專利名稱：：用于治療呼吸道合胞病毒感染的重組多克隆抗體的制作方法用于治療呼吸道合胞病毒感染的重組多克隆抗體發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于預(yù)防、治療或減輕與呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)感染相關(guān)的一種或多種癥狀的重組多克隆抗體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生抗RSV重組多克隆抗體(抗RSVrpAb)的多克隆表達(dá)細(xì)胞系。進(jìn)一步，本申請(qǐng)描述了包含抗RSVrpAb的診斷和藥物組合物，及其在預(yù)防、治療或減輕與RSV感染相關(guān)的一種或多種癥狀方面的用途。發(fā)明背景呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒下呼吸道疾病的主要原因。具有潛在健康問題(例如慢性肺病或先天性心臟病)的未成熟嬰幼兒在RSV感染后具有最大的罹患嚴(yán)重疾病(例如細(xì)支氣管炎和肺炎)的危險(xiǎn)。最近，還將RSV認(rèn)為是某些高危成年人，例如免疫受損的成年人，特別是接受骨髓移植者，大齡個(gè)體和患有慢性肺部疾病的個(gè)體中的重要病原體。人RSV是葛'J津占病毒-牛(family尸"rawyxov7'n'(iag)肺病毒(尸"ew附ov/rws)亞科的成員，以A和B亞型存在。RSV是有包膜、非分段型、負(fù)義RNA病毒。病毒基因組編碼至少11種蛋白，其中3種是包膜相關(guān)蛋白，F(xiàn)(融合糖蛋白)、G(受體結(jié)合糖蛋白)和SH(小疏水蛋白)。包膜蛋白存在于病毒表面，并且在某種程度上也存在于被感染細(xì)胞的表面。F蛋白促進(jìn)病毒與細(xì)胞膜的融合，由此使病毒RNA滲透進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。F蛋白由2個(gè)二硫鍵連接的亞單位F!和F2組成，其是通過蛋白酶切割574個(gè)氨基酸的無活性、N糖基化前體產(chǎn)生的。G蛋白是II型跨膜糖蛋白，具有289-299個(gè)氨基酸(取決于病毒林系)。前體形式是32kDa,其在同時(shí)添加了N-和O-連接的寡糖后成熟為80-90kDa的蛋白質(zhì)。RSVG蛋白負(fù)責(zé)將病毒體附著于靶細(xì)胞。G蛋白除了膜結(jié)合形式之外，還會(huì)產(chǎn)生截短的可溶形式。有人提出，這樣的功能是重定向(redirect)免疫應(yīng)答，使之背離病毒和被感染細(xì)胞。而且已經(jīng)顯示，G蛋白與許多前炎性效應(yīng)，例如趨化因子和細(xì)胞因子表達(dá)的修飾以及白細(xì)胞征集(leukocyterecruitment)有關(guān)。SH蛋白是64-65個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，以極低量存在于純化的RSV顆粒的表面上，但是在RSV感染的細(xì)胞的表面上大量表達(dá)。SH蛋白的功能還不明確，但是它可能幫助病毒蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)通過高爾基復(fù)合體(Rixonetal2004,J.Gen.Virol.85:1153-1165)。認(rèn)為阻斷G和F蛋白的功能與預(yù)防RSV感染有關(guān)。在過去十年里，預(yù)防和治療RSV感染受到了相當(dāng)大的關(guān)注，并包括疫苗開發(fā)、抗病毒化合物(Ribavirin已被批準(zhǔn)用于治療)、反義藥物、RNA干擾(RNAi)技術(shù)和抗體產(chǎn)品，例如免疫球蛋白和單克隆抗體(均綜述于MaggonandBarik，2004,Rev.med.Virol.14:149-168中)。這些方法中，靜脈內(nèi)免疫球蛋白R(shí)SV-IVIG和單克隆抗體Palivizumab(帕利珠單抗)已被批準(zhǔn)用于高危孩童的RSV預(yù)防。然而，已知免疫球蛋白產(chǎn)品如RSV-IVIG(RespiGam)具有幾個(gè)缺點(diǎn)，如低特異活性導(dǎo)致需要大體積注射，這在由于先前的強(qiáng)化治療導(dǎo)致靜脈輸入受限制的孩子中具有困難。而且，還有從得自于血清的免疫球蛋白產(chǎn)品傳播病毒疾病的危險(xiǎn)，以及批次間的差異問題。最后，難以獲得足夠的供體以滿足對(duì)超免疫RSV免疫球蛋白產(chǎn)品的需求，因?yàn)橹挥写蠹s8%的正常供體具有足夠高的RSV中和抗體效價(jià)(RSVneutralizingantibodytiter)。也已顯示針對(duì)F蛋白或G蛋白的單克隆抗體具有體外中和效果和體內(nèi)預(yù)防效果(例如，BeelerandCoelingh1989.J.Virol.63:2941-50;Garcia-Barrenoetal.1989.J.Virol.63:925-32;Tayloretal.1984.Immunology52:137-142;Walshetal.1984,InfectionandImmunity43:756-758;US5,842,307和US6,818,216)。今天，單克隆抗體Palivizumab已經(jīng)幾乎完全取代了RSV-IVIG的使用。中和實(shí)驗(yàn)顯示，Palivizumab和RSV-IVIG對(duì)RSVB亞型的作用相當(dāng)，而對(duì)于A亞型，Palivizumab效果更好(Johnsonetal.1997.J.Infect.Dis.176:1215-24.)。然而，盡管如通過產(chǎn)品例如Palivizumab和Numax所證實(shí)的單克隆抗體具有良好的中和和預(yù)防效果，但是這些也可能與由于RSV病毒本身引起的某些缺陷有關(guān)。RSV存在兩種不同的抗原群或亞型A和B。大多^:RSV蛋白在這兩個(gè)亞群之間是高度保守的，其中F蛋白顯示有91。/。的氨基酸相似性。然而，G蛋白顯示有廣泛的序列變異性，在A和B亞群之間只有53%的氨基酸相似性(Sullender2000.Clin.Microbiol.Rev.13:1-15)。除了G蛋白之外，大多數(shù)蛋白還顯示一些有限的亞群內(nèi)變異，在氨基酸水平上，A亞群內(nèi)有高達(dá)200/0的差異，B亞群內(nèi)有高達(dá)9%的差異。A和B病毒亞型在大多凄tRSV流行病中共傳播，不同年份之間有相對(duì)頻率變化。因此，必須仔細(xì)選擇單克隆抗體，以便能夠同時(shí)中和兩種亞型以及亞型內(nèi)變異體。除了兩種RSV亞型和亞型內(nèi)多樣性的問題之外，人RSV與大多數(shù)RNA病毒一樣，在選擇壓力下具有快速突變的能力。使用mAb在體外選擇RSV逃逸突變體已有充分描述(welldocumented)(例如，Garcia-Barrenoetal.1989.J.Virol.63:925-32)。重要的是，最近發(fā)現(xiàn)Palivizumab也會(huì)選擇逃逸突變體，無論在體外還是體內(nèi)，一些分離的突變體在棉鼠體內(nèi)對(duì)Palivizumab預(yù)防完全抵抗(ZhaoandSullender2005.J.Virol.79:3962-8andZhaoetal.2004.J.Infect.Dis.l卯:1941-6.)。進(jìn)一步，還可能存在本身對(duì)Palivizumab有抗性的野生型RSV病毒林，如通過作為Palivizumab起源的鼠科動(dòng)物抗體不能中和一種臨床分離物所證明的(BeelerandCoelingh1989.J.Virol.63:2941-50)。而且，在免疫活性棉鼠體內(nèi)進(jìn)行Palivizumab預(yù)防后還鑒定了一種明顯有抗性的病毒(Johnsonetal.1997.J.Infect.Dis.176:1215-24)。因此，在某些條件下，使用單一的單特異性抗體可能不足以或足夠用于治療RSV疾病，因?yàn)榇嬖谔右萃蛔凅w，或者作為治療的結(jié)果隨時(shí)間產(chǎn)生逃逸突變體。關(guān)于RSV-IVIG和Palivizumab使用的進(jìn)一步的考慮是實(shí)現(xiàn)有效治療所需的劑量。已經(jīng)顯示大于30嗎/ml的血清濃度是使棉鼠RSV感染模型中肺部RSV復(fù)制降低100倍所必需的。對(duì)于RSV-IVIG,靜脈內(nèi)施用750mg總蛋白/kg的月劑量可有效降低高危孩童RSV住院治療的發(fā)生率，而對(duì)于Palivizumab,每月15mg/kg的肌內(nèi)劑量已證實(shí)是有效的。然而，多次靜脈內(nèi)或肌內(nèi)大劑量施用對(duì)于患者而言不方便，從而妨礙這些產(chǎn)品在預(yù)防和治療大群具有RSV感染危險(xiǎn)的成人中的廣泛使用。因此，需要有一種抗體產(chǎn)品，其不依賴于供體的可得性，并免疫特異性地結(jié)合于一種或多種RSV抗原，含蓋了A和B亞型以及任何由于病毒突變產(chǎn)生的逃逸突變體，并且效力高，具有改進(jìn)的藥物代謝分布(pharmacokineticprofile)，乂人而具有整體上改進(jìn)的治療"i普(therapeuticprofile),因此所需施用頻次更少和/或施用劑量更低。貢獻(xiàn)的公開(DisclosureofContribution)因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供高效力替代型抗RSV免疫球蛋白產(chǎn)品，其是重組產(chǎn)生的，對(duì)呼吸道合胞病毒的A和B亞型顯示反應(yīng)性，以及對(duì)至少一種主表面抗原上的多個(gè)表位顯示反應(yīng)性，從而限制逃逸突變的可能性。本發(fā)明還有一個(gè)目的，就是提供新型人抗RSV抗體分子及其衍生物，其中該抗體分子或衍生物與現(xiàn)有單克隆抗RSV抗體和抗體衍生物相比顯示有改進(jìn)的特性。發(fā)明的描述使用耙向RSV上多個(gè)表位的多克隆抗體組合物預(yù)期使逃逸突變體的發(fā)生最小化，并且還能夠針對(duì)多種多樣的天然傳播的病毒提供保護(hù)。與血清來源的RSV-IVIG相比，本發(fā)明的多克隆抗體不包含與非RSV抗原結(jié)合的抗體分子。本發(fā)明提供了多克隆抗RSV抗體。優(yōu)選地，該多克隆抗RSV抗體,人天然不產(chǎn)生抗體的細(xì)胞獲得。這種抗體稱作重組多克隆抗體(rpAb)。本發(fā)明的抗RSVrpAb定向針對(duì)F或G蛋白上的多個(gè)表位。具體地，同時(shí)定向針對(duì)G和F蛋白上多個(gè)表位的抗RSVrpAb是優(yōu)選的。優(yōu)選地，抗RSVrpAb涵蓋屬于保守群以及潛在的屬于亞型特異群和抹特異群的G蛋白表位。進(jìn)一步，針對(duì)第三包膜蛋白，小疏水(SH)蛋白有反應(yīng)性的抗體是本發(fā)明抗RSVrpAb的期望組分。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了藥物組合物，其活性成分是抗RSV多克隆抗體，還提供了這些組合物用于預(yù)防、減輕或治療RSV感染方面的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于反映(mirror)RSV感染引起的體液免疫應(yīng)答的方法，其是通過從這些被刺激的(challenged)個(gè)體分離原始的VH和V^基因?qū)?，并產(chǎn)生保持這種原始配對(duì)的抗體來進(jìn)行。定義術(shù)語"抗體，，描述血清的功能成分，通常是指分子(抗體或免疫球蛋白)的集合，或者一個(gè)分子(抗體分子或免疫球蛋白分子)?？贵w分子能夠結(jié)合或者與特異的抗原決定簇(抗原或抗原表位)反應(yīng)，其繼而(inturn)可誘發(fā)免疫效應(yīng)物機(jī)制。單個(gè)抗體分子通常被視作是單特異性的，抗體分子的組合物可以是單克隆的(也就是，包含相同的抗體分子)或者多克隆的(也就是，包含子)。每個(gè)抗體分子具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，使它能夠特異性結(jié)合于其相應(yīng)抗原，所有天然抗體分子均具有相同的整體基本結(jié)構(gòu)，有兩個(gè)相同的輕鏈和兩個(gè)相同的重鏈?？贵w還被統(tǒng)稱為免疫球蛋白。本文使用的術(shù)語抗體以其最廣泛的意義使用，并包括完整抗體、嵌合的、人源化的、全人(fullyhuman)和單鏈抗體，以及抗體的結(jié)合片段，例如Fab、Fv片段或scFv片段，以及多聚體形式，例如二聚體IgA分子或五價(jià)IgM。在一些情況下，本申請(qǐng)使用術(shù)語"合成或半合成抗體類似物"，其特異指顯示抗體特性(顯示與RSV抗原特異性結(jié)合)的非天然存在的分子，并且包括來自天然存在抗體的CDRs-這種類似物的代表是例如scFv片段、雙特異抗體(diabody)等，但也可為例如看起來天然存在的抗體，其^皮工程化/人而包含來自本文公開的抗RSV抗體分子的CDRs(例如，通過本領(lǐng)域已知的移植技術(shù)(grafingtechniques)來進(jìn)行)-例如，這樣的抗體類似物可以包括整合入另一動(dòng)物物種的抗體分子中或整合入相同物種的不同抗體亞型或類型中的本文公開的CDRs。術(shù)語"抗RSV重組多克隆抗體"或者"抗RSVrpAb"描述的是重組產(chǎn)生的多種抗體分子的組合物，其中單個(gè)成員能夠結(jié)合于呼吸道合胞病毒上的至少一個(gè)表位，并且該多克隆組合物作為整體能夠中和RSV。優(yōu)選地，抗RSVrpAb組合物中和兩種RSV亞型A和B。更優(yōu)選地，抗RSVrpAb進(jìn)一步包含對(duì)于G和F蛋白的結(jié)合反應(yīng)性。優(yōu)選地，該組合物從單個(gè)多克隆制造細(xì)胞系(polyclonalmanufacturingcellline)產(chǎn)生。術(shù)語"同源Vh和ViJ扁碼對(duì)"描述的是包含在相同細(xì)胞內(nèi)或者由相同細(xì)胞得到的Vh和Vt編碼序列的原始配對(duì)。因此，同源Vh和V^對(duì)代表最初存在于產(chǎn)生這種細(xì)胞的供體內(nèi)的Vh和Vt配對(duì)。術(shù)語"從VH和VL編碼對(duì)表達(dá)的抗體"是指，抗體或抗體片段從含有該Vh和Vt編碼序列的載體、質(zhì)?；蝾愃莆锂a(chǎn)生。當(dāng)同源Vh和Vt編碼對(duì)被表達(dá)時(shí)，無論是作為完整抗體還是作為其穩(wěn)定的片段，它們保留最初由產(chǎn)生它們的細(xì)胞表達(dá)的抗體的結(jié)合親和性和特異性。同源配對(duì)文庫也稱作同源配對(duì)的庫(repertoire)或集合，其可以單獨(dú)保存或者匯集(pooled)保存。術(shù)語"重組多克隆抗體的不同成員"是指重組多克隆抗體組合物的單個(gè)抗體分子，包括可變區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)伸展片段(stretch)，其特征在于與多克隆蛋白的其它各成員相比，氨基酸序列有差異。這些伸展片段具體位于CDR1、CDR2和CDR3區(qū)。術(shù)語"表位"一般用于描述在動(dòng)物體內(nèi)，優(yōu)選地在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，最優(yōu)選地在人體內(nèi)，具有抗原或免疫原活性的較大分子的一定比例份(proportion)或者較大分子(例如抗原或抗原位點(diǎn))的一部分。具有免疫原活性的表位是引起動(dòng)物體內(nèi)抗體響應(yīng)的較大分子的一部分。具有抗原活性的表位是與抗體免疫特異性結(jié)合的較大分子的一部分，如通過本領(lǐng)域熟知的任何方法，例如通過本文描述的免疫測(cè)定法所確定的?？乖砦徊恍枰欢ㄊ敲庖咴缘?。抗原是與抗體或抗體片段免疫特異性結(jié)合的物質(zhì)，例如毒素、病毒、細(xì)菌、蛋白質(zhì)或DNA。抗原或抗原位點(diǎn)經(jīng)常具有多于一個(gè)表位，除非它們非常小，并且經(jīng)常能夠刺激免疫應(yīng)答。與相同抗原上的不同表位結(jié)合的抗體可以對(duì)其所結(jié)合抗原的活性具有不同的作用，這取決于表位的位置。與抗原活性位點(diǎn)內(nèi)的表位結(jié)合的抗體可完全阻斷抗原的功能，而結(jié)合于不同表位的另一抗體可單獨(dú)對(duì)抗原的活性沒有或者有很小的影響。然而，這樣的抗體仍可激活補(bǔ)體，由此造成抗原的消除，并且當(dāng)與一種或多種結(jié)合于相同抗原上不同表位的抗體組合時(shí)可導(dǎo)致協(xié)同作用。在本發(fā)明中，表位為其一部分的較大分子優(yōu)選地是RSV多肽的一部分。本發(fā)明的抗原優(yōu)選地是RSV相關(guān)蛋白、其與抗體或抗體片段免疫特異性結(jié)合的多肽或片段。RSV相關(guān)抗原還可以是RSV多肽或其與抗體或抗體片段免疫特異性結(jié)合的片段的類似物或衍生物。術(shù)語"全人，，在用于例如涉及DNA、RNA或蛋白序列時(shí)，是指有98-100%是人的序列。術(shù)語"免疫球蛋白，，一般用作在血液或血清中發(fā)現(xiàn)的抗體混合物的總體名稱，但是也可以用于表示從其它來源產(chǎn)生的抗體的混合物。當(dāng)涉及多克隆抗體使用術(shù)語"反映體液免疫應(yīng)答"時(shí)是指如下的抗體組合物，其中編碼各個(gè)抗體成員的核酸序列來源于供體，所述供體具有提高的產(chǎn)生抗RSV特異性抗體的漿細(xì)胞的頻數(shù)(frequency)。這種供體可以是從RSV感染中恢復(fù)的，與RSV感染的個(gè)體有過親密接觸的，或者接受過RSV疫苗接種的(例如RSV疫苗，參見例如MaggonandBarik,2004，Rev.med.Virol.14:149-168)。為了反映供體在受到感染或刺激后引起的抗體的親和性和特異性，編碼可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的序列應(yīng)當(dāng)保持當(dāng)其被分離時(shí)原始存在于供體內(nèi)的基因配對(duì)或組合(同源配對(duì))。為了反映供體內(nèi)體液免疫應(yīng)答的多樣性，根據(jù)篩選方法選擇編碼與RSV結(jié)合的抗體的全部序列。對(duì)被分離序列進(jìn)行分析，分析可變區(qū)，特別是CDR區(qū)的多祥性以及Vh和VL家族。根據(jù)這些分析，選擇出代表RSV結(jié)合抗體整體多樣性的同源對(duì)群體。這種多克隆抗體通常具有至少5、10、20、30、40、50、100、1000或104個(gè)不同成員。如果其施用能夠被接受患者所耐受，則稱該組合物是"藥物可接受的"，該定義同樣適用于作為組合物組分的賦形劑、媒介物、載體和稀釋劑。術(shù)語"多克隆抗體，，描述的是能夠結(jié)合于或者與相同或不同抗原上的幾種不同的特異性抗原決定簇/表位反應(yīng)的不同(多種)抗體分子的組合物，其中組合物中的每個(gè)單獨(dú)抗體能夠與特定的表位反應(yīng)。通常，多克隆抗體的可變性位于所謂的多克隆抗體可變區(qū)，特別是CDR1、CDR2和CDR3區(qū)。在本發(fā)明中，多克隆抗體可以從多克隆細(xì)胞系以一鍋(onepot)產(chǎn)生，或者可以是不同多克隆抗體的混合物。單克隆抗體的混合物并不同樣地被認(rèn)為是多克隆抗體，因?yàn)樗鼈冊(cè)诟髯缘呐沃挟a(chǎn)生，而且不必來自相同的細(xì)胞系，這會(huì)造成例如翻譯后修飾差異。然而，如果單克隆抗體混合物提供的抗原/表位的覆蓋范圍與本發(fā)明的多克隆抗體相同，則它可認(rèn)為是多克隆抗體的等同物。當(dāng)陳述多克隆抗體的成員特異性結(jié)合于或者具有針對(duì)抗原/抗原位點(diǎn)/表位的特異反應(yīng)性時(shí)，本文中是指該結(jié)合常數(shù)低于100nM，優(yōu)選低于10nM，甚至更優(yōu)選地低于1nM。術(shù)語"重組抗體"用于描述從用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或細(xì)胞系表達(dá)的抗體分子或者數(shù)種分子，該表達(dá)載體包括并非與細(xì)胞天然關(guān)聯(lián)的抗體的編碼序列。如果重組抗體組合物中的抗體分子是多樣的或者不同的，則根據(jù)多克隆抗體的定義使用術(shù)語"重組多克隆抗體"或"rpAb"。術(shù)語"重組多克隆細(xì)胞系，，或"多克隆細(xì)胞系"是指用一系列(arepertoireof)與被轉(zhuǎn)染細(xì)胞非天然關(guān)聯(lián)的變體核酸序列(例如一系列編碼抗體的核酸序列)轉(zhuǎn)染的蛋白表達(dá)細(xì)胞的混合物/群體。優(yōu)選地，進(jìn)行轉(zhuǎn)染使得共同構(gòu)成重組多克隆細(xì)胞系的各個(gè)細(xì)胞每個(gè)攜帶單個(gè)不同目標(biāo)核酸序列的轉(zhuǎn)錄活性拷貝，其編碼目標(biāo)重組多克隆抗體的一個(gè)成員。甚至更優(yōu)選的，只有不同核酸序列的單個(gè)拷貝整合在基因組中的特定位點(diǎn)。例如通過抗生素篩選來選擇構(gòu)成重組多克隆細(xì)胞系的細(xì)胞其保持不同目標(biāo)核酸序列的整合拷貝的能力?？蓸?gòu)成這種多克隆細(xì)胞系的細(xì)胞可以是例如細(xì)菌、真菌、真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是永生哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞(例如Sp2/0細(xì)胞、NS0)、NIH3T3、YB2/0和永生人細(xì)胞，例如HeLa細(xì)胞、HEK293細(xì)胞或PER,C6。術(shù)語"編碼Vh和V^對(duì)的序列"或者"VH和VL編碼序列對(duì)"是指核酸分子，其中每個(gè)分子包括編碼用于表達(dá)可變重鏈和可變輕鏈的序列，從而在存在合適的啟動(dòng)子和/或IRES區(qū)并且與所述序列可操作連接時(shí)，這些可以從所述核酸分子成對(duì)表達(dá)。核酸分子還可以編碼重鏈和/或輕鏈的部分恒定區(qū)或完整恒定區(qū)，使得在存在合適的啟動(dòng)子和/或IRES區(qū)并且與所述序列可操:作連接時(shí)，允許Fab片段、全長(zhǎng)抗體或者其它抗體片段表達(dá)。如果施用量在生理上足以例如預(yù)防或者減弱動(dòng)物或人體的RSV感染，則稱重組多克隆抗體以"治療有效量"施用。圖1:(A)來自原型抹(prototypicstrain),Long(A亞型)和18537(B亞型)，的完整G蛋白的氨基酸序列比對(duì)。信號(hào)/跨膜區(qū)用虛線框出。Caneetal.1991J.Gen.Virol.72:2091-2096鑒定的氨基酸101-133和208-299之間的兩個(gè)可變區(qū)用下劃線標(biāo)出。G蛋白的中心片段已在大腸桿菌Co/0中作為融合蛋白表達(dá)，并用黑線框出。在SEQIDNOs:711(A亞型)和712(B亞型)中列出了2個(gè)氨基酸序列。(B)如(A)中所示的中心片段的比對(duì)。13-aa保守區(qū)(a,a.殘基164-176)和G蛋白富半胱氨酸區(qū)(GCRR)的位置用括號(hào)指示。GCRR中的二硫橋(兩種亞型相同)用方括號(hào)指示。在SEQIDNOs:713(A型)和714(B亞型)中列出了2個(gè)氨基酸序列。圖2:多倍重疊延伸RT匿PCR(multiplexoverlapextensionRT畫PCR)(A)和克隆步驟(B)的示意流程。(A)使用分別特異于VH和VK基因家族的兩對(duì)引物CH+VH1-8和VK1-6+CK1進(jìn)行第一PCR步驟。VH或VK引物之間的同源區(qū)導(dǎo)致產(chǎn)生重疊PCR產(chǎn)物。在第二步驟中，該產(chǎn)物在嵌套PCR中擴(kuò)增。引物還包括限制酶的識(shí)別位點(diǎn)以便于克隆。(B)匯集所產(chǎn)生的同源聯(lián)結(jié)VH和VK編碼對(duì)，并利用側(cè)翼的^zol和限制位點(diǎn)插入到哺乳動(dòng)物IgG表達(dá)載體(例如圖3)中。隨后，將雙向啟動(dòng)子插入到位于聯(lián)結(jié)Vh和VK編碼序列之間的Jscl-M2el限制位點(diǎn)內(nèi)，從而便于全長(zhǎng)抗體的表達(dá)。使用的PCR引物如水平箭頭所示。CHI:重鏈恒定區(qū)1,CL:恒定區(qū)，LC:輕鏈；Ab:抗體；Pl-P2:雙向啟動(dòng)子。圖3:哺乳動(dòng)物全長(zhǎng)抗體表達(dá)載體00-VP-530的示意表達(dá)。載體包括如下元件Amp和Amppro=氨節(jié)青霉素抗性基因及其啟動(dòng)子。pUCorigen=pUC復(fù)制起點(diǎn)。Pl=驅(qū)動(dòng)輕鏈表達(dá)的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。P2=驅(qū)動(dòng)重鏈表達(dá)的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。LeaderIGHV=基因組人重鏈前導(dǎo)序列。VH=重鏈可變區(qū)編碼序列。IgGl=編碼基因組免疫球蛋白Gl亞型重鏈恒定區(qū)的序列。兔B-球蛋白A=兔卩-球蛋白polyA序列。Kappaleader=編碼鼠類k前導(dǎo)序列的序列。LC=輕《連編碼序列的序列。SV40term=猿K吳病毒40終止子序列。FRT二Flp識(shí)別靶位點(diǎn)。Neo=新霉素抗性基因。SV40polyA-猿猴病毒40多聚A信號(hào)序列。圖4:利用Biacore分析對(duì)從克隆801(Ab801)獲得的抗體的表位特異性進(jìn)行表征。抗體801的結(jié)合在與蛋白F結(jié)合的成對(duì)竟?fàn)幹羞M(jìn)行測(cè)試，使用三種抗體，9c5(2),133-h(3)和Palivizumab(4)，它們分別結(jié)合抗原位點(diǎn)Fl,C和II。對(duì)照細(xì)胞說明非竟?fàn)嶢b801(l)與蛋白F的結(jié)合。四種抗體的注射時(shí)間用箭頭指示。響應(yīng)用相對(duì)共振單位(resonanceunit)(RU)表示。長(zhǎng)雙頭箭頭指示非竟?fàn)庬憫?yīng)的大小(magnitude)，短雙頭箭頭指示9c5抑制響應(yīng)的大小。圖5:顯示RSV亞型A和B抹系的體外中和的結(jié)果。測(cè)試抗F抗體混合物的稀釋物中和RSVLong(圖A)和RSVB1(圖B)抹的能力。從克隆810、818、819、825和827獲得的抗體混合物抗F(I)顯示為三角形(A)，從克隆735、800、810、818、819、825、827、863、880、884和894獲得的抗體混合物抗F(II)顯示為用方形(B)。Palivizumab顯示為菱形(令)，而與亞型相配的負(fù)對(duì)照(抗恒河猴(Rhesus)D)抗體顯示為圓形(*)。測(cè)量490nm吸光度，并與RSV復(fù)制關(guān)聯(lián)。圖6:顯示體外RSV融合抑制測(cè)定的結(jié)果。測(cè)試抗體混合物的稀釋物中和RSVB1林的能力。從克隆810、818、819、825、827、793、796、838、841、856和888獲得的抗體混合物抗F(I)G用空方形(口)表示，從克隆735、訓(xùn)、810、818、819、825、827、863、880、884、894、793、796、838、841、856和888獲得的抗體混合物抗F(II)G用空三角形(A)表示。Palivizumab用菱形(令)表示。測(cè)量490nm吸光度，并與RSV復(fù)制關(guān)聯(lián)。圖7:顯示在活化補(bǔ)體存在下如通過PRNT測(cè)得的抗G抗體克隆組合在體外中和RSV的結(jié)果。在兔補(bǔ)體存在下,各種抗體組合物(表8中所述)的稀釋物用RSV病毒抹Long溫育，之后使之感染HEp-2細(xì)胞。溫育24小時(shí)后，使用免疫檢測(cè)RSV特異性斑點(diǎn)(plaque)測(cè)定感染程度。抗RSVrpAb13用空三角形(A)表示，抗RSVrpAb35用三角形(A)表示，抗RSVrpAb36用方形(B)表示，抗RSVrpAb41用圓形(參)表示，抗RSVrpAb45用空方形(口)表示。數(shù)據(jù)用相對(duì)于對(duì)照的％感染±SD表示。發(fā)明詳述乾我^和/^;謦拔傳逸合參本發(fā)明的多克隆抗體由同一組合物中的大量不同的抗體分子組成。每種分子根據(jù)其結(jié)合RSV相關(guān)抗原的能力加以選擇。本發(fā)明多克隆抗體包含的結(jié)合反應(yīng)性與構(gòu)成該多克隆抗體組合物的不同抗體分子的匯集的(compiled)結(jié)合反應(yīng)性相對(duì)應(yīng)。本發(fā)明的抗RSV多克隆抗體優(yōu)選包含針對(duì)G和F蛋白的匯集的結(jié)合反應(yīng)性，更優(yōu)選針對(duì)多個(gè)表位的匯集的結(jié)合反應(yīng)性，以使產(chǎn)生逃逸突變體的危險(xiǎn)最小化，并獲得盡可能高的中和能力。