專利名稱：：無需冷藏儲(chǔ)存流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及防止流感病毒感染的疫苗，具體涉及無需冷藏即保留功效的疫苗。
背景技術(shù)：
：目前可獲得各種形式的流感病毒疫苗(例如，參見參考文獻(xiàn)1的第17和18章)。疫苗通?；诨畈《净驕缁畈《?。滅活疫苗可能基于完整病毒顆粒，'裂解'病毒顆粒，或者基于純化的表面抗原。典型流感疫苗要求保存期為52周。為滿足這一要求，目前流感疫苗的共有特征是，直到給藥之前它們是保存在冷藏條件下的。這些條件能維持包括血凝素(HA)在內(nèi)的保護(hù)性抗原的穩(wěn)定性。參考文獻(xiàn)2包括各種疫苗制品中HA降解的分析，并報(bào)道稱，如果在5"C保存則HA含量可維持在允許限度內(nèi)達(dá)78周，但儲(chǔ)存溫度升至25"C(即室溫)會(huì)時(shí)降解速率提高至少6倍(觀察到的最壞情況是升至24倍)。盡管當(dāng)在5'C儲(chǔ)存時(shí)一種待測疫苗的預(yù)期保存期為104周，而當(dāng)在25。C儲(chǔ)存時(shí)降至16周，但預(yù)計(jì)這種疫苗在25'C放置5.3周以上將是不穩(wěn)定的。由于這種溫度敏感性，目前的流感疫苗制造、包裝和銷售系統(tǒng)要求維持冷鏈。為避免這種對(duì)冷鏈的需求，已經(jīng)提出了許多替代免疫策略。例如，參考文獻(xiàn)3和4報(bào)道了干粉狀流感疫苗制劑。還提出過用DNA疫苗代替基于蛋白質(zhì)的疫苗。本發(fā)明的目的是提供進(jìn)一步改進(jìn)的流感疫苗，以及它們的制造方法，該方法避免了對(duì)于維持冷鏈的需求，尤其避免了銷售過程中和/或達(dá)到最終健康護(hù)理提供者之前對(duì)于冷鏈的需求。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明，流感疫苗在包裝和給藥之間無需冷藏。盡管現(xiàn)有技術(shù)稱，即便在室溫儲(chǔ)存至少6個(gè)月，流感疫苗的HA含量仍可維持在允許限度內(nèi)。本發(fā)明還能夠免除病毒生長之后原料抗原制造期間(例如，抗原純化期間)的冷藏條件，但是，為了無需改變現(xiàn)有制造方法，這些步驟仍舊可在冷藏條件下進(jìn)行，而僅將原料制成之后的步驟(例如，將不同毒株的抗原混合、填裝劑量、儲(chǔ)存、銷售)在沒有冷藏的條件下進(jìn)行。本發(fā)明的一個(gè)重要益處是允許銷售商和/或醫(yī)師等在非冷藏條件下儲(chǔ)存包裝的疫苗。此外，本發(fā)明能提高患者的舒適度，因?yàn)橐呙缡窃诮咏w溫的溫度下給予的。因此，本發(fā)明提供了一種銷售多份包裝的水性流感疫苗的方法，包括在非冷藏條件下將疫苗從第一地點(diǎn)運(yùn)輸?shù)降诙攸c(diǎn)的步驟。所述第一和第二地點(diǎn)優(yōu)選相隔至少l公里。本發(fā)明還提供了一種銷售原料水性流感疫苗的方法，包括在非冷藏條件下將疫苗從第一地點(diǎn)移動(dòng)到第二地點(diǎn)的步驟。所述第一和第二地點(diǎn)優(yōu)選相隔至少1公里。所述原料可以是單價(jià)或多價(jià)原料。該方法可包括從原料中提取單位劑量疫苗并將該單位劑量置于容器內(nèi)的進(jìn)一步的步驟。因此，本發(fā)明提供了一種銷售多份包裝的水性流感疫苗的方法，包括將疫苗從第一地點(diǎn)運(yùn)輸?shù)降诙攸c(diǎn)的步驟，且其中所述疫苗在非冷藏條件下在所述第二地點(diǎn)儲(chǔ)存至少h小時(shí)。h的值選自12、18、24、36、48、60、72、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、5000或更大。第二地點(diǎn)優(yōu)選是給予疫苗的地點(diǎn)，如診所、手術(shù)室等。本發(fā)明還提供了一種銷售流感疫苗的方法，其中，所述疫苗在非冷藏條件下從第一地點(diǎn)移動(dòng)到第二地點(diǎn)，其中所述第二地點(diǎn)是可以(優(yōu)選就是)給患者接種疫苗的地點(diǎn)。所述第二地點(diǎn)可以是，例如，診所、健康護(hù)理中心、大賣場、患者家中、患者工作場所，等等。本發(fā)明還提供了一種儲(chǔ)存水性流感疫苗的方法，包括將疫苗在l(TC以上儲(chǔ)存超過10周的步驟。所述儲(chǔ)存的疫苗可以是原料疫苗(單價(jià)或多價(jià))或包裝的疫苗。當(dāng)所述疫苗是原料疫苗時(shí)，該方法可包括從原料中提取單位劑量疫苗并將該單位劑量置于容器內(nèi)的進(jìn)一步的步驟。當(dāng)所述原料是單價(jià)原料時(shí)，該方法可包括將單價(jià)原料(在任何相關(guān)稀釋處理之前、期間或之后)與單獨(dú)的單價(jià)原料混合的進(jìn)一步的步驟。當(dāng)所述疫苗是包裝的疫苗時(shí)，它優(yōu)選不是(i)包含毒株A/Panama/2007/99RESVIR-17再造株(reass.)和A/NewCaledonia/20/99IVR-116再造株和B/Yamanashi/166/98的三價(jià)疫苗；(ii)包含毒株A/Panama/2007/99RESVIR-17再造株和A/NewCaledonia/20/99IVR-116再造株和B/Guangdong/120/00的三價(jià)疫苗；或(iii)包含毒株A/Panama/2007/99RESVIR-17再造株和A/NewCaledonia/20/99IVR-116再造株和B/Shangdong/7/97的三價(jià)疫苗。本發(fā)明還提供了一種從疫苗原料制備包裝的水性疫苗的方法，包括在非冷藏條件下從原料中取出單位劑量的疫苗并置于容器內(nèi)的步驟。本發(fā)明還提供了一種稀釋濃縮的流感抗原原料的方法，包括在非冷藏條件下用水性介質(zhì)稀釋濃縮原料的步驟。該方法得到了具有所需最終濃度的抗原制品。所述原料可包含多種流感病毒的抗原。作為替代，它也可以是含有一種流感病毒株的抗原的單價(jià)原料，此時(shí)，該方法可包括將稀釋的抗原與一種或多種其他流感病毒株的抗原混合的進(jìn)一步的步驟，從而得到多價(jià)組合物。本發(fā)明還提供了一種制備多價(jià)流感疫苗的方法，包括在非冷藏條件下將包含第一流感病毒株抗原的水性制品與包含第二流感病毒株抗原的水性制品混合的步驟。該方法可用于制備原料疫苗，或者可用于制備包裝的疫苗。優(yōu)選地，該方法用于通過混合三種不同流感病毒株的抗原來制備三價(jià)流感疫苗。當(dāng)該方法被用于制備原料疫苗時(shí)，該方法可包括從原料中提取單位劑量疫苗并將該單位劑量置于容器內(nèi)的進(jìn)一步的步驟。本發(fā)明還提供了一種將包含流感病毒的組合物滅活的方法，其中，該方法包括在非冷藏條件下將所述組合物與滅活劑(例如甲醛，詳見下文)混合的步驟。本發(fā)明還提供了一種制備含佐劑的流感病毒疫苗的方法，包括在非冷藏條件下將流感病毒抗原與佐劑混合的步驟。該方法可用于提供原料疫苗，此時(shí)，該方法可包括從原料中提取單位劑量的含佐劑的疫苗并將該單位劑量置于容器內(nèi)的進(jìn)一步的步驟。與佐劑混合的流感病毒抗原優(yōu)選是多價(jià)的。本發(fā)明還提供了通過這些方法可獲得的或者獲得的疫苗。本發(fā)明還提供了在非冷藏條件下已儲(chǔ)存至少h小時(shí)的水性流感病毒疫苗，其中(a)h選自12、18、24、36、48、60、72、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、5000或更大;和(b)該疫苗不是(i)包含毒株A/Panama/2007/99RESVIR-17再造株和A/NewCaledonia/20/99IVR-116再造株和B/Yamanashi/166/98的三價(jià)疫苗；(ii)包含毒株A/Panama/2007/99RESVIR-17再造株和A/NewCaledonia/20/99IVR-116再造株和B/Guangdong/120/00的三價(jià)疫苗；或(iii)包含毒株A/Panama/2007/99RESVIR-17再造株和A/NewCaledonia/20/99IVR-116再造株和B/Shangdong/7/97的三價(jià)疫苗。