專利名稱：結合血小板生成素受體的肽和化合物的制作方法
結合血小板生成素受體的肽和化合物本申請是以下申請的分案申請申請日2004年8月13日；申請?zhí)?200480031452. 0 (PCT/US2004/026422)；發(fā)明名稱同上。相關申請的相互參照本申請要求2003年8月觀號提交的申請60/498，740的優(yōu)先權。 發(fā)明領域本發(fā)明提供了結合并激活血小板生成素受體(c-mpl或TP0-R)或用作TPO激動劑的肽和化合物。本發(fā)明可應用于生物化學和醫(yī)療化學領域，具體地說提供TPO激動劑用于治療人類疾病。
背景技術：
巨核細胞是骨髓來源的細胞，負責生產(chǎn)循環(huán)血的血小板。盡管在大多數(shù)物種中它們占少于0.25%的骨髓細胞，其容積是典型骨髓細胞的10倍以上。參見Kuter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :11104-11108 (1994)。巨核細胞進行稱為核內(nèi)有絲分裂的過程，在該過程中它們復制它們的核但是沒有進行細胞分裂，因此產(chǎn)生了多倍體細胞。為響應血小板計數(shù)的下降，核內(nèi)有絲分裂速率增加，形成更高多倍體的巨核細胞，巨核細胞數(shù)可以增至 3倍。參見Harker, J. Clin. Invest. ,47 :458-465(1968)。相反的，為響應血小板計數(shù)的提高，核內(nèi)有絲分裂速率下降，形成較低多倍體的巨核細胞，巨核細胞數(shù)可減少50%。循環(huán)血小板的數(shù)量調(diào)控核內(nèi)有絲分裂速率和骨髓巨核細胞數(shù)量的確切生理學反饋機制還不清楚?，F(xiàn)在認為涉及調(diào)節(jié)該反饋回路的循環(huán)血小板生成因子是血小板生成素 (TPO)。更具體的是，已經(jīng)顯示TPO是涉及血小板減少的情況中的主要體液調(diào)控因子。參見，例如，Metcalf，Nature，369 :519-520(1994)。幾項研究顯示，TPO增加血小板計數(shù)，增加血小板大小，促進同位素摻入接受動物的血小板。具體地說，TPO被認為通過某些途徑影響巨核細胞生成(1)它增加巨核細胞的尺寸和數(shù)量；(2)它以多倍體形式增加巨核細胞中的 DNA含量；(3)它增加巨核細胞的核內(nèi)有絲分裂；(4)它促進巨核細胞的成熟；(5)它增加骨髓中小乙酰膽堿酯酶陽性細胞形式的前體細胞的百分比。因為血小板是凝血必需的，當它們的數(shù)量非常低時，患者有死于災難性出血的嚴重風險，TPO在診斷和治療各種血液疾病(例如主要由于血小板缺陷的疾病)中具有潛在的有價值應用。正在進行的TPO臨床試驗已表明可安全地給予患者ΤΡ0。另外，近來的研究也為治療血小板減少中TPO療法的有效性預測(projection)提供了基礎，尤其是在治療癌癥或淋巴瘤中由化療、放療或骨髓移植導致的血小板減少。參見例如McDonald，Am. J. Ped. Hematology/Oncology, 14 :8-21 (1992)。已克隆并鑒定編碼TPO的基因，參見Kuter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91 11104-11108(1994) ；Barley 等，Cell 77:1117-1124(1994) ；Kaushansky 等，Nature 369 568-571(1994) ；Wendling 等，Nature，369 :571-574(1994)；和 Sauvage 等，Nature 369 533-538(1994)。血小板生成素是至少具有兩種形式的糖蛋白，表觀分子量為和 31kDa，N末端氨基酸序列相同。參見Bartley等，Cel 1，77 1117-1124 (1994)。血小板生成素顯示出具有兩個明顯不同的區(qū)域，被潛在的Arg-Arg切割位點分開。氨基端區(qū)域在人和小鼠中高度保守，并和促紅細胞生成素、干擾素_a和干擾素_b有某些同源性。羧基末端區(qū)域顯示出很大的種族差異。已描述了人TP0-R(也稱為c-mpl)的DNA序列和其編碼的肽序列。參見Vigon等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :5640-5644 (1992)。