在F蛋白上已經(jīng)鑒定了至少5個(gè)被中和抗體識(shí)別的主抗原位點(diǎn)(L叩ezetal.1998.J.Virol.72:6922-8)。所有抗原位點(diǎn)均映像(mapped)于Fi鏈，并包括位點(diǎn)I、II、IV、V和VI,其中位點(diǎn)I和II還分別稱作B和A。位點(diǎn)II位于N末端片段中的蛋白酶抗性區(qū)，位點(diǎn)IV、V和VI位于蛋白富半胱氨酸區(qū)的C末端。位點(diǎn)I位于該半胱氨酸簇的中間。F蛋白上的另外一個(gè)抗原位點(diǎn)是位點(diǎn)C,其中有包括氨基酸位置241和242的表位F2。此外，有與稱作Fl的抗原位點(diǎn)結(jié)合的單克隆抗體，F(xiàn)l包括稱為Fla、Flb和Flc的表位。目前，該抗原位點(diǎn)尚未映射于F蛋白上的特定位置。這些位點(diǎn)/表位的大部分產(chǎn)生廣泛中和性抗體，但是一些特異于抗原位點(diǎn)I的抗體顯示是A亞型特異的。與位點(diǎn)I結(jié)合的抗體在病毒中和中還具有邊際效應(yīng)(marginaleffect)。Palivizumab識(shí)別的表位位于抗原位點(diǎn)II,如通過選擇的在氨基酸位置272發(fā)生的逃逸突變的定位來判斷的(Zhaoetal.2004.J.Infect.Dis.l卯:1941-6)。此外，在G蛋白上已經(jīng)鑒定了3種類型的表位i)保守表位，其存在于所有RSV抹內(nèi)，ii)群特異性表位，其存在于所有屬于相同亞型的病毒內(nèi)，和iii)株特異性或可變表位，其僅存在于屬于相同亞型的抹的亞系列內(nèi)。保守的和群特異性表位已經(jīng)映射于G蛋白的中心部分，所述G蛋白包括四半胱氨酸(氨基酸殘基173、176、182和186)簇和在全部人RSV分離物中相同序列的短氨基酸片段(殘基164-176)。半胱氨酸簇由位置173-183和176-182之間的二硫鍵保持，并構(gòu)成G蛋白富半胱氨酸區(qū)(GCRR)的中心部分，其范圍是氨基酸殘基171-187，由此GCRR與13個(gè)氨基酸的保守區(qū)重疊。G糖蛋白看起來在誘導(dǎo)保護(hù)免疫性和疾病發(fā)病中均起作用。例如，小鼠研究顯示G糖蛋白引發(fā)(primesfor)Th2CD4+T細(xì)胞響應(yīng)，其特征是IL-4、IL-5、IL-13和肺嗜酸細(xì)胞增多癥(pulmonaryeosinophilia)的產(chǎn)生。嗜酸性細(xì)胞的募集和活化受幾種因子的促進(jìn)，如IL-4和IL-5。而且，在急性感染期間小鼠中的RSVG蛋白的表達(dá)與經(jīng)過修飾的先天免疫應(yīng)答相關(guān)，其特征是Thl細(xì)胞因子(例如IL-2和y干擾素)表達(dá)降低，趨化因子mRNA(例如MIP-la、MIP-1p、MIP-2、IP-IO、MCP-1)表達(dá)改變，和與被感染肺傳輸(trafficking)的NK細(xì)胞降低。特別地，GCRR已顯示在調(diào)節(jié)先天炎性響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，由此潛在延遲了RSV清除(Polacketal.2005.PNAS102:8996-9001)。GCRR包括位于氨基酸位置182-186的CX3C基序。被RSV感染的小鼠的呼吸速度降低已顯示與CX3C基序相關(guān)，因?yàn)獒槍?duì)該基序的抗體消除呼吸速度的降低(Trippetal.2003.J.Virol.77:6580-6584andUS2004/0009177(申請(qǐng)?zhí)?0/420,387))。林特異表位優(yōu)選地位于第三G多肽的可變C末端，盡管抹特異表位已經(jīng)映射于G蛋白胞外域(ectodomain)半胱氨酸蔟的可變區(qū)N末端(Martinezetal.1997.J.Gen.Virol.78:2419-29)。圖1顯示來自Long病毒抹(A亞型)和18537病毒林(B亞型)的G蛋白的比對(duì)，指示了G蛋白的各個(gè)區(qū)域。一般地，單克隆抗G蛋白抗體對(duì)RSV中和具有邊際效應(yīng)。然而，據(jù)報(bào)道單克隆抗G抗體的混合物在體外和體內(nèi)增強(qiáng)RSV的中和(Walshetal.1989.J.Gen.Virol.70:2953-61andMartinezandMelero1998J.Gen.Virol.79:2215-20)。當(dāng)抗體結(jié)合不同的表位時(shí)，明顯獲得組合單克隆抗G抗體的最大效果，盡管仍然有一部分病毒對(duì)中和保有抗性。而且，已經(jīng)顯示，組合兩種具有不同表位特異性的不同抗F抗體或者組合一種抗F和一種抗G特異性抗體顯示對(duì)RSV的增強(qiáng)的體外中和效果(Andersonetal.1988.J,Virol.62:4232-4238)。通過混合單克隆抗體獲得的一些優(yōu)點(diǎn)似乎是由于單克隆抗體的單獨(dú)的(individual)性質(zhì)，例如拮抗效應(yīng)，例如通過活性位點(diǎn)阻斷。其它效應(yīng)似乎通過目前尚不理解的原因而協(xié)同作用。RSV中和的機(jī)制復(fù)雜，且未完全理解。在F和G蛋白上單獨(dú)鑒定的大量不同表位，保守的、亞型特異性以及抹特異性表位，以及逃逸突變體的潛在產(chǎn)生表明，需要有廣譜的抗體特異性，以用于在RSV感染的預(yù)防中可發(fā)揮作用的全部中和機(jī)制。因此，理性地講，選擇能夠預(yù)防以A和B亞型RSV病毒抹以及逃逸突變體和今天已知的從RSV病毒株產(chǎn)生的新病毒林引起的RSV感染的單克隆抗體混合物是非常困難的。本發(fā)明的一個(gè)方面是提供具有相當(dāng)多樣而廣泛的抗RSV特異性的多克隆抗RSV抗體。本發(fā)明的多克隆抗RSV抗體在生產(chǎn)時(shí)不依賴于供體的可得性，并且批次之間的差異與在得自于供體的抗RSV免疫球蛋白產(chǎn)品(例如RSVIVIG)中觀察到的相比要低得多。在本發(fā)明的多克隆抗RSV抗體中，所有的單個(gè)抗體成員均能夠結(jié)合RSV相關(guān)抗原，并且該多克隆抗體能夠中和RSV亞型A和B。優(yōu)選地，多克隆抗體的每種不同抗體與不被多克隆抗體的任何其它成員結(jié)合的表位結(jié)合。本發(fā)明的多克隆抗RSV抗體以多價(jià)形式與RSV抗原結(jié)合，這通常產(chǎn)生協(xié)同中和，受感染細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬的改進(jìn)，和對(duì)受感染細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的改進(jìn)，以及增加的補(bǔ)體激活。而且，本發(fā)明的多克隆抗體不會(huì)被非結(jié)合蛋白"稀釋"，而RSVIVIG則會(huì)，其需要有750mg總蛋白/kg的劑量才會(huì)有效。750mg總蛋白中RSV特異性抗體的百分比未知，但是不可能占多于最大1%，很可能更低。因此，當(dāng)估計(jì)Palivizumab的體外效力是RSVIVIG的25-30倍高時(shí)(Johnsonetal.1997.J.Infect.Dis.176:1215-24),這可以被RSVIVIG減少的比活性補(bǔ)償。因此，如果RSV-IVIG中含有的免疫球蛋白分子僅1。/。對(duì)RSV有特異性，那么RSV-IVIG多克隆抗體的活性劑量只有7.5mg/kg，這低于單克隆抗體Palivizumab的活性劑量。由于這些原因，本發(fā)明的重組多克隆RSV特異性抗體預(yù)期比單克隆抗體顯著更高效，因此與Palivizumab和RSVIVIG的有效劑量相比，可能的是施用更小劑量的本發(fā)明多克隆抗體。因此，本發(fā)明的多克隆抗RSV抗體還被認(rèn)為適合于預(yù)防和治療高危成年人，特別是骨髓移植接受者，大齡個(gè)體和患有慢性肺部疾病的個(gè)體。本發(fā)明多克隆抗RSV抗體的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，單個(gè)抗體成員的濃度顯著低于單克隆抗體的濃度(即使是使用的劑量相同)，因此個(gè)別抗體被接受治療的個(gè)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別為外來物的可能性降低，并且即使某一個(gè)單獨(dú)的抗體被患者的免疫應(yīng)答消除，也不可能影響多克隆抗RSV抗體的中和能力或者清除速度，因?yàn)槭Ｓ嗟目贵w成員仍保持完整。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是能夠中和RSV亞型A和B的重組多克隆抗RSV抗體，其中所述多克隆抗體包括不同的抗體成員，其聯(lián)合起來特異性結(jié)合至少一種RSV包膜蛋白上的至少3個(gè)不同的表位。優(yōu)選地，F(xiàn)蛋白被至少3種不同的抗體成員特異性結(jié)合，所述表位優(yōu)選位于不同的抗原位點(diǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是能夠中和RSV亞型A和B的重組多克隆抗RSV抗體，其中所述多克隆抗體包括不同的抗體成員，其聯(lián)合起來提供針對(duì)至少兩種RSV包膜蛋白的特異反應(yīng)性。這兩種包膜蛋白可以從RSVG蛋白、RSVF蛋白和RSVSH蛋白中選擇。優(yōu)選地，本發(fā)明的多克隆抗RSV抗體包括抗G和抗F反應(yīng)性。這種多克隆抗體的抗G和抗F反應(yīng)性優(yōu)選包括至少兩種不同的抗G抗體和至少一種不同的抗F抗體。優(yōu)選地，至少3種不同的抗體與不同的表位結(jié)合，由此覆蓋至少3個(gè)不同的表位，并且這些抗體一起能夠同等地中和RSV亞型A和亞型B病毒抹。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的多克隆抗RSV抗體的抗G和抗F反應(yīng)性包括下述抗G和抗F反應(yīng)性的任意組合。最優(yōu)選地，本發(fā)明的多克隆抗RSV抗體包括針對(duì)下文提到的全部抗原位點(diǎn)/表位的抗G和抗F反應(yīng)性。為了獲得本發(fā)明多克隆抗RSV抗體可能的最廣泛的特異性，理想的是，一個(gè)或者多個(gè)，優(yōu)選全部抗原位點(diǎn)被多于一個(gè)不同的抗體覆蓋。因此，優(yōu)選地，相同抗原或抗原位點(diǎn)上的幾個(gè)表位被本發(fā)明多克隆抗體的不同成員結(jié)合。關(guān)于本發(fā)明多克隆抗RSV抗體的抗G反應(yīng)性，該反應(yīng)性優(yōu)選地被定向針對(duì)保守表位。甚至更優(yōu)選地，抗G反應(yīng)性包括能夠特異性結(jié)合G蛋白上保守表位的第一抗G抗體，和能夠特異性結(jié)合G蛋白富半胱氨酸區(qū)(GCRR)的第二抗G抗體。多克隆抗RSV抗體優(yōu)選包括至少兩種不同的抗G抗體，其中至少一種第一抗體能夠特異性結(jié)合G蛋白上的保守表位，至少一個(gè)第二抗體能夠特異性結(jié)合不同的保守表位或識(shí)別亞型A或亞型B的群特異表位。優(yōu)選地，多克隆抗體包括至少三種不同的抗G抗體，其中第一抗體能夠特異性結(jié)合G蛋白上的保守表位，第二抗體能夠特異性結(jié)合A亞型的G蛋白，第三抗體能夠特異性結(jié)合B亞型的G蛋白。G蛋白富半胱氨酸區(qū)(GCRR)與保守表位所處的上游13氨基酸區(qū)及群特異表位所處的區(qū)域部分重疊。因此，如果能夠特異性結(jié)合保守表位的抗體以及群特異抗體所識(shí)別的表位位于GCRR內(nèi)，則它們可以結(jié)合GCRR。優(yōu)選地，至少一種以結(jié)合保守表位或抹特異表位為特征的不同抗體也識(shí)別GCRR。從病毒中和的觀點(diǎn)來看，結(jié)合GCRR之CX3C基序的抗體是特別優(yōu)選的。然而，與CX3C基序結(jié)合的抗體還結(jié)合大量其它不相關(guān)的人抗原，如fractalkine和其它人CX3C趨化因子，因而產(chǎn)生不期望的副作用，這意味著測(cè)試這類抗體的交叉反應(yīng)性(例如在實(shí)施例中對(duì)于某些抗體所例證的)以及隨后在合適的模型系統(tǒng)中測(cè)試相同的抗體是合理的方法。無論如何，在能夠在某種程度上確認(rèn)給定藥物，例如本發(fā)明的抗體不具有、有很少或者至少可以接受的副作用之前，總是需要對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。除了保守的和群特異抗G反應(yīng)性之外，本應(yīng)性。定向針對(duì)在過去5年內(nèi)曾導(dǎo)致RSV感染的病毒抹上存在的最豐富的抹特異性表位的抹特異性抗G反應(yīng)性是優(yōu)選的。在本發(fā)明中，抹特異性表位可理解為僅存在于有限數(shù)目RSV病毒林上的表位。添加群特異性和/或抹特異性抗G抗體能夠?yàn)楸景l(fā)明的抗RSV抗體提供額外的多樣性，并且在與對(duì)G蛋白保守區(qū)具有反應(yīng)性的抗體組合時(shí)可誘發(fā)協(xié)同作用。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗G抗體直接中和RSV,阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞，防止細(xì)胞遷移，抑制炎性響應(yīng)和/或預(yù)防合胞體形成。關(guān)于本發(fā)明多克隆抗RSV抗體的抗F反應(yīng)性，該反應(yīng)性優(yōu)選定向針對(duì)一個(gè)或多個(gè)抗原位點(diǎn)I、II、IV、V、VI、C或F1上的至少一個(gè)表位。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，這些抗原位點(diǎn)/表位中的至少2、3、4、5、6個(gè)或全部^L本發(fā)明多克隆抗RSV抗體中的不同抗體覆蓋。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗F抗體直接中和RSV和/或阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞和/或預(yù)防合胞體形成。在本發(fā)明的多克隆抗RSV抗體組合物中，其中該組合物不包括定向針對(duì)F蛋白上全部抗原位點(diǎn)的結(jié)合反應(yīng)性，優(yōu)選存在至少一種不同的抗F抗體，其特異性結(jié)合抗原位點(diǎn)II的表位。甚至更優(yōu)選地，位點(diǎn)II特異的抗F抗體與和抗體Palivizumab相同的表位或抗原位點(diǎn)結(jié)合。除了位點(diǎn)II特異的抗體之外，還期望一種或多種不同的位點(diǎn)IV特異的抗F抗體，這樣的抗體優(yōu)選地與和RSVF2-5相同的表位結(jié)合。亞型特異的抗F抗體在本領(lǐng)域中也是已知的。然而，因?yàn)镕蛋白在兩亞型A和B之間顯示有91%的氨基酸相似性，所以亞型特異的抗F抗體不如抗G抗體豐富。然而，這些林特異的抗F抗體有助于獲得盡可能廣泛的特異性，因此也是本發(fā)明多克隆抗RSV抗體的理想組分。除了上述的RSVG和F蛋白抗原之外，RSV病毒還表達(dá)第三包膜蛋白，小疏水(SH)蛋白。已顯示針對(duì)來自SH蛋白的肽產(chǎn)生的超免疫血清在體外不能中和RSV(Akerlind-Stopneretal.1993J.Med.Virol.40:112-120)。然而，因?yàn)樵摰鞍字饕诒桓腥炯?xì)胞上表達(dá)，所以我們相信，針對(duì)SH蛋白的抗體對(duì)融合抑制具有作用，并可能與針對(duì)RSV感染的體內(nèi)保護(hù)有關(guān)。這得到如下事實(shí)的支持，即缺乏SH基因的RSV病毒林的復(fù)制效率在上呼吸道內(nèi)弱為1/10(10-foldless)(Bukreyevetal.1997J.Virol.71:8973-82)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是能夠中和RSV亞型A和B，并包含抗SH反應(yīng)性和抗G或抗F反應(yīng)性的多克隆抗RSV抗體。SH蛋白從氨基酸41到6^65(亞型A/B)的C末端暴露在細(xì)胞表面上。因此，針對(duì)位于該區(qū)域內(nèi)的表位的抗SH反應(yīng)性是理想的。SH蛋白的C末端在A和B亞型中不同，因此在本發(fā)明的多克隆抗體中期望包括針對(duì)A和B兩種亞型的抗SH反應(yīng)性。特異性結(jié)合SHA亞型，第二抗體能夠特異性結(jié)合SHB亞型。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多克隆抗RSV抗體包括針對(duì)SHA和/或B亞型的特異反應(yīng)性以及針對(duì)G蛋白的特異反應(yīng)性。針對(duì)G蛋白的反應(yīng)性可由上述的任何反應(yīng)性組成。在可選擇的實(shí)施方案中，針對(duì)SHA和/或B亞型的特異反應(yīng)性可以和上文描述的任何抗F反應(yīng)性組合，從而組成多克隆抗RSV抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，多克隆抗RSV抗體包括針對(duì)全部三種包膜蛋白F、G和SH的反應(yīng)性。本發(fā)明多克隆抗RSV抗體包括的反應(yīng)性可以構(gòu)成具有針對(duì)表1中總結(jié)的抗原/抗原位點(diǎn)和/或表位的特異結(jié)合反應(yīng)性的不同抗體的任何可能的組合，只要該組合能夠中和RSV亞型A和B即可。優(yōu)選地，該組合包含針對(duì)至少兩種RSV包膜蛋白的反應(yīng)性。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多克隆抗體的各個(gè)不同抗體成員其自身具有中和/或抗炎性質(zhì)。然而，沒有這些特定性質(zhì)的抗體也在RSV清除中發(fā)揮作用，例如通過補(bǔ)體激活。表l:RSV相關(guān)抗原、抗原位點(diǎn)和表位的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>優(yōu)選地，本發(fā)明的多克隆抗體從非天然表達(dá)抗體分子的多克隆細(xì)胞系作為單批或少數(shù)幾批產(chǎn)生(也稱作重組多克隆抗體表達(dá))。產(chǎn)生重組多克隆抗體與混合單克隆抗體相比的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，同時(shí)(以與生產(chǎn)單個(gè)單克隆抗體相似的成本)產(chǎn)生不限數(shù)目的不同抗體分子的能力。因此，有可能包括具有針對(duì)大量RSV相關(guān)抗原的反應(yīng)性的抗體，而不會(huì)顯著提高終產(chǎn)物的成本。特別是對(duì)于像生物學(xué)尚未完全理解的RSV—樣復(fù)雜的靶標(biāo)，不顯示單獨(dú)中和除了上述那些之外，在多克隆抗體組合物中包括不同的抗體是有利的，唯一的標(biāo)準(zhǔn)是單個(gè)抗體結(jié)合RSV相關(guān)抗原(例如通過與被RSV感染的細(xì)胞結(jié)合來進(jìn)行評(píng)估)。優(yōu)選地，上述所有多克隆抗RSV抗體組合物都是重組多克隆抗RSV抗體(抗RSVrpAb)組合物。獲得結(jié)合尚未被證實(shí)為相關(guān)抗原但可能是相關(guān)抗原的RSV靶抗原的潛在相關(guān)抗體的一種方法，是產(chǎn)生如下的多克隆抗體組合物，其由被RSV感RSV的全免疫應(yīng)答的抗體之外，還可對(duì)與抗原結(jié)合的抗體進(jìn)行陽性選擇，所述抗原^f艮可能與保護(hù)、中和和/或消除RSV感染特別相關(guān)。而且，如果針對(duì)被認(rèn)為與保護(hù)、中和和/或消除RSV相關(guān)的特定抗原、抗原位點(diǎn)或表位的抗體在供體的全免疫應(yīng)答中沒有被鑒定，那么這類抗體可以用該特定抗原對(duì)供體進(jìn)行免疫/疫苗接種而產(chǎn)生(選擇的免疫應(yīng)答)。一般地，中和通過體外中和測(cè)定加以評(píng)估，例如斑點(diǎn)還原(plaquereduction),微量中和或融合抑制測(cè)定(e.g.Johnsonetal.1997.J.Infect.Dis.176:1215-24)。因此，在這些測(cè)定中的其中之一內(nèi)與負(fù)對(duì)照相比具有顯著效果的抗體或抗體組合物可認(rèn)為有中和作用。保護(hù)作用一般通過例如棉鼠模型(例如Johnsonetal.1997.J.Infect.Dis.176:1215-24)或者鼠科動(dòng)物模型(例如Tayloretal.1984.Immunology52,137-142和Mejias,etal.2005.Antimicrob.AgentsChemother.49:4700-4707)中的體內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。體內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)可以以預(yù)防模式(其中在病毒刺激之前施用抗體)或作為治療(其中在病毒刺激之后施用抗體)或者以兩者的組合來進(jìn)行。本發(fā)明的多克隆抗體組合物可由能夠結(jié)合未必已知或未必是包膜蛋白的RSV抗原的抗體(該抗體與被感染細(xì)胞結(jié)合，但并非與所選抗原或抗原位點(diǎn)結(jié)合)組成，但是其中抗體是從RSV感染后的全免疫應(yīng)答中獲得的，例如通過從患有RSV感染或從RSV感染中恢復(fù)的一個(gè)或多個(gè)供體獲得編碼不同抗體的核酸序列。其次，來自同一全免疫應(yīng)答、根據(jù)其結(jié)合特定抗原、抗原位點(diǎn)和/或表位的能力選擇的抗體也包含在本發(fā)明的多克隆抗體中。第三，用特定RSV相關(guān)抗原免疫/疫苗接種一個(gè)或多個(gè)供體，由此在這些供體內(nèi)產(chǎn)生"選擇的"免疫應(yīng)答，由從這些供體獲得的Vh和VL對(duì)編碼的不同抗體也包含在本發(fā)明多克隆抗體組合物中。因此，通過在本發(fā)明中提到的任何技術(shù)得到的抗體均可組合到單個(gè)多克隆抗體中。優(yōu)選地，編碼本發(fā)明抗體的核酸從人供體獲得，所產(chǎn)生的抗體是全人抗體。本發(fā)明多克隆抗體組合物背后的動(dòng)機(jī)是如果受RSV感染的供體產(chǎn)生針對(duì)該抗原的體液免疫應(yīng)答，則這些抗體可能(至少在一定程度上)有利于病毒清除，由此有資格包含在多克隆抗體產(chǎn)品中。本發(fā)明另外的方面是產(chǎn)生抗RSVrpAb，其中不同抗體成員的組合物反映了體液免疫應(yīng)答針對(duì)RSV包膜抗原的多樣性、親和性和特異性。優(yōu)選地，通過保證滿足如下的一條或多條來確立體液響應(yīng)的反映i)編碼這類抗RSVrpAb中各個(gè)抗體成員的Vh和Vl區(qū)的核酸序列源自于如下的供體，其在例如RSV感染后產(chǎn)生針對(duì)RSV的體液免疫應(yīng)答；ii)從供體中分離Vh和Vl編碼序列，從而保持供體中存在的Vh和Vj扁碼序列的原始配對(duì)；iii)選擇編碼rpAb各個(gè)成員的Vh和Vl^于，使得CDR區(qū)盡可能多樣化；或者iv)選擇抗RSVrpAb各個(gè)成員的特異性，使得抗體組合物整體與在哺乳動(dòng)物中引起顯著抗體響應(yīng)的抗原結(jié)合。優(yōu)選地，抗體組合物整體與在所述供體的血清樣品中產(chǎn)生顯著抗體效價(jià)(titer)的抗原、抗原位點(diǎn)和/或表位結(jié)合。這些抗原、抗原位點(diǎn)和/或表位總結(jié)于上面的表1中，但是還可構(gòu)成未知的抗原、抗原位點(diǎn)和/或表位以及非包膜抗原，如上文所述。優(yōu)選地，供體是人，而多克隆抗體是全人抗體。本發(fā)明鑒定了一系列Vh和Vt對(duì)，其能夠表達(dá)為與RSV相關(guān)抗原特異結(jié)合的全長(zhǎng)抗體、Fab片段或其它抗體片段。特異的Vh和VL對(duì)在實(shí)施例2的表5中以克隆號(hào)標(biāo)識(shí)。含有在表5中標(biāo)識(shí)的Vh和V^對(duì)的抗體優(yōu)選地是全人抗體。然而，如果期望，也可以產(chǎn)生嵌合抗體。本發(fā)明優(yōu)選的抗RSV重組多克隆抗體由不同的成員組成，所述成員包括從表5中列舉的Vh和Vt對(duì)的組中選擇的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)。優(yōu)選地，CDR區(qū)保持表5中指示的配對(duì)，并插入到期望的框架內(nèi)。選擇地，來自第一克隆重鏈的CDR區(qū)(CDRH)與來自第二克隆輕鏈的CDR區(qū)(CDRL)結(jié)合(Vh和VL對(duì)的亂序(scrambling))。CDR區(qū)還可以在輕鏈和重鏈內(nèi)亂序，例如通過組合來自第一克隆的CDRL1區(qū)和來自第二克隆的CDRL2和CDRL3區(qū)。這種亂序優(yōu)選在結(jié)合相同抗原的克隆之間進(jìn)行。本發(fā)明的CDR區(qū)還可以(例如通過點(diǎn)突變)進(jìn)行親和性成熟。為、岸和逸舉^Tf重鏈和^Tf控^絲碼對(duì)產(chǎn)生抗RSV重組多克隆抗體組合物的方法包括從合適的來源分離編碼可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VO的序列，由此生成VH和VL編碼對(duì)的庫(repertoire)。一般地，用于獲得Vh和VL編碼序列的合適來源是含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分，例如來自被RSV感染的或從RSV感染恢復(fù)的動(dòng)物或人的血液、脾或骨髓樣品，或者來自用RSV病毒抹或者由這種病毒株衍生的蛋白質(zhì)或DNA免疫/疫苗接種的動(dòng)物或人。優(yōu)選地，含淋巴細(xì)胞的級(jí)分從人或者具有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物收集。所收集的含淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分可以進(jìn)一步富集，從而獲得特定的淋巴細(xì)胞群體，例如來自B淋巴細(xì)胞細(xì)胞系(linage)的細(xì)胞。優(yōu)選地，用磁球細(xì)胞分選(MACS)和/或焚光激活細(xì)胞分選(FACS)進(jìn)行富集，利用例如B細(xì)胞、漿胚細(xì)胞(plasmablast)和/或漿細(xì)胞的譜系特異性細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白。優(yōu)選地，對(duì)含淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分關(guān)于B細(xì)胞、漿胚細(xì)胞和/或漿細(xì)胞進(jìn)行富集。甚至更優(yōu)選地，從血液分離具有高CD38表達(dá)和中等CD19和/或CD45表達(dá)的細(xì)胞。這些細(xì)胞有時(shí)稱作循環(huán)漿細(xì)胞、早期漿細(xì)胞(earlyplasmacell)或漿胚細(xì)胞。簡(jiǎn)便起見，在本發(fā)明中它們只稱作漿細(xì)胞，盡管其它術(shù)語也可以互換使用。Vh和Vt編碼序列的分離可以按照經(jīng)典方法進(jìn)行，其中Vh和V^編碼序列在載體內(nèi)隨機(jī)組合，生成Vh和Vt編碼序列對(duì)的組合庫。然而，在本發(fā)明中，優(yōu)選的是反映受RSV感染后在體液免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的抗體的多樣性、親和性和特異性。這涉及保持供體內(nèi)原始存在的Vh和VL配對(duì)，由此生成一系列序列對(duì)，其中每對(duì)編碼可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VO，其相應(yīng)于最初存在于由分離出該序列的供體產(chǎn)生的抗體內(nèi)的Vh和VL對(duì)。這也稱作VH和VL編碼序列的同源對(duì)，而該抗體稱作同源抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的VH和VL編碼對(duì)，組合或者同源，從人供體獲得，因此序列是完全人的。有數(shù)種不同的方法用于產(chǎn)生Vh和VL編碼序列的同源對(duì)，一種方法涉及對(duì)從含淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分選出的單種細(xì)胞進(jìn)行Vh和Vi編碼序列的擴(kuò)增和分離。Vh和VL編碼序列可以分別擴(kuò)增，在第二個(gè)步驟中配對(duì)或者可以在擴(kuò)增期間配對(duì)(Coronellaetal.2000.NucleicAcidsRes.28:E85;Babcooketal1996.PNAS93:7843-7848和WO05/042774)。