專利名稱：人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑的制作方法
技術領域：
本實用新型是涉及生物應用技術領域，特別是涉及用于一種人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑的體外診斷試劑。
背景技術：
自人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的艾滋病在20世紀80年代發(fā)現(xiàn)以來，已傳遍全球。據(jù)聯(lián)合國艾滋病總署(UNAIDS)報告，至2010年底，全球感染艾滋病人數(shù)達3700萬。我國目前大約有HIV感染者70余萬。迄今為止尚無有效的藥物及疫苗來治療和預防艾滋病，因而HIV感染已成為當今全球威脅最為嚴重的傳染病及公共衛(wèi)生問題。正由于此，HIV感染的監(jiān)測受到世界各國的高度重視，WHO、美國FDA及許多發(fā)達國家已于1985年相繼制定了有關供血者、血液制品等篩選檢查的法規(guī)，其中HIV抗體的檢測被列為常規(guī)。我國在1987年就頒布了《艾滋病監(jiān)測管理的若干規(guī)定》，在1990年和1994年又制定了有關獻血員檢查HIV抗體及加強供血員血樣檢驗用體外免疫診斷試劑的質(zhì)量控制，實行了批批檢定的規(guī)定，確保HIV檢測試劑盒有穩(wěn)定的質(zhì)量，從而有效的控制了 HIV感染的傳播。由于HIV病毒的易變性，目前還沒找到有效的疫苗，也沒有有效藥物進行有效治療。當前控制HIV病毒傳播的最有效手段就是盡早發(fā)現(xiàn)病毒攜帶者，盡早隔絕傳染源。對HIV感染者的診斷主要以檢測抗體為主。檢測方法有凝聚法、間接免疫熒光法、ELISA、金標試劑、蛋白印跡法等。第一個獲得美國FDA批準用于檢測HIV抗體的試劑盒是美國Abbott (亞倍)公司的ELISA試劑盒，之后許多國家的ELISA試劑盒也相繼投入市場，我國檢測HIV抗體的ELISA試劑盒是1989年問世的。間接免疫熒光法和凝聚法由于操作過程繁瑣，受影響因素較多，已較少采用。膠體金法是近年來發(fā)展起來的常用的檢測方法。目前應用最為普遍的是采用ELISA或膠體金人群進行初步篩選，然后對有感染可疑的樣本用蛋白印跡(Western Blot, WB)法進行確認，稱為抗體確認試劑。目前WB法國內(nèi)外只有少數(shù)幾個公司生產(chǎn)，并且反應時間長，操作煩瑣。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，具有操作簡便、快速、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。本發(fā)明提供一種人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，其特征在于，試劑包括HIV抗體試紙洗滌液、顯色系統(tǒng)、陽性對照品、陰性對照品和免疫層析結果判讀儀；所述HIV抗體試紙上包被了 10 條蛋白條帶，分別是 HIVlgpl60、gpl20、P66、p51、gp41、p24、pl7、HIV2gp36和2條不同濃度的人IgG條帶；膠體金標記的抗人IgG或SPA，或是生物素標記的抗人IgG或SPA、膠體金標記的親和素顯色系統(tǒng)。HIV抗體試紙結構為NC膜、NC膜下方緊密連接的吸樣墊和裝載NC膜及吸樣墊的塑料外殼；NC膜從一端開始，依次包被的10條蛋白條帶為高濃度人 IgG, HIVlgpl60、gpl20、P66、p51、gp41、p24、pl7、HIV2gp36 和低濃度人 IgG0 膠體金直徑為20-100nm。[0007]其中，所述HIV抗體抗確認試劑的反應結果通過免疫層析結果判讀儀是一種光學檢測系統(tǒng)進行判定。所述人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，HIV抗體試紙制備方法如下:1、包被NC膜:將蛋白用0.0lM的磷酸鹽緩沖液稀釋成0.001_2mg/ml，優(yōu)選為，高濃度人 IgG 為 0.05mg/ml,低濃度人 IgG 為 0.005mg/ml, gpl60 為 1.0mg/ml, gpl20 為 0.8mg/ml,p66 為 0.8mg/ml, p51 為 0.8mg/ml,gp41 為 0.8mg/ml, p24 為 0.5mg/ml,pl7 為 0.5mg/ml, gp36為0.6mg/ml ；NC膜選用0.45um孔徑的膜，寬度為40mm,長度為300mm ;將稀釋好的抗體裝載在噴膜機上，按lul/cm劃線，各線的間隔為2-4mm，優(yōu)選為3mm ;劃線完成后，將NC膜置于30%以下的濕度，干燥4小時以上。