本發(fā)明還提供了在非冷藏條件下已儲(chǔ)存至少h小時(shí)的水性流感病毒疫苗，其中(a)h選自12、18、24、36、48、60、72、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、5000或更大;和(b)該疫苗是從生長在細(xì)胞培養(yǎng)物中的流感病毒制備的。因此，不同于從雞蛋制備的疫苗，這種疫苗不含雞DNA和雞蛋蛋白質(zhì)(如卵清蛋白和卵類黏蛋白)，因此降低了變應(yīng)原性。'本發(fā)明還提供了一種藥盒，其中裝有(a)水性流感疫苗，和(b)標(biāo)明該疫苗可以(i)在非冷藏條件下儲(chǔ)存和/或(ii)在室溫儲(chǔ)存的書面材料。本發(fā)明還提供了一種含有至少一種流感病毒株的血凝素的水性疫苗，其中，當(dāng)所述疫苗在25'C儲(chǔ)存時(shí)，血凝素的降解速率低于33%/年/毒株。例如，當(dāng)抗原濃度為30pg/ml/毒株時(shí)，降解速率低于10pg/ml/年/毒株。本發(fā)明還提供了一種含有至少一種流感病毒株的神經(jīng)氨酸酶的水性疫苗，其中，當(dāng)所述疫苗在25tM諸存時(shí)，神經(jīng)氨酸酶的降解速率低于33%/年/毒株。本發(fā)明還提供了一種含有至少一種流感病毒株的血凝素和神經(jīng)氨酸酶的水性疫苗，其中，當(dāng)所述疫苗在25X:儲(chǔ)存時(shí)，血凝素和神經(jīng)氨酸酶的降解速率都低于33%/年/毒株。本發(fā)明還提供了流感病毒抗原在制造由執(zhí)業(yè)醫(yī)師給予患者的藥物中的應(yīng)用，其中，所述藥物在藥物制造和被執(zhí)業(yè)醫(yī)師收到之間無需冷藏。本發(fā)明還提供了流感病毒抗原在制造由執(zhí)業(yè)醫(yī)師給予患者的藥物中的應(yīng)用，其中，所述藥物在被執(zhí)業(yè)醫(yī)師收到和給予患者之間無需冷藏。本發(fā)明還提供了一種將流感病毒疫苗給予患者的方法，其中，在給藥前24小時(shí)內(nèi)(例如，注射前)，該疫苗已在非冷藏條件下儲(chǔ)存至少12小時(shí)(優(yōu)選至少18小時(shí)，更優(yōu)選至少23小時(shí)，例如，在之前的所有24小時(shí))。本發(fā)明還提供了一種將流感病毒疫苗給予患者的方法，其中，該疫苗在非冷藏條件下儲(chǔ)存至少h小時(shí)后再給予患者，其中，h選自12、18、24、36、48、60、72、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、5000或更大。用于本發(fā)明方法、應(yīng)用和疫苗的抗原優(yōu)選是從生長在細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒而不是從生長在雞蛋中的病毒制備的，這是由于發(fā)現(xiàn)這些抗原特別穩(wěn)定。不希望局限于理論，發(fā)明人目前認(rèn)為，相對(duì)于雞蛋培養(yǎng)的抗原穩(wěn)定性提高可能有兩個(gè)原因(a)殘留的雞蛋衍生組分(例如酶類，如蛋白酶和/或糖苷酶)可能會(huì)造成現(xiàn)有疫苗的HA降解；因此避免將雞蛋作為病毒生長基質(zhì)能提供具有更佳熱穩(wěn)定性的疫苗；和/或(b)在細(xì)胞培養(yǎng)物，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得的流感病毒糖蛋白的糖型較之在雞蛋中獲得的糖型更加穩(wěn)定。本發(fā)明的疫苗可包含去污劑，如聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑(稱為'吐溫，)，辛苯聚醇(如辛苯聚醇-9(TritonX-100)或叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六垸基三甲銨('CTAB，)，去氧膽酸鈉，尤其是對(duì)于裂解或表面抗原疫苗而言。吐溫80的含量可相對(duì)于HA過量(即大于lpg/嗎HA)，如5-25pg/^igHA，例如10-15pg/pg。CTAB的含量為0.5-2.5pg/ngHA，例如1.0-1.5^g4ig。吐溫80和CTAB也可同時(shí)存在。去污劑可以穩(wěn)定流感病毒抗原(如HA)并防止它們熱降解。存在吐溫80(聚山梨酯80)尤其可解釋在下面的實(shí)施例中觀察到的熱穩(wěn)定性?？乖M分本發(fā)明采用流感病毒抗原。所述抗原通常從流感病毒顆粒制備，但作為替代，抗原也可由重組宿主表達(dá)并以純化形式使用。例如，重組血凝素已被用作抗原，例如使用桿狀病毒載體在昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)[5,6]，重組神經(jīng)氨酸酶亦是如此[7]。然而，抗原通常來自病毒顆粒?？乖男问娇梢允腔畈《荆蛘吒鼉?yōu)選是滅活病毒。滅活病毒的化學(xué)方法包括用有效量的以下一種或多種物質(zhì)處理去污劑、甲醛(例如以福爾馬林的形式)、p-丙內(nèi)酯或UV光。其他化學(xué)滅活方法包括用亞甲藍(lán)、補(bǔ)骨脂素、羧基富勒烯(C60)或其任意組合處理。本領(lǐng)域已知其他病毒滅活方法，例如二乙胺、乙酰氮丙啶或Y射線輻射。INFLEXALTM產(chǎn)品是全病毒顆粒滅活疫苗?？赏ㄟ^各種方法從含有病毒的液體收獲病毒顆粒。例如，純化方法可涉及采用線性蔗糖梯度溶液的區(qū)帶離心，其中包含去污劑以破裂病毒顆粒。然后可通過透析純化抗原，純化前可任選進(jìn)行稀釋。獲得裂解病毒顆粒的過程包括用去污劑(如乙醚、聚山梨酯80、脫氧膽酸鹽、三正丁基磷酸鹽、TritonX-IOO、TritonNlOl、溴化十六烷基三甲銨、TergitolNP9等)處理純化的病毒顆粒以產(chǎn)生亞病毒顆粒制劑，包括'吐溫-醚'裂解方法。裂解流感病毒的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如參見參考文獻(xiàn)8-13等。一般使用破壞性濃度的裂解劑通過破壞或片段化完整病毒來裂解病毒，無論該病毒有無感染性。這種破壞導(dǎo)致病毒蛋白的完全或部分溶解，改變病毒的完整性。優(yōu)選的裂解劑是非離子型和離子型(例如陽離子型)表面活性劑，如烷基糖苷、烷基硫苷、?；恰⒒腔鸩藟A、甜菜堿、聚氧乙烯垸基醚、N，N-二垸基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季銨化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六垸基三甲銨)、三正丁基磷酸酯、塞塔隆(Cetavlon)、十四烷基三甲銨鹽、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑、脂轉(zhuǎn)染胺、和DOTMA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如Triton表面活性劑，如TritonX-100或TritonNlOl)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂解方法使用脫氧膽酸鈉和甲醛連續(xù)作用，在最初病毒顆粒純化過程中(例如在蔗糖密度梯度溶液中)發(fā)生裂解?？蓪⒘呀獾牟《绢w粒重懸于磷酸鈉緩沖的等滲氯化鈉溶液中。BEGRIVACTM、FLUARIXtm、FLUZONEtm和FLUSHIELDTM產(chǎn)品是裂解疫苗。純化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，一般還包含神經(jīng)氨酸酶。制備純化形式的這些蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的。FLUVIRINtm、agrippaijm和influvactm產(chǎn)品是亞單位疫苗。流感抗原也可以病毒體(無核酸的病毒樣脂質(zhì)體顆粒)的形式存在[14]，例如inflexalVtm和invavactm產(chǎn)品，但本發(fā)明優(yōu)選不使用病毒體。因此，在一些實(shí)施方式中，流感抗原不是病毒體的形式?？墒沽鞲胁《緶p毒。流感病毒可以是溫度敏感型。