(jié)果如表-1所示，依托泊苷注射液兩種劑型血管刺激性試驗(yàn)肉眼觀察結(jié)果表明Cz的血管刺激性弱于Cs；鏡檢報告表明Cs組對新西蘭白兔耳血管有一定程度的血管刺激性，Cz組對新西蘭白兔耳血管未見明顯刺激性。鏡檢結(jié)果見報告。
表-1 血管刺激性試驗(yàn)肉眼觀察

(2)肌肉刺激性實(shí)驗(yàn)依托泊苷注射液的劑量換算、藥物配制、新西蘭白兔的選擇同上(共4只，每種劑型2只)。剪去白兔兩側(cè)股四頭肌部位的兔毛，用碘酊和乙醇消毒后，分別在右側(cè)股四頭肌注射Cs和Cz注射液1ml，左側(cè)股四頭肌注射等量的無菌生理鹽水注射液作為對照，注射48小時后，由耳緣靜脈入空氣處死白兔，解剖取出股四頭肌，縱向切開，觀察注射部位肌肉組織的反應(yīng)情況，確定反應(yīng)級數(shù)。
0級無變化。
1級輕度充血，其范圍在0.5cm×1.0cm以下。
2級中度充血，其范圍在0.5cm×1.0cm以上。
3級重度充血，伴有肌肉變性。
4級出現(xiàn)壞死，有褐色變性。
5級出現(xiàn)廣泛性壞死。
然后算出4塊股四頭肌反應(yīng)級數(shù)總和，如果股四頭肌反應(yīng)級數(shù)的最高值和最低值之差大于2，則應(yīng)另取2只健康白兔重新試驗(yàn)。得到結(jié)果后，若4塊股四頭肌反應(yīng)級數(shù)總和小于10，則認(rèn)為供試品的局部刺激性試驗(yàn)符合規(guī)定。
結(jié)果依托泊苷兩種劑型注射液的肌肉刺激性試驗(yàn)結(jié)果如表-2所示。結(jié)果表明Cz的肌肉刺激性弱于Cs。
表-2 肌肉刺激性試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例4 溶血性實(shí)驗(yàn)自新西蘭白兔的頸總動脈取血20ml，置于燒瓶內(nèi)，用玻璃棒輕輕攪動，數(shù)分鐘后，除去纖維蛋白，取出血液，加等量生理鹽水注射液，離心(1500r/min，10min)，除去上清液；沉淀的紅細(xì)胞再加生理鹽水注射液清洗，離心。如此反復(fù)直至上清液透明，按紅細(xì)胞的容量用生理鹽水配成2％的混懸液。
取干凈試管7支，分別編號，依次加入下表內(nèi)各液，第6管不加供試液作為空白對照管，第7管用蒸餾水代替生理鹽水，搖勻，置于37℃水浴中，分別于0.5小時、1小時、2小時、3小時觀察是否有溶血現(xiàn)象發(fā)生。
結(jié)果表明Qs、Qz都未見溶血現(xiàn)象發(fā)生，兩種劑型的溶血性實(shí)驗(yàn)都合格。
實(shí)施例5 過敏性實(shí)驗(yàn)取健康豚鼠8只，體重250-280g，雌雄各半，Qs、Qz兩種劑型各4只(雌雄各半)，按依托泊苷注射液的臨床應(yīng)用劑量(100mg/次)折算豚鼠用量(2.0mg/200g)并用生理鹽水注射液配制，每只豚鼠ip(腹腔注射)相應(yīng)供試液0.5ml，隔日一次，共三次。在首次注射后的第14、21天于每只豚鼠的后腳掌外側(cè)靜脈注入相應(yīng)供試藥液1ml(劑量折算同前)，進(jìn)行攻擊。每次靜脈給藥觀察2小時，如出現(xiàn)抓鼻、豎毛、咳嗽、呼吸困難中的兩種或兩種以上者判為陽性；如有痙攣、大小便失禁、虛脫、休克、死亡現(xiàn)象之一者判為陽性。未出現(xiàn)上述癥狀的為陰性。
結(jié)果表明Qs、Qz兩種劑型都符合過敏性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例6 大鼠血漿藥代動力學(xué)研究給藥方案12只大鼠隨機(jī)分成二組，每組6只，實(shí)驗(yàn)前禁食一夜。甲組為對照組，于右后股靜脈注射依托泊苷普通注射液(1mg·mL-1)，乙組為受試組，于右后股靜脈注射依托泊苷脂質(zhì)微球，分別于5min，10min，15min，30min，45min，1h，2h，4h，6h眼眶取0.5mL血，置預(yù)先肝素化的尖底離心試管中，離心，精密吸取上層血漿200μL，加入20μL注射用水，按一定方法處理后，取20μL進(jìn)樣，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時間點(diǎn)樣品中依托泊苷的濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果隔室模型藥物動力學(xué)參數(shù)用3P97藥物動力學(xué)程序處理依托泊苷脂質(zhì)微球和注射液的平均血藥濃度數(shù)據(jù)。根據(jù)AIC和擬合度判斷兩者的模型歸屬，結(jié)果表明，依托泊苷脂質(zhì)微球和注射液的血藥濃度數(shù)據(jù)均符合雙隔室模型。
非隔室模型藥物動力學(xué)參數(shù)其中ETP依托泊苷脂質(zhì)微球；EPT依托泊苷普通注射液

Values are mean±SD.
ap＜0.01.
bp＜0.05.
