專利名稱：一種新的抗血小板四肽——nb06及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域一種新的具有抗血小板聚集作用的線性四肽化合物。
背景技術(shù)：
血栓形成、腫瘤轉(zhuǎn)移及骨質(zhì)破壞吸收，長期以來嚴(yán)重影響著人類的健康。近年來，隨著有關(guān)細(xì)胞間相互作用的學(xué)說——細(xì)胞粘附理論的不斷完善，細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的粘附、轉(zhuǎn)運(yùn)，被認(rèn)為是以上疾病發(fā)生的主要環(huán)節(jié)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，一種三肽序列RGD(Arg-Gly-Asp)及其相應(yīng)配體的結(jié)合，是細(xì)胞相互作用的必需環(huán)節(jié)，阻斷此環(huán)節(jié)的研究，將對以上疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床治療具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
纖維蛋白原α鏈上的RGD序列與血小板糖蛋白(GP)IIb/IIIa受體發(fā)生特異性結(jié)合，是血小板血栓形成的最后共同通路。正因?yàn)槔w維蛋白原上的RGD序列可以與血小板發(fā)生特異性結(jié)合，使得人工合成的RGD及類似物也有可能競爭性地抑制纖維蛋白原與血小板的結(jié)合。所以，在理論上可以完全阻斷血小板聚集，抑制任何原因引起的血栓形成。因而，以RGD及其類似物為基礎(chǔ)的新藥研究已成為世界許多制藥公司研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
雖然纖維蛋白原上的RGD序列在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用，但是作為藥物，僅天然的RGD序列并不能達(dá)到適宜的強(qiáng)度和選擇性。因?yàn)樗撾x了在天然蛋白中所具有的正確空間構(gòu)象。所以RGD在天然蛋白質(zhì)中的構(gòu)象以及附近的氨基酸序列，對于識(shí)別過程極為重要。周圍的氨基酸序列可以使RGD維持正確的構(gòu)象，特別是與RGD序列緊鄰的氨基酸殘基，對于維持正確的構(gòu)象更有意義。
對RGD類肽構(gòu)效關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，RGD類肽的立體構(gòu)象呈“V”字形，而“V”字角度的大小，即“V”字形頂端胍基和羧基的距離，與肽的生物活性密切相關(guān)，距離大的可以更好地與受體結(jié)合。與RGD序列相連的第四位氨基酸對其活性影響較大。Tomiyama等通過試驗(yàn)證明，RGD類肽的羧基端以疏水性氨基酸為佳，疏水性越強(qiáng)，其抑制纖維蛋白原與血小板GPIIb/IIIa受體結(jié)合的能力越強(qiáng)[J.Biol Chem，1992]。
本發(fā)明人曾將RGD類肽氨基端的精氨酸改造為ω-氨基辛酸，并將第四位氨基酸采用高疏水性的氨基酸，獲得了系列高活性的RGD類肽，成功地申請并獲得了中國發(fā)明專利(ZL 02123924.X)。
為了進(jìn)一步提高目標(biāo)化合物的生物學(xué)活性及其抗水解能力，以期開發(fā)成為功能更強(qiáng)的新一代抗血小板凝聚藥物，本發(fā)明人在上述發(fā)明基礎(chǔ)上，對四肽化合物的羧基端進(jìn)行了改造，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究，最終選擇了色氨酰胺作為RGD類肽的C端結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提供了一種新的四肽——ω-氨基辛酸-甘氨酸-天門冬氨酸-色氨酰胺肽(NB06)。本發(fā)明所涉及的新四肽序列結(jié)構(gòu)，迄今尚未見到相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的四肽，其氨基酸序列為ω-氨基辛酸-甘氨酸-天門冬氨酸-色氨酰胺肽。酰胺化的C末端使得“V”字形肽頂端的距離增大，增強(qiáng)了目標(biāo)化合物的生物學(xué)活性，同時(shí)也提高了其抗水解能力。