流感病毒可以是冷適應(yīng)性病毒。使用活病毒作為抗原時(shí)這三種特征特別有用。疫苗中使用的流感病毒毒株隨季節(jié)而變。在目前的大流行間期，疫苗一般包含兩種甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一種乙型流感毒株，一般是三價(jià)疫苗。本發(fā)明也可使用來自大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群未曾免疫接觸的毒株)的HA，如H2、H5、H7或H9亞型毒株(尤其是甲型流感病毒毒株)，大流行毒株的流感疫苗可以是單價(jià)疫苗，或者可基于補(bǔ)充有大流行毒株的正常三價(jià)疫苗。然而，根據(jù)季節(jié)和疫苗中包含的抗原特性，本發(fā)明可保護(hù)免受甲型流感病毒HA亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16中一種或多種的感染。采用Hl抗原時(shí)，與參考文獻(xiàn)2相比，觀察到HA降解速率大幅下降。采用H3抗原也觀察到降解速率降低，采用乙型流感病毒抗原亦是如此。本發(fā)明可保護(hù)免受甲型流感病毒NA亞型Nl、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中一種或多種的感染。除了適合免疫對(duì)抗大流行間期毒株，本發(fā)明組合物也特別適用于免疫對(duì)抗大流行毒株。可能引起大流行爆發(fā)的流感毒株的特征是(a)與目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即數(shù)十年沒有在人群中發(fā)現(xiàn)的血凝素(如H2)，或者從未在人群中發(fā)現(xiàn)的血凝素(如H5、H6或H9，通常只出現(xiàn)在鳥群體中)，和/或與目前流通的人毒株中的神經(jīng)氨酸酶相比，它含有新的神經(jīng)氨酸酶，以至于人群未曾免疫接觸過該毒株的血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶；(b)它能夠在人群中水平傳播；和(c)它能使人致病。含有H5血凝素類型的病毒優(yōu)選用于獲得對(duì)大流行流感，如H5N1毒株的免疫。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出現(xiàn)的大流行毒株。在H5亞型內(nèi)，病毒可能屬于HA進(jìn)化枝1、HA進(jìn)化枝1'、HA進(jìn)化枝2或HA進(jìn)化枝3[15]，進(jìn)化枝1和3特別相關(guān)。其抗原可有用地包含在本發(fā)明組合物中的其它毒株是對(duì)抗病毒治療有抗性(例如對(duì)奧塞米韋[16]和/或扎那米韋有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[17]。本發(fā)明組合物可包含一種或多種(如1、2、3、4或更多種)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原?？芍苽鋯蝺r(jià)疫苗，也可制備2-價(jià)、3-價(jià)、4-價(jià)疫苗，等等。當(dāng)疫苗包含一種以上流感毒株時(shí)，一般單獨(dú)培養(yǎng)不同毒株，收獲病毒后將它們混合在一起，然后制備抗原。因此，本發(fā)明方法可包括混合一種以上流感毒株的抗原的步驟，且該步驟可在非冷藏條件下進(jìn)行。優(yōu)選三價(jià)疫苗，其包含來自兩種甲型流感病毒毒株和一種乙型流感病毒毒株的抗原。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，該組合物可包含來自一種甲型流感毒株的抗原。在一些實(shí)施方式中，該組合物可包含來自兩種甲型流感毒株的抗原，前提是這兩種毒株不是H1N1和H3N2。在一些實(shí)施方式中，該組合物可包含來自兩種以上甲型流感毒株的抗原。流感病毒可能是再造毒株，可通過逆向遺傳學(xué)技術(shù)獲得該病毒。逆向遺傳學(xué)技術(shù)[如18-22]能夠用質(zhì)粒在體外制備含有所需基因組區(qū)段的流感病毒。該技術(shù)一般包括例如(a)由poll啟動(dòng)子表達(dá)編碼所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)由polll啟動(dòng)子表達(dá)編碼病毒蛋白的DNA分子，這兩種類型的DNA在細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致組裝成完整的感染性病毒顆粒。該DNA優(yōu)選提供病毒的所有RNA和蛋白質(zhì)，但也可能使用輔助病毒來提供一些RNA和蛋白質(zhì)。優(yōu)選采用不同質(zhì)粒產(chǎn)生各病毒RNA的基于質(zhì)粒的方法[23-25]，這些方法也包括使用質(zhì)粒來表達(dá)所有或一些病毒蛋白(例如，僅PB1、PB2、PA和NP蛋白)，在一些方法中使用12種質(zhì)粒。為了減少所需的質(zhì)粒數(shù)量，近期方法[26]將多個(gè)RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒(用于合成病毒RNA)合并到同一質(zhì)粒上(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種甲型流感vRNA區(qū)段的序列)，并且將多個(gè)蛋白編碼區(qū)與RNA聚合酶II啟動(dòng)子合并到另一個(gè)質(zhì)粒上(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種甲型流感mRNA轉(zhuǎn)錄物的序列)。參考文獻(xiàn)26方法的優(yōu)選方面包括:(a)PB1、PB2和PAmRNA編碼區(qū)在同一質(zhì)粒上；和(b)所有8個(gè)vRNA編碼區(qū)段在同一質(zhì)粒上。一個(gè)質(zhì)粒上包含NA和HA區(qū)段而另外六個(gè)區(qū)段位于另一質(zhì)粒上也可能是有利的。作為使用poll啟動(dòng)子來編碼病毒RNA區(qū)段的替換方式，可使用噬菌體舉合酶啟動(dòng)子[27]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的啟動(dòng)子。由于poll啟動(dòng)子的物種特異性，噬菌體聚合酶啟動(dòng)子可能較適合許多細(xì)胞類型(如MDCK)，但也必須用編碼外源性聚合酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在其它技術(shù)中，可使用poll和polll雙啟動(dòng)子由一個(gè)模板同時(shí)編碼病毒RNA和可表達(dá)的mRNA[28,29]。因此，病毒，特別是甲型流感病毒可包含來自A/PR/8/34病毒的一個(gè)或多個(gè)RNA區(qū)段(一般6個(gè)區(qū)段來自A/PR/8/34，HA和N區(qū)段來自疫苗毒株，即6:2再造毒株)。也可包含來自A/WSN/33病毒，或用于產(chǎn)生疫苗制劑的再造病毒的任何其它毒株的一個(gè)或多個(gè)RNA區(qū)段。本發(fā)明一般保護(hù)免受能夠在人之間傳播的毒株的感染，因此該毒株的基因組通常包含起源于哺乳動(dòng)物(如人)流感病毒的至少一個(gè)RNA區(qū)段。它可包含起源于禽流感病毒的NS區(qū)段。通常在細(xì)胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)用作抗原來源的病毒，但在一些實(shí)施方式中，可以在雞蛋上培養(yǎng)它們。目前標(biāo)準(zhǔn)的流感病毒培養(yǎng)方法采用無特定病原(SPF)含胚雞蛋，由雞蛋內(nèi)容物(尿囊液)純化病毒。如果使用基于雞蛋的病毒培養(yǎng)，則可將一種或多種氨基酸與病毒一起引入雞蛋尿囊液中[12]。細(xì)胞基底層一般是哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞系。