實(shí)施例7 大鼠組織分布動力學(xué)研究給藥方案84只大鼠隨機(jī)分成二組，每組42只。甲組為對照組，于右后股靜脈注射依托泊苷普通注射液，乙組為受試組，于右后股靜脈注射依托泊苷脂質(zhì)微球，分別于0.5h，1h，2h，4h，6h，12h，24h(每點(diǎn)12只大鼠，甲、乙組各6只)斷頭處死動物，取出心，肝，脾，肺，腎，腦，用生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干，稱取0.2g，加1mL緩沖鹽(pH7.4)勻漿，離心，取上清液，按“組織樣品處理與測定”項(xiàng)下處理后，取20μL進(jìn)樣，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時間點(diǎn)樣品中依托泊苷的濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)動物靜脈注射依托泊苷脂質(zhì)微球和依托泊苷普通注射液后AUC測定結(jié)果見表3，實(shí)驗(yàn)動物各時間點(diǎn)各組織藥物濃度的平均值與時間的關(guān)系見圖1～6。
表-3 ETP與EPE組織分布曲線的AUC0.05-24h

Data are preaented as mean±SD(n＝6).
aAUC0.05-24hof EPE was compared with that of ETP in correeponding tissue.
由大鼠體內(nèi)血漿藥動學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，在各個時間點(diǎn)的血中藥物濃度均高于普通市售注射液。說明脂質(zhì)微球注射液具有高效性。組織分布動力學(xué)考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，依托泊苷在各組織中的分布情況由大到小依次是肝、肺、腎臟、心臟和腦。其中，心臟和腦部的AUC0.05-24h均高于普通劑型。最近有研究顯示，肺部小細(xì)胞癌常向腦部轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，因此依托泊苷脂質(zhì)微球注射液在腦部的聚集，很有可能對于腫瘤細(xì)胞的腦轉(zhuǎn)移產(chǎn)生療效，從而具有更廣泛的抗腫瘤功效。
權(quán)利要求
1.一種含依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于該注射液包含依托泊苷，脂溶性介質(zhì)，水和表面活性劑，以制劑質(zhì)量計(jì)本發(fā)明的配方組成為油相5％～30％，依托泊苷0.001％～0.5％，表面活性劑0.5％～5％，滲透壓調(diào)節(jié)劑0.5％～5％，其余為注射用水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于油選自礦物油，植物油，動物油，精油和合成油，及其混合物；表面活性劑選自磷脂，吐溫，司盤，普朗尼克，油酸鈉，油酸，膽酸，去氧膽酸及其混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種含有依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于所述的油選自紅花油，大豆油，玉米油，中鏈脂肪酸甘油三酯(MCT)，薏苡仁油，鴉膽子油，及其混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種含有依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于所述的油是大豆油，中鏈脂肪酸甘油三酯(MCT)，或者是二者混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種含依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于所述吐溫選自吐溫20，吐溫40，吐溫60，吐溫80，吐溫85，或者是以上不同規(guī)格的混合物；所述普朗尼克是普朗尼克F68；所述磷脂選自卵磷脂，豆磷脂，或者是二者混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于還可含有甘油，山梨醇，甘露醇，葡萄糖，及其混合物；氫氧化鈉，鹽酸，及其混合物；緩沖鹽；金屬螯合劑；抗氧劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種含依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于緩沖鹽為醋酸、醋酸鈉、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，及其混合物；金屬螯合劑為依地酸二鈉，依地酸鈉鈣，及其混合物；?？寡鮿榫S生素E，維生素C，亞硫酸鈉，焦亞硫酸鈉、半胱氨酸，及其混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種含依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液，其特征在于所述甘油以制劑計(jì)用量為0.5％至5％；緩沖鹽為0.005％至2％；金屬螯合劑為0％至1％；抗氧劑為0.001％至0.2％。
9.一種含有依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液的制備方法，其特征在于包含以下步驟a)將依托泊苷超微顆粒混懸液或者是超微的粉末加入至不含依托泊苷的空白乳劑或者是含有部分依托泊苷的乳劑中經(jīng)混合制得依托泊苷脂質(zhì)微球注射液或依托泊苷的水包油乳劑；b)將依托泊苷加入至含有表面活性劑的水溶性介質(zhì)中，然后與油相混合，經(jīng)過高速攪拌制備初乳；c)將依托泊苷溶液或粉末加入至含有表面活性劑的油溶性介質(zhì)中，然后與水相混合，經(jīng)過高速攪拌制備初乳，鑒于依托泊苷的水溶液化學(xué)穩(wěn)定性差，制備過程應(yīng)控制水相pH值始終保持在4-8之間；制劑的制備方法主要包括高速攪拌過程及高壓均質(zhì)過程，制劑的滅菌采用高壓旋轉(zhuǎn)滅菌法，構(gòu)成脂質(zhì)微球注射液的組合物與水包油乳劑的組合物相同，制劑中依托泊苷在油水兩相的界面膜中有一定的分布，約20～80％，其余部分依托泊苷分布于水相及油相中，