第二種方法涉及Vh和VL編碼序列在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增和配對(duì)(Embletonetal.1992.NucleicAcidsRes.20:3831-3837;Chapaletal.1997.BioTechniques23:518-524)。第三種方法是選擇的淋巴細(xì)胞抗體方法(SLAM)，其組合了溶血斑點(diǎn)測(cè)定和VH和VLcDNA的克隆(Babcooketal.1996.PNAS93:7843-7848)。為了獲得一系列類似于供體內(nèi)Vh和Vt序列對(duì)之多樣性的Vh和Vt編碼序列對(duì)，具有盡可能少的VH和V^對(duì)亂序(隨才幾組合)的高通量方法是優(yōu)選的，例如在WO05/042774中所述(由此并入以作參考)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)如下方法生成一系列Vh和Vt編碼對(duì)，其中成員對(duì)反映了負(fù)責(zé)由RSV感染導(dǎo)致的體液免疫應(yīng)答的基因?qū)?，所述方法包括如下步驟i)提供來自被RSV感染或從RSV感染恢復(fù)的供體的含淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分；ii)從所述細(xì)胞級(jí)分任選地富集B細(xì)胞或漿細(xì)胞；iii)獲得分離的單細(xì)胞群體，包括將來自所述細(xì)胞級(jí)分的細(xì)胞單獨(dú)分配到多個(gè)容器(vessel)內(nèi)；iv)在多倍重疊延伸RT-PCR步驟中使用得自于所述分離的單細(xì)胞的模板擴(kuò)增和實(shí)現(xiàn)Vh和Vt編碼對(duì)的聯(lián)結(jié)；和v)任選地進(jìn)行對(duì)已聯(lián)結(jié)Vh和VL編碼對(duì)的嵌套PCR。優(yōu)選地，將分離的同源Vh和VL編碼對(duì)進(jìn)行如下所述的篩選方法。一旦生成Vh和V^序列對(duì)，便進(jìn)行篩選方法以鑒定編碼具有針對(duì)RSV相關(guān)抗原的結(jié)合反應(yīng)性的Vh和vl對(duì)的序列。優(yōu)選地，RSV相關(guān)抗原是RSV包膜蛋白，具體為RSVG蛋白、RSVF蛋白和RSVSH蛋白。如果Vh和Vl序列對(duì)是組合的，則可在篩選之前使用噬菌體展示方法來富集編碼與RSV結(jié)合的抗體片段的Vh和Vi^對(duì)。為了反映受到RSV感染后在體液免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的抗體的多樣性、親和性和特異性，本發(fā)明開發(fā)了用于同源對(duì)的篩選方法，以獲得可能最廣泛的多樣性。出于篩選目的，使用轉(zhuǎn)染入合適宿主細(xì)胞的細(xì)菌或哺乳動(dòng)物篩選載體將一系列同源vH和VL編碼對(duì)單獨(dú)表達(dá)為抗體片段(例如scFv或Fab)或表達(dá)為全長(zhǎng)抗體。篩選Fab/抗體庫(repertoire)與一種或多種RSV病毒林的病毒顆粒的反應(yīng)性。優(yōu)選地，至少使用兩種病毒林，一個(gè)A亞型的，一個(gè)B亞型的。A亞型病毒林是例如Long(ATCCVR-26),A2(ATCCVR-1540)或者更新近的Long-樣A亞型分離物。B亞型病毒株是例如18537(ATCCVR-1580)，B1(ATCCVR-1400)，9320(ATCCVR-955)或者更新近的18537-樣分離物。平行地，針對(duì)所選抗原(如重組G蛋白、重組F蛋白和得自于RSV抗原的肽)篩選Fab/抗體庫?？乖目梢岳邕x自G蛋白的保守區(qū)(氨基酸164-176)和G蛋白的半胱氨酸核心區(qū)(A亞型以及B亞型病毒林的氨基酸171-187)，以及SH蛋白的細(xì)胞外區(qū)(A亞型的氨基酸42-64和B亞型的42-65)。優(yōu)選地，將肽生物素化，從而便于在篩選期間固定到珠或板上。也可以使用可替代的固定方法?？梢愿鶕?jù)RSV的生物學(xué)知識(shí)和預(yù)期的中和和/或保護(hù)效果選擇抗原，可以提供能夠潛在結(jié)合這些抗原的抗體。這種篩選方法可以類似地應(yīng)用于組合噬菌體展示庫。可以在細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者其它合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)用于篩選的重組G和/或F蛋白。G和/或F蛋白可以表達(dá)為合適的可溶蛋白(無跨膜區(qū))或者可將其與第三蛋白融合，從而提高穩(wěn)定性。如果G和/或F蛋白表達(dá)具有融合標(biāo)記，則融合伴估(fusionpartner)可以在篩選之前切除。優(yōu)選地，表達(dá)代表A亞型和B亞型的G和/或F蛋白，并用于篩選。此外，可以表達(dá)抹特異的G蛋白并用于篩選。除了上述的初級(jí)篩選之外，還可進(jìn)行二次篩選，以確保所選序列不編碼假陽性。在二次篩選中，再次針對(duì)病毒林和所選抗原篩選在第一次篩選中鑒定的全部RSV/抗原結(jié)合vh和vl對(duì)。一般地，免疫學(xué)測(cè)定適合于在本發(fā)明中進(jìn)行的篩選。這些測(cè)定方法在本領(lǐng)域是熟知的，并構(gòu)成例如ELISPOTS、ELISA、FLISA、膜測(cè)定(例如Westernblots)、濾膜上陣列(arraysonfilters)和FACS。利用從編碼VH和VL對(duì)的序列產(chǎn)生的多肽可以不經(jīng)任何先前的富集步驟來進(jìn)行測(cè)定。在Vh和Vi編碼對(duì)的庫是同源對(duì)的情況下，在篩選之前不需要通過例如噬菌體展示來進(jìn)行富集。然而，在組合庫篩選中，免疫測(cè)定優(yōu)選地與富集方法組合進(jìn)行或者在其后進(jìn)行，富集方法例如噬菌體展示、核糖體展示、細(xì)菌表面展示、酵母展示、真核病毒展示、RNA展示或共l介展示(綜述見FitzGerald,K.，2000.DrugDiscov.Today5,253-258)。在篩選中選擇的Vh和Vi^對(duì)編碼序列一般要經(jīng)過測(cè)序，并分析可變區(qū)的多樣性。具體地，CDR區(qū)的多樣性是感興趣的，而且Vh和Vl家族表示(representation)也是感興趣的。根據(jù)這些分析，選擇編碼Vh和Vt對(duì)的序歹'J，所述Vh和V^對(duì)代表從一個(gè)或多個(gè)供體分離的RSV結(jié)合抗體的整體多樣性。優(yōu)選地，選擇在所有CDR區(qū)(CDRH1，CDRH2，CDRH3和CDRL1，CDRL2和CDRL3)具有差異的序列。如果存在具有一個(gè)或多個(gè)相同或非常相似的屬于不同Vh或V^家族的CDR區(qū)的序列，則同樣將其選出。優(yōu)選地，至少可變重鏈的CDR3區(qū)(CDRH3)在所選序列對(duì)之間有差異。潛在地，VH和VL序列對(duì)的選擇可以嚴(yán)格地基于CDRH3區(qū)的變異性。在引發(fā)和擴(kuò)增序列期間，在可變區(qū)的框架區(qū)內(nèi)(特別是在第一框架區(qū)內(nèi))可能會(huì)發(fā)生突變。優(yōu)選地，對(duì)第一框架區(qū)內(nèi)發(fā)生的錯(cuò)誤進(jìn)行修正，以確保該序列與供體的序列完全或者至少98%—致，從而使序列完全是人的。當(dāng)保證編碼Vh和VL對(duì)的所選序列的集合的整體多樣性高度代表針對(duì)RSV感染的體液響應(yīng)在基因水平上見到的多樣性時(shí)，則可預(yù)期由所選VH和VL編碼對(duì)的集合表達(dá)的抗體的整體特異性也可代表在被RSV感染的供體內(nèi)產(chǎn)生的抗體的特異性。通過比較針對(duì)病毒抹以及供體血液所選抗原的抗體效價(jià)與從所選Vh和VL編碼對(duì)的集合表達(dá)的抗體的特異性，可以獲得從所選Vh和VL編碼對(duì)的集合表達(dá)的抗體的特異性是否代表被感染的供體產(chǎn)生的抗體的特異性。此外，還可以進(jìn)一步分析從所選Vh和VL編碼對(duì)的集合表達(dá)的抗體的特異性。特異性的程度與可檢測(cè)結(jié)合反應(yīng)性的不同抗原的數(shù)目相關(guān)。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過表位作圖(epitopemapping)來分析從所選Vh和VJ扁碼對(duì)的集合表達(dá)的單個(gè)抗體的特異性。表位作圖可通過多種方法進(jìn)行，其不必彼此排斥。對(duì)抗體克隆的表位特異性進(jìn)行作圖的一個(gè)方法是，估計(jì)與從靶抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)獲得的不同長(zhǎng)度的肽的結(jié)合。這些肽可以是線性且構(gòu)象化的(conformational),并可以在多種測(cè)定形式中使用，包括ELISA、FLISA和表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振(SPR,Biacore)。而且，可以使用可獲得的序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來合理地選擇肽以代表例如輩巴抗原細(xì)胞外區(qū)或保守區(qū)，或者可以設(shè)計(jì)成一組代表所選部分或全部抗原的重疊肽(MeloenRH，PuijkWC，SchaaperWMM.EpitopemappingbyPEPSCAN.In:ImmunologyMethodsManual.EdIwanLefkovits1997,AcademicPress,pp982-988)。抗體克隆與一種或多種這類肽的特異反應(yīng)性一般是表位特異性的指示。然而，在許多情況下，肽是被針對(duì)類蛋白抗原產(chǎn)生的抗體識(shí)別的表位的較差模擬物，這是由于缺乏構(gòu)象，以及與抗體和肽相比抗體與蛋白抗原之間相互作用具有通常較大的埋藏表面積(buriedsurfacearea)。表位作圖的第二種方法，其允許直接在蛋白質(zhì)抗原上限定特異性，是通過用現(xiàn)存的、良好限定的抗體進(jìn)行的選擇性表位遮蔽(masking)。阻斷后，第二探測(cè)抗體與抗原的結(jié)合降低一般指示分享的或重疊的表位。通過選擇性遮蔽進(jìn)行的表位作圖可通過多種免疫測(cè)定進(jìn)行，其包括但不僅限于ELISA和Biacore，它們?cè)诒绢I(lǐng)域是熟知的(例如Ditzeletal.1997.J.Mol.Biol.267:684畫695;Aldaz-Carrolletal.2005.J.Virol.79:6260-6271)。另外一種用于確定抗病毒抗體之表位特異性的潛在方法是在抗體的存在下選擇病毒逃逸突變體。對(duì)來自這些逃逸突變體的感興趣的基因進(jìn)行測(cè)序一般顯示抗原中哪些氨基酸對(duì)于抗體的識(shí)別是重要的，從而構(gòu)成(部分)表位。優(yōu)選地，對(duì)本發(fā)明抗RSVrpAb中包含的各個(gè)成員進(jìn)行選擇，從而使抗體組合物整體的特異性覆蓋RSV亞型A和B,以及RSV相關(guān)抗原蛋白F和G,優(yōu)選地還有SH。,^:^《摩這K//和ni^碼對(duì)的重紐,^發(fā)我伴本發(fā)明的多克隆抗體是在一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)生物反應(yīng)器或其等同物中從多克隆表達(dá)細(xì)胞系產(chǎn)生的。根據(jù)這種方法，在處理期間可以從反應(yīng)器將抗RSVrpAb純化為單一制備物，而不必分離構(gòu)成抗RSVrpAb的各個(gè)成員。如果多克隆抗體在超過一個(gè)生物反應(yīng)器中產(chǎn)生，則可以在純化之前匯集每個(gè)生物反應(yīng)器的上清液，或者可以通過匯集從每個(gè)生物反應(yīng)器各自的純化上清液而得到的抗體來獲得純化的抗RSVrpAb。產(chǎn)生重組多克隆抗體的一個(gè)方法在WO2004/061104和WO2006/007850(PCT/DK2005/000501)中有說明(這些參考文獻(xiàn)并入本文以作參考)。其中描述的方法是根據(jù)將抗體編碼序列位點(diǎn)特異性整合到各個(gè)宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)，確保在生產(chǎn)期間Vh和VL蛋白鏈保持它們的原始配對(duì)。而且，位點(diǎn)特異性整合使位置效應(yīng)最小化，因此多克隆細(xì)胞系中各個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)和表達(dá)性質(zhì)預(yù)期非常相似。一般地，該方法包括如下i)具有一個(gè)或多個(gè)重組酶識(shí)別位點(diǎn)的宿主細(xì)胞；ii)具有至少一個(gè)與宿主細(xì)胞相容的重組酶識(shí)別位點(diǎn)的表達(dá)載體；iii)通過將所選Vh和VL編碼對(duì)從篩選載體轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體來產(chǎn)生表達(dá)載體的集合，從而能夠由該載體表達(dá)全長(zhǎng)抗體或抗體片段(如果篩選載體與表達(dá)載體相同則不必進(jìn)行這種轉(zhuǎn)移)；iv)用表達(dá)載體集合和編碼重組酶的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，該編碼重組酶的載體能夠使宿主細(xì)胞基因組中的重組酶識(shí)別位點(diǎn)與載體的重組酶識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行組合；v)由轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞獲得/產(chǎn)生多克隆細(xì)胞系和vi)從多克隆細(xì)胞系表達(dá)并收集多克隆抗體。優(yōu)選地，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO細(xì)胞、COS纟田胞、BHK細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞(例如Sp2/0或NS0細(xì)胞)、成纖維細(xì)胞如NIH3T3，和7Jc生人細(xì)月包如HeLa細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、或PER.C6。然而，也可以利用非哺乳動(dòng)物真核或原核細(xì)胞，如植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌、大腸桿菌等。合適的宿主細(xì)胞在其基因組中包括一個(gè)或多個(gè)合適的重組酶識(shí)別位點(diǎn)。宿主細(xì)胞還應(yīng)當(dāng)含有選擇模式，其與整合位點(diǎn)可操作連接，以便能夠選擇整合體(即，在整合位點(diǎn)具有抗RSVAb表達(dá)載體或表達(dá)載體片段的整合拷貝的細(xì)胞)。在基因組的預(yù)定位置具有FRT位點(diǎn)的細(xì)月包的制備在例如US5,677,177中描述。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞只有單個(gè)整合位點(diǎn)，其位于允許高表達(dá)整合體的位點(diǎn)(所謂的熱點(diǎn))。合適的表達(dá)載體包括與宿主細(xì)胞的重組酶識(shí)別位點(diǎn)匹配的重組識(shí)別位點(diǎn)。優(yōu)選地，重組酶識(shí)別位點(diǎn)與合適的選擇基因聯(lián)結(jié)，該選擇基因不同于用于構(gòu)建宿主細(xì)胞的選擇基因。選擇基因在本領(lǐng)域是熟知的，并包括谷氨酰胺合成酶基因(GS)、二氫葉酸還原酶基因(DHFR)、和新霉素，其中GS或DHFR可用于所插入Vh和V^序列的基因擴(kuò)增。載體還可包含兩個(gè)不同的重組酶識(shí)別位點(diǎn)，從而允許抗體編碼序列的重組酶-介導(dǎo)的盒式交換(RMCE)代替載體的完全整合。RMCE在如下文獻(xiàn)中描述Langeretal2002.NucleicAcidsRes.30，3067-3077;SchlakeandBode1994.Biochemistry33，12746-12751和Beltekietal2003.Nat,biotech.21,321-324。合適的重組酶識(shí)別位點(diǎn)在本領(lǐng)域是熟知的，包括FRT、1ox和attP/attB位點(diǎn)。優(yōu)選地，整合載體是同種型(isotype)編碼載體，其中在從篩選載體轉(zhuǎn)移Vh和V^編碼對(duì)之前載體內(nèi)存在恒定區(qū)(優(yōu)選包括內(nèi)含子)(或者如果篩選是在全長(zhǎng)抗體上進(jìn)行的，則篩選載體內(nèi)已然存在恒定區(qū))。存在于載體內(nèi)的恒定區(qū)可以是整個(gè)重鏈恒定區(qū)(CI^至CH3或至CH4)或編碼抗體的Fc部分的恒定區(qū)(CH2至CH3或至CH4)。在轉(zhuǎn)移之前還可以存在輕鏈k或入恒定區(qū)。所存在的恒定區(qū)數(shù)目的選擇，如果有，取決于所用的篩選和轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。重鏈恒定區(qū)可以從同種型IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgAl，IgA2，IgM，IgD和IgE中選擇。優(yōu)選的同種型是IgGl和/或IgG3。進(jìn)一步，用于位點(diǎn)特異性整合抗RSV抗體編碼核酸的表達(dá)載體含有指導(dǎo)每條Vh和V^鏈高水平表達(dá)的合適的啟動(dòng)子或等同序列。圖3闡明了設(shè)計(jì)表達(dá)載體的一種可能方法，盡管可能有許多其它的設(shè)計(jì)。從篩選載體轉(zhuǎn)移所選的Vh和ViJ扁碼對(duì)可通過傳統(tǒng)的限制酶切割和連接來進(jìn)行，從而使每個(gè)表達(dá)載體分子含有一個(gè)Vh和Vt編碼對(duì)。優(yōu)選地，將Vh和VL編碼對(duì)單獨(dú)轉(zhuǎn)移，然而如果期望，它們也可以集體轉(zhuǎn)移。當(dāng)全部所選Vh和VL編碼對(duì)轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體時(shí)，便獲得表達(dá)載體的集合或文庫。如果期望，也可使用可選擇的轉(zhuǎn)移方式。如果篩選載體與表達(dá)載體相同，則表達(dá)載體的文庫由篩選期間所選的Vh和Vt序列對(duì)構(gòu)成，其定位于篩選/表達(dá)載體內(nèi)。用于將核酸序列轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)的方法在技術(shù)上是已知的。為了保證位點(diǎn)特異性整合，必須也向宿主細(xì)胞提供合適的重組酶。這優(yōu)選地通過共轉(zhuǎn)染編碼重組酶的質(zhì)粒來實(shí)現(xiàn)。合適的重組酶是例如Flp,Cre或噬菌體OC31整合酶，與具有相應(yīng)重組酶識(shí)別位點(diǎn)的宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)一起使用。宿主細(xì)胞可以大批轉(zhuǎn)染，意味著在一個(gè)單反應(yīng)中將表達(dá)載體的文庫轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，由此獲得多克隆細(xì)胞系。可選擇地，可將表達(dá)載體的集合單獨(dú)轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，由此產(chǎn)生單細(xì)胞系的集合(每個(gè)細(xì)胞系產(chǎn)生具有特定特異性的抗體)。然后對(duì)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的細(xì)胞系(單獨(dú)或多克隆)進(jìn)行篩選，選擇位點(diǎn)特異性整合體，并且使其適合于在懸浮液和無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，如果它們?cè)谵D(zhuǎn)染之前不具有這些性質(zhì)的話。如果轉(zhuǎn)染是單獨(dú)進(jìn)行的，則對(duì)單個(gè)細(xì)胞系的生長(zhǎng)特性和抗體產(chǎn)生進(jìn)行進(jìn)一步的分析。優(yōu)選地，選擇具有相似增殖速度和抗體表達(dá)水平的細(xì)胞系用于產(chǎn)生多克隆細(xì)胞系。然后通過以預(yù)定的比例混合單個(gè)細(xì)胞系來產(chǎn)生多克隆細(xì)胞系。一般地，從多克隆細(xì)胞系建立(laydown)多克隆主細(xì)胞庫(pMCB)、多克隆研究細(xì)胞庫(pRCB)和/或多克隆工作細(xì)胞庫(pWCB)。通過以預(yù)定的比例混合單個(gè)細(xì)胞系來產(chǎn)生多克隆細(xì)胞系。將多克隆細(xì)胞系分配到安瓿(ampoule)內(nèi)，由此產(chǎn)生多克隆研究細(xì)胞庫(pRCB)或主細(xì)胞庫(pMCB)，通過從研究或主細(xì)胞庫擴(kuò)增細(xì)胞可產(chǎn)生多克隆工作細(xì)胞庫(pWCB)。研究細(xì)胞庫主要用于證明概念研究，其中該多克隆細(xì)胞系包含的單個(gè)抗體可能沒有主細(xì)胞庫中的多克隆細(xì)胞系包含得多。通常，將pMCB進(jìn)一步擴(kuò)展，從而建立用于生產(chǎn)目的的pWCB。一旦pWCB用完，可以對(duì)來自pMCB的一個(gè)新安瓿進(jìn)行擴(kuò)展，從而建立新的pWCB。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是能夠表達(dá)本發(fā)明重組多克隆抗RSV抗體的多克隆細(xì)胞系。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是多克隆細(xì)胞系，其中每個(gè)單個(gè)的細(xì)胞能夠表達(dá)單個(gè)Vh和Vt編碼對(duì)，多克隆細(xì)胞系作為整體能夠表達(dá)Vh和Vt編碼對(duì)的集合，其中每個(gè)Vh和Vt對(duì)編碼抗RSV抗體。優(yōu)選地，VH和Vt編碼對(duì)的集合是根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的同源對(duì)。本發(fā)明重組多克隆抗體的表達(dá)是通過在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中將來自pWCB的一安瓿培養(yǎng)一段時(shí)間使得抗體充分表達(dá)，且其中所述多克隆細(xì)胞系保持穩(wěn)定(窗口大約15天-50天)?？梢允褂玫呐囵B(yǎng)方法例如補(bǔ)料分批培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)。從培養(yǎng)基獲得重組多克隆抗體，并通過傳統(tǒng)的純化:^支術(shù)進(jìn)行純化。IgG的純化經(jīng)常使用親和色譜與后續(xù)純化步驟的組合，例如離子交換色i普、疏水相互作用和凝膠過濾。純化后，通過例如離子交換色譜對(duì)多克隆抗體組合物中存在的所有個(gè)體成員進(jìn)行估計(jì)。多克隆抗體組合物的表征在WO2006/007853(PCT/DK2005/000504)中有詳細(xì)描述(并入本文以作參考)。WO04/009618中描述了一種在重組宿主內(nèi)表達(dá)抗體混合物的可選擇方法。該方法產(chǎn)生的抗體具有與來自單個(gè)細(xì)胞系的相同輕鏈相關(guān)的不同重鏈。如果抗RSVrpAb從組合庫產(chǎn)生，則可應(yīng)用這種方法。治《紐合務(wù)本發(fā)明的另一個(gè)方面是藥物組合物，其包括作為活性成分的抗RSVrpAb或抗RSV重組多克隆Fab或另一種抗RSV重組多克隆抗體片段。優(yōu)選地，這種組合物的活性成分是如本發(fā)明所述的抗RSV重組多克隆抗體。這些組合物是用于預(yù)防和/或治療RSV感染。優(yōu)選地，將藥物組合物施用于人、家畜或?qū)櫸?。藥物組合物進(jìn)一步包括藥物可接受的賦形劑?？梢栽谒幬锟山邮艿南♂寗?、載體或賦形劑內(nèi)以單位劑量形式施用抗RSVrpAb或其多克隆片段?？刹捎脗鹘y(tǒng)的藥學(xué)實(shí)踐以提供合適的制劑或組合物，從而施用于被RSV感染的患者或者處于被RSV感染高度危險(xiǎn)的患者。在優(yōu)選實(shí)施方案中，施用是預(yù)防性的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，施用是治療性的，意味著是在出現(xiàn)與RSV感染相關(guān)的癥狀之后施用。任何適當(dāng)?shù)氖┯猛緩骄刹捎茫缈梢阅c胃外、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣霧劑、栓劑或經(jīng)口施用。例如，藥物制劑可為液體溶液或懸浮液的形式；用于經(jīng)口施用，制劑可為片劑、膠囊、口香糖或糊劑的形式；和用于鼻內(nèi)制劑時(shí)為粉末、滴鼻劑或氣霧劑的形式。本發(fā)明的藥物組合物用本身已知的方式制備，例如通過傳統(tǒng)的溶解、凍干、混合、?；虺尚吞幚?confectioningprocess)。藥物組合物可以根據(jù)傳統(tǒng)的藥物實(shí)踐配制(參見例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(20thed.),ed.A.R.Gennaro,2000,Lippincott^Williams&Wilkins，Philadelphia,PA和EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology,eds.J.SwarbrickandJ.C.Boylan，1988-1999,MarcelDekker,NewYork,NY)。優(yōu)選地，使用活性成分的溶液或懸浮液，尤其是等滲水溶液或懸浮液來制備本發(fā)明的藥物組合物。在只包含活性成分或者連同載體，例如甘露醇的凍干組合物情況中，如果可能的話，將這些溶液或懸浮液在使用之前產(chǎn)生。藥物組合物可以經(jīng)過滅菌和/或可以包含賦形劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕和/或乳化劑、助溶劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖液，并且以自身已知的方式制備，例如通過傳統(tǒng)的溶解和凍干處理。所述溶液或懸浮液可以包含提高粘度的物質(zhì)，例如羧曱基纖維素鈉、羧曱基纖維素、右旋糖酐(dextran)、聚乙烯吡咯烷酮或明膠。注射組合物可以用傳統(tǒng)的方法在無菌條件下制備；其還可以應(yīng)用于將組合物引入到安瓿或小瓶中并且密封容器。用于經(jīng)口施用的藥物組合物可通過組合活性成分與固體載體獲得，如果期望，使最終的混合物?；⑶胰绻谕蛘弑匦?，在將適當(dāng)?shù)馁x形劑添加到藥片、藥丸或膠嚢中之后對(duì)混合物進(jìn)行處理，所述藥片、藥丸或膠嚢可以用蟲膠、糖或兩者包覆。還有可能將它們合并到塑性載體(plasticscarrier)內(nèi)，<吏活性成分以測(cè)定量(measuredamounts)擴(kuò)散或4皮釋》文。藥物組合物含有大約1%-大約95%，優(yōu)選地大約20%-大約90%的活性成分。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以呈例如單位劑量形式，例如以安瓿、小瓶、栓劑、片劑、丸劑或膠嚢的形式。制劑可以以治療或預(yù)防有效量(例如預(yù)防、消除或減輕病癥的量)施用給人個(gè)體，為疾病或病癥提供治療。待施用的治療劑的優(yōu)選劑量很可能取決于如下變量，例如RSV感染的嚴(yán)重程度、具體患者的整體健康狀況、化合物賦形劑的配制及其施用途徑。旅凝本發(fā)'效的遂合參的治《^途根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以用于治療、改善或預(yù)防哺乳動(dòng)物疾病。本藥物組合物可以治療或預(yù)防的病癥包括預(yù)防和治療被RSV感染的或者處于被RSV感染的危險(xiǎn)的患者，特別是處于被RSV感染的高度危險(xiǎn)的患者。高危患者是例如嬰兒和小孩。特別是具有潛在問題(例如慢性肺病或先天心臟病)的未成熟兒和兒童處于罹患RSV感染后的嚴(yán)重疾病(例如細(xì)支氣管炎和肺炎)的最大危險(xiǎn)。同樣，高危成年人，例如免疫受損的(immunocompromised)成年人，特別是骨髓移植接受者，大齡個(gè)體和患有慢性肺病的個(gè)人，可優(yōu)選地用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)行預(yù)防或治療處理。