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源包括但不限于倉鼠、牛、靈長動(dòng)物(包括人和猴)和犬細(xì)胞?？刹捎酶鞣N細(xì)胞類型，例如腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肺細(xì)胞等。合適的倉鼠細(xì)胞的例子是稱為BHK21或HKCC的細(xì)胞系。合適的猴細(xì)胞是(例如)非洲綠猴細(xì)胞，例如腎細(xì)胞，如Vero細(xì)胞系。合適的犬細(xì)胞是(例如)腎細(xì)胞，例如MDCK細(xì)胞系。因此，合適的細(xì)胞系包括但不限于MDCK、CHO、293T、BHK、Vero、MRC-5、PER.C6、WI-38等。使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞意味著疫苗可不含雞DNA，以及不含雞蛋蛋白質(zhì)(如卵清蛋白和卵類黏蛋白)，從而降低變應(yīng)原性。用于培養(yǎng)流感病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系優(yōu)選包括MadinDarby犬腎來源的MDCK細(xì)胞[30-33];非洲綠猴(Cen:o;7^ea^aeA/o戸)腎來源的Vero細(xì)胞[34-36];或人胚視網(wǎng)膜母細(xì)胞來源的PER.C6細(xì)胞[37]。這些細(xì)胞系可由各種來源獲得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)[38]、Coridl細(xì)胞庫[39]或歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC供應(yīng)各種不同Vero細(xì)胞，目錄號(hào)為CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587，還供應(yīng)MDCK細(xì)胞，目錄號(hào)為CCL-34。PER,C6可獲自ECACC，保藏號(hào)96022940。作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的代替，可在禽細(xì)胞系[如參考文獻(xiàn)40-42]，包括禽胚胎干細(xì)胞[40，43]和鴨(如鴨視網(wǎng)膜)或母雞來源的細(xì)胞系上培養(yǎng)病毒。合適的禽胚胎干細(xì)胞包括衍生自雞胚胎干細(xì)胞的Ebx細(xì)胞系、EB45、EB14和EB14-074[44]。也可使用雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，等等。用于培養(yǎng)流感病毒的最優(yōu)選的細(xì)胞系是MDCK細(xì)胞系。原始MDCK細(xì)胞系可購自ATCC(CCL-34)，但也可利用該細(xì)胞系的衍生細(xì)胞系。例如，參考文獻(xiàn)45公開了適合懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系('MDCK33016'，保藏號(hào)DSMACC2219)。類似地，參考文獻(xiàn)45公開了在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的MDCK衍生細(xì)胞系('B-702'，保藏號(hào)FERMBP-7449)。參考文獻(xiàn)46公開了非致瘤性MDCK細(xì)胞，包括'MDCK-S'(ATCCPTA-6500)、'MDCK-SFIOI'(ATCCPTA-6501)、'MDCK-SF102'(ATCCPTA-6502)和'MDCK-SF103'(PTA-6503)。參考文獻(xiàn)47公開了非常易于感染的MDCK細(xì)胞系，包掛MDCK.5F1鄰胞(ATCCCRL-12042)?？墒褂萌魏芜@些MDCK細(xì)胞系。細(xì)胞生長培養(yǎng)物，以及用于啟動(dòng)培養(yǎng)的病毒接種物優(yōu)選不含(即經(jīng)測試且得到陰性污染結(jié)果)單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、多瘤病毒、雙RNA病毒、環(huán)病毒和/或細(xì)小病毒[48]。特別優(yōu)選不存在單純皰疹病毒。可以在懸浮[30,49,50]或貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞中培養(yǎng)病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞可能適合懸浮培養(yǎng)。一種適合懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系是MDCK33016(保藏號(hào)DSMACC2219)。或者，可采用微載體培養(yǎng)。優(yōu)選在無血清培養(yǎng)基和/或無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)支持流感病毒復(fù)制的細(xì)胞系。在本發(fā)明中，如果培養(yǎng)基中沒有人或動(dòng)物來源的血清添加劑，則稱為無血清培養(yǎng)基。無蛋白應(yīng)理解為在不含蛋白質(zhì)、生長因子、其它蛋白添加劑和非血清蛋白質(zhì)的情況下發(fā)生細(xì)胞增殖的培養(yǎng)物，但可任選包含諸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等可能是病毒生長所必需的蛋白質(zhì)。在這類培養(yǎng)物中培養(yǎng)的細(xì)胞在天然情況下本身含有蛋白質(zhì)。在病毒復(fù)制過程中，支持流感病毒復(fù)制的細(xì)胞系優(yōu)選在37°C以下[51](如30-36。C)培養(yǎng)。在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖病毒的方法通常包括以下步驟用待培養(yǎng)的毒株接種培養(yǎng)的細(xì)胞，將感染細(xì)胞培養(yǎng)所需時(shí)間以使病毒增殖，例如通過病毒效價(jià)或抗原表達(dá)來確定所需時(shí)間(如接種后24-168小時(shí))，然后收獲增殖的病毒。用1:500-1:1，優(yōu)選1:100-1:5，更優(yōu)選1:50-1:10的病毒(由PFU或TCID50測定):細(xì)胞比接種培養(yǎng)的細(xì)胞。將病毒加入細(xì)胞懸液中，或施加于細(xì)胞單層，在25-40°C，優(yōu)選28-37t:下，使病毒吸附于細(xì)胞至少60分鐘，但通常小于300分鐘，優(yōu)選卯-240分鐘?？赏ㄟ^凍融或酶作用去除感染的細(xì)胞培養(yǎng)物(如單層)，以提高收獲的細(xì)胞上清液的病毒含量。然后，可滅活或冷凍儲(chǔ)存收獲的液體?？梢约s0.0001-10、優(yōu)選0.002-5、更優(yōu)選0.001-2的感染復(fù)數(shù)("m.o.i.")感染培養(yǎng)的細(xì)胞。更優(yōu)選地，以約O.Ol的m.o丄感染細(xì)胞?？梢栽诟腥竞?0-60小時(shí)收獲感染的細(xì)胞。優(yōu)選在感染后34-48小時(shí)收獲細(xì)胞。更優(yōu)選在感染后38-40小時(shí)收獲細(xì)胞。通常在細(xì)胞培養(yǎng)期間加入蛋白酶(一般是胰蛋白酶)，以使病毒釋放，可以在培養(yǎng)的任何合適的階段加入蛋白酶。目前參照一般由SRID測定的HA水平來標(biāo)準(zhǔn)化流感疫苗?，F(xiàn)有疫苗一般含有約15嗎HA/毒株，但較低劑量也可使用(例如，當(dāng)用作佐劑時(shí))。采用了分?jǐn)?shù)劑量如'/2(即7.5昭HA/毒株)、^和V8[65,66]，以及較高劑量(如3x或9x劑量[52,53])。因此，疫苗可包含0.1-150嗎HA/流感毒株，優(yōu)選0.1-50昭，例如0.1-20嗎、0.1-15嗎、O.l-lO嗎、0.1-7,5嗎、0.5-5昭等。具體劑量包括例如，約45、約30、約15、約10、約7.5、約5、約3.8、約1.9、約1.5pg/毒株等?？