TPO-R 是血細胞生成素生長因子受體家族的成員，該家族特征為胞外結構域的共有結構方案，包括N末端部分中4個保守的C殘基和臨近跨膜區(qū)的 WSXWS 基序(SEQ ID NO :1)。參見 Bazan，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 6934-6938(1990)。該受體在血細胞生成中起著功能性作用的證據(jù)包括，觀察到它的表達在小鼠中限于脾、骨髓或胚胎肝臟(參見Souyri等，Cell 63 1137-1147 (1990))，在人中限于巨核細胞、血小板和CD34+細胞(參見Methia等，Blood 82 1395-1401 (1993)) 而且， 使CD34+細胞暴露于合成的mpl RNA反義寡核苷酸顯著抑制巨核細胞集落的出現(xiàn)，而不影響紅細胞系或髓細胞系集落的形成。某些研究者推測該受體作為同型二聚體發(fā)揮功能，類似于G-CSF和促紅細胞生成素的受體的情況?？色@得TPO-R克隆基因促進了尋找該重要受體的激動劑?？色@得重組受體蛋白使受體-配體相互作用的研究可在各種隨機和半隨機肽多樣性產(chǎn)生系統(tǒng)中進行。這些系統(tǒng)包括美國專利5，270，170和5，338，665中描述的“質(zhì)粒上的肽”系統(tǒng)；1991年6月20日提交的美國專利申請07/718，577、1990年6月20日提交的美國專利申請07/541，108和Cwirla 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :6378-6382(1990)中描述的“噬菌體上的肽”；1994 年 9 月2日提交的美國專利申請08/300，262和PCT WO 95/11992中描述的“核糖體”系統(tǒng)，前一申請為基于1993年10月四日提交的美國專利申請08/144，775的部分繼續(xù)申請；1993年 11月12日提交的美國專利申請08/146，886、1992年9月16日提交的07/946，239和1991 年9月18日提交的07/762，522中描述的“編碼合成文庫”系統(tǒng)；以及美國專利5，143，854、 1990年12月13日公開的PCT專利申請90/15070、1990年12月6日公開的美國專利申請 07/624，120、Fodor 等，Science，251 :767-773 0/1991)、Dower 等，Ann. Rep. Med. Chem. ,26 271-180(1991)和1991年12月6日提交的美國專利申請07/805，727中描述的“極大規(guī)模固定化聚合物合成”系統(tǒng)；上述每個專利申請和出版物通過引用結合到本文中?；佳“鍦p少的患者中血小板水平恢復緩慢是嚴重的問題，迫切需要找到能加速血小板再生的血液生長因子激動劑。本發(fā)明提供這種激動劑。發(fā)明概述本發(fā)明部分涉及新的意外發(fā)現(xiàn)，即定義的低分子量肽和肽模擬物具有強的TPO-R 結合特性，并可激活TP0-R。因此，該肽和肽模擬物可在治療由TPO介導的疾病(例如由化療、放療或骨髓輸入導致的血小板減少)中用于治療目的，在研究造血機制中用于診斷目的以及用于體外擴增巨核細胞和定向祖細胞。適合于治療或診斷目的的肽和肽模擬物的IC5tl是約2mM或更低，IC5tl由以下實施例3中說明的結合親合力試驗來測定，其中較低的IC5tl對應于和TPO-R的結合親合力較強。 對于藥用目的，肽和肽模擬物的IC5tl優(yōu)選不超過約100 μ Μ,更優(yōu)選不超過500ηΜ。在優(yōu)選的實施方案中，肽或肽模擬物的分子量是約250至約8，000道爾頓。如果本發(fā)明的肽寡聚化、 二聚化和/或用本文描述的親水性聚合物衍生化，這種肽的分子量會顯著增大，可在約500 至約120，000道爾頓的范圍內(nèi)的任何地方，更優(yōu)選約8，000到約80，000道爾頓。