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是預(yù)防、治療或減輕哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種或多種與RSV感染相關(guān)的癥狀的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明抗RSV重組多克隆抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是使用本發(fā)明的抗RSV重組多克隆抗體制備用于治療、減輕或預(yù)防哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種或多種與RSV感染相關(guān)的癥狀的組合物。優(yōu)選地，本實(shí)施方案中的哺乳動(dòng)物是人、家畜或?qū)櫸?。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，用預(yù)防、治療或減輕一種或多種RSV感染相關(guān)的癥狀的方法處理的哺乳動(dòng)物優(yōu)選具有高于40kg的體重。在受試者為人的實(shí)施方案中，優(yōu)選是患有慢性肺病或先天心臟病的未成熟兒、幼兒。在可選擇實(shí)施方案中，人是免疫受損的成年人，具體的是骨髓移植接受者、大齡個(gè)體和患有慢性肺病的個(gè)人。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及診斷試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明制備的抗RSVrpAb，其蛋白質(zhì)可以用可檢測(cè)標(biāo)記來標(biāo)記或者不進(jìn)行標(biāo)記用于無標(biāo)記檢測(cè)。該試劑盒可用于鑒定被RSV感染的個(gè)體。本發(fā)效的戎謬為、f《^^^^才面應(yīng)當(dāng)注意，本文公開的新型抗體分子械_認(rèn)為憑其自身(intheirownright)對(duì)于技術(shù)的狀態(tài)有所貢獻(xiàn)。因此，本發(fā)明還涉及本文公開的任意一種抗體分子以及這些抗體的片段和類似物，其中所述片段或類似物至少包含本文公開的抗體的CDRs。例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，從人供體分離的一些全人抗體分子包含結(jié)合位點(diǎn)，所述結(jié)合位點(diǎn)在進(jìn)行抗原結(jié)合時(shí)與已知現(xiàn)有技術(shù)的單克隆抗體相比顯示出極大改進(jìn)的動(dòng)力學(xué)分布(profile)。因此，盡管本公開對(duì)多克隆抗體組合物給予了大量關(guān)注，但是與本文列出的多克隆抗體的使用相關(guān)的全部主題也與本文公開的任意一種單一抗體分子相關(guān)-即，涉及與本發(fā)明多克隆抗體組合物有關(guān)的配制、劑量、施用等的所有公開內(nèi)容在加以細(xì)節(jié)上的必要改動(dòng)之后Owtotomwtomfe)均可應(yīng)用于本文公開的單個(gè)抗體分子、抗體片段和抗體類似物，優(yōu)選還包括框架序列。因此，本發(fā)明還涉及從本文表5中列出的抗體分子中選擇的分離的人體類似物，所述結(jié)合片段或類似物至少包含所述分離的抗體分子的補(bǔ)體決定區(qū)(CDRs)。通常，天然人抗體可變區(qū)的框架區(qū)也包含在這些片段或類似物中，因?yàn)榭贵w的抗原特異性已知取決于框架區(qū)和CDRs的3D組織。表述"分離的抗體分子"意欲表示從天然雜質(zhì)中分離出來并顯示相同氨基酸序列(也就是相同的可變和恒定區(qū))的不同抗體的集合。通常，抗體分子、片段或類似物得自于表8中所列抗體，或者包括包含于SEQIDNos:1-44其中之一內(nèi)的重鏈CDR氨基酸序列和伴隨的輕鏈CDR氨基酸序列，所述輕鏈CDR氨基酸序列具有的SEQIDNO比從SEQIDNos:1-44中選擇的氨基酸序列高88。這意味著抗體分子、片段或類似物包括在上面討論的44個(gè)克隆中的抗體分子、片段或類似物中存在的可變區(qū)的如上文提到的，大量本發(fā)明的抗體分子顯示非常高的親和性，因此本發(fā)明還涉及分離的抗體分子、抗體片段或合成或半合成抗體類似物，其含有的CDRs與得自于人抗體的Fab中的CDRs相同，當(dāng)在Biacore3000上進(jìn)行表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振分析來測(cè)定(使用以非常低的密度固定在傳感器表面上的重組RSVG蛋白以避免質(zhì)量輸送受到限制)時(shí)，所述Fab對(duì)RSVG蛋白的解離常數(shù)KD至多為500nM。所述分離的抗體分子、抗體片段或合成或半合成抗體通常顯示更低的KD，至多為400nM,如至多300nM、至多200nM、至多100nM、至多1nM、至多900pM、至多800pM、至多700pM、至多600pM、至多500pM、至多400pM、至多300pM、至多200pM、至多100pM、至多90pM和至多80pM。關(guān)于Biocore測(cè)量的細(xì)節(jié)在實(shí)施例中提供。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及分離的抗體分子、抗體片段或合成或半合成抗體，其包含的抗原結(jié)合位點(diǎn)與得自于人抗體的Fab中的抗原結(jié)合位點(diǎn)相同，當(dāng)在Biacore3000上進(jìn)行表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振分析來測(cè)定(使用以非常低的密度固定在傳感器表面上的重組RSVF蛋白以避免質(zhì)量輸送受到限制)時(shí)，所述Fab對(duì)RSVF蛋白的解離常數(shù)Ko至多為500nM。所述分離的抗體分子、抗體片段或合成或半合成抗體通常顯示至多為400nM的Kd，例如至多300nM、至多200nM、至多100nM、至多l(xiāng)nM、至多900pM、至多800pM、至多700pM、至多600pM、至多500pM、至多400pM、至多300pM、至多200pM、至多100pM、至多卯pM、至多80pM、至多70pM、至多60pM、至多50pM、至多40pM、至多30pM、至多25pM、至多20pM、至多15pM、至多10pM、至多9pM、至多8pM、至多7pM、至多6pM和至多5pM。特別有用的抗體分子或特異性結(jié)合片段或合成或半合成抗體類似物包括在克隆No.810,818,819，824,825，827,858或894中產(chǎn)生的人抗體的CDRs。如上所述，本發(fā)明的這些有用抗體分子可以用與本發(fā)明多克隆制劑相同的方式配制并且用于相同的應(yīng)用。因此，本發(fā)明涉及的抗體組合物包括在本部分中討論的與藥物可接受的載體、賦形劑、媒介物或稀釋劑混合的抗體分子、特異性結(jié)合片段或合成或半合成抗體類似物。該組合物可以包含超過一種結(jié)合特異性，并且可以例如包含本發(fā)明的2種不同的抗體分子和/或本發(fā)明的特異性結(jié)合片段和/或合成或半合成抗體類似物。組合物甚至可以包含本發(fā)明的至少3種不同的抗體分子和/或抗體片段和/或合成或半合成抗體類似物、特異性結(jié)合片段和/或合成或半合成抗體類似物，因此可以構(gòu)成包含4，5,6，7，9，10，11，12，13,15,16，17,18,19，20，21,22,23，24，25,26，組合物。特別感興趣的組合物包括至少一種結(jié)合RSVF蛋白的本發(fā)明抗體分子、片段或類似物和至少一種結(jié)合RSVG蛋白的本發(fā)明抗體、片段或類似物。另外，本發(fā)明的一部分是分離的核酸片段，其編碼限定本發(fā)明抗體分子的至少一種CDR的氨基酸序列，例如至少編碼由表5所列出的其中一個(gè)克隆產(chǎn)生的抗體的CDRs的核酸片段。核酸片段通常是DNA,但也可以是腦A。另一個(gè)實(shí)施方案是分離的核酸片段，其編碼在SEQIDNOs1-44任一個(gè)中列出的重鏈氨基酸序列的CDR序列，或者分離的核酸片段，其編碼在SEQIDNOs89-132任一個(gè)中列出的輕鏈氨基酸序列的CDR序列。本發(fā)明優(yōu)選的核酸片段編碼在SEQIDNOs1-44任一個(gè)中列出的重鏈氨基酸序列的CDR序列和伴隨的輕鏈CDR氨基酸序列，所述輕鏈CDR氨基酸序列具有的SEQIDNO比從SEQIDNOs1-44選擇的氨基酸序列高88。這當(dāng)然意味著，核酸片段編碼在上面討論的44個(gè)克隆中存在的可變區(qū)的同源對(duì)。因此核酸片段包括在SEQIDNOs:45-88和/或133-176中包含的編碼序列。方便地，將核酸片段引入在載體中，其也是本發(fā)明的一部分。這種載體能自主復(fù)制，通常選自下組質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、微型染色體和病毒。在本發(fā)明的載體是表達(dá)載體的情況下，優(yōu)選地具有如下的概括(outline)(也參考圖3中的示例載體)-沿5'43'方向并且與用于驅(qū)動(dòng)上面討論的第一核酸片段表達(dá)的至少一個(gè)啟動(dòng)子可操作連接，其編碼至少一個(gè)輕鏈CDR以及任何必需的框架區(qū)，任選的編碼前導(dǎo)肽的核酸序列，所述第一核酸片段，任選的編碼抗體恒定區(qū)的核酸序列，和任選的編碼第一終止子的核酸序列，和/或沿5'—3'方向并且與用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明第二核酸片段表達(dá)的至少一個(gè)啟動(dòng)子可操作連接，其編碼至少一個(gè)重鏈CDR以及任何必需的框架區(qū)，任選的編碼前導(dǎo)肽的核酸序列，所述第二核酸片段，任選的編碼抗體恒定區(qū)的核酸序列，和任選的編碼第二終止子的核酸序列如果能夠用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其能夠隨后加以培養(yǎng)以便獲得重組表達(dá)產(chǎn)物，則這種載體是特別有用的。因此，優(yōu)選的載體是如下的載體，其在引入到宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)被整合到宿主細(xì)胞基因組中。因此，本發(fā)明還涉及攜帶在本部分中討論的本發(fā)明載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并且涉及攜帶這種載體并且表達(dá)在本部分中討論的本發(fā)明核酸片段的穩(wěn)定細(xì)胞系。轉(zhuǎn)化細(xì)胞和細(xì)胞系均任選地在其表面上分泌或攜帶其重組表達(dá)產(chǎn)物C即本發(fā)明的抗體分子、抗體片段或類似物)。實(shí)施例1本實(shí)施例是用于例證本發(fā)明的方法的集合。a.灰供沐J&濕為、^A厲'/:^獎(jiǎng)嚴(yán)勿/S根據(jù)制造商的使用說明用Lymphoprep(AxisShidd)和梯度離心從抽自供體的血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。分離的PBMC或者在FCS,10%DMSO中于-150。C冷藏或者直接使用。B細(xì)胞級(jí)分用抗CD19抗體標(biāo)記，并用磁性細(xì)胞分選(MACS)從PBMC級(jí)分中分離。PBMC(lxl06細(xì)胞)在4。C與抗-CD19-FITC接合抗體(BDPharmingen)溫育20min。細(xì)胞在MACS緩沖液(MiltenyiBiotec)中洗滌2次并重懸。將抗-FITC微珠(MiltenyiBiotec)與標(biāo)記細(xì)胞混合，并在4。C溫育15min。重復(fù)洗滌步驟然后將細(xì)胞-珠懸浮物施加到LSMACS柱(MiltenyiBiotec)。根據(jù)制造商的使用說明將CD19P日性細(xì)胞級(jí)分從柱中洗脫出來，并或者保存于FCS-10o/()DMSO中或者直接進(jìn)行單細(xì)胞分選。通過焚光激活細(xì)胞分選(FACS)基于CD19、CD38和CD45細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)譜從CD19+B細(xì)胞級(jí)分中選擇漿胚細(xì)胞。CD19是B細(xì)胞標(biāo)記物，其也在漿細(xì)胞前體上表達(dá)，而CD38在漿胚細(xì)胞和漿細(xì)胞上高表達(dá)。漿胚細(xì)胞與其余的CD19+細(xì)胞相比顯然具有有些降低的CD19和CD45表達(dá)，這允許離散的群體的分離。細(xì)胞在FACS緩沖液(PBS;1。/。BSA)中洗滌，并用抗-CD19-FITC、抗-CD38-APC、抗-入-PE(BDPharmingen)染色20min。還包括X-輕鏈染色，以便允許排除不能用作PCR模板的細(xì)胞(參見c部分)。將染色的細(xì)胞在FACS緩沖液中洗滌并重懸。將FACS期間細(xì)胞的流速設(shè)定為大約200事件/秒(events/sec)，細(xì)胞濃度為5xl05/ml,以獲得高的漿細(xì)胞挽救(plasmacellrescue)。使用如下系列的閘門(gate)。每個(gè)閘門是前一個(gè)的子體(daughter)。閘門l:FSC/SSC閘門選擇具有最高FSC的淋巴細(xì)胞群體，由此保證活細(xì)力包的分選。閘門2:SSCh/SSCw這個(gè)閘門保證單細(xì)胞分選(雙重區(qū)分)。閘門3:代表漿胚細(xì)胞的事件作為CD38高/CD19中等被門限在(gatein)CD38/CD19散點(diǎn)圖(dotplot)中。閘門4:因?yàn)樵赾部分中描述的PCR方法僅擴(kuò)增k輕鏈，所以X陰性事件被門限在A/CD19散點(diǎn)圖中。作為閘門3的替代或補(bǔ)充，漿胚細(xì)胞還在CD45/CD38散點(diǎn)圖中被鑒定為CD38高和CD45中等。這需要用抗-CD45-PerCP對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。將滿足這4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的最終群體單細(xì)胞分選到含有分選緩沖液的96孔PCR板中(參見c部分)。將該含有細(xì)胞的板保存于-80。C。6甜—fELISpot用于估計(jì)表達(dá)抗-RSV抗體的漿胚細(xì)胞在所得細(xì)胞樣品(即PBMC、MACS純化的CD19+細(xì)胞或FACS分選的漿胚細(xì)胞群體)中的百分比。用25嗎/ml滅活RSVLong顆粒(HyTest)的溶液涂布具有硝酸纖維素表面的96孔板(Millipore)。通過用RPMI、2°/。牛奶粉末溫育并在4。C方史置大約5h然后在37°C溫育1h將孔封閉。洗滌平板并向每個(gè)孔添加RPMI培養(yǎng)基中的細(xì)胞樣品，然后在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件下溫育24h。分泌的RSV特異抗體將與圍繞在產(chǎn)抗體細(xì)胞周圍的固定病毒顆粒結(jié)合。通過在PBS、0.01%Tween20中洗滌3次和在PBS中洗滌3次除去細(xì)胞。添加HRP偶連的抗-人IgG(H+L)(CalTag)和HRP偶連抗-人IgA(Serotec)，使之與被固定的抗體在37°C反應(yīng)1h。重復(fù)洗滌步驟，并添加色原性底物(chromogensubstrate)(溶解于N,N-DMF(二曱基曱酰胺)中的3-氨基-9-乙基呼唑)。4min后通過添加H20終止顯色。在分泌抗原特異性抗體的細(xì)胞所處的位點(diǎn)可識(shí)別出紅斑。c.^源F/z和FL對(duì)的^錄對(duì)如a部分所述獲得的單細(xì)胞進(jìn)行Vh和Vt編碼序列的聯(lián)結(jié)，以便于Vh和VL編碼序列的同源配對(duì)。該步驟使用兩步PCR方法，其基于一步多倍重疊延伸RT-PCR然后是嵌套PCR。本發(fā)明使用的引物混合物僅擴(kuò)增k輕鏈。然而，如果期望，也可以向多重引物混合物和嵌套PCR引物混合物中添加能夠擴(kuò)增X輕鏈的引物。如果添加X引物，則應(yīng)當(dāng)對(duì)a部分中的分選步驟進(jìn)行改編，以使X陽性細(xì)胞不被排除。聯(lián)結(jié)同源Vh和Vl序列的原理如圖2所示。將在a部分中產(chǎn)生的96孔PCR板解凍，并將分選的細(xì)胞作為多倍重疊延伸RT-PCR的模板。在單細(xì)胞分選之前向每個(gè)孔添加的分選緩沖液含有反應(yīng)緩沖液(OneStepRT-PCRBuffer;Qiagen)、RT-PCR引物(參見表2)和RNA酶抑制劑。補(bǔ)充OneStepRT-PCR酶混合物(25x稀釋；Qiagen)和dNTP混合物(每種200pM)，以便在20-^1反應(yīng)體積內(nèi)獲得給定的最終濃度。平板在55°C溫育30min，以允許從每個(gè)孔反轉(zhuǎn)錄RNA。RT后，對(duì)板進(jìn)行如下的PCR循環(huán)94°C10min,35x(94。C40sec,60。C40sec,72。C5min)，72。C10min。PCR反應(yīng)在H20BITThermal循環(huán)儀(cycler)中進(jìn)行，其具有用于24個(gè)96孔板(ABgene)的殼密封籃(PeelSealBasket)以促進(jìn)高通量。循環(huán)之后將PCR板保存于-20。C。表2:RT-PCR多倍重疊延伸引物混合物引物名稱終濃度nM序列SEQIDNO:VHsetCH-IgG0.2GACSGATGGGCCCTTGGTGG179CH-IgA0.2GAGTGGCTCCTGGGGGAAGA180VH-10.04TATTCCCATGGCGCGCCCAGRTGCAGCTGGTGCART181VH-20.04TATTCCCATGGCGCGCCSAGGTCCAGCTGGTRCAGT182VH-30.04TATTCCCATGGCGCGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGT183VH-40.04TATTCCCATGGCGCGCCSAGGTGCAGCTGGTGGAG184VH-50.04TATTCCCATGGCGCGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGT185VH-60.04TATTCCCATGGCGCGCCCAGSTGCAGCTGCAGGAGT186VH-70.04TATTCCCATGGCGCGCCGARGTGCAGCTGGTGCAGT187VH-80.04TATTCCCATGGCGCGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTC188LCsetCK10.2ATATATATGCGGCCGCTTATTAACACTCTCCCCTGTTG189VL-10.04GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGACATCCAGWTGACCCAGTCT190VL-20.04GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGATGTTGTGATGACTCAGTCT191VL-30.04GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAAATTGTGWTGACRCAGTCT192VL-40.04GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGATATTGTGATGACCCACACT193VL-50.04GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAAACGACACTCACGCAGT194VL-60.04GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAAATTGTGCTGACTCAGTCT195W=A/T,R=A/G，S=G/C對(duì)于嵌套PCR步驟，在每個(gè)孔中(20卞1反應(yīng))以如下的混合物準(zhǔn)備96孔PCR板，以獲得給定的最終濃度lxFastStart緩沖液(Roche)，dNTP混合物(每個(gè)200pM)，嵌套引物混合物(參見表3),PhusionDNA聚合酶(0.08U;Finnzymes)和FastStart高保真酶混合(0.8U;Roche)。作為嵌套PCR的模板，從多倍重疊延伸PCR反應(yīng)轉(zhuǎn)移1pl。對(duì)嵌套PCR板進(jìn)行如下的PCR循環(huán)35x(95。C30sec，60。C30sec,72。C90sec),72。C10min。在1%瓊脂糖凝膠上對(duì)隨機(jī)選擇的反應(yīng)進(jìn)行分析，以驗(yàn)證大約1070bp的重疊延伸片段的存在。將板保存在-20。C直到進(jìn)一步處理PCR片段。表3:嵌套引物組<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>d.將同源V11和VL編碼對(duì)插入到篩選載體內(nèi)為了鑒定與RSV顆粒或抗原有結(jié)合特異性的抗體，將根據(jù)c部分中的描述獲得的Vh和VL編碼序列表達(dá)為全長(zhǎng)抗體。這涉及將一系列Vh和Vl編碼對(duì)插入到表達(dá)載體內(nèi)，并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。采用兩步克隆方法產(chǎn)生一系列含有聯(lián)結(jié)的VH和VL編碼對(duì)的表達(dá)載體。統(tǒng)計(jì)上，如果表達(dá)載體庫含有的重組質(zhì)粒數(shù)目是用于產(chǎn)生篩選庫的同源配對(duì)的Vh和V^PCR產(chǎn)物的IO倍，則有99%的可能性代表全部的獨(dú)特基因配對(duì)。因此，如果在c部分中獲得了400個(gè)重疊延伸V基因片段，那么要產(chǎn)生至少含有4000個(gè)克隆庫用于篩選。簡(jiǎn)而言之，匯集來自步驟c中嵌套PCR的聯(lián)結(jié)的VH和VL編碼對(duì)系列(不混合來自不同供體的配對(duì))。用^zo1和iVortDNA內(nèi)切酶在？1入到PCR產(chǎn)物末端的識(shí)別位點(diǎn)處切割PCR產(chǎn)物。通過標(biāo)準(zhǔn)連接步驟將切割并純化的片段連接到WoI/A^I消化的哺乳動(dòng)物IgG表達(dá)載體內(nèi)(圖3)。將連接混合物電穿孔進(jìn)入大腸桿菌，并添加到含有適當(dāng)抗生素的2xYT^反，并37。C溫育過夜。用標(biāo)準(zhǔn)的DNA純化方法(Qiagen)從由板回收的細(xì)胞純化載體的擴(kuò)增庫(repertoire)。通過用Acl和7Wzel內(nèi)切酶切割來制備用于插入啟動(dòng)子-前導(dǎo)片段的質(zhì)粒。這些酶的限制位點(diǎn)位于Vh和VL編碼基因?qū)χg。載體純化后，通過標(biāo)準(zhǔn)連接步驟將用Acl-A^el消化的雙向哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子-前導(dǎo)片段插入到AcI和MzeI限制位點(diǎn)內(nèi)。在大腸桿菌中對(duì)已連接載體進(jìn)行擴(kuò)增，并用標(biāo)準(zhǔn)方法純化質(zhì)粒。通過傳統(tǒng)的步驟將所產(chǎn)生的篩選載體庫轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。將所得的菌落合并在384孔主板(masterplate)內(nèi)并保存。所排列菌落的數(shù)目超過輸入PCR產(chǎn)物的數(shù)目至少3倍，從而給出95%的存在全部在c部分中獲得的獨(dú)特V基因?qū)Φ陌俜直瓤赡苄?。e謬遂將在d部分中排列的細(xì)菌菌落接種到相似384孔板的培養(yǎng)基中并過夜生長(zhǎng)。從細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔制備用于轉(zhuǎn)染的DNA。轉(zhuǎn)染前一天，用20pl培養(yǎng)基中的CHOFlp-In細(xì)胞(Invitrogen)以3000個(gè)細(xì)胞/孔接種384-孔板。使用Fugene6(Roche)根據(jù)制造商的使用說明用DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。溫育2-3天后，收獲含全長(zhǎng)抗體的上清液，并保存用于篩選目的。使用AppliedBiosystems8200FMATTM系統(tǒng)進(jìn)行篩選，該系統(tǒng)是基于同質(zhì)珠的可溶俘獲FLISA(熒光聯(lián)接的免疫吸附測(cè)定)(Swartzmanetal.1999,Anal.Biochem.271:143-151)。有大量抗原可用于篩選，例如病毒顆粒、重組G蛋白和得自于RSV抗原的生物素化肽。肽得自于G蛋白的保守區(qū)(氨基酸164-176)和半胱氨酸核心區(qū)(氨基酸171-187，病毒林Long和18537)以及SH蛋白的細(xì)胞外區(qū)(A2抹的氨基酸42-64和18537林的42-65)。通過用300|al病毒儲(chǔ)液(蛋白質(zhì)濃度200pg/ml)溫育300pl5%w/v珠(6.79iam直徑，SpherotechInc.)將RSV病毒林Long(HyTest)的滅活病毒顆粒固定在聚苯乙烯珠上。將可溶重組G蛋白(18537病毒抹序列的氨基酸66-292)類似地直接固定在聚苯乙烯珠上，而將生物素化肽以飽和濃度俘獲在預(yù)涂布抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)聚苯乙烯的珠上(6.0-8.0nm直徑，GerlindeKisker)。將涂布混合物溫育過夜，并在PBS中洗滌2次。將珠在含有1%牛血清白蛋白(PBS/BSA)和5pl羊抗人IgGAlexa647接合物(分子探針)的50mlPBS中重懸。將10|il重懸的涂布混合物添加到FMAT相容的384孔板內(nèi)20pl含抗體上清液，并溫育大約12h,之后測(cè)量各個(gè)孔內(nèi)珠表面的熒光。如果熒光強(qiáng)度比背景基線高至少6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差則認(rèn)為該熒光事件是陽性的。從原始主板重新得到導(dǎo)致初級(jí)命中(primaryhit)的克隆，并收集在新的板內(nèi)。從這些克隆分離DNA，并用于V基因的DNA測(cè)序。將序列進(jìn)行比對(duì)并選擇所有的獨(dú)特克隆。對(duì)所選克隆進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。簡(jiǎn)而言之，用1.7|Lig來自所選克隆的DNA和0.3|iigpAdVAntage質(zhì)斗立(Promega)在2mlFreestyle培養(yǎng)基(Invitrogen)內(nèi)才艮據(jù)制造商的使用說明轉(zhuǎn)染2x106個(gè)Freestyle293細(xì)胞(Invitrogen)。2天后，通過FLISA和/或ELISA測(cè)試上清液的IgG表達(dá)以及與和用于初級(jí)篩選不同的抗原和重組純化的F蛋白及大腸桿菌產(chǎn)生的G蛋白片段(18537病毒抹序列的氨基酸127-203)的反應(yīng)性?？贵w上清以系列稀釋進(jìn)行測(cè)試，以根據(jù)抗原反應(yīng)性對(duì)克隆進(jìn)行分級(jí)(ranking)。當(dāng)使用如c部分中所述的多重PCR方法時(shí)，由于高度的同源性,預(yù)期會(huì)產(chǎn)生一定程度的V基因家族內(nèi)或家族間交叉引發(fā)(cross-priming)。交叉引發(fā)會(huì)引入在免疫球蛋白框架內(nèi)非天然存在的氨基酸，具有多種潛在的結(jié)果，例如結(jié)構(gòu)改變和免疫原性增加，這都會(huì)導(dǎo)致治療活性降低。為了消除這些缺點(diǎn)并保證所選克隆反映天然的體液免疫應(yīng)答，需要在稱作克隆修補(bǔ)的過程中對(duì)這類交叉引發(fā)突變進(jìn)行修正。在克隆修補(bǔ)方法的第一個(gè)步驟中，以含有對(duì)應(yīng)于感興趣的克隆所來源的V『基因的序列的引物組PCR擴(kuò)增VH序列，由此修正任何由于交叉引發(fā)引入的突變。用iol和Acl對(duì)PCR片段進(jìn)行消化，并使用傳統(tǒng)的連接方法將其連接回^2oI/AcI消化的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(圖3)。連接載體在大腸桿菌中擴(kuò)增，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法純化質(zhì)粒。對(duì)VH序列進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)正確，用Mzel/iVort對(duì)載體進(jìn)行消化，以制備它用于插入輕鏈。