2、制備試紙:將NC膜橫向切成3_8mm的寬度，優(yōu)選為5臟，在NC膜下部墊上吸樣墊，吸樣墊為吸水材料，吸水能力不低于2ml，然后裝入大小合適的塑料卡內(nèi)，形成試紙。所述人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，顯色系統(tǒng)的制備方法為:1、直接顯色系統(tǒng):(I)用還原法制備濃度為0.02%的20-100nm的膠體金，優(yōu)選為40nm的膠體金；⑵用K2CO3將膠體金pH調(diào)節(jié)成8.0，按IOug抗人IgG或SPA每ml膠體金將蛋白加入，混勻30min，離心棄上清，將溶液用1/10體積的磷酸鹽緩沖液溶解，加入微量防腐劑，即成為顯色系統(tǒng)。2、生物素-親和素顯色系統(tǒng):(I)用還原法制備濃度為0.02%的20_100nm的膠體金，優(yōu)選為40nm的膠體金；(2)用無水DMSO配制10mg/ml生物素N-輕基琥拍酰亞胺酯溶液，用硼酸鹽緩沖液(0.lmol/L, pH8.8)配制濃度為2mg/ml的抗人IgG或SPA溶液，按25ug/mg的比率將生物素酯加入抗體中，混合均勻并在室溫下孵育4hr，將抗體溶液用PBS透析，以除去未結合的生物素，再稀釋成合適的比例后，制成顯色底物I ;⑶用K2CO3將膠體金pH調(diào)節(jié)成8.0,按IOug親和素每ml膠體金將蛋白加入,混勻30min,離心棄上清,將溶液用1/10體積的磷酸鹽緩沖液溶解，加入微量防腐劑，為顯色底物2 ； (4)顯色底物I和2構成顯色系統(tǒng)。所述HIV抗體抗確認試劑，陽性對照品為人HIV抗體陽性血清，經(jīng)處理后制成，其抗 HIV-1 的8 160、8 120、？66、？51、8 41、？24、？17，抗!11￥-2 的 gp36 均為陽性；陰性對照品為人HIV抗體陰性血清，經(jīng)處理后制成，抗HIV-1和HIV-2各類抗原均為陰性。洗滌液為含0.5% Tween20的0.0lM的磷酸鹽緩沖液。所述HIV抗體抗確認試劑，保存條件為2_8°C，避光保存，有效期12個月。所述人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，檢測方法如下:1、將試劑和待檢血清(漿)平衡到室溫；2-8°C保存的試劑需20_30min平衡至室溫;2、將HIV抗體試紙取出，平放，向試紙的NC膜上滴加100_150ul的待檢血清(漿)樣本，樣本將緩慢滲入NC膜，最后進入吸樣墊，此過程約2-3min ；3、向NC膜上滴加100-150ul洗滌液，等洗滌液滲入進膜后，再滴加100_150ul洗滌液，重復洗滌2次，此過程約5-8min ；
4、若采用直接顯色系統(tǒng)，向NC膜上滴加100_150ul抗人IgG或SPA標記膠體金，膠體金將將緩慢滲入NC膜，最后進入吸樣墊，此過程約2-3min ;若采用生物素-親和素顯色系統(tǒng)，向NC膜上滴加100-150ul生物素標記抗人IgG或SPA,待生物素標記抗體緩慢滲入NC膜后，再滴加100-150ul洗滌液，參照步驟3，洗滌3次，此過程約5-8min，再加入100_150ul膠體金標記的親和素，膠體金將緩慢滲入NC膜，最后進入吸樣墊，此過程約2-3min ；5、向NC膜上滴加100-150ul洗滌液，等洗滌液滲入進膜后，再滴加100_150ul洗滌液，重復洗滌I次,此過程約4-6min ；6、此時NC膜上將出現(xiàn)膠體金顯色的紅色條帶，用專用的檢測儀器或肉眼判定檢測結果。進行上述檢測時需同時平行做陽性和陰性對照，即用陽性對照品和陰性對照品同時做一次檢測。所述HIV抗體抗確認試劑，結果判定方法如下:1、條帶陰、陽性的判定方法:免疫層析結果判讀記錄儀判定方法:將反應后的HIV抗體試紙放入儀器內(nèi)，啟動設定程序，儀器將自動顯示出各條帶的檢測結果，給出定量的值，檢測出有效值(檢測值不低于低濃度IgG條帶值)為陽性，反之為陰性。檢測結果也可以用肉眼判讀法:直接觀察指定區(qū)域內(nèi)是否有顯色條帶出現(xiàn)，有條帶出現(xiàn)且強度不低于低濃度IgG強度為陽性，反之為陰性。