在用于診斷目的時，本發(fā)明的肽和肽模擬物優(yōu)選用可檢測標記標記，因此，沒有這種標記的肽和肽模擬物作為制備標記肽和肽模擬物的中間體。符合分子量和TPO-R結合親合力的既定標準的肽包含9個或更多的氨基酸，其中氨基酸是天然的或是合成的(非天然的)氨基酸。因此，優(yōu)選的肽和肽模擬物包括的化合物及其生理可接受的鹽具有(1)小于約5000道爾頓的分子量，(2)用IC5tl表示的TPO結合親合性不超過約100 μ Μ, 其中肽的0個至所有一C (0) NH-鍵已被選自以下的鍵置換-CH20C (0) NR-鍵、膦酸酯鍵、-CH2S (0) 2NR—鍵、-CH2NR-鍵、一C (0) NR6-鍵和一NHC (0) NH-鍵，其中 R 是氫或低級烷基，R6是低級烷基，另外其中所述肽或肽模擬物的N端選自-NRR1基團、-NRC (0) R基團、-NRC (0) OR 基團、-NRS (0) 2R基團、-NHC (0) NHR基團、琥珀酰亞胺基團、芐氧基羰基-NH—基團和在苯環(huán)上含有1-3個取代基的芐氧基羰基-NH-基團，所述取代基選自低級烷基、低級烷氧基、 氯和溴，其中R和R1獨立選自氫和低級烷基，再另外其中所述肽或肽模擬物的C端具有式一C(O)R2,其中R2選自羥基、低級烷氧基和-NR3R4,其中R3和R4獨立選自氫和低級烷基，其中-NR3R4的氮原子可任選為肽N端的胺基，使得形成環(huán)肽。在相關的實施方案中，本發(fā)明涉及標記的肽或肽模擬物，它們包括共價結合了可檢測標記的上述肽或肽模擬物。在一個實施方案中，核心肽化合物包含氨基酸序列(SEQ ID NO 2)X9X8GX1X2X3X4X5X6X7其中X9 為 A、C、E、G、I、L、M、P、R、Q、S、T 或 V ;X8 為 A、C、D、E、K、L、Q、R、S、T 或 V ； \為β-(2-萘基)丙氨酸殘基(本文稱為“2-Nal”)。更優(yōu)選X9S A或I A8為D、E或K。 另外 & 為 C、L、M、P、Q、V ；X2 為 F、K、L、N、Q、R、S、T 或 V ；X3 為 C、F、I、L、M、R、S、V 或 W ；X4 為任何20種遺傳編碼的L-氨基酸；X5為A、D、E、G、K、M、Q、R、S、Τ、V或Y ；X7為C、G、I、K、 L、M、N、R 或 V。特別優(yōu)選的肽包含氨基酸序列(SEQ ID NO 3) 1 E G P T L R Q(2-Nal)L AAR A0在另一個實施方案中，本發(fā)明的肽化合物優(yōu)選二聚化或寡聚化，以增加化合物的親合力和/或活力。優(yōu)選的二聚化肽化合物的實例包括但不限于
權利要求
1.一種結合血小板生成素受體的化合物，所述化合物具有(1)小于8000道爾頓的分子量，(2)用IC5tl表示的對血小板生成素受體的結合親合性不超過100μ M，其中所述化合物由以下氨基酸序列組成X9X8GX1X2X3X4X5X6X7其中 X9 為 Α、C、E、G、I、L、Μ、P、R、Q、S、T 或 V ；X8 為 Α、C、D、Ε、K、L、Q、R、S、T 或 V ；X1 為 C、L、Μ、P、Q、V ；X2 為 F、K、L、N、Q、R、S、T 或 V ；X3 為 C、F、I、L、M、R、S、V 或 W ；X4 為任何 20 種遺傳編碼的 L-氨基酸；X5 為 A、D、E、G、K、M、Q、R、S、Τ、V 或 Y ；X7 為 C、G、I、K、L、Μ、N、 R或VA6為β-(2-萘基)丙氨酸。
2.權利要求1的化合物，其中所述氨基酸序列為二聚化的。
3.一種化合物在制備激活細胞中血小板生成素受體的藥物中的用途，所述化合物的分子量小于8000道爾頓，所述化合物由以下的氨基酸序列組成X9X8GX1X2X3X4X5X6X7其中 X9 為 Α、C、E、G、I、L、Μ、P、R、Q、S、T 或 V ；X8 為 Α、C、D、Ε、K、L、Q、R、S、T 或 V ；X1 為 C、L、Μ、P、Q、V ；X2 為 F、K、L、N、Q、R、S、T 或 V ；X3 為 C、F、I、L、M、R、S、V 或 W ；X4 為任何 20 種遺傳編碼的 L-氨基酸；X5 為 A、D、E、G、K、M、Q、R、S、Τ、V 或 Y ；X7 為 C、G、I、K、L、Μ、N、 R或VA6為β-(2-萘基)丙氨酸。
4.權利要求3的用途，其中所述氨基酸序列為二聚化的。
全文摘要
公開了結合并激活血小板生成素受體(c-mpl或TPO-R)或用作TPO激動劑的肽和化合物。
文檔編號C07KGK102241742SQ20111013419
公開日2011年11月16日 申請日期2004年8月13日 優(yōu)先權日2003年8月28日
發(fā)明者B·R·麥唐納德, E·J·尤爾科, J·K·維斯 申請人:奧索-麥克尼爾藥品公司