在第二步中，用含有對(duì)應(yīng)于感興趣的克隆所來源的Vl-基因的序列的引物組PCR擴(kuò)增整個(gè)輕鏈，由此修正任何由于交叉引發(fā)引入的任何突變。用A%eI/A^I對(duì)PCR片段進(jìn)行消化，并將其連接到如上制備的含VH的載體內(nèi)。連接產(chǎn)物在大腸桿菌中擴(kuò)增，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法純化質(zhì)粒。隨后，對(duì)輕鏈進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)正確。當(dāng)在如C部分所述的基因擴(kuò)增期間引入了含有突變的所選克隆的K恒定區(qū)的情況下，將其以無突變恒定區(qū)替換。這是在重疊PCR中實(shí)現(xiàn)的，其中將修補(bǔ)的VL-基因(無恒定區(qū)擴(kuò)增)融合于具有正確序列的恒定區(qū)(在單獨(dú)的PCR中獲得)。如上所述對(duì)整個(gè)序列進(jìn)行擴(kuò)增并克隆到含Vh栽體內(nèi)，對(duì)經(jīng)過^f奮補(bǔ)的輕鏈進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)正確。g^:成,^發(fā)勿應(yīng)屑生產(chǎn)重組多克隆抗體的多克隆表達(dá)細(xì)胞系的生成是一個(gè)多步程序，包括各個(gè)表達(dá)細(xì)胞系的生成，其每一個(gè)從單個(gè)Vh和Vt基因序列表達(dá)獨(dú)特的抗體。多克隆細(xì)胞系通過如下方法獲得混合各個(gè)細(xì)胞系，并將混合物分配到安瓿內(nèi)，由此產(chǎn)生多克隆研究細(xì)胞庫(pRCB)或者主細(xì)胞庫(pMCB),通過從研究或主細(xì)胞庫擴(kuò)增細(xì)胞可以產(chǎn)生多克隆工作細(xì)胞庫(pWCB)。一般地，來自pRCB的多克隆細(xì)胞系可直接使用而無需生成pWCB。生成多克隆細(xì)胞系過程中的各個(gè)步驟如下文所述。g-7#染和這#嘑#乙動(dòng)錄勿應(yīng)系使用Flp-InCHO細(xì)胞系(Invitrogen)作為起始細(xì)胞系。為了獲得更均質(zhì)的(homogenous)細(xì)胞系，通過有限稀釋對(duì)親本Flp-InCHO細(xì)胞系進(jìn)行亞克隆，選擇數(shù)個(gè)克隆并擴(kuò)增。根據(jù)生長(zhǎng)行為選擇一個(gè)克隆CHO-Flp-In(019)作為起始細(xì)胞系。在含有10。/o胎牛血清(FCS)的HAM-F12中將CHO-Flp-In(019)細(xì)胞培養(yǎng)成粘附細(xì)胞。在T175燒瓶?jī)?nèi)用Fugene6(Roche)將單個(gè)質(zhì)粒制備物(其每一個(gè)含有所選并經(jīng)過修補(bǔ)的在f部分中獲得的Vh和V^編碼對(duì))與Flp重組酶編碼質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到19xl()6個(gè)CHO-Flp-In(019)細(xì)胞內(nèi)(進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見WO04/061104)。24h后將細(xì)胞胰蛋白酶化(trypsinate)，并轉(zhuǎn)移到2-層(1260cm2)細(xì)胞工廠(cellfactory)(Nunc)。通過在500jig/ml遺傳霉素存在下進(jìn)行培養(yǎng)選擇重組細(xì)胞系，其中遺傳霉素在轉(zhuǎn)染后48h添加。大約2周后出現(xiàn)克隆。對(duì)克隆計(jì)數(shù)，將細(xì)胞胰蛋白酶化，之后培養(yǎng)成表達(dá)其中一種RSV特異性抗體的克隆的匯集物。g-2這^無j&清老浮培^將各個(gè)粘附的抗RSV抗體表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)物胰蛋白酶化、離心并轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的搖瓶(250ml)內(nèi)，具有1.15x106個(gè)細(xì)胞/ml適當(dāng)?shù)臒o血清培養(yǎng)基(Excel1302,JRHBiosciences;500pg/ml遺傳霉素，抗聚集劑(1:250)和4mML-谷氨酰胺)。對(duì)生長(zhǎng)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)跟蹤數(shù)周。4-6周后，細(xì)胞系通常顯示出良好而穩(wěn)定的生長(zhǎng)行為，其倍增時(shí)間低于30h，然后將已適應(yīng)的單個(gè)細(xì)胞系冷凍保存在多個(gè)安瓿中。使用在i)部分中描述的方法從上清液中純化在適應(yīng)期間表達(dá)的各個(gè)抗體。純化的抗體用于表征抗原特異性和生物化學(xué)性質(zhì)，如下文所述。勿應(yīng)系4在對(duì)所有的單個(gè)細(xì)胞系的抗體產(chǎn)生和增殖進(jìn)行表征。這用如下的測(cè)定方法進(jìn)行。產(chǎn)生在適應(yīng)期間，通過k特異的ELISA對(duì)各個(gè)表達(dá)細(xì)胞系的重組抗體的產(chǎn)生進(jìn)行跟蹤。在碳酸鹽緩沖液，pH9.6中用羊抗人Fc純化抗體(Serotec)將ELISA板涂布過夜。板用洗滌緩沖液(PBS;0.05%吐溫20)洗涂6次，并通過在含有2%脫脂乳的洗滌緩沖液中溫育1h來進(jìn)行封閉。添加細(xì)胞培養(yǎng)基上清并將溫育延長(zhǎng)lh。將板在洗滌緩沖液中洗滌6次，添加第二抗體(羊抗人kHRP,Serotec),重復(fù)溫育步驟。強(qiáng)力洗滌之后，用TMB底物對(duì)ELISA進(jìn)行顯影，通過添加H2S04終止反應(yīng)。板在450nm進(jìn)行閱讀。進(jìn)一步，使用細(xì)胞內(nèi)染色確定一般表達(dá)水平，以及確定與重組抗體表達(dá)有關(guān)的細(xì)胞群體的同質(zhì)性。將5xl()s個(gè)細(xì)胞在冷FACS緩沖液(PBS;2%FCS)中洗滌，然后通過在CellFix(BD-Biosciences)中溫育20min來進(jìn)行固定。在水冷曱醇中l(wèi)Omin將細(xì)胞?；涂蓾B透化(permeabilize)，并在FACS緩沖液中洗滌2次。將懸浮液熒光標(biāo)記，添加抗體(羊F(ab，)2片段，抗人IgG(H+L)-PE,BeckmanCoulter)。在水上20min后，將細(xì)胞洗滌并重懸在FACS緩沖液中，隨后進(jìn)行FACS分析。增殖每周將細(xì)胞懸浮液的等分2-3次，并通過Vi-CellXR(細(xì)胞生存力分析儀，BeckmanCoulter)分析確定細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞大小和生存力。用從Vi-細(xì)胞測(cè)量獲得的細(xì)胞數(shù)目計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)的倍增時(shí)間(doublingtime)。g-4各個(gè)在傳的我,掙弄^的4在對(duì)各個(gè)表達(dá)抗體的抗原和表位特異性進(jìn)行估計(jì)，以允許產(chǎn)生具有良好表征的特異性的抗RSVrpAb。如在e部分中已經(jīng)描述的，通過FLISA、ELISA和表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振(SPR;Biacore)估計(jì)抗體與單個(gè)RSV抗原(重組G蛋白、重組或純化的F蛋白)或其肽片段(蛋白G(亞型A和B)的保守區(qū)和半胱氨酸核心基序，SH蛋白(亞型A和B)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)的結(jié)合特異性，從而驗(yàn)證在篩選期間鑒定的抗體。在ELISA中通過與良好表征的商業(yè)抗體進(jìn)行竟?fàn)巵泶_定表位特異性，其中一些商業(yè)抗體如表4中所示。在表征本發(fā)明的每個(gè)單獨(dú)抗體時(shí)不必使用表4所示的全部抗體，也可以使用潛在的其它抗體或抗體片段，關(guān)于它們結(jié)合的抗原、抗原位點(diǎn)和/或表位已得到表征。簡(jiǎn)而言之，將用于表位封閉的抗體或抗體片段與固定抗原(RSVLong顆粒,HyTest)—起溫育，其中抗體或抗體片段大大過量，即濃度是給出75%最大結(jié)合的濃度的100倍，如通過實(shí)驗(yàn)所確定的(Ditzeletal.，J.Mol.Biol.1997,267:684-695)。洗滌后，各個(gè)抗體克隆與各種濃度的被封閉抗原一起溫育，用羊抗人HRP接合物(Serotec)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)ELISA規(guī)程檢測(cè)任何結(jié)合的人IgG。用(實(shí)驗(yàn)確定的)飽和濃度的封閉和探測(cè)抗體通過在Biacore內(nèi)不同抗體克隆之間的成對(duì)竟?fàn)庍M(jìn)一步對(duì)表位特異性進(jìn)行表征。使用通過直接胺偶連(Biacore)固定的純化F或G蛋白作為抗原。在基于ELISA和Biacore的表位作圖中，將表位封閉后被還原的結(jié)合與無竟?fàn)幗Y(jié)合進(jìn)行比較。表4:用于抗F和抗G抗體表位作圖的單克隆抗體MAb/Fab抗原抗原位點(diǎn)表位(aa)參考文獻(xiàn)131-2aFFlFla1,29C5FFlFla592-1lcFFlFlb1,2102-10bFFlFlc1,2133-lhFCF21,2,3130-8fFCF2(241/421)1,2,3,4143-6cFA/IIF31,2,3PalivizumabFA/II(272)81153FA/II(262)3,41142FA/II31200FA/II(272)2,41214FA/II(276)3，41237FA/n(276)3,41129FA/II(275)3,41〗21FA/II31112FB/I(389)3,61269FB/I(389)3,61243FC(241/421)3，6Fab19FA/II(266)7RSVF2-5FIV(429)4Mabl9FIV(429)127.936FV(432-447)139.432FVI(436)1363-10fG(A)GllGCRR(A171-187)1,2130-6dG(A)G12CA174-214)1，2，9131-2gG(A+B)G13(150-173)1,2,9143-5aG(A+B)G5a2L9G(A+B)A1/B1保守的(164-176)14,158C5GND51C2G(A)NDGCRR(A172-188)10,113F4G(A)ND10,114G4G(A)NDGCRR(A172-188)10,11抗原，，列表示被Mab/Fab結(jié)合的RSV相關(guān)抗原，并且如果亞型特異性已知，則在()內(nèi)指出。"表位(aa)"列表示被MAb/Fab識(shí)別的表位的名稱，而且在()中表示的是導(dǎo)致RSV逃逸突變體的氨基酸位置，或者對(duì)其已顯示結(jié)合的肽/蛋白質(zhì)片段。表4中給出的編號(hào)參考文獻(xiàn)(Ref.)相應(yīng)于1.Andersonetal.,J.Clin.Microbiol.1986,23:475-480.2.Andersonetal.，J.Virol.1988,62:1232-4238,3.Beeler&vanWykeCoelingh,J.Virol.1989,63:2941-2950.4.Croweetal.,JID1998，177:1073-1076.5.Somininaetal"VestnRossAkadMedNauk1995,9:49-54.6.Collinsetal.,FieldsVirology,p.1313-1351.7.Croweetal.，Virology1998,252:373-375.8.Zhao&Sullender，J.Virol.2004，79:3962-3968.9.Sullender,Virology1995,209:70-79.10.Morganetal.，J.Gen.Virol.1987，68:2781-2788.11.McGilletal.，J.Immunol.Methods2005,297:143-152.12.Arbizaetal.,J.Gen.Virol.1992，73:2225-2234.13.Lopezetal.J.Virol.1998,72:6922-6928.14.Walshetal.,J.Gen.Virol.1989，70:2953-2961.15.Walshetal.，J.Gen.Virol.1998,79:479-487.而且，抗體克隆還可以通過FACS根據(jù)與被不同RSV病毒抹(Long和Bl)感染的人喉上皮HEp-2細(xì)胞(ATCCCLL-23)的結(jié)合進(jìn)行表征。簡(jiǎn)而言之，在無血清培養(yǎng)基中用RSVLong(ATCC號(hào)VR-26)病毒抹或RSVBl(ATCC號(hào)VR-1400)病毒林以0.1pfti/細(xì)胞的比例對(duì)HEp-2細(xì)胞感染24(Long病毒株)或48h(Bl病毒抹)。脫離(detachment)和洗滌后，將細(xì)胞分配在96孔板內(nèi)，并與各個(gè)抗RSV抗體的稀釋物(4pM-200pM)在37°C溫育1h。細(xì)胞在1%曱醛中固定，細(xì)胞表面結(jié)合抗體通過與羊F(ab)2抗人IgG-PE接合物(BeckmanCoulter)在4。C溫育30min來進(jìn)4亍才企觀'J。類4以i也分一斤與才莫4以感染的HEp-2細(xì)胞的結(jié)合。還通過ELISA對(duì)所選的鑒定為蛋白G特異性的克隆進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試其與重組人fractalkine(CX3CL1;R&D系統(tǒng))的交叉反應(yīng)性。使用抗人CX3CL1/Fractalkine單克隆抗體(R&D系統(tǒng))作為陽性對(duì)照。g-5吝個(gè)拔沐的潛合動(dòng)力夢(mèng)或在在Biacore3000(BiacoreAB，Uppsala,Sweden)上用表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振分析對(duì)本發(fā)明的抗體進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，其使用以非常低的密度固定在傳感器表面上的重組抗原以避免質(zhì)量輸送限制。使用通過ImmunoPureFab制備試劑盒(Pierce)以從各個(gè)抗體克隆制備的Fab片段進(jìn)行分析。簡(jiǎn)而言之，用胺偶連試劑盒(Biacore)根據(jù)制造商的使用說明將總共200共振單位(RU)的重組蛋白質(zhì)F或總共50RU的重組蛋白質(zhì)G接合于CM5芯片表面。將Fab片段以系列稀釋注射在芯片表面上，以一個(gè)優(yōu)化的濃度開始，其在芯片上用固定蛋白質(zhì)測(cè)試時(shí)不會(huì)造成超過25的RUmax值。結(jié)合速度常數(shù)(ka)和解離常數(shù)(kd)在BIAevaluation41軟件(BIAcore)中用預(yù)定的1:1(Langmuir)結(jié)合和解離模型進(jìn)行總體估計(jì)。通過對(duì)Fab片段進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，確保所得數(shù)據(jù)真實(shí)反映與RSV蛋白質(zhì)的結(jié)合親和性。如果使用完全抗體，則數(shù)據(jù)反映結(jié)合親合力，其不能容易地轉(zhuǎn)換成關(guān)于抗體結(jié)合特性相對(duì)抗原的確切性質(zhì)的有意義的量度。g-6吝個(gè)我伴的蘭參^夢(mèng)^l的^在異質(zhì)性是抗體和重組蛋白質(zhì)中的一個(gè)普遍現(xiàn)象。抗體修飾通常在表達(dá)期間發(fā)生，例如翻譯后修飾，如N-糖基化、蛋白水解片段化、和導(dǎo)致大小或電荷異質(zhì)性的N-和C-末端異質(zhì)性。此外，在隨后的短期或長(zhǎng)期保存期間會(huì)發(fā)生修飾，例如曱硫氨酸氧化和脫氨基。因?yàn)檫@些參數(shù)對(duì)于治療性抗體需要明確限定，所以在生成多克隆細(xì)胞系之前要對(duì)它們進(jìn)行分析。用于表征純化的單個(gè)抗體的方法(參見i部分)包括SDS-PAGE(還原和非還原條件)、弱陽離子交換色譜(正X)、大小排阻色譜(SEC)和RP-HPLC(還原和非還原條件)。還原和非還原條件下的SDS-PAGE分析和SEC表明，純化的抗體確實(shí)保持完整，只有微少量的片段化和凝集形式。純化抗體的IEX分布分析產(chǎn)生單峰分布或多峰色譜圖，表明在這些特定抗體中的電荷異質(zhì)性。對(duì)在IEX分析中產(chǎn)生多個(gè)峰和/或在SDS凝膠中產(chǎn)生輕鏈或重鏈異常遷移或者產(chǎn)生異常RP-HPLC分布的抗體制備物進(jìn)行詳細(xì)分析，通過N末端測(cè)序詳細(xì)分析完整的N末端，并詳細(xì)分析由于寡糖分布的差異導(dǎo)致的異質(zhì)性。此外，用酶處理和隨后的SDS-PAGE分析對(duì)所選抗體進(jìn)行分析，研究在可變鏈中額外N-糖基化位點(diǎn)的存在。g-7^fV^^戎i5y重逸/^i謦戎傳的多^發(fā)細(xì)應(yīng)屑^^^ji從已建立的表達(dá)細(xì)胞系的集合選擇一個(gè)待混合的亞類用于產(chǎn)生多克隆細(xì)胞系和多克隆研究/主細(xì)胞庫(pRCB/pMCB)。可以才艮據(jù)待從多克隆細(xì)胞系中產(chǎn)生的多克隆抗體的用途和各個(gè)細(xì)胞系的性能來確定選擇參數(shù)。一般地，考慮如下的參數(shù)細(xì)胞系特征；為了優(yōu)化多克隆細(xì)胞系的穩(wěn)定性，倍增時(shí)間為21-30小時(shí)且抗體生產(chǎn)力高于1pg/細(xì)胞/天的單個(gè)細(xì)胞系是優(yōu)選的。反應(yīng)性；仔細(xì)考慮抗RSVrpAb發(fā)揮反應(yīng)性所針對(duì)的抗原/抗原位點(diǎn)和表位。蛋白質(zhì)化學(xué)；優(yōu)選地，具有明確的生物化學(xué)特性的抗體包括在最終的抗RSVrpAb內(nèi)。將所選的單個(gè)細(xì)胞系(其每個(gè)表達(dá)重組抗RSV抗體)在搖弁瓦內(nèi)的無血清培養(yǎng)基中在37。C解凍和擴(kuò)增，以達(dá)到每個(gè)克隆至少4xl()S個(gè)細(xì)月包，群體倍增時(shí)間為21-34小時(shí)。生存力的優(yōu)選范圍是93%-96%。通過混合來自每個(gè)細(xì)胞系的2乂106個(gè)細(xì)胞制備多克隆細(xì)胞系。將多克隆細(xì)胞系分配到冷凍安瓿中，含有5.6xl0個(gè)細(xì)胞，并冷凍保存。該具有多克隆細(xì)胞系的小瓶的集合被稱作多克隆研究/主細(xì)胞庫(pRCB/pMCB),從其可以產(chǎn)生多克隆工作細(xì)胞庫(pWCB),其是通過擴(kuò)增來自pRCB/pMCB的一個(gè)安瓿以達(dá)到足夠數(shù)目的細(xì)胞，從而建立大約200個(gè)安瓿的多克隆工作細(xì)胞庫(pWCB)，其細(xì)胞密度與pRCB/pMCB的安瓿相同。測(cè)試來自該細(xì)胞庫的樣品的支原體和無菌性。重逸多^鏖我/^F戎體的襲這在5升生物反應(yīng)器(B.BraunBiotechInternational,Melsungen,Germany)中產(chǎn)生重組多克隆抗RSV抗體批次。簡(jiǎn)而言之，將來自pRCB或pWCB的小瓶解凍，并在搖瓶(Corning)中擴(kuò)增。種子系列(seedtrain)中的細(xì)胞在含有G418并且含有抗聚集劑的ExCell302培養(yǎng)基中在37。C,5%C02下培養(yǎng)。向生物反應(yīng)器接種0.6xl(^個(gè)細(xì)胞/ml，其懸浮于31無G418且無抗聚集劑的ExCell302培養(yǎng)基中。每天通過CASY或ViCell計(jì)數(shù)監(jiān)視細(xì)胞數(shù)目/存活細(xì)胞。在50h,補(bǔ)加2000mlExCell302培養(yǎng)基，92h后,將溫度從37。C調(diào)低到32。C。164h后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物上清，并按照i)部分所述進(jìn)行純化。/卓個(gè)我i^r戎糸和/^謦我7^r我謬^^化如g、g-2和h部分所述表達(dá)的抗體，全部為IgGl亞型，用MabSelectSuRe柱(蛋白-A)進(jìn)行親和純化。單個(gè)抗體在pH7.4與固定的蛋白質(zhì)A相互作用，而雜質(zhì)蛋白被從柱中洗去。隨后通過將pH降低到2.7將結(jié)合抗體從柱中洗脫。匯集含有抗體的級(jí)分(其由在280nm的吸光度測(cè)量來確定)，使用G-25柱將緩沖液變成5mM醋酸鈉、150mMNaCl，pH5，并保存于-20。C。y謬#哞和豸定y-/斜務(wù)刀f謬/A炎^的活沐7^r將人喉上皮HEp-2細(xì)胞(ATCCCLL-23)以lx107個(gè)細(xì)胞/瓶接種在175cm2燒瓶?jī)?nèi)。細(xì)胞在3ml無血清培養(yǎng)基中以0.1pfW細(xì)胞的比例用RSVLong(ATCC號(hào)VR-26)、RSVBl(ATCC號(hào)VR-1400)或RSVBWash/18537(AdvancedBiotechnologiesInc.)病毒林感染。細(xì)胞在37。C;5%C02條件下感染2h,之后添加37ml完全MEM培養(yǎng)基。將細(xì)胞溫育，直到細(xì)胞病變效果明顯。通過刮擦使細(xì)胞分離，對(duì)培養(yǎng)基和細(xì)胞超聲處理20秒，等分試樣，在液氮中驟凍，并保存于-80。C。將HEp-2細(xì)胞以2xl04細(xì)胞/孔接種在96孔培養(yǎng)板上，并于37。C;5%C02溫育過夜。將測(cè)試物在無血清MEM中稀釋，并允許在不存在或者存在補(bǔ)體(來自兔的補(bǔ)體血清，Sigma)的情況下在37。C與RSV預(yù)溫育30min。將該混合物施加到單層HEp-2細(xì)胞，并在37。C;5。/。C02溫育24h。細(xì)胞用80%丙酮；20%PBS固定20min。洗涂后，在含有1%BSA的PBS中添加生物素化的羊抗RSV抗體(AbDSerotec)(1:200),并在室溫溫育1h。洗滌后，添加HRP-抗生物素蛋白，并溫育30min。通過與3-氨基-9-乙基寸唑(AEC)底物溫育25min(RSVLong)或45min(RSVBl)來使斑點(diǎn)顯影。斑點(diǎn)在Bioreader(Bio-SysGmbH)中計(jì)數(shù)。計(jì)算EC5o值(使斑點(diǎn)數(shù)目減少50%所需的有效濃度)，其可用于效力比較。y'-3融合一伊賴^/;t基本上如斑點(diǎn)還原中和測(cè)定來進(jìn)行融合抑制測(cè)定，只是在添加測(cè)試物之前允許進(jìn)行RSV感染。在實(shí)踐中，向HEp-2細(xì)胞單層添加無血清培養(yǎng)基中的病毒達(dá)1.5h。除去上清液，添加溶于具有或者沒有補(bǔ)體(來自兔的補(bǔ)體血清，Sigma)的完全MEM培養(yǎng)基中的測(cè)試物。將板溫育過夜，并如上文在斑點(diǎn)還原中和測(cè)定中所述進(jìn)行處理。微量哞和兩;t除了在j-2和j-3部分中描述的PRNT和融合抑制測(cè)定之外，還可采用基于RSV蛋白質(zhì)檢測(cè)的微量中和測(cè)定用于確定RSV中和和融合抑制。對(duì)于中和測(cè)定，測(cè)試物在無血清MEM中稀釋，并允許在96孔培養(yǎng)板中在不存在或者存在補(bǔ)體(來自兔的補(bǔ)體血清，Sigma)的情況下與RSV在室溫預(yù)溫育30min。以1.5x104個(gè)細(xì)胞/孔添加胰蛋白酶化的HEp-2細(xì)胞，并在37。C;5。/。C02溫育2-3天。洗滌細(xì)胞，并在4°C用80%丙酮；20%PBS固定15min,并干燥。然后將板在室溫用含有0.5%明膠的PBS封閉30min，并用針對(duì)RSV蛋白質(zhì)的鼠科動(dòng)物單克隆抗體的匯集物(NCL-RSV3，Novocastra)(其在含有0.5%明膠和0.5%吐溫-20的PBS中以l:200稀釋)在室溫染色2h。洗滌后，添加多克隆兔抗鼠免疫球蛋白HRP-接合物(P0260;DakoCytomation)，其在含有0.5%明膠和0.5%吐溫-20的PBS中以1:1000稀釋，并在室溫溫育2h。對(duì)板進(jìn)行洗滌，并通過添加鄰-苯二胺(ortho-phenylendiamine)進(jìn)行顯影。通過添加H2S04終止反應(yīng)，在ELISA板閱讀器內(nèi)在490nm對(duì)板進(jìn)行閱讀?；旧先缥⒘恐泻蜏y(cè)試來進(jìn)行融合抑制測(cè)定，只是在添加稀釋于完全MEM中的測(cè)試物之前向細(xì)胞添加病毒，并在37。C;5%C02溫育1.5h。將板在37。C;5%C02溫育2-3天，并如上所述地進(jìn)4亍顯影。A-7V、篇刺激fc/za〃e"^;^f型在研究的-1天用0.2ml抗體制備物對(duì)7-8周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)接種。安慰劑處理的小鼠也類似地用0.1mlPBS緩沖液i.p.接種。在研究的0天，通過吸入異熒烷(isofluorane)將小鼠麻醉，并鼻內(nèi)接種50pi10義1(T7pfuRSV病毒林A2或者細(xì)胞裂解物(才莫擬接種物)。使動(dòng)物用30秒鐘呼吸接種物，同時(shí)保持豎立，直到從麻醉中完全蘇醒。剌激5天后，用過量戊巴比妥鈉殺死小鼠。死后，通過腋血管放血獲得血液，用于制備血清。移出肺并在2.5ml緩沖液中用滅菌沙均質(zhì)化。將肺均質(zhì)物離心以沉積沙子和細(xì)胞碎片，等分上清液，并保存于-70。C。通過用反轉(zhuǎn)錄酶(RT-)PCR定量肺樣品中RSVRNA拷貝數(shù)來確定病毒負(fù)載(virusload)。用MagNAPureLC總核酸^式劑盒(RocheDiagnostics)自動(dòng)提取系統(tǒng)根據(jù)制造商的使用說明從肺均質(zhì)物中提取RNA。使用LightCycler儀器和試劑(RocheDiagnostics)通過單管實(shí)時(shí)(real-time)RT-PCR以特異于RSV亞型A的N基因的焚光標(biāo)記探針和引物進(jìn)行RSVRNA的沖全測(cè)，如Whiley等(J.ClinicalMicrobiol.2002,40:4418-22)所述。對(duì)具有已知RSVRNA拷貝數(shù)的樣品進(jìn)行相似的分析以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過商業(yè)多元免疫測(cè)定在Rules-BasedMedicine(Austin,TX)使用它們的嚙齒類多分析物分布(profile)(MAP)確定肺組織樣品中不同細(xì)^^因子和趨化因子的水平。A:-2^葳冉濃^型在研究的-1天，用0.5ml抗體制備物或安慰劑(PBS)對(duì)6-8周齡雌性棉鼠(57gwodo"/^pWM力進(jìn)行腹膜內(nèi)接種。24小時(shí)后，用異熒烷將動(dòng)物輕度麻醉，并給予IO-M(T7pfURSV病毒林A2或者對(duì)照媒介物(模擬接種物)的鼻內(nèi)刺激。施用總體積為100pl的接種物，并均勻分布于兩個(gè)鼻孔。鼻內(nèi)刺激完成后，使每個(gè)動(dòng)物保持豎立姿勢(shì)最少30秒，從而允許完全吸入接種物。刺激5天后，通過致死的腹膜內(nèi)注射戊巴比妥殺死動(dòng)物，并通過心臟穿刺放血。獲得血清樣品并在-80。C冷凍，在無菌條件下解剖每只動(dòng)物，除去肺和鼻組織。將組織樣品均質(zhì)化，并將上清液等分保存于-80。C。通過基于VanElden等的方法(JClinMicrobiol.2003,41(9):4378-4381)的Taq-Man實(shí)時(shí)測(cè)定來定量RSVRNA拷貝的數(shù)目，從而確定組織樣品中的病毒負(fù)載。簡(jiǎn)而言之，用RNeasy(Qiagen)方法根據(jù)制造商的使用說明從肺均質(zhì)物樣品中提取RNA。使用SuperscriptIIIPlatinumOneStepQuantitativeRT-PCRSystem(Invitrogen)及特異于RSV亞型A的N基因的標(biāo)記探針和引物將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,隨后通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)具有已知RSV濃度的樣品進(jìn)行相似的分析，以便獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)施例2在本實(shí)施例中，舉例說明了對(duì)含有被表達(dá)為具有抗RSV特異性的全長(zhǎng)抗體的同源Vh和Vi對(duì)的克隆的分離、篩選、選擇和儲(chǔ)積(bank)。