蓪?duì)本發(fā)明所述疫苗、藥盒和方法的組分(例如，它們的體積和濃度)進(jìn)行選擇以在最終產(chǎn)品中提供這些抗原劑量。從濃縮的原料稀釋成最終所需的HA濃度可在非冷藏條件下進(jìn)行。在活疫苗中，利用組織培養(yǎng)感染劑量中值(TCID5o)而非HA含量來測定劑量，TCID5。一般為106-108(優(yōu)選為1065-1075)/毒株。本發(fā)明所用HA可以是天然HA，如病毒中發(fā)現(xiàn)的天然HA，或者可以是經(jīng)修飾的HA。例如，已知修飾HA以去除導(dǎo)致病毒在禽類動(dòng)物中具有高度致病性的決定簇(如HA1和HA2之間切割位點(diǎn)周圍的超堿性區(qū)域(hyper-basicregion)),因?yàn)檫@些決定簇可導(dǎo)致病毒不能在雞蛋中生長。除了包含血凝素，本發(fā)明的組合物和包含其他流感病毒蛋白。例如，它們通常包含神經(jīng)氨酸酶糖蛋白。它們還可包含基質(zhì)蛋白，如M1和/或M2(或其片段)，和/或核蛋白。在一些實(shí)施方式中，尤其當(dāng)(a)抗原是從雞蛋培養(yǎng)的疫苗制備的，(b)疫苗是滅活的表面抗原疫苗，和/或(c)疫苗包含硫柳汞時(shí)，本發(fā)明不涉及參考文獻(xiàn)2中披露的以下三種疫苗(i)包含毒株A/Panama/2007/99RESVIR-17再造株和A/NewCaledonia/20/99IVR-116再造株和B/Yamanashi/166/98的三價(jià)疫苗；(ii)包含毒株A/Panama/2007/99RESVIR-17再造株和A/NewCaledonia/20/99IVR-116再造株和B/Guangdong/120/00的三價(jià)疫苗；或(iii)包含毒株A/Panama/2007/99RESVIR-17再造株和A/NewCaledonia/20/99IVR-116再造株和B/Shangdong/7/97的三價(jià)疫苗。宿主細(xì)胞DNA用細(xì)胞系培養(yǎng)病毒時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐是最大程度減少最終疫苗中殘留的細(xì)胞系DNA的含量，以盡可能降低這些DNA的致癌活性。因此，本發(fā)明組合物優(yōu)選含有小于10ng(優(yōu)選小于1ng，更優(yōu)選小于100pg)殘留的宿主細(xì)胞DNA/劑量，但可能存在痕量宿主細(xì)胞DNA。通常，需要從本發(fā)明組合物中排除的宿主細(xì)胞DNA是長度大于100bp的DNA?，F(xiàn)在，殘留宿主細(xì)胞DNA的測定是生物制品的常規(guī)管理要求，并且在普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。用于測定DNA的實(shí)驗(yàn)一般是驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[54,55]?？赏ㄟ^數(shù)學(xué)和可以量化的條件來描述驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的性能特征，并鑒定可能的誤差來源。通常測試該實(shí)驗(yàn)的某些特征，如精確性、準(zhǔn)確性、特異性。一旦校正(例如用已知標(biāo)準(zhǔn)量的宿主細(xì)胞DNA校正)并檢驗(yàn)了某個(gè)實(shí)驗(yàn)，則可按常規(guī)進(jìn)行定量DNA測定。可采用三種DNA定量的基本技術(shù)雜交方法，如Southern印跡或狹線印跡[56];免疫測定法，如ThresholdTM系統(tǒng)[57];和定量PCR[58]。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些方法，但各方法的準(zhǔn)確特征，例如雜交探針的選擇、引物的選擇和/或用于擴(kuò)增的引物等可能取決于所研究的宿主細(xì)胞。來自分子設(shè)備公司(MolecularDevices)的ThresholdTM系統(tǒng)是皮克水平的總DNA的定量實(shí)驗(yàn)，已用于監(jiān)測生物藥品中污染DNA的水平[57]。典型實(shí)驗(yàn)包括生物素化ssDNA結(jié)合蛋白、脲酶偶聯(lián)的抗ssDNA抗體和DNA之間以非序列特異性方式形成反應(yīng)復(fù)合物。購自生產(chǎn)商的總DNA測定試劑盒(TotalDNAAssayKit)中包含所有實(shí)驗(yàn)組分。多個(gè)商業(yè)生產(chǎn)商均提供了用于檢測殘留宿主細(xì)胞DNA的定量PCR實(shí)驗(yàn)，例如AppTecTM實(shí)驗(yàn)室服務(wù)公司(AppTecTMLaboratoryServices)、BioRelianceTM公司奧西科技公司(AltheaTechnologies)等。用于測定人病毒疫苗的宿主細(xì)胞DNA污染的化學(xué)發(fā)光雜交實(shí)驗(yàn)和總DNAThresholdTM系統(tǒng)的比較參見參考文獻(xiàn)59。在疫苗制備過程中可采用標(biāo)準(zhǔn)純化方法，如層析法等去除污染的DNA?？赏ㄟ^核酸酶處理，例如DNA酶處理來改進(jìn)對(duì)殘留宿主細(xì)胞DNA的清除效果。參考文獻(xiàn)60和61公開了一種減少宿主細(xì)胞DNA污染的方便方法，該方法包括兩步處理，第一步是在病毒生長期間使用DNA酶(如Benzonase)處理，然后是在病毒顆粒破裂期間使用陽離子去污劑(如CTAB)進(jìn)行處理。也可利用垸化劑如P-丙內(nèi)酯處理來去除宿主細(xì)胞DNA，該方法也宜用于滅活病毒顆粒[62〗。優(yōu)選每15嗎血凝素中宿主細(xì)胞DNA含量〈10ng(如〈1ng、〈100pg)的疫苗，以及每0.25ml體積中宿主細(xì)胞DNA含量〈10ng(如〈lng、〈100pg)的疫苗。更優(yōu)選每5(Hig血凝素中宿主細(xì)胞DNA含量〈10ng(如〈lng、〈100pg)的疫苗，以及每0.5ml體積中宿主細(xì)胞DNA含量<10ng(如〈1ng、〈100pg)的疫苗。儲(chǔ)存條件和運(yùn)輸當(dāng)提及疫苗或抗原組合物無需冷藏(或類似描述)時(shí)，是指無需在平衡時(shí)溫度58。C的條件下儲(chǔ)存。因此，暫時(shí)放置在冰箱中，而沒有放置足夠長的時(shí)間以至其整體溫度降至8t:或更低的組合物未經(jīng)冷藏。然而，在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明允許根本不接觸冷藏條件，即便是暫時(shí)的。當(dāng)本發(fā)明涉及在兩個(gè)地點(diǎn)之間運(yùn)輸時(shí)，兩個(gè)地點(diǎn)之間優(yōu)選相隔n公里以上，其中n選自1、2、3、4、5、10、20、25、30、40、50、IOO或更多。當(dāng)組合物在1(TC以上儲(chǔ)存時(shí)，它可在^11。C、^12。C、^13。C、^14。C、^15。C、^16。C、^17。C、^18。C、^19C、^20。C、^21。C、^22。C、^23。C、^24。C儲(chǔ)存。通常，它將被儲(chǔ)存于4(TC以下，例如^39。C、三38。C、537°C、536°C、三35。C、534。C、533°C、￡32°C、￡31°C、S30。C、529°C、￡28°C、S270C、$26°C。典型的儲(chǔ)存溫度將是室溫，例如在18'C和23。C之間，如20土1。C。當(dāng)組合物在非冷藏條件下儲(chǔ)存10周以上時(shí)，它可被儲(chǔ)存^11周、^12周、^13周、^14周、^15周、^16周、^17周、^18周、^19周、^20周、^25周、^26周、^30周、235周、yO周。通常儲(chǔ)存l年以下。疫苗可儲(chǔ)存在直射光線外，例如避光儲(chǔ)存。當(dāng)疫苗的血凝素降解速率低于33%/年/毒株時(shí)，優(yōu)選532%、^31%、530%、￡29%、528%、527%、526%、525%、524%、523%、￡22%、￡21%、520%、519%、^18%、^17%、￡16%、￡15%、￡14%、￡13%、^12%、￡ll%、，％、^>%、^8%、^7%、￡6%、55%或更低。