2、檢測系統(tǒng)有效的判定，需滿足以下所有條件:陽性對照的有所條帶需顯示為陽性；陰性對照兩條IgG線需顯示為陽性，余下10條帶均需顯示為陰性；待檢樣本兩條IgG線需顯示為陽性，且所有檢測試紙中高濃度IgG條帶的強度需高于低濃度IgG條帶；否則檢測無效，需重新檢測。3、檢測結果陰陽性的判定，需在檢測系統(tǒng)有效的情況下判定:HIV抗體試紙包被的10條抗原分為以下4類:env抗原:gpl60、gpl20、gp41和gp36 (HIV-2 型)；gag 抗原:p24 和 pl7 ；Pol 抗原:p66 和 p51。陰性:所有HIV特異性條帶均判定為陰性；HIV-1陽性:至少有2條env條帶(gp41和gpl60/gpl20)為陽性，或至少I條env條帶和p24條帶同時為陽性。HIV-2疑似陽性:gp36條帶為陽性。不確定:出現(xiàn)HIV抗體特異帶，但不滿足陽性的判定標準。本專利和現(xiàn)有的產(chǎn)品或?qū)＠容^，有以下不同:(I)選用的抗原部分不同，明確選用10條的HIV抗原，用重組或合成的方法制成，而不是用HIV培養(yǎng)的病毒經(jīng)裂解制成，降低制造和判定復雜程度，提高了產(chǎn)品的精密性，但不影響判定結果；(2)采用了膠體金顯色方法，與酶顯色法相比，更為簡單、直接、穩(wěn)定；(3)明顯縮短了檢測時間，并且操作簡單，本試劑在60min內(nèi)可完成單個檢測，30個檢測所需時間不超過90min，而其它檢測需時約4小時；(4)結果可用免疫層析結果判讀記錄儀判定，與肉眼判定相比，可以檢測出更微弱的條帶，并可避免肉眼主觀判定時潛在的錯誤。綜合以上特點，本試劑是一種新型的HIV抗體確認試劑，具有操作簡便、快速、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。

附圖1為HIV抗體試紙抗原包被示意圖具體實施例實施例1:人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑的制造1、主要材料1.1HIV 特異性抗原為 HIV-1 的 gpl60、gpl20、p66、p51、gp41、p24、pl7 和 HIV-2的gp36:由北京軍事醫(yī)學科學院提供，基因工程表達的HIV抗原；人IgG和鼠抗人IgG:由深圳菲鵬生物技術有限公司提供；NC膜:美國Millipore公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG) 20000、水解蛋白:美國Sigma公司產(chǎn)品；其它試劑為為常規(guī)分析純化學試劑。1.2檢測儀器:免疫層析結判讀記錄儀，型號:NS3001，天津中新科炬生物制藥有限公司產(chǎn)品。1.3臨床血清:由公司在相關醫(yī)院獲得，HIV-1陽性樣本19份，HIV-2陽性樣本I份，已由新加坡MP試劑檢測確證。陰性樣本20份，采自健康人，臨床綜合檢測判定為陰性。2、主要方法2.1HIV抗體試紙的制備:將蛋白用0.0lM的磷酸鹽緩沖液稀釋成不同濃度，每個蛋白均設3個濃度:高濃度人IgG為0.02,0.05和0.lmg/ml，低濃度人IgG為0.002,0.005和 0.0 lmg/ml, gpl60 為 0.5、1.0、1.5mg/ml, gpl20 為 0.4、0.8、1.2mg/ml, p66 為 0.4、0.8、
1.2mg/ml, p51 為 0.4、0.8、1.2mg/ml, gp41 為 0.5、1.0、1.5mg/ml, p24 為 0.5、1.0、1.5mg/ml，pl7 為 0.25,0.5、1.0mg/ml，gp36 為 0.6、1.2、1.8mg/ml ;NC 膜選用 0.45um 孔徑的膜，寬度30mm,長度300mm ;將稀釋好的抗體裝載在噴膜機上,按lul/cm劃線,各線的間隔為3mm,劃線完成后，將NC膜置于30%以下的濕度，干燥4小時。干燥完成后用切條機將NC膜橫向切成5mm的寬度，在NC膜下部墊上吸水濾紙，吸水濾紙大小為15X30mm,6層吸水濾紙重疊擺放,吸水能力2_2.5ml,然后裝入大小合適的塑料卡內(nèi)，壓緊，形成試紙。