供體從雇員和曾在RSV季期間在Hvidovre醫(yī)院(Denmark)兒科部住院的兒童的父母中招募了總共89位供體。抽取了18ml初始血液樣品，對(duì)CD19+B細(xì)胞進(jìn)行純化(實(shí)施例l,a部分)，用ELISpot(實(shí)施例1，b部分)篩選是否存在抗RSV抗體，并通過FACS分析確定漿細(xì)胞的頻數(shù)(fr叫uency)。在初始血液樣品篩選中發(fā)現(xiàn)有l(wèi)l位供體呈陽性，從其中10位收集450ml第二血液樣品。根據(jù)實(shí)施例1的a部分對(duì)漿胚細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分選。對(duì)CD19陽性B細(xì)胞的級(jí)分進(jìn)行ELISpot。在第二次血液捐獻(xiàn)中鑒定出了4位供體，其ELISpot頻數(shù)是RSV特異性漿細(xì)胞(IgG+和IgA+)占總漿細(xì)胞群的0.2-0.6%。這些頻數(shù):帔認(rèn)為已足夠高以進(jìn)行同源VH和VL對(duì)的庫(repertoire)的聯(lián)結(jié)。/^7源K//和編,4對(duì)的為、岸通過多倍重疊延伸RT-PCR(實(shí)施例1,c部分)從來自5個(gè)供體的單細(xì)胞分選的漿細(xì)胞中分離編碼抗體庫的核酸。多倍重疊延伸RT-PCR在重鏈可變區(qū)基因片段(VH)和全長(zhǎng)輕鏈(LC)之間創(chuàng)建物理聯(lián)系。通過使用兩個(gè)引物組(一個(gè)用于VH擴(kuò)增，一個(gè)用于LC擴(kuò)增)，設(shè)計(jì)規(guī)程以擴(kuò)增所有Vh-基因家族和k輕鏈的抗體基因。在反轉(zhuǎn)錄和多倍重疊延伸PCR之后，用嵌套引物組對(duì)聯(lián)結(jié)的序列進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。將每個(gè)供體單獨(dú)處理，通過多倍重疊延伸RT-PCR產(chǎn)生1480-2450個(gè)重疊產(chǎn)物。將從每個(gè)供體產(chǎn)生的同源聯(lián)結(jié)Vh和VL編碼對(duì)的集合匯集起來，并插入到哺乳動(dòng)物IgG表達(dá)載體(圖3)中，如實(shí)施例1d)部分所述。將所產(chǎn)生的庫轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，并合并到20個(gè)384孔主々反內(nèi)并加以保存。該庫構(gòu)成每個(gè)供體lxl0、3.6xl(^個(gè)克隆。謬逸用從來自于母板的細(xì)菌克隆制備的DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，并從該CHO細(xì)胞獲得含IgG抗體的上清。如實(shí)施例l，e部分中所述對(duì)上清液進(jìn)行篩選。對(duì)大約600個(gè)初級(jí)命中物(hit)進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)。多數(shù)落于兩個(gè)或更多個(gè)成員的簇中，但是也有僅僅被分離了一次的克隆，所謂的單元素(singleton)。如實(shí)施例1e)部分所述對(duì)來自每個(gè)簇的代表性克隆和單元素進(jìn)行確認(rèn)研究。大量的初級(jí)命中物由于不良的序列特征而不能進(jìn)行進(jìn)一步的表征，其中不良的序列特征如不配對(duì)半胱氨酸，非保守突變，其為潛在的PCR錯(cuò)誤，多個(gè)密碼子插入和/或缺失，以及截?cái)?。總?5個(gè)獨(dú)特的克隆經(jīng)過了確認(rèn)。這些被總結(jié)在表5中。每個(gè)克隆號(hào)指定一個(gè)特定的Vh和Vt對(duì)。對(duì)每個(gè)克隆指示了IGHV和IGKV基因家族，并指定了所選克隆的框架區(qū)(FR)。顯示了從每個(gè)克隆表達(dá)的抗體的補(bǔ)體決定區(qū)(CDR)的氨基酸序列，其中CDRH1,CDRH2,CDRH3指示重鏈的CDR1、2和3區(qū)，CDRL1,CDRL2和CDRL3指示輕鏈的CDR1、2和3區(qū)。從表5中的信息可以建立完整的可變重鏈和輕鏈序列。下面給出了表5中各個(gè)列的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。IGHV和IGKV基因家族名稱根據(jù)正式HUGO/IMGT命名法(IMGT;Lefranc&Lefranc，2001,TheImmunoglobulinFactsBook，AcademicPress)指定。根據(jù)Chothia(Al-Lazikanietal.1997J.Mol.Biol.273:927-48)進(jìn)行編號(hào)和比對(duì)?？寺?09在CDRH1的5，有2個(gè)密碼子插入，其可能翻譯到延伸的CDR環(huán)內(nèi)。克隆831在CDRH1的位置31處有1個(gè)密碼子缺失。"Ag"列表示被從命名克隆產(chǎn)生的抗體識(shí)別的RSV相關(guān)抗原，如通過ELISA、FLISA和/或Biacore所確定的。"+"表示克隆與RSV顆粒和/或RSV感染的細(xì)胞結(jié)合，但是該抗原尚未鑒定。"表位"列表示被從命名克隆產(chǎn)生的抗體識(shí)別的抗原位點(diǎn)或表位(參見表4和下文)。"U，，表示表位未知。UCI和UCII表示未知的簇I和II。屬于這些簇的抗體具有相似的反應(yīng)性分布(profile)，但目前尚沒有被指定于特定的表位。一些抗體識(shí)別復(fù)雜的表位，如A&C。()中表示的表位僅在ELISA中被鑒定。表5:每種獨(dú)特已確認(rèn)克隆的序列和特異性總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>在稱作CDRH1的列中從上到下的氨基酸序列以SEQIDNOs:201-285中相同的順序列出。在稱作CDRH2的列中從上到下的氨基酸序列以SEQIDNOs:286-370中相同的順序列出。在稱作CDRH3的列中從上到下的氨基酸序列以SEQIDNOs:371-455中相同的順序列出。在稱作CDRL1的列中從上到下的氨基酸序列以SEQIDNOs:456-540中相同的順序列出。在稱作CDRL2的列中從上到下的氨基酸序列以SEQIDNOs:541-625中相同的順序列出。在稱作CDRL3的列中從上到下的氨基酸序列以SEQIDNOs:626-710中相同的順序列出。我^掙7f^表在在確認(rèn)期間，通過與病毒顆粒、可溶性G和F蛋白以及G蛋白的片段的結(jié)合在一定程度上確定克隆的抗原特異性。對(duì)于具有抗F反應(yīng)性的克隆，進(jìn)一步對(duì)從該克隆表達(dá)的單個(gè)抗體的特異性進(jìn)行評(píng)估以確定抗原位點(diǎn)，并且如果有可能，確定被單個(gè)克隆結(jié)合的表位(參見實(shí)施例1，g-4部分)。圖4圖解了利用Biacore分析對(duì)從克隆801獲得的抗體的表位特異性的表征。分析顯示，當(dāng)在將抗體801注射入Biacore細(xì)胞之前通過133-lh或Palivizumab(抗原位點(diǎn)分別為C和II)封閉蛋白F時(shí)，可以檢測(cè)到高度的抗體801結(jié)合。當(dāng)與無竟?fàn)?01抗體的結(jié)合進(jìn)行比較時(shí)，竟?fàn)?01抗體的結(jié)合略微減少。然而該減少是如此之小以致于很可能是由于空間位阻而非直接竟?fàn)幗Y(jié)合位點(diǎn)所導(dǎo)致。在將抗體801注射入Biacore細(xì)胞之前用9c5抗體(抗體位點(diǎn)Fl)封閉蛋白F，顯示幾乎完全抑制抗體801與F蛋白的結(jié)合。因此得出結(jié)論，抗體801與蛋白F結(jié)合在F1位點(diǎn)，或者非常接近于它。對(duì)于具有抗G反應(yīng)性的克隆，進(jìn)一步對(duì)從該克隆表達(dá)的單個(gè)抗體的特異性進(jìn)行評(píng)估以確定單個(gè)抗體結(jié)合于G蛋白的中心域、保守區(qū)還是GCRR，并確定表位是保守的還是亞型特異的。這通過ELISA和/或FLISA使用如下的G蛋白片段完成G(B):RSV病毒抹18537的殘基66-292(在DG44CHO細(xì)胞中表達(dá))G(B)片段RSV病毒抹18537的殘基127-203(在大腸桿菌中表達(dá))GCRRA:RSV病毒抹Long的殘基171-187(合成的具有選擇性形成的半胱氨酸橋)GCRRB:RSV病毒抹18537的殘基171-187(合成的具有選擇性形成的半胱氨酸橋)G保守的殘基164-176還通過如實(shí)施例1,g-4部分所述的竟?fàn)幮詼y(cè)定對(duì)于抗G反應(yīng)性克隆進(jìn)行額外表位分析。此外，在如實(shí)施例l，e部分所述的篩選方法中鑒定的克隆中的一個(gè)產(chǎn)生SH特異性抗體。此外，大量克隆結(jié)合一個(gè)或多個(gè)測(cè)試的RSV病毒才朱，但抗原尚未確定。在表5中總結(jié)了與所有已確認(rèn)克隆的抗原特異性相關(guān)的數(shù)據(jù)。已確認(rèn)的克隆中沒有一個(gè)與人喉上皮細(xì)胞結(jié)合，任何已測(cè)試的G特異性克隆(793,816，835,841，853，855,856和888)也不與人fractalkine(CX3CL1)結(jié)合。潛合動(dòng)力夢(mèng)的4在通過表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振確定大量抗體克隆對(duì)重組RSV抗原的結(jié)合親和性。該分析用通過酶切割全長(zhǎng)抗體制備的Fab片段進(jìn)行。表6提供了大量KD值在皮摩爾至納摩爾范圍的高親和性抗體克隆的數(shù)據(jù)。對(duì)源自商業(yè)可獲得的Palivizumab(Synagis)的Fab片段進(jìn)行相似的分析，作為參考。表6:所選克隆的動(dòng)力學(xué)結(jié)合常數(shù)和親和性Fab克隆(抗原)(1()5]vr1s_1)koff(1051/s)&(mill)KD(pM)735(F)4.079.18130226810(F)17.4034.8033200818(F)1.922.20530115817(F)0.927.54150820819(F)3.564.99230140825(F)7.7215.0077195858(F)4.970.343400了831(F)3.7242281130796(G)8.3340.328.67480811(G)4.9817.168340816(G)20.2017.8065卯838(G)2.645.06230l卯<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>^這卓個(gè)戎^的義^的細(xì)應(yīng)岸的Z^選擇相應(yīng)于表5中克隆nr735，736,744,793,795，796,799，800，801，804,810，811,812,814,816,817,818,819,824,825,827，828,829,830，831,835，838,841，853，855，856,857，858,859，861，863，868，870，871,880，881，884,885，886,888，894和955的化個(gè)獨(dú)特的同源Vh和VL編碼對(duì)的子集(subset)用于產(chǎn)生穩(wěn)定的單個(gè)表達(dá)細(xì)胞系，其每一個(gè)表達(dá)來自單個(gè)Vh和Vl基因序列的獨(dú)特抗體。44個(gè)所選克隆(上面鑒定的除去828、885和955)的全序列(DNA和導(dǎo)出的氨基酸)如SEQIDNOs1-176所示。這44個(gè)克隆通過產(chǎn)生如下的Vh序列加以表征，其在SEQIDNOs.1-44中列出。克隆No.735:YGGGQYFAMDVWSPGTTVTVSS克隆No.736:KDMDYYGSRSYSVTYYYGMDVWGQGTTVTVSS克隆No.744:AREDGTMGTNSWYGWFDPWGQGTLVTVSS克隆No,793:YINRGGTTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQ顧SLRAGDTALYYCARGLILALPTATVELGAFDIWGQGTMVTVSS克隆No.795:DFPVWGMNRYLALWGRGTLVTVSS克隆No.796:KDDVATDLAAYYYFDVWGRGTLVTVSS克隆No.799:AVISYDGRNKYFADSVKGRFIISRDDSRNTVFLQ畫SLRVEDTAVYYCARGSVQVWLHLGLFDNWGQGTLVTVSS克隆No.800:TPYEFWSGYYFDFWGQGTLVTVSS克隆No.801:AVIYYEGSNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRAEDTAVYYCARKWLGMDFWGQGTLVTVSS克隆No.804:WGFGNFFDYWGRGTLVTVSS克隆No.810:STRGWDTDGFDIWGQGTMVTVSS克隆No.811:QVQLVQSGAVVETPGASVKVSCKASGYIFGNYYIHWVRQAPGQGLEWMQRSVTGGFDAWLLIPDASNTWGQGT雨TVSS克隆No.812:FSTSTLDPYYFDYWGQGTLVTVSS克隆No.814:RAGRSSMNEEVIMYFDNWGLGTLVTVSS克隆No.816:VIRASGDSEIYADSVRGRFTISRDNSKNTVFLQMDSLRVEDTAVYFCANIGQRRYCSGDHCYGHFDYWGQGTLVTVSS克隆No.817:HIGGTNAYFEWTVPFDGWGQGTLVTVSS克隆No.818:QVFASGGYYLYYLDHWGQGTLVTVSS克隆No.819:YGGNSYSHSYYYGLDVWGRGTTVTVSS克隆No.824:曹AGYEDWGQGTLVTVSS克隆No.825:GWISASSGNKKYAPKFQGRVTLTTDISTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKDGGTYVPYSDAFDFWGQGTMVTVSS克隆No.827:ATVAAAGNFDNWGQGTLVTVSS克隆No.829:GIYDSSGYYLYYFDYWGQGTLVTVSS克隆No.830:CARDRVGGSSSEVLSRAKNYGLDVWGQGTTVTVSS克隆No.831:RASQYGEVYGNYFDYWGQGTLVTVSS克隆No.835:ARDRNVVLLPAAPFGGMDVWGQGTMVTVSS克隆No.838:TPYFNESSGLVPDWGQGTLVTVSS克隆No.841:ESMLRGVTEGFGPIDYWGQGTLVTVSS克隆No.853:YYFDSSGQFSEMYYFDFWGQGTLVTVSS克隆No.855:DLLRSTYFDYWGQGTLVTVSS克隆No.856:ARDGNTAGVDMWSRDGFDIWGQGTMVTVSS克隆No.857:WIDIVVASVISPYYYDGMDVWGQGTTVTVSS克隆No.858:MNLGSHSGRPGFDMWGQGTLVTVSS克隆No,859:GGVNVTSWSDVEHSSSLGYWGLGTLVTVSS克隆No.861:KDEVYDSSGYYLYYFDSWGQGTLVTVSS克隆No.863:YDFWSGYPGGQYWFFDLWGRGTLVTVSS克隆No.868:SIHHSGSAYYNSSLKSRATISIDTSKNQFSLNLRSVTAADTAVYYCARDTILTFGEPH曹DPWGQGTLVTVSS克隆No,870:DSGGYYLFYFQHWGQGTLVTVSS克隆No.871:RASEYSISWRHRGVLDYWGQGTLVTVSS克隆No.880:VDWDDDRRYRPSLKSRLTVTKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHSAYYTSSGYYLQYFHHWGPGTLVTVSS克隆No.881:EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCEVSGFTFNSYEMTWVRQAPGKGLEWVSDYYDSSGYYLLYLDSWGHGTLVTVSS克隆No.884:QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGHTF證AMHWVRQAPGQGLEWM麗GGSAIIFYYWGQGTLVTVSS克隆No.886:KTTDQRLLVDWFDPWGQGTLVTVSS克隆No.888:SIFYSGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSPVTAADTAVYHCARHGFRYC麗GVCSINLDAFDIWGQGTMVTVSS克隆No.894:VPFQIWSGLYFDHWGQGTLVTVSS這些VH氨基酸序列處于由如下核酸序列編碼的克隆中，其也作為SEQIDNOs.45-88列出克隆No.735:caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacgtgcactgtgtctaatggcgccatcggcgactacgactggagctggattcgtcagtccccagggaagggactggagtggattgggaacataaattacagagggaacaccaactacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatgtccctacgcacgtccacgatgcagttctccctgaagctgagctctgcgaccgctgcggacacggccgtctattactgtgcgagagatgtaggctacggtggcgggcagtatttcgcgatggacgtctggagcccagggaccacggtcaccgtctcgagt克隆No.736:caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtacagcgtctggattcaccttcagtacctatggcatgcactgggtccgccaggctcccggcaaggggctggaatgggtggcatttatacggtatgatggaagtactcaagactatgtagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaatatggtgtatgtgcagatgaacagcctgagagttgaggacacggctgtctattactgtgcgaaagacatggattactatggttcgcggagttattctgtcacctactactacggaatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt克隆No.744:caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcagcggctattatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcaacactagcagtggtggcacaaactatgcgcagaagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtccatcagcacagcccacatggaactgaggaggctgagatctgacgacacggccgtgtattattgtgcgagagaggacggcaccatgggtactaatagttggtatggctggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.793:caggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcggcctctggattccccttcggtgactactacatgagctggatccgccaggctccagggaagggactggagtgggttgcatacattaatagaggtggcactaccatatactacgcagactctgtgaagggccgattcaccatctccagggacaacgccaagaactccctgtttctgcaaatgaacagcctgagagccggggacacggccctctattactgtgcgagagggctaattctagcactaccgactgctacggttgagttaggagcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgag克隆No.795:caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtgcctccatcagcagtggtgattattactggagttggatccgtcagtctccaaggaagggcctggagtggattgggtacatcttccacagtgggaccacgtactacaacccgtccctcaagagtcgagctgtcatctcactggacacgtccaagaaccaattctccctgaggctgacgtctgtgactgccgcagacacggccgtctattattgtgccagagatgtcgacgattttcccgtttggggtatgaatcgatatcttgccctctggggccggggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.796:caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggatteagcttcagtcactttggcatgcactgggtccgccaggttccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatcatatgatgggaataatgtacactatgccgactccgtaaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtttctgcaaatgaacagcctgagagatgacgacacgggtgtgtattactgtgcgaaggacgacgtggcgacagatttggctgcctactactacttcgatgtctggggccgtggcaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.799:caggtgcagctggtggagtctgggggcggcgtggtccagcctgggaggtccctgaaactctcttgtgaagcctctggattcaacttcaataattatggcatgcactgggtccgccaggcaccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatttcatatgacggaagaaataagtattttgctgactccgtgaagggccgattcatcatctccagagacgattccaggaacacagtgtttctgcaaatgaacagcctgcgagttgaagatacggccgtctattactgtgcgagaggcagcgtacaagtctggctacatttgggactttttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.800:caggtgcagctggtggagtctgggggagccgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgaagtgtctggattcagtttcagtgactatggcatgaactgggtccgccagggtccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggcatgacggaagtaataaaaattatctagactccgtgaagggccgattcaccgtctccagagacaattccaagaacacattgtttctgcaaatgaacagcctgagagccgaagacacggctgtatattactgtgcgaggacgccttacgagttttggagtggctattactttgacttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.801:caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattccccttcaatagctatgccatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagtgatatattatgaagggagtaatgaatattatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacactctgtatttgcaaatggatagcctgagagccgaggacacggctgtctattactgtgcgaggaagtggctggggatggacttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.804:gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccggcctggggggtccctgagactctcctgttcagcctctggattcaccttcagtaactatgctatgcactgggtccgccaggctccagggaagagactggaatatgtttcagctactagtactgatggggggagcacatactacgcagactccctaaagggcacattcaccatctccagagacaattccaagaacacactgtatcttcaaatgagcagtctcagtactgaggacacggctatttattactgcgcccgccgattctggggatttggaaacttttttgactactggggccggggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.810:caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagtccgggtcctcggtgaaggtctcctgcagggcttctggaggcaccttcggcaattatgctatcaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtgggtgggaaggatcatccctgtctttgatacaacaaactacgcacagaagttccagggcagagtcacgattaccgcggacagatccacaaacacagccatcatgcaactgagcagtctgcgacctcaggacacggccatgtattattgtttgagaggttccacccgtggctgggatactgatggttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt克隆No.811:caggttcagctggtgcagtctggggctgtcgtggagacgcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcatctggatacatcttcggcaactactatatccactgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggatggcagttatcaatcccaatggtggtagcacaacttccgcacagaagttccaagacagaatcaccgtgaccagggacacgtccacgaccactgtctatttggaggttgacaacctgagatctgaggacacggccacatattattgtgcgagacagagatctgtaacagggggctttgacgcgtggcttttaatcccagatgcttctaatacctggggccaggggacaatggtcaccgtctcgagt克隆No.812:caggtgcagctggtgcagtctggggctgagatgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggctccttcagcagctattctatcagctgggtgcgacaggcccctggacgagggcttgagtgggtgggaatgatcctgcctatctctggtacaacaaactacgcacagacatttcagggcagagtcatcattagcgcggacacatccacgagcacagcctacatggagctgaccagcctcacatctgaagacacggccgtgtatttctgtgcgagagtctttagagaatttagcacctcgacccttgacccctactactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.814:caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaagtccgtgagactctcctgtgtaggctctggcttcaggctcatggactatgctatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggactggattgggtggcagttatttcatatgatggagccaatgaatactacgcagagtccgtgaagggccgattcaccgtctccagagacaattcagacaacactctgtatctacaaatgaagagcctgagagctgaggacacggctgtgtatttctgtgcgagagcgggccgttcctctatgaatgaagaagttattatgtactttgacaactggggcctgggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.816:gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgtagcctccggattcacctttagtacctacgccatgacctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagtcattcgtgctagtggtgatagtgaaatctacgcagactccgtgaggggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacggtgtttctgcaaatggacagcctgagagtcgaggacacggccgtatatttctgtgcgaatataggccagcgtcggtattgtagtggtgatcactgctacggacactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No,817:caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccaacctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcggcttcaacacccatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtggctgtcaattatctcacttgatgggattaagacccactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacggtgtttctacaattgagtggcctgagacctgaagacacggctgtatattactgtgcgaaagatcatattggggggacgaacgcatattttgaatggacagtcccgtttgacggctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.818:caggtcaccttgagggagtctggtccagcggtggtgaagcccacagaaacgctcactctgacctgcgccttctctgggttctcactcaacgccggtagagtgggtgtgagttggatccgtcagcccccagggcaggccccggaatggcttgcacgcattgattgggatgatgataaagcgttccgcacatctctgaagaccagactcagcatctccaaggactcctccaaaaaccaggtggtccttacactgagcaacatggaccctgcggacacagccacatattactgtgcccggacacaggtcttcgcaagtggaggctactacttgtactaccttgaccactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.819:caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctagtggcgccatcagtggtgctgattactactggagttggatccgccagcccccagggaagggcctggagtgggttgggttcatctatgacagtgggagcacctactacaacccgtccctcaggagtcgagtgaccatatcaatagacacgtccaagaagcagttctccctgaagctgacctctgtgactgccgcagacacggccgtgtattactgtgccagagatctaggctacggtggtaactcttactcccactcctactactacggtttggacgtctggggccgagggaccacggtcaccgtctcgagt克隆No.824:caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcggaaattactactggggctggatccggcagcccccagggaagggacttgagtggattgggcatatctacttcggtggcaacaccaactacaacccttccctccagagtcgagtcaccatttcagtcgacacgtccaggaaccagttctccctgaagttgaactctgtgaccgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagggatagcagcaactggcccgcaggctatgaggactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.825:caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggtttctggttacacctttaccagtaatggtctcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggtttgagtggctgggatggatc3gcgctegt3gtggaaac3肌aagtatgccccga3attccagggaagagtcaccttg3ccac3gacatttcc3cg3gcacagcctacatggaactgaggagtctgagatctgacgatacggccgtatattactgtgcgaaagatgggggcacctacgtgccctattctgatgcctttgatttctggggccaggggacaatggtcaccgtctcgagt克隆No.827:caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcagggtttccggacacactttcactgcattatccaaacactggatgcgacagggtcctggaggagggcttgagtggatgggattttttgatcctgaagatggtgacacaggctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccgaggacacagccacaggcacagcctacatggagctgagcagcctgacatctgacgacacggccgtatattattgtgcaacagtagcggcagctggaaactttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.829:caggtcaccttgaaggagtctggtcctgcgctggtgaaagccacacagaccctgacactgacctgcaccttctctgggttttcactcagtaggaatagaatgagtgtgagctggatccgtcagcccccagggaaggccctggagtggcttgcacgcattgattgggatgatgataaattctacaacacatctctgcagaccaggctcaccatctccaaggacaectccaaaaaccaggtggtccttacaatgaccaacatggaccctgtggacacagccacctattactgcgcacggactgggatatatgatagtagtggttattacctctactactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.830:caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaaggtgcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccacttacggtgtcagctgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggttggatcagcgcttacaatggtaacacatactatctacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgcggggcctgaggtctgacgacacggccatgtattactgtgcgagagatcgtgttgggggcagctcgtccgaggttctatcgcgggccaaaaactacggtttggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt克隆No.831:caggttcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagttaaggtttcctgcaaggcttctgcaaacatcttcacttatgcaatgcattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgttggcaatggtcagacaaaatattcacagaggttccagggcagagtcaccattaccagggacacgtccgcgactacagcctacatggagctgagcaccctgagatctgaggacacggctgtgtattactgtgcgaggcgtgcgagccaatatggggaggtctatggcaactactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.835:caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaggcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttcaggttacacctttatcagctatggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggagcagcgtttacaatggtgacacaaactatgcacagaagttccacggcagagtcaacatgacgactgacacatcgacgaacacggcctacatggaactcaggggcctgagatctgacgacacggccgtgtatttctgtgcgagggatcgcaatgttgttctacttccagctgctccttttggaggtatggacgtctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt克隆No,838:caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagccggggacttccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtacgtttggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaaataagaaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaagtgaacagcctgagagtcgaggacacggctgtgtattactgtgcggcccaaactccatatttcaatgagagcagtgggttagtgccggactggggccagggcaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.841:caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttatcagttttggcatcagctgggtgcgacaggcccctggacaaggacttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacagactatgcacagaggctccaggacagagtcaccatgactagagacacagccacgagcacagcctacttggagctgaggagcctgaaatctgacgacacggccgtgtactattgcactagagacgagtcgatgcttcggggagttactgaaggattcggacccattgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.853:gaagtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagccggggcagtctctgaagatctcctgtaagacttctggatacatctttaccaactactggatcggctgggtgcgccagaggcccgggaaaggcctggagtggatgggggtC3tctttcctgctgactctg3tgccagatac3gcccgtcgttccaaggccaggtcaccatctc3gccgacaagtccatcggtactgcctacctgcagtggagtagcctgaaggcctcggacaccgccatatattactgtgcgagaccgaaatattactttgatagtagtgggcaattctccgagatgtactactttgacttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.855:caggttcagctggtgcagtctggacctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttatgtgttgaccaactatgccttcagctgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggctgggatggatcagcggctccaatggtaacacatactatgcagagaagttccagggccgagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagtctgagatctgacgacacggccgtttatttctgtgcgagagatcttctgcggtccacttactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt克隆No.856:caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacaccttttccaactacggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacgagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacatactatgcacagaacctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgaccacagcctacatggtactgaggagcctgagatctgacgacacggccatgtattactgtgcgagagatggaaatacagcaggggttgatatgtggtcgcgtgatggttttgatatctggggccaggggacaatggtcaccgtctcgagt克隆No.857:gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtac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cgtccagcctggaaagtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcagattcagtgactacggcatgcactgggtccggcaggctccaagcaaggggctggagtgggtggcagttatctggcatgacggaagtaatataaggtatgcagactccgtgaggggccgattttccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatttgcaaatgaacagcatgagagccgacgacacggctttttattattgtgcgagagtcccgttccagatttggagtggtctttattttgaccactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt在相同的克隆中，輕鏈的完整氨基酸序列(即，包含恒定和可變區(qū)的輕鏈)具有如下的氨基酸序列，其也作為SEQIDNOs:89-132列出克隆No.735:NRVTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLATEDFGVYYCQQRSNWPPALTFGGGTSPVTKSFNRGEC克隆No.736:SSPVTKSFNRGEC克隆No.744:ASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDSSLSTWTFGQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.793:VTKSFNRGEC克隆No.795:ASTGATGTPDRFSGSGSGTDFTLTISTLEPEDFAVYYCQQYGRTPYTFGQGNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.796:FGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWHQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.799:GTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.800:PVTKSFNRGEC克隆No.801:HQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.804:ASGRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYFGSPYTFGQGTSPVTKSFNRGEC克隆No.810:SPVTKSFNRGEC克隆No.811:THQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.812:SRRATGVPDRFSGSGSATDFTLTISRLEPEDLAVYYCQHYGNSLFTFGPGTKVDVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDSSPVTKSFNRGEC克隆No.814:SSPVTKSFNRGEC克隆No.816:THQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.817:TKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDSSPVTKSFNRGEC克隆No.818:TKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDSSPVTKSFNRGEC克隆No.819:KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNSPVTKSFNRGEC克隆No.824:PVTKSFNRGEC克隆No.825:VTHQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.827:KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNSPVTKSFNRGEC克隆No.829:SPVTKSFNRGEC克隆No.830:SPVTKSFNRGEC克隆No.831:SPVTKSFNRGEC克隆No.835:VDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ狐VDNAPVTKSFNRGEC克隆No.838:SPVTKSFNRGEC克隆No.841:VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.853:TEVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.855:ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQADTFPFTFGPGTSPVTKSFNRGEC克隆No.856:THQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.857:THQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.858:ATKLETGVPTRFIGSGSGTDFTVTITSLQPEDVATYYCQHFANLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDSSPVTKSFNRGEC克隆No.859:KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNSPVTKSFNRGEC克隆No.861:PVTKSFNRGEC克隆No.863:NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWLTFGGGTKVESGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.868:EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSIKNNLAWYQVKPGQAPRLLTSGASPVTKSFNRGEC克隆No.870:SPVTKSFNRGEC克隆No.871:SPVTKSFNRGEC克隆No.880:KLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNSPVTKSFNRGEC克隆No.881:TKVDITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDSSPVTKSFNRGEC克隆No.884:SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF皿GEC克隆No.886:SSPVTKSFNRGEC克隆No.888:DIVMTQSPLSLPVTPGAPASISCRSSQSLLRTNGYNYLDWYLQKPGQSPQLQGLSSPVTKSFNRGEC克隆No.894:SPVTKSFNRGEC在這些克隆中，編碼輕鏈的核酸片段具有如下的核酸序列，其也作為SEQIDNOs:133-176列出克隆No735:g犯attgtgttgac3C3gtctccagccaccctgtccttgtctccagg3g咖gEigccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttaacagccacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctataatacattcaatagggtcactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagccttgcgactgaagattttggcgtttattactgtcagcagcgtagcaactggcctcccgccctcactttcggcggagggaccaaagtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt克隆No736:gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggagacagagtcaccttcacttgccgggccagtcagaggattagcaaccatttaaattggtatcaacaaaagccagggaaagcccctaaactcctgatctttggtgcatccactcttcaaagtggggccccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaatgtacaacctgacgattttgcaacttactactgtcaacagagttacagaactcccccgatcaacttcggccaagggacacgcctggacattaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctg3cgctg3gc犯3gcagact3cg3g3犯c3caa3gtctecgcctgcg犯gtcaccc3tc3gggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt克隆No744:gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtatcagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatgatagctcactttctacgtggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt克隆No793:gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattaccggctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaaactcctgatctatgctacatccactttgcaaagtgaggtcccatcaaggtt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atctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt克隆No888:gatattgtg3tgacccagtctccactctccctgcccgtcacccctgg3gcgccggcctccatctcctgc3ggtctagtcagagcctcctgcgtactaatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatttgggttctattcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggctcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaatctctacaaacttcgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt克隆No894:gaaattgtaatgacacagtctccagccaccctgtctgtgtctccgggggaaagagccaccctctcctgcagggctagtcagagtgttggcaacaacttagcctggtaccagcagagacctggccaggctcccagactcctcatctatggtgcgtccaccagggccactggtatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaggattttgcagtttattactgtcagcagtatgataagtggcctgagacgttcggccaggggaccaaggtggacatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtc3C3犯g3gcttca3C3ggggagagtgt在所有上面討論的44個(gè)克隆中，編碼抗體包含相同的恒定IgG重鏈，其具有如下的氨基酸序列(SEQIDNO:178):SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK編碼該重鏈的基因組序列具有如下的核酸序列(SEQIDNO:177):agtgcctccacc鄉(xiāng)ggcccatc印tcttccccctggcaccctcctcc鄉(xiāng)叫cacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagc犯cttgggcaccc3gacct3catctgcaacgtgaatcac犯gcccagcaacacc犯ggt印3C犯g犯犯ttggtgagaggccagcacagggagggagggtgtctgctggaagccaggctcagcgctcctgcctggacgcatcccggctatgc3gtccc3gtccagggc3gcaaggc3ggccccgtctgcctcttcacccggaggcctctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggctttttccccaggctctgggcaggcacaggctaggtgcccctaacccaggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctcagacctgccaagagccatatccgggaggaccctgcccctgacct犯gccc3cccc3犯ggcc3a3ctctcc3ctccctc3gctcgg3C3ccttctctcctccc3g3ttcc3gtaactccc3atcttctctctgcagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtcc3cctccatctcttcctc犯c3cctg肌ctcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaa3ccca犯gacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagcc3cg肌gaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtac犯c犯c3cgtoccgtgtggtc犯cgtcctc3ccgtcctgc3cc3gg3ctggctg3atggc犯gg犯toc犯gtgc犯ggtctccaac犯agccctccc叫cccccatcg犯aEi犯ccatctcc犯agccaa犯gtggg3cccgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgaccgctgtaccaacctctgtccctoc犯ggcagccccgag33ccac犯gtgtocaccctgcccccatcccgggaggagatgacca犯肌cc犯gtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaag叫c叫g(shù)tggc叫c叫g(shù)g，cgtcttctcatgctcc辨atgcat鄉(xiāng)gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga在該序列中，外顯子用雙下劃線表示。