優(yōu)選按照題為"新藥和產(chǎn)品的穩(wěn)定性檢觀'J(StabilityTestingofNewDrugSubstancesandProducts)"的ICH(國際人類用藥登i己技術(shù)要求幼、調(diào)會(huì)i義(InternationalConferenceonHarmonisationofTechnicalRequirementsforRegistrationofPharmaceuticalsforHumanUse))準(zhǔn)貝(JQ1A(R2)測定降解，并進(jìn)行有關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。佐劑本發(fā)明組合物宜包含佐劑，佐劑可用于在接受該組合物的患者中提高所引發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)(體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答)。曾經(jīng)描述過將佐劑與流感疫苗一起使用。參考文獻(xiàn)63和64中使用了氫氧化鋁，參考文獻(xiàn)65中使用了氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。參考文獻(xiàn)66也描述了鋁鹽佐劑的應(yīng)用。希龍疫苗公司(ChironVaccines)的FLUADTM產(chǎn)品包含水包油乳液?？捎糜诒景l(fā)明的佐劑包括但不限于包含鈣鹽和鋁鹽(或其混合物)的含礦物質(zhì)組合物。鈣鹽包括磷酸鈣(如參考文獻(xiàn)67公開的"CAP"顆粒)。鋁鹽包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等，所述鹽取任何合適的形式(如凝膠、晶體、無定形態(tài)等)。優(yōu)選吸附于這些鹽。也可將含有礦物質(zhì)的組合物制成金屬鹽的顆粒[68]。下面開始更詳細(xì)地描述鋁鹽佐劑。細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑(詳述見下)皂苷[參考文獻(xiàn)104第22章]，皂苷是在許多種類的植物的樹皮、葉、莖干、根甚至花中發(fā)現(xiàn)的甾醇糖苷和三萜糖苷的異質(zhì)群體。已廣泛研究了作為佐劑的來自皂樹sopo"an'a)Molina樹皮的皂苷。皂苷也可購自麗花菝葜(Smilaxomata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophillapaniculata)(婚紗花)和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21以及脂質(zhì)制劑如ISCOM。QS21以商標(biāo)StimulonTM出售。已釆用HPLC和RP-HPLC來純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術(shù)純化的特定組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷優(yōu)選QS21。制備QS21的方法參見參考文獻(xiàn)69。也可將QuilA的組分A與至少一種其他佐劑一起使用[70]。皂苷制劑也可包含甾醇，如膽固醇[71]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨(dú)特顆粒[參考文獻(xiàn)104的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。ISCOM中可采用任何已知的皂苷。ISCOM優(yōu)選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻(xiàn)71-73中進(jìn)一步描述了ISCOM。任選地，ISCOM可不含其它去污劑[74]。也可使用至少兩種ISCOM復(fù)合物的混合物，各種復(fù)合物基本上包含一種皂苷組分，此時(shí)的復(fù)合物是ISCOM復(fù)合物或ISCOM基質(zhì)復(fù)合物[75]。開發(fā)基于皂苷的佐劑的綜述可參見參考文獻(xiàn)76和77。脂肪佐劑(詳述見下)。細(xì)菌ADP-核糖基化毒素(如大腸桿菌(五.co/Z)不耐熱腸毒素"LT"、霍亂毒素"CT"或百日咳毒素"PT")及其脫毒衍生物，如稱為LT-K63和LT-R72的突變毒素[78]。參考文獻(xiàn)79中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑，參考文獻(xiàn)80中描述了將其用作胃腸道外佐劑。生物粘附劑和粘膜粘附劑，如酯化透明質(zhì)酸微球[81]或殼聚糖及其衍生物。由可生物降解和無毒材料(例如聚(a-羥酸)、聚羥基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)，優(yōu)選丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(即直徑約100nm-150pm，更優(yōu)選約200nm-30pm，最優(yōu)選約500nm-l(Him的顆粒)，任選處理以具有帶負(fù)電表面(如用SDS處理)或帶正電表面(例如用陽離子去污劑如CTAB處理)。脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)104第13和14章)。適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子見參考文獻(xiàn)83-85所述。水包油乳液(詳述見下)聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑[86]。這種制劑還包括聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑和辛苯聚醇[87]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑和至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯聚醇[88]的混合物。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-固醇醚(steorylether)、聚氧乙烯-8-固醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞壁酰-L-A1-D-異谷氨酰-L-Ala-二棕櫚酰丙酰胺("DTP-DPP"或19"TheramideTM")N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(r-2'-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。由第一種革蘭陰性菌制備的外膜蛋白蛋白酶體制劑與第二種革蘭陰性菌產(chǎn)生的脂多糖制劑的組合，其中所述外膜蛋白蛋白酶體和脂多糖制劑形成穩(wěn)定的非共價(jià)佐劑復(fù)合物。這類復(fù)合物包括"IVX-908"，它是由腦膜炎奈瑟球菌(A^hen'"mem'"g/^fo)外膜蛋白和脂多糖組成的復(fù)合物。已將它們用作流感疫苗佐劑[89]。甲基肌苷5'-單磷酸酯("MIMP")[90]。多聚羥化吡咯雙烷類化合物[91]，如下式化合物式中R選自氫，直鏈或支鏈、未取代或取代、飽和或不飽和的?；?、垸基(如環(huán)烷基)、烯基、炔基和芳基，或這些化合物藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物。例子包括但不限于木麻黃(casuarine)、木麻黃-6-a-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黃、7-表-木麻黃、3,7-二表-木麻黃等。Y菊糖[92]或其衍生物，如algammulin。CDld配體，如(x-糖基神經(jīng)酰胺，例如a-半乳糖基神經(jīng)酰胺。參考文獻(xiàn)104和105中更詳細(xì)地討論了這些和其它佐劑活性物質(zhì)。