本發(fā)明提供了一種制備所說抗血小板四肽化合物—NB06的方法。該方法是以本發(fā)明人前述專利公開的氨基酸序列X-Gly-Asp-Y為基礎(chǔ)，將其中的X選用ω-氨基辛酸，Y選用色氨酰胺來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明NB06的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)在于對Y的選擇。在前述發(fā)明專利中規(guī)定“Y為Trp、Leu、Val、Ile、Phe、Ser中的任意一個(gè)”，均為天然氨基酸，末端為羧基。本發(fā)明中對應(yīng)的Y選用了色氨酰胺，末端進(jìn)行了酰胺化修飾，不屬于前述專利中定義的任何一個(gè)。
本發(fā)明又提供了新的四肽化合物—NB06的藥物組合物，所說組合物是以新的四肽化合物—NB06為有效成分，并含有藥學(xué)上可接受的一種或多種載體。
本發(fā)明還提供了所說新的四肽化合物—NB06抗血小板聚集活性實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與前述發(fā)明專利公開的化合物AoGDW肽相比，本發(fā)明NB06的抗血小板聚集活性提高了近四倍，并且具有更好的生物學(xué)穩(wěn)定性。
本發(fā)明所述結(jié)構(gòu)的化合物，如在NB06的N端或C端增加一個(gè)或數(shù)個(gè)天然或非天然氨基酸，即可形成的新的化合物。
本發(fā)明所述結(jié)構(gòu)的化合物，如對NB06進(jìn)行常規(guī)的化學(xué)修飾，也可形成的新的化合物。
發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果在于，經(jīng)過對氨基酸序列X-Gly-Asp-Y的修飾和改造，尤其是選用了色氨酰胺取代Y，對末端進(jìn)行了酰胺化修飾，從而大大提高了本發(fā)明所說新的四肽—NB06化合物的抗血小板聚集活性和穩(wěn)定性，為開發(fā)臨床有效的新一代抗血小板凝聚藥物奠定了良好基礎(chǔ)。


圖1-NB06化合物的高壓液相層析；圖2-NB06化合物的質(zhì)譜檢測分析。
實(shí)施方案下面給出一些實(shí)施例，目的僅僅在于更好地幫助了解本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制。
<實(shí)施例1>NB06的固相合成稱取76mg Rink Amide MBHA樹脂(載量為0.55mM/克)，于多肽反應(yīng)瓶中用二氯甲烷溶脹1小時(shí)后，抽濾除去二氯甲烷；加入20％吡啶/二甲基甲酰胺5毫升，室溫振蕩混勻10分鐘以脫去Fmoe保護(hù)基；抽濾除去脫保護(hù)液，重復(fù)脫保護(hù)一次；稱取5倍過量的Fmoc保護(hù)的色氨酸，溶于2M DIEA 1ml(或0.5ml)中，加入過量5倍的0.5M HBTU/HoBT，混勻，室溫活化10分鐘；將活化的保護(hù)氨基酸轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器，振蕩混勻，室溫反應(yīng)60分鐘后，負(fù)壓抽去液體；加入二氯甲烷4ml，振蕩混勻30秒，負(fù)壓抽去洗滌液，重復(fù)洗滌共7次；取少量肽樹脂，用茚三酮法檢測縮合效率，反應(yīng)陰性說明縮合完全，可進(jìn)行下一步，否則重復(fù)縮合一次；重復(fù)進(jìn)行脫保護(hù)—縮合反應(yīng)，分別將天門冬氨酸、甘氨酸和ω-氨基辛酸引入肽鏈。反應(yīng)結(jié)束后，將肽—樹脂抽真空干燥。
<實(shí)施例2>固相合成肽—樹脂的切割取實(shí)施例1得到的肽-樹脂，加入2毫升裂解液(95％三氟醋酸、2.5％水、2.5％三異丙基硅烷)，室溫下攪拌反應(yīng)兩小時(shí)；之后抽濾出切割液，并用少量TFA洗滌反應(yīng)瓶內(nèi)的樹脂，抽濾出TFA合并入切割液；負(fù)壓抽干濾出的切割液，行冰乙醚沉淀，分離沉淀，用1ml水溶解。
<實(shí)施例3>NB06的純化取少量溶解的切割產(chǎn)物，進(jìn)行高壓液相層析，確定產(chǎn)物的保留時(shí)間，并分離產(chǎn)物。反相高壓液相純化的條件為C8柱(3.9×150mm，waters公司)，流動(dòng)相A0.1％TFA/H2O，B0.1％TFA/乙腈，梯度洗脫，流速1ml/mm，監(jiān)測214nm吸收峰。結(jié)果如圖1有兩個(gè)主要的洗脫峰，分別是17.422分鐘的洗脫峰(記為P1)和17.712分鐘的洗脫峰(記為P2)；其中P1為目的化合物，其峰面積約占總面積的40％。收集P1洗脫峰，經(jīng)真空凍干，即為純化后的NB06。