2.2顯色系統(tǒng)的制備:用氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為40nm的膠體金溶液，制備完成后取三份膠體金，分別用0.2M K2CO3將溶液調(diào)到pH7.0、pH8.0和pH9.0o然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOOml溶液加入0.5mg、lmg、l.5mg鼠抗人IgG，將抗體滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌2小時，再滴加入到終濃度為0.1 %的PEG2000和I %的BSA進行封閉20min，標記結束后以12000r/m離心，棄上清，沉淀按原體積復溶至原體積1/10的膠體金工作液(硼酸鹽緩沖液，PH8.0，含BSA、羊血清、蔗糖、表面活性劑和防腐劑)中。2.3洗滌液的制備:為0.0lM pH7.4的磷酸緩沖液，含0.9% NaCl和0.05 %Tween20,以20倍濃縮形式保存，使用前用純化水稀釋至工作濃度。2.4對照品:用臨床血清制成。陽性對照品:選用HIV抗體陽性血清，數(shù)份血清合并，經(jīng)適當稀釋，并滅活制成，用MP試劑盒檢測,HIV-1的gpl60、gpl20、p66、p51、gp41、p24、pl7以及HIV-2的gp36均為陽性，陰性對照品:用數(shù)份健康人血清混合制成，用MP試劑盒驗證為HIV抗體陰性。2.5檢測方法:對不同濃度包被的HIV抗體試紙和不同pH標記的顯色系統(tǒng)進行逐一配對，分別用陽性對照品和陰性對照品進行檢測，檢測方法如說明書所述，檢測結果放入免疫層析結果判讀記錄儀中，設定參數(shù)，讀取各反應線的GOD值，確定產(chǎn)品的最佳參數(shù)。2.6結果判定方法:如說明書所述方法進行判定。[0051]3、結果檢測3.1包被抗原濃度的確定采用不同濃度的蛋白抗原包被后，用pH8.0標記的顯色系統(tǒng)測試，陰性對照品測試結果均為陰性，陽性對照品測試結果如下:表1:不同包被蛋白濃度的檢測值(GOD)
權利要求1.一種人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，其特征在于:試劑包括HIV抗體試紙、洗滌液、顯色系統(tǒng)、陽性對照品、陰性對照品和免疫層析結果判讀儀；所述HIV抗體試紙上包被7 10 條蛋白條帶，分別是 HIVlgpl60、gpl20、P66、p51、gp41、p24、pl7、HIV2 gp36 和 2 條不同濃度的人IgG條帶；膠體金標記的抗人IgG或SPA，或是生物素標記的抗人IgG或SPA、膠體金標記的親和素顯色系統(tǒng)。
2.根據(jù)權利要求1所述人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，其特征在于:HIV抗體試紙結構為NC膜、NC膜下方緊密連接的吸樣墊和裝載NC膜及吸樣墊的塑料外殼；NC膜從一端開始，依次包被的10條蛋白條帶為高濃度人IgG, HIV gpl60、gpl20、P66、p51、gp41、p24、pl7、HIV2 gp36 和低濃度人 IgG。
3.根據(jù)權利要求1所述人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，其特征在于:膠體金直徑為20_100nm。
專利摘要一種人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑，試劑包括人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)抗體試紙、洗滌液、顯色系統(tǒng)、陽性對照品、陰性對照品和免疫層析結果判讀儀；HIV抗體反應試紙上包被了10條蛋白條帶，分別是HIV1 gp160、gp120、P66、p51、gp41、p24、p17、HIV2 gp36和2條不同濃度的人IgG條帶；膠體金標記的抗人IgG或SPA，或是生物素標記的抗人IgG或SPA、膠體金標記的親和素組成顯色系統(tǒng)。檢測時將樣本加在HIV抗體試紙上，洗滌去除無關蛋白，用顯色系統(tǒng)進行顯色，用免疫層析結果判讀儀或肉眼根據(jù)條帶顯色情況進行結果判定，具有操作簡便、快速、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/569GK202975018SQ20122017090
公開日2013年6月5日 申請日期2012年4月23日 優(yōu)先權日2012年4月23日
發(fā)明者齊明山, 吳瀾 申請人:齊明山, 吳瀾