組合物可包含兩種或多種所述佐劑。例如，它們宜同時(shí)包含水包油乳液和細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑，因?yàn)檫@種組合提高了流感疫苗引發(fā)的細(xì)胞因子應(yīng)答，如干擾素-Y應(yīng)答，與該乳液或藥劑單用時(shí)相比，它們聯(lián)用時(shí)引發(fā)的應(yīng)答高得多。組合物中的抗原和佐劑一般形成混合物。組合物中的抗原和佐劑通常是混合在一起的。當(dāng)疫苗包含佐劑時(shí)，它可在遞送時(shí)當(dāng)場制備。因此，本發(fā)明提供了包含各種易混的抗原和佐劑組分的藥盒。該藥盒可將佐劑和抗原單獨(dú)保存，直到使用。在藥盒中各組分在物理上互相分離，可通過各種方式實(shí)現(xiàn)這種分離。例如，這兩種組分可以裝在兩個(gè)不同的容器，如藥瓶中?？赏ㄟ^(例如)取出一個(gè)藥瓶的內(nèi)容物并將其加入另一個(gè)藥瓶，或者分別取出兩個(gè)藥瓶的內(nèi)容物并在第三個(gè)容器中將它們混合在一起，來混合兩個(gè)藥瓶的內(nèi)容物。在優(yōu)選的安排中，藥盒的一種組分在注射器中，另一種組分在容器如藥瓶中。可使用該注射器(例如裝有針頭的注射器)將其內(nèi)容物注入第二個(gè)容器中混合，然后將該混合物抽回注射器中。然后，一般通過新的無菌針頭將該注射器中的混合成分給予患者。將一種組分包裝到注射器中使得不需要另外準(zhǔn)備注射器進(jìn)行給藥。在另一優(yōu)選的安排中，這兩種藥盒組分在同一注射器，例如雙室注射器(如參考文獻(xiàn)93-100等所述)中分開保存。當(dāng)注射器致動(dòng)時(shí)(例如給予患者時(shí))，則這兩室中的內(nèi)容物混合。這種安排避免了使用時(shí)的單獨(dú)混合步驟。水包油乳液佐劑發(fā)現(xiàn)水包油乳液特別適用于含佐劑的流感病毒疫苗。多種這類乳液是已知的，它們一般包含至少一種油和至少一種表面活性劑，油與表面活性劑是可生物降解(可代謝)和生物相容性的。乳液中油滴的直徑通常小于5pm，甚至可以是亞微米級(jí)，用微流化床實(shí)現(xiàn)這種小尺寸以提供穩(wěn)定的乳液。優(yōu)選小于220nm的液滴，因?yàn)樗鼈兛蛇M(jìn)行過濾除菌。本發(fā)明可使用的油諸如動(dòng)物油(如魚油)或植物油。植物油的來源包括堅(jiān)果、種籽和谷粒。堅(jiān)果油中最常見的是花生油、大豆油、可可油和橄欖油。也可使用獲自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷粒油中，最常見的是玉米油，但也可采用其它谷類如小麥、燕麥、裸麥、稻、畫眉草、黑小麥等的油?？蓮膱?jiān)果和種籽油開始，通過水解、分離和酯化合適的物質(zhì)來制備6-10碳脂肪酸甘油酯和1，2-丙二醇，雖然這些物質(zhì)不是種籽油中天然產(chǎn)生的。來自哺乳動(dòng)物乳汁的脂肪和油是可代謝的，因此可用于實(shí)施本發(fā)明。由動(dòng)物來源獲得純油的過程中必需的分離、純化、皂化和其它步驟是本領(lǐng)域眾所周知的。大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和鯨油如鯨蠟代表了可用于本發(fā)明的幾種魚油的例子。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單元合成許多支鏈油，它們總稱為萜類。鯊魚肝油含有支鏈不飽和類萜，稱為鯊烯2,6,10,15,19,23-六甲基-2，6，10,14,18，22-二十四碳六烯，本文特別優(yōu)選此類萜。鯊烯的飽和類似物鯊?fù)橐彩莾?yōu)選的油。魚油，包括鯊烯和鯊?fù)椋子趶纳虡I(yè)來源購得，或可通過本領(lǐng)域已知方法獲得。其它優(yōu)選油是生育酚(見下)?？刹捎糜偷幕旌衔铩？筛鶕?jù)'HLB'(親水/親脂平衡值)對(duì)表面活性劑進(jìn)行分類。本發(fā)明優(yōu)選的表面活性劑的HLB至少為10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16?？捎糜诒景l(fā)明的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80;以商品名DOWFAXTM出售的環(huán)氧乙垸(EO)、環(huán)氧丙垸(PO)和域環(huán)氧丁垸(BO)的共聚物，如直鏈EP/PO嵌段共聚物；重復(fù)的乙氧基(氧-l，2-乙二基)基團(tuán)數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9(TritonX-100，或叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；衍生自十二浣醇、十六垸醇、十八垸醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤表面活性劑)，如三乙二醇單月桂基醚(芐澤30);以及失水山梨糖醇酯(通常稱為司盤)，如失水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和失水山梨糖醇單月桂酸酯。包含在乳液中的優(yōu)選表面活性劑是吐溫80(聚氧乙烯失水山梨糖醇酯)、司盤85(失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和TritonX-IOO。如上所述，去污劑如吐溫80也可提高熱穩(wěn)定性，從下面的實(shí)施例可見?？墒褂帽砻婊钚詣┑幕旌衔?，如吐溫80/司盤85混合物。也適合采用聚氧乙烯失水山梨糖醇酯如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TritonX-100)的混合物。另一種有用的混合物包含聚乙二醇單月桂醚9和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。表面活性劑的含量(重量％)優(yōu)選為聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(如吐溫80)0.01-1%，具體為約0.1%;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如TritonX-IOO，或Triton系列的其它去污劑)0.001-0.1%,具體為0.005-0.02%;聚氧乙烯醚(如聚乙二醇單月桂醚9)0.1-20%，優(yōu)選0.1-10%，具體是0.1-1%或約0.5%。本發(fā)明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于鯊烯、吐溫80和司盤85的亞微米乳液。該乳液的體積組成可以是約5%鯊烯、約0.5%聚山梨酯80和約0.5%司盤85。以重量計(jì)，這些比例變?yōu)?.3%鯊烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盤85。此佐劑稱為'MF59'[101-103]，如參考文獻(xiàn)104的第10章和參考文獻(xiàn)105的第12章所詳述。MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如lOmM擰檬酸鈉緩沖液。鯊烯、生育酚和吐溫80的乳液。該乳液可包含磷酸鹽緩沖鹽水。它也可含有Span85(如1%)和/或卵磷脂。這些乳液可含有2-10%鯊烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐溫80，鯊烯:生育酚的重量比優(yōu)選S1，因?yàn)檫@能使乳液更穩(wěn)定。鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5:2?？赏ㄟ^下述方法制備一種這樣的乳液將吐溫80溶解于PBS得到2%溶液，然后將90ml該溶液與5gDL-a-生育酚和5ml鯊烯的混合物混合，然后使該混合物微流體化。得到的乳液可含有，例如，平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油滴。