<實(shí)施例4>NB06的質(zhì)譜(MS)鑒定于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所合成室進(jìn)行質(zhì)譜檢測。結(jié)果如圖2主峰明顯，分子量為516.2，與理論分子量相符，雜峰低而少。質(zhì)譜檢測表明合成的NB06分子量正確，純度高。
<實(shí)施例5>NB06與AoGDW肽(ω-氨基辛酸-甘氨酸-天門冬氨酸-色氨酸)的活性對比實(shí)驗(yàn)1)RGD類肽體外抗人血小板聚集實(shí)驗(yàn)方法于清晨空腹經(jīng)肘靜脈采人血，以3.8％枸櫞酸鈉抗凝(血與抗凝劑的體積比為9∶1)，室溫下，1000r/分鐘離心8分鐘，取上層血漿即為富血小板血漿(PRP，platelet-rich plasma)，分離PRP。將余血再以3000r/分鐘離心10分鐘，取上層血漿得貧血小板血漿(PPP，platelet-poor plasma)，用PPP調(diào)整PRP，使血小板數(shù)約為25萬/μL。取PRP400μL，分別加入0.9％NaCl(陰性對照)及不同濃度的RGD類肽50ul，采用比濁法測定血小板聚集率(Helena Packs-4型血小板聚集儀)，37℃以900r/分鐘，在血小板聚集儀上攪拌，孵育2分鐘后加入二磷酸腺苷(ADP)50ul，同時(shí)開始測定。測定時(shí)間為10分鐘。記錄最大血小板聚集率。
血小板聚集抑制率的計(jì)算 A0生理鹽水組最大血小板聚集率ARGD類肽的最大血小板聚集率
2)AoGDW體外抗人血小板聚集的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

由上表數(shù)據(jù)，描記抑制曲線，選取線性段進(jìn)行回歸分析，其線性回歸方程為Y＝8.3429X+3.6 (R2＝0.9836)由回歸方程計(jì)算，AoGDW體外抗人血小板聚集的IC50值為5.56uM。
3)NB06體外抗人血小板聚集的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

由上表數(shù)據(jù)，描記抑制曲線，選取線性段進(jìn)行回歸分析，其線性回歸方程為Y＝31.5X+4.8 (R2＝0.985)由回歸方程計(jì)算，NB06體外抗人血小板聚集的IC50值為1.43uM。
4)NB06與AoGDW肽的活性對比實(shí)驗(yàn)AoGDW是發(fā)明專利02123924.X所述RGD類肽中活性較好的一種，結(jié)構(gòu)與NB06接近。根據(jù)實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，NB06的抗人血小板聚集的活性是AoGDW的3.89倍，即本發(fā)明提供的的新的四肽—ω-氨基辛酸-甘氨酸-天門冬氨酸-色氨酰胺肽(NB06)，其活性提高了約4倍。
<實(shí)施例6>NB06抗人血小板聚集活性的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例1所述的活性測定方法，進(jìn)行NB06抗人血小板聚集活性測定。為觀察藥物的作用時(shí)間強(qiáng)度，即在血漿中的穩(wěn)定性，分別將NB06、AoGDW和RGDS(精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-絲氨酸)(終濃度分別為1、4和20uM)與PRP(加入量同上)37℃孵育3h后，以濃度為20uM ADP誘導(dǎo)血小板聚集，測定最大血小板聚集率。測定時(shí)間為10分鐘。所用儀器為Helena Packs-4型血小板聚集儀。相同條件下設(shè)對照組作直接檢測，以對比孵育與不孵育的活性差別。同時(shí)，用生理鹽水作陰性對照，以測定最大血小板聚集率。每組設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，測定最大血小板聚集率后，計(jì)算各組的聚集抑制率(計(jì)算方法參考實(shí)施例5)。對各抑制率求平均值后，對比不同藥品抑制血小板聚集的活性變化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下1)生理鹽水組不孵育的最大血小板聚集率為87.6，孵育3小時(shí)后的血小板聚集率為87.1；2)NB06(終濃度為1uM)的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果不孵育組的血小板聚集率分別為56.2，55.8，54.3，對應(yīng)的聚集抑制率為35.8％，36.3％，38.0％，平均聚集抑制率為36.7％。孵育3h組的血小板聚集率分別為55.1，55.7，54.8，對應(yīng)的聚集抑制率為36.7％，36.1％，37.1％，平均聚集抑制率為36.6％。