此外，作為將^7zoI消化的PCR產(chǎn)物引入到Wol消化的表達(dá)載體內(nèi)的結(jié)果，產(chǎn)生起始編碼Ser的核苷酸agt(粗體下劃線)，該P(yáng)CR產(chǎn)物在IgG表達(dá)載體中編碼可變重鏈。根據(jù)在ELISA和/或FLISA中對(duì)各種抗原和肽的結(jié)合特異性、表位作圖、抗原多樣性和序列多樣性，對(duì)上面討論的Vh和VL編碼對(duì)進(jìn)行選擇。如果鑒定出錯(cuò)誤，則對(duì)所選的同源V-基因?qū)M(jìn)行克隆修復(fù)(實(shí)施例1，f部分)。各個(gè)表達(dá)構(gòu)建體與Flp重組酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入CHO-Flpln受體細(xì)胞系(Invitrogen)，隨后對(duì)整合子進(jìn)行抗生素篩選。如實(shí)施例1，g-l和g-2部分所述進(jìn)行轉(zhuǎn)染、選擇和適應(yīng)無血清培養(yǎng)。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的、適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)的單個(gè)表達(dá)細(xì)胞系冷凍保存在多個(gè)安瓿中，以生成產(chǎn)單個(gè)抗體的細(xì)胞系的細(xì)胞庫。實(shí)施例3對(duì)單抗體克隆以及純化抗體的組合進(jìn)行體外中和試驗(yàn)。下文描述的所有抗體混合物由本發(fā)明的大量單個(gè)抗RSV抗體構(gòu)成，其用等量的不同抗體組合成混合物。卓,在沐^/試最初，在針對(duì)RSV亞型A和B病毒抹的補(bǔ)體的存在下在PRNT中確定每個(gè)抗體的中和活性，如上文在實(shí)施例1，j-2部分中所述。表7顯示了大量純化抗體的ECso值。有趣的是，盡管大多數(shù)抗F抗體單獨(dú)顯示病毒中和活性，但是對(duì)于大多數(shù)抗RSV蛋白G抗體不能確定出EC5o值，表明這些抗體不能單獨(dú)中和病毒?？瞻讌^(qū)表示尚未進(jìn)行分析。ND表示在PRNT中由于中和活性非常低或者缺乏而不能確定EC5o值。表7:針對(duì)RSV亞型A和B的純化抗RSV蛋白F和蛋白G抗體的ECso值<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>抗RSV蛋白F抗體的混合物中和A和B亞型RSV病毒4朱的能力與用Palivizumab(也是抗F抗體)獲得的中和效果進(jìn)行比較。用微量中和測(cè)定或PRNT估計(jì)中和能力，如實(shí)施例1，部分j中所述。在最初的實(shí)驗(yàn)中，用微量中和測(cè)定將分別含有5和11種不同抗F抗體的兩種抗體混合物(即抗F(I)和抗F(II))與Palivizumab進(jìn)行比較?？笷(I)由從克隆810,818，819,825和827獲得的抗體組成?？贵w810和819與抗原位點(diǎn)A/II結(jié)合，抗體818與位點(diǎn)B/I或F1結(jié)合，抗體825與和位點(diǎn)A和C重疊的復(fù)雜表位結(jié)合，抗體827與另一個(gè)復(fù)雜表位結(jié)合(參見表5)?？笷(II)由從克隆735,800，810，818，819,825，827，863，880，884和894獲得的抗體組成?？笷(II)含有一些已定義抗原位點(diǎn)的多結(jié)合子(multiplebinder):抗體810、819和863結(jié)合A/II，抗體800和818結(jié)合Fl(或B/I)，抗體827和825結(jié)合上述的復(fù)雜表位，抗體735和894屬于未知簇(UC)1,抗體880屬于UCI1，884結(jié)合于另一種目前未知的表位(參見表5)。如表5所示，兩種組合物抗F(I)和抗F(II)在中和兩種亞型的RSV病毒4朱方面均比Palivizumab更有效力。表5還顯示，5種抗體的組合(抗F(I))看起來比11種抗體的組合(抗F(II))更有效力。抗F(I)混合物含有一些具有迄今為止已經(jīng)限定的不同表位特異性的最有效力的單獨(dú)中和抗體?？笷(II)混合物含有相同的5種高效抗體，但是它還含有與一些已限定表位結(jié)合的額外的結(jié)合子，并且所包含的抗體自身也顯示廣泛的中和活性。因此有可能在抗F(II)組合中高效抗體的活性由于竟?fàn)幗Y(jié)合F蛋白上的中和表位而被稀釋。然而，當(dāng)在體內(nèi)考慮時(shí)，因?yàn)槌酥泻托?yīng)之外還可能存在其它與每個(gè)單獨(dú)抗體相關(guān)的效應(yīng)，例如吞噬作用增加、抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)增加、抗炎效應(yīng)、補(bǔ)體激活和產(chǎn)生逃逸突變體的可能性降低，這種結(jié)果不能被認(rèn)為是在體內(nèi)使用時(shí)5種抗體的混合物比11種抗體的混合物更好的指示。體外測(cè)定和克隆組合均已被改進(jìn)(refined)，因?yàn)橐呀?jīng)對(duì)初始試驗(yàn)和在補(bǔ)體存在下具有高度效力的F特異抗體克隆的大量組合進(jìn)行了鑒定。表8列出了額外抗F抗體組合物的中和效力，表示為ECso值(使斑點(diǎn)數(shù)目減少50%所需的有效濃度)。不考慮組合物中克隆的確切數(shù)目，在中和RSV病毒林A亞型方面，大部分已測(cè)試的F特異抗體組合比Palivizumab更有效力。抗G我謬;遂合參用PRNT測(cè)試抗G抗體混合物中和A亞型RSV病毒抹的能力，如實(shí)施例1,j-2部分所述。表8列舉了已測(cè)試的抗G抗體組合物的EC5o值。大多數(shù)兩個(gè)抗G抗體的組合物與單個(gè)抗G抗體相比，沒有顯示出顯著增加的中和病毒的能力。不考慮濃度，一些兩個(gè)或三個(gè)抗G抗體的組合從未達(dá)到100%的病毒中和。然而，當(dāng)向該組合物添加額外的抗G抗體時(shí)，效力增力o，這可能表明抗G抗體之間的協(xié)同中和作用。圖7顯示了在組合多個(gè)G特異性克隆時(shí)效力提高的實(shí)例。拔F和拔G^體的濕合^#將抗RSV蛋白F和蛋白G的抗體混合物中和B亞型RSV病毒抹的能力與使用Palivizumab獲得的中和效果進(jìn)行比較。用微量中和融合抑制(如實(shí)施例1，j-4部分所述)或者斑點(diǎn)還原中和測(cè)定(實(shí)施例1,j-2部分)對(duì)中和能力進(jìn)行評(píng)估。最初，在微量中和融合抑制測(cè)定中對(duì)兩種抗體混合物抗F(I)G和抗F(II)G的中和活性進(jìn)行測(cè)量。這些混合物的每一個(gè)均含有上述組合物抗F(I)和抗F(II)的抗F抗體，以及從克隆793,796,838,841，856和888獲得的抗G抗體，其中抗體793、796、838與G蛋白的保守區(qū)結(jié)合，841、856與RSV亞型A的GCRR結(jié)合，888與兩種亞型的GCRR結(jié)合(參見表5)。如圖6所示，在中和RSVBl病毒林方面，兩種組合物抗F(I)G和抗F(II)G均比Palivizumab更有效力。而且，兩種混合物的中和活性基本上相等。因此，看起來當(dāng)抗F抗體與大量蛋白G特異性克隆組合時(shí)，先前觀察到的兩種抗F抗體混合物的效力差異被消除。這可以表明，將可識(shí)別廣泛的RSV上的抗原和表位的抗體進(jìn)行組合時(shí)，中和活性會(huì)總體上增力口(generalincrease)。從那之后，在存在或不存在補(bǔ)體的條件下，將抗F和抗G抗體兩者的大量不同組合在PRNT中進(jìn)行測(cè)試。表8中給出了在活性補(bǔ)體存在下由該測(cè)定獲得的ECs。值。所有包含抗F和抗G抗體兩者的測(cè)試組合物均確實(shí)中和RSVA亞型，而且其中大部分比Palivizumab更有效力。結(jié)果還顯示，用本發(fā)明的抗體克隆技術(shù)可以從人供體重復(fù)獲得具有天然高親和性的抗體。表8:針對(duì)RSV亞型A和B的抗RSV抗體組合的EQo值?？瞻讌^(qū)表PRNT中不能確定EC50值。<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>實(shí)施例4在被4染的小葳的單裁的減^，本發(fā)明純化抗體的組合針對(duì)RSV感染的體內(nèi)保護(hù)能力在BALB/c小鼠模型中得到證明(Tayloretal.1984.Immunology52，137-142;Mejias,etal.2005.Antimicrob.AgentsChemother.49:4700-4707)，如實(shí)施例1,k-1部分所述。在表9中，提供了用由相同量的本發(fā)明不同抗體克隆(如表8所述)組成的三種不同的抗RSVrpAb進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，與來自相同實(shí)驗(yàn)中未感染的對(duì)照動(dòng)物和用安慰劑(PBS)處理的動(dòng)物的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。每個(gè)處理組含有5只小鼠，樣品在感染后5天獲得，其接近于本模型中病毒復(fù)制的峰。如表9所示，在預(yù)防施用時(shí)，rpAb組合可將病毒負(fù)載有效降低至少1個(gè)數(shù)量級(jí)?？截悢?shù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差給出。其中兩個(gè)處理組的拷貝數(shù)處于或者低于本測(cè)定方法的檢測(cè)限，也就是3.81ogl0RNA拷貝/ml。表9:預(yù)防施用和RSV刺激后小鼠肺中的病毒負(fù)載<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>被RSV染的小鼠的肺樣品中的細(xì)胞因子和趨化因子水平通過商業(yè)的多重免疫測(cè)定對(duì)來自初步小鼠預(yù)防研究的肺樣品進(jìn)行分和趨化因子的水平，如實(shí)施例l,k-l部分所述。還對(duì)來自未感染和未處理的動(dòng)物的樣品進(jìn)行分析，以獲得BALB/c小鼠的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。所有樣品在感染后5天獲得。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差提供。分析顯示，在安慰劑處理的動(dòng)物的肺中，已被指示為人和小鼠兩者體內(nèi)RSV感染和隨后炎癥響應(yīng)之重要標(biāo)記的大量細(xì)胞因子和趨化因子的水平增加，所述細(xì)胞因子和趨化因子包括干擾素(IFN)-y,白介素(IL)-ip,IL-4，IL-6，IL-8(KC/GROot)，IL-10,巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-loc，正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的激活后受到調(diào)節(jié)的因子(RANTES，CCL5)和腫瘤壞死因子(TNF)-a，同。用其它抗RSVrpAb組合也可獲得相似的結(jié)果。應(yīng)當(dāng)注意，小鼠不具有明確的(clear-cut)IL-8同源物，但是它們具有人GROa(與IL-8功能相似)的功能同源物，稱作KC。抗體預(yù)防的炎癥響應(yīng)動(dòng)力學(xué)和劑量-響應(yīng)效果仍待研究。表10:RSV感染的小鼠肺組織中細(xì)胞因子和趨化因子的水平<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>權(quán)利要求1.能夠中和RSV亞型A和B的抗RSV重組多克隆抗體，其中所述多克隆抗體包括不同的抗體成員，它們聯(lián)合起來特異性結(jié)合至少一種RSV包膜蛋白上的至少三個(gè)不同的表位。2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗RSV重組多克隆抗體，其中所述多克隆抗體包括不同的抗體成員，它們一起提供針對(duì)至少兩種RSV包膜蛋白的特異反應(yīng)性。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗RSV重組多克隆抗體，其中該RSV包膜蛋白從RSVG蛋白、RSVF蛋白和RSVSH蛋白中選擇。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的抗RSV重組多克隆抗體，其中該抗包膜蛋白反應(yīng)性是抗G和抗F反應(yīng)性，并且所述反應(yīng)性由至少兩個(gè)不同的抗G抗體和至少一個(gè)不同的抗F抗體提供。5.根據(jù)權(quán)利要求4的抗RSV重組多克隆抗體，其中第一抗G抗體能夠特異性結(jié)合G蛋白上的保守表位，第二抗G抗體能夠特異性結(jié)合G蛋白的富半胱氨酸區(qū)域(GCRR)，并且所述抗F反應(yīng)性針對(duì)于抗原位點(diǎn)I、II、IV、V、VI、C或F1中的至少一個(gè)。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的抗RSV重組多克隆抗體，其中抗G反應(yīng)性的至少一部分針對(duì)于CX3C基序。7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的抗RSV重組多克隆抗體，其中抗G反應(yīng)性另外針對(duì)于至少一個(gè)林特異性表位。8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)的抗RSV重組多克隆抗體，其中抗F反應(yīng)性至少針對(duì)于抗原位點(diǎn)II和抗原位點(diǎn)IV。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的抗RSV重組多克隆抗體，其中抗包膜蛋白反應(yīng)性針對(duì)于SH蛋白，或者在權(quán)利要求4-8中，其另外針對(duì)于SH蛋白。10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗RSV重組多克隆抗體，其中不同抗體成員的組合物反映(mirror)供體內(nèi)針對(duì)RSV包膜抗原的體液免疫應(yīng)答的多樣性、親和性和特異性。11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗RSV重組多克隆抗體，其中不同的抗體由從已經(jīng)產(chǎn)生針對(duì)RSV的體液免疫應(yīng)答的一個(gè)或多個(gè)人供體獲得的核酸序列編碼，并且該多克隆抗體是完全的人抗體。12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的抗RSV重組多克隆抗體，其中不同的抗體成員由最初存在于供體內(nèi)的Vh和Vi^對(duì)構(gòu)成。13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗RSV重組多克隆抗體，其中每一個(gè)不同的成員包括從在表5中給出的VH和VL配對(duì)組中選擇的CDRl、CDR2和CDR3區(qū)。14.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的抗RSV重組多克隆抗體作為活性成分和藥物可接受的賦形劑。15.預(yù)防、治療或減輕哺乳動(dòng)物體內(nèi)與RSV感染相關(guān)的一種或多種癥狀的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的抗RSV重組多克隆抗體或者根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中有效量是每kg體重至多100mg抗體，例如每kg體重至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20、至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2、至多1、至多0.9、至多0.8、至多0.7、至多0.6、至多0.5、至多0.4、至多0.3、至多0.2和至多O.lmg抗體。17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中有效量是每kg體重至少O.Ol.mg抗體，例如每kg體重至少0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg抗體。18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中有效量是每kg體重0.1-20mg抗體。19.根據(jù)權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的方法，其中該抗體每年至少施用1次，例如每年l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和次。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中在引起RSV感染的危險(xiǎn)性增加的年份內(nèi)以規(guī)則的時(shí)間間隔施用抗體。21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中規(guī)則的時(shí)間間隔是每周、每?jī)芍?、每月或每?jī)稍隆?2.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的抗RSV重組多克隆抗體或根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物在制備用于治療、減輕或預(yù)防哺乳動(dòng)物體內(nèi)與RSV感染相關(guān)的一種或多種癥狀的組合物方面的用途。23.用于產(chǎn)生Vh和VL編碼對(duì)的庫(repertoire)的方法，其中其成員反映了負(fù)責(zé)由RSV感染導(dǎo)致的體液免疫應(yīng)答的基因?qū)?，該方法包括a.提供來自RSV感染的供體或來自由RSV感染恢復(fù)的供體的含淋巴細(xì)胞的細(xì)胞組分；b.任選地從所述細(xì)胞組分富集B細(xì)胞或漿細(xì)胞；c.獲得分離的單細(xì)胞的群體，包括將來自所述細(xì)胞組分的細(xì)胞單獨(dú)(individually)分配到多個(gè)容器內(nèi)；和d.在多倍重疊延伸RT-PCR(multiplexoverlapextensionRT-PCR)步驟中，使用從所述分離的單細(xì)胞得到的模板擴(kuò)增和實(shí)現(xiàn)Vh和Vi編碼對(duì)的聯(lián)結(jié)(linkage);e.任選地對(duì)已聯(lián)結(jié)的VH和Vl編碼對(duì)進(jìn)行嵌套PCR。24.多克隆細(xì)胞系，其能夠表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的重組多克隆抗RSV抗體。25.多克隆細(xì)胞系，其中每個(gè)單獨(dú)細(xì)胞能夠表達(dá)單一的VH和VL編碼對(duì)，并且該多克隆細(xì)胞系的整體能夠表達(dá)VH和VL編碼對(duì)的集合，其中每個(gè)VH和VL編碼對(duì)編碼抗RSV抗體。26.根據(jù)權(quán)利要求25的多克隆細(xì)胞系，其中所述Vh和VJ扁碼對(duì)的集合根據(jù)權(quán)利要求23的方法產(chǎn)生。27.從在本文表5中所列的抗體分子中選擇的分離的人抗RSV抗體分子，或者所述抗體分子的特異性結(jié)合片段或合成或半合成抗體類似物，所述結(jié)合片段或類似物至少包括所述分離的抗體分子的補(bǔ)體決定區(qū)(CDRs)。28.根據(jù)權(quán)利要求27的抗體分子、片段或類似物，其得自于在表8中列出的抗體，或者其包括在SEQIDNOsl-44其中之一包含的重鏈CDR氨基酸序列和伴隨的輕鏈CDR氨基酸序列，該伴隨輕鏈CDR氨基酸序列的SEQIDNO比選自SEQIDNOs.144中的氨基酸序列高88。29.分離的抗體分子、抗體片段或者合成或半合成抗體類似物，其包含與得自于人抗體的Fab中的CDRs相同的CDRs，當(dāng)在Biacore3000上進(jìn)行表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振分析測(cè)量時(shí)，其中使用以非常低的密度固定在傳感器表面上的重組RSVG蛋白以避免質(zhì)量輸送限制，所述Fab對(duì)RSVG蛋白的解離常數(shù)Ko至多為500nM。30.根據(jù)權(quán)利要求29的分離的抗體分子、抗體片段或者合成或半合成抗體，其中Ko至多為400nM，例如至多300nM，至多200nM，至多100nM,至多l(xiāng)nM，至多900pM，至多800pM，至多700pM,至多600pM，至多500pM,至多400pM,至多300pM,至多200pM，至多100pM，至多90pM，和至多80pM。31.分離的抗體分子、抗體片段或者合成或半合成抗體，其包含與得自于人抗體的Fab中的抗原結(jié)合位點(diǎn)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)在Biacore3000上進(jìn)行表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振分析測(cè)量時(shí)，其中使用以非常低的密度固定在傳感器表面上的重組RSVF蛋白以避免質(zhì)量輸送限制，所述Fab對(duì)RSVF蛋白的解離常數(shù)Ko至多為500nM。32.根據(jù)權(quán)利要求31的分離抗體分子、抗體片段或者合成或半合成抗體，其中K。至多為400nM,例如至多300nM,至多200nM，至多100nM，至多InM,至多900pM，至多800pM，至多700pM,至多600pM，至多500pM，至多400pM,至多300pM，至多200pM，至多100pM，至多90pM，至多80pM,至多70pM,至多60pM，至多50pM,至多40pM，至多30pM，至多25pM，至多20pM，至多15pM，至多10pM,至多9pM，至多8pM,至多7pM，至多6pM,和至多5pM。33.根據(jù)權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)的抗體分子或特異性結(jié)合片段或合成或半合成抗體類似物，其包括在克隆No.810,818，819,824,825,827,858或894中產(chǎn)生的人抗體的CDRs。34.—種抗體組合物，其包括與藥物可接受的載體、賦形劑、媒介物或稀釋劑混合的根據(jù)權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)的抗體分子或特異性結(jié)合片段或合成或半合成抗體類似物。35.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，其包括2種不同的根據(jù)權(quán)利要求27-3336.根據(jù)權(quán)利要求3^4的組合物，其包括i少3-不同的根據(jù)權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)的抗體分子和/或抗體片段和/或合成或半合成抗體類似物，特異性結(jié)合片段或合成或半合成抗體類似物，例如該組合物包括至少4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30種不同的抗體分子和/或片段和/或合成或半合成抗體類似物。37.根據(jù)權(quán)利要求34-36中任一項(xiàng)的組合物，其包括至少一種結(jié)合RSVF蛋白的抗體分子、片段或類似物，并且其包括至少一種結(jié)合RSVG蛋白的抗體分子、片段或類似物。38.分離的核酸片段，其編碼在權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)中定義的至少一個(gè)CDR的氨基酸序列。39.分離的核酸片段，其至少編碼由表5中列出的其中一個(gè)克隆產(chǎn)生的抗體的CDRs。40.分離的核酸片段，其編碼在SEQIDNOsl-44任一中列出的童鏈氨基酸序列的CDR序列。41.分離的核酸片段，其編碼在SEQIDNOs89-132任一中列出的輕鏈氨基酸序列的CDR序列。42.分離的核酸片段，其編碼在SEQIDNOsl-44任一中列出的重鏈氨基酸序列的CDR序列和伴隨輕鏈CDR氨基酸序列，其中伴隨輕鏈CDR氨基酸序列的SEQIDNO比選自SEQIDNOs.1-44的氨基酸序列高88。43.根據(jù)權(quán)利要求38-42中任一項(xiàng)的核酸片段，其包括包含在SEQIDNOs:45-88和/或133-176中的編碼序列。44.一種載體，其包括根據(jù)權(quán)利要求38-43中任一項(xiàng)的核酸片段。45.根據(jù)權(quán)利要求44的載體，其能夠自主復(fù)制。46.根據(jù)權(quán)利要求44或45的載體，其選自下組質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、微型染色體和病毒。47.根據(jù)權(quán)利要求44-46中任一項(xiàng)的載體，其包括-沿5'—3'方向并且以可操作的方式連接的用于驅(qū)動(dòng)根據(jù)權(quán)利要求38-43中任一項(xiàng)的第一核酸片段表達(dá)的至少一個(gè)啟動(dòng)子，所述第一核酸片段編碼至少一個(gè)輕鏈CDR及必需的框架區(qū)，任選的編碼前導(dǎo)肽的核酸序列，所述第一核酸片段，任選的編碼恒定區(qū)的核酸序列，和任選的編碼第一終止子的核酸序列，和/或-沿5'~>3'方向并且以可操作的方式連接的用于驅(qū)動(dòng)根據(jù)權(quán)利要求38-43中任一項(xiàng)的第二核酸片段表達(dá)的至少一個(gè)啟動(dòng)子，所述第二核酸片段編碼至少一個(gè)重鏈CDR及必需的框架區(qū)，任選的編碼前導(dǎo)肽的核酸序列，所述第二核酸片段，任選的編碼恒定區(qū)的核酸序列，和任選的編碼第二終止子的核酸序列。48.根據(jù)權(quán)利要求44-47中任一項(xiàng)的載體，其在引入到宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)整合到宿主細(xì)胞基因組中。49.攜帶權(quán)利要求44-48中任一項(xiàng)的載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。50.—種穩(wěn)定的細(xì)胞系，其攜帶根據(jù)權(quán)利要求44-48中任一項(xiàng)的載體，而且其表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求38-43中任一項(xiàng)的核酸片段，并且其任選地分泌或在其表面攜帶其重組表達(dá)產(chǎn)物。全文摘要本文公開了靶向呼吸道合胞病毒(RSV)的新型多克隆抗體，以及可與RSV反應(yīng)的新型高親和性抗體分子。該多克隆抗體包括可同時(shí)與RSV蛋白F和RSV蛋白G反應(yīng)的抗體分子，并且優(yōu)選地，該多克隆抗體靶向這些蛋白質(zhì)上的多個(gè)表位。本發(fā)明的單抗體分子顯示具有可提供低至皮摩爾范圍的解離常數(shù)的親和性。本文還公開了產(chǎn)生本發(fā)明抗體的方法，以及它們?cè)谥委烺SV感染方面應(yīng)用的方法。文檔編號(hào)A61K39/42GK101395182SQ200780007778公開日2009年3月25日申請(qǐng)日期2007年3月6日優(yōu)先權(quán)日2006年3月6日發(fā)明者亨麗埃特·S·尼爾森,克勞斯·凱福德,拉斯·S·尼爾森,約翰·蘭托,露西拉·斯泰納申請(qǐng)人:西福根有限公司