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述含有依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液的制備方法，其特征在于(1)將處方量的EDTA、甘油與預(yù)熱至40-100℃的適量注射用水進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至各成份溶解，得水相；同時將卵磷脂、油酸、司盤20、依托泊苷加至處方量大豆油中40-100℃加熱溶解，得油相；(2)將油相加入水相中，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至油相均勻分散，得初乳，調(diào)pH值至4-8；(4)將初乳加入高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(6)取依托泊苷亞微乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于高壓旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌；(1)將處方量的Tween-80、油酸鈉、甘油與預(yù)熱至40-100℃的適量注射用水進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至各成份溶解，得水相；同時將豆磷脂加至處方量大豆油中40-100℃加熱溶解，得油相；(2)將油相加入水相中，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至油相均勻分散，得初乳，調(diào)pH值至4-8；(3)將依托泊苷藥物粉末加入此初乳中，攪拌10分鐘，加入預(yù)熱至40-100℃的注射用水至全量；(4)轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)中，高壓均質(zhì)1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(5)灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中滅菌；(1)將處方量的Tween-80、EDTA、甘油與預(yù)熱至40-100℃的適量注射用水進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至各成份溶解，得水相；同時將卵磷脂、油酸、依托泊苷加至處方量大豆油中40-100℃加熱溶解，得油相；(2)將油相加入水相中，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至油相均勻分散，得初乳，調(diào)pH值至4-8；(4)將初乳加入高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(6)取依托泊苷亞微乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌；(1)將處方量的EDTA、甘油與預(yù)熱至40-100℃的適量注射用水進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至各成份溶解，得水相；同時將卵磷脂、油酸、依托泊苷加至處方量大豆油中40-100℃加熱溶解，得油相；(2)將油相加入水相中，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至油相均勻分散，得初乳，調(diào)pH值至4-8；(4)將初乳加入高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(6)取依托泊苷亞微乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌；(1)將處方量的EDTA、甘油與預(yù)熱至40-100℃的適量注射用水進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至各成份溶解，得水相；同時將卵磷脂、油酸、司盤20、依托泊苷加至處方量大豆油中40-100℃加熱溶解，得油相；(2)將油相加入水相中，轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)內(nèi)，攪拌數(shù)分鐘，1-5次，直至油相均勻分散，得初乳，調(diào)pH值至4-8；(4)將初乳加入高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)1-10次，取樣鏡檢，至油滴在0.5微米以下；(6)取依托泊苷亞微乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于高壓旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及含依托泊苷的脂質(zhì)微球注射液(水包油乳劑)及其制備方法。該注射液包含依托泊苷，脂溶性介質(zhì)，水和表面活性劑，以制劑質(zhì)量計(jì)本發(fā)明的配方組成為油相5％～30％，依托泊苷0.001％～0.5％，表面活性劑0.5％～5％，滲透壓調(diào)節(jié)劑0.5％～5％，其余為注射用水。將依托泊苷經(jīng)過高壓均質(zhì)，高速的氣流撞擊形成一種超音速攪拌，使藥物迅速溶解并以分子形式滲透到油水界面膜中。使依托泊苷在油水兩相的界面膜中有一定的分布(約20～80％)。本發(fā)明所述制劑應(yīng)用界面膜載藥的原理，提高了油水中均難溶的藥物依托泊苷在乳劑中的載藥量和穩(wěn)定性并降低其毒性和血管刺激性。提高了藥物化學(xué)穩(wěn)定性和療效。使本制劑應(yīng)用在臨床上具有低毒性、低刺激性和高效性的特點(diǎn)。
文檔編號A61K31/7048GK1973826SQ200610169149
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月18日
發(fā)明者唐星, 田玲玲, 張洪瑤 申請人:沈陽藥科大學(xué)