對比孵育組與不孵育組，NB06的血小板聚集抑制率幾乎無差別。這說明，在富血小板血漿(PRP)中孵育3小時(shí)后，NB06具有與孵育前相同的抗血小板聚集活性，即NB06具有極好的穩(wěn)定性。
3)AoGDW(終濃度為4uM)的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果不孵育組的血小板聚集率分別為25.8，27.4，24.5，對應(yīng)的聚集抑制率為70.6％，68.7％，72.0％，平均聚集抑制率為70.4％。孵育3h組的血小板聚集率分別為38.3，32.6，40.7，對應(yīng)的聚集抑制率為56.0％，62.6％，53.3％，平均聚集抑制率為57.3％。
對比孵育組與不孵育組，AoGDW的血小板聚集抑制率有較明顯的變化。與不孵育組相比，AoGDW孵育3小時(shí)后的抗血小板聚集活性下降為孵育前的81.4％。這說明AoGDW在富血小板血漿中可能有一定程度的降解，導(dǎo)致其抗血小板聚集活性的下降。
4)RGDS(終濃度為20uM)的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果不孵育組的血小板聚集率分別為68.5，70.2，71.6，對應(yīng)的聚集抑制率為21.8％，19.9％，18.3％，平均聚集抑制率為20.0％。孵育3小時(shí)組的血小板聚集率分別為85.9，84.2，87.0，對應(yīng)的聚集抑制率為1.4％，3.3％，0.1％，平均聚集抑制率為1.6％。
對比孵育組與不孵育組，RGDS的血小板聚集抑制率有非常明顯的變化。與不孵育組相比，RGDS孵育3h后的抗血小板聚集活性幾乎消失，僅為孵育前活性的8％。這說明RGDS在富血小板血漿中有明顯的降解，導(dǎo)致其抗血小板聚集活性明顯下降，甚至消失。
5)三種RGD類肽的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比由上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與血漿在體外共同孵育3小時(shí)后，NB06仍具有幾乎100％的活性；AoGDW的活性降低為約80％；而RGDS的活性幾乎完全喪失。這說明，NB06具有很好的抗血小板穩(wěn)定性，這與其酰胺化的C末端結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系。
權(quán)利要求
1.一種新的抗血小板四肽化合物-NB06，其氨基酸序列為ω-氨基辛酸-甘氨酸-天門冬氨酸-色氨酰胺。
2.權(quán)利要求1所述四肽化合物-NB06在制備抗血小板凝聚及治療心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述化合物的藥物組合物，其特征是它以所含治療有效量的上述化合物為活性成分，并且含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
4.如權(quán)利要求3所述組合物在制備抗血小板凝聚及治療心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的抗血小板聚集四肽－NB06，其氨基酸序列為ω－氨基辛酸－甘氨酸－天門冬氨酸－色氨酰胺肽，酰胺化的C末端可使“V”字形肽頂端的距離拉大，從而增強(qiáng)了目標(biāo)化合物的生物學(xué)活性，同時(shí)也提高了其抗水解能力，為其制備抗血小板聚集和治療心腦血管疾病藥物奠定了良好基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K38/07GK101045746SQ20071008747
公開日2007年10月3日 申請日期2007年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月20日
發(fā)明者牛勃, 王國亮, 羅佳, 王建華, 馮倩佳, 李樂意, 李樂工, 韓銳 申請人:牛勃