鯊烯、生育酚和Triton去污劑(如TritonX-100)的乳液。該乳液也可包含3d-MPL(見下)。該乳液可含有磷酸鹽緩沖液。含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、Triton去污劑(如TritonX-100)和生育酚(如琥珀酸a-生育酚)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75:11:10(如750嗎/ml聚山梨酯80,110pg/mlTritonX-100和100|ig/ml琥珀酸a-生育酚)，這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。該乳液還可包含鯊烯。該乳液也可包含3d-MPL(見下)。水相可含有磷酸鹽緩沖液。鯊烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401("TML121")的乳液?？梢杂昧姿猁}緩沖鹽水，pH7.4配制該乳液。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽遞送載體，已知與用"SAF-I"佐劑(0.05-l。/oThr-MDP、5%鳘烯、2.5%PluronicL121和0.2%聚山梨酸酯80)配的蘇氨?；?MDP—起使用[106]。也可不與Thr-MDP—起使用，例如用"AF"佐劑(5Q/。鯊烯、1.25%PluronicL121和0.2%聚山梨酸酯80)[107]。優(yōu)選微流體化。含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非離子型表面活性劑的乳液。如參考文獻(xiàn)108所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴大小。不可代謝油(如輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液?？砂砑觿鏠uilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂體偶聯(lián)物(如通過葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫?；碥丈隙a(chǎn)生的GPI-OIOO，參見參考文獻(xiàn)109)、二甲基二-十八烷基溴化銨和/或N，N-二-十八垸基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺。含有礦物油、非離子型親脂乙氧基化脂肪醇和非離子型親水表面活性劑(如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[110]。含有礦物油、非離子型親水乙氧基化脂肪醇和非離子型親脂表面活性劑(如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[110]。皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如膽固醇)結(jié)合成螺旋膠束的乳液[111]?？梢栽谶f送時(shí)將該乳液與抗原臨時(shí)混合。因此，在包裝或出售的疫苗中該佐劑和抗原可分開保存，使用時(shí)配制成最終制劑?？乖ǔＪ撬孕问剑员阕罱K通過混合兩種液體制備疫苗?；旌系膬煞N液體的體積比可變(例如5:1-1:5)，但通常約為l:l。將抗原與佐劑混合之后，血凝素抗原通常保留在水溶液中，但其本身可分布于油/水界面附近。通常，血凝素很少(如果有)會(huì)進(jìn)入該乳液的油相。當(dāng)組合物包含生育酚時(shí)，可使用a、p、y、5、s或g生育酚中任何一種，但優(yōu)選a-生育酚。生育酚可采取不同形式，例如不同的鹽和/或異構(gòu)體。鹽包括有機(jī)鹽，例如琥珀酸鹽、乙酸鹽、煙酸鹽等。D-a-生育酚和DL-a-生育酚均可使用。用于老年患者(如年齡大于60歲或更大的患者)的疫苗中宜包含生育酚，因?yàn)閾?jù)報(bào)道維生素E在此患者群體中對(duì)免疫應(yīng)答有正面作用[112]。它們也具有抗氧化特性，這種特性有助于穩(wěn)定該乳液[113]。優(yōu)選的(x-生育酚是DL-a-生育酚，這種生育酚的優(yōu)選鹽是琥珀酸鹽。發(fā)現(xiàn)琥珀酸鹽在體內(nèi)能與TNF相關(guān)配體協(xié)作。而且，已知琥珀酸a-生育酚與流感疫苗相容，并且是有用的替代含汞化合物的防腐劑[ll]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑給予患者時(shí)包含在本發(fā)明組合物中的細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑能夠引發(fā)免疫應(yīng)答，以釋放細(xì)胞因子，包括干擾素和白細(xì)胞介素。已知細(xì)胞因子應(yīng)答參與針對(duì)流感病毒感染的宿主防御的早期和決定階段[114]。優(yōu)選藥劑可引發(fā)以下一種或多種物質(zhì)的釋放干擾素Y;白細(xì)胞介素-l;白細(xì)胞介素-2;白細(xì)胞介素-12;TNF-Ct;TNF-P;和GM-CSF。優(yōu)選的藥劑引發(fā)與Thl型免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞因子釋放，如干擾素Y、TNF-a、白介素-2。優(yōu)選刺激干擾素-Y和白細(xì)胞介素-2。因此，接受本發(fā)明組合物的結(jié)果是，用流感抗原刺激時(shí)，患者的T細(xì)胞以抗原特異性方式釋放所需細(xì)胞因子。例如，由血液純化的T細(xì)胞在體外接觸流感病毒血凝素時(shí)釋放Y干擾素。本領(lǐng)域已知測定外周血單核細(xì)胞的這類應(yīng)答的方法，包括ELISA、ELISPOT、流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)PCR。例如，參考文獻(xiàn)115報(bào)道了監(jiān)測針對(duì)破傷風(fēng)類毒素的抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，特別是Y干擾素應(yīng)答的一項(xiàng)研究，發(fā)現(xiàn)ELISPOT是區(qū)分抗原特異性TT誘導(dǎo)的應(yīng)答與自發(fā)性應(yīng)答的最靈敏的方法，但通過流式細(xì)胞術(shù)檢測胞漿內(nèi)細(xì)胞因子則是檢測再刺激作用的最有效方法。合適的細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑包括但不限于免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(含有通過磷酸鍵連接于鳥嘌呤的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)、或雙鏈RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。3-0-脫?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A('3dMPL'，也稱為'MPL頂')[116-119]。咪唑喹啉化合物，如咪喹莫特("R-837")[120，121]、瑞喹莫德("R-848")[122]、和它們的類似物；以及它們的鹽(如鹽酸鹽)。有關(guān)免疫剌激性咪唑喹啉的其它細(xì)節(jié)可參見參考文獻(xiàn)123-127?？s氨基硫脲化合物，如參考文獻(xiàn)128所述的化合物。參考文獻(xiàn)129中也描述了配制、制備和篩選活性化合物的方法?？s氨基硫脲在剌激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子如TNF-ct方面特別有效。色胺酮化合物，如參考文獻(xiàn)129所述的化合物。參考文獻(xiàn)129中也描述了配制、制備和篩選活性化合物的方法?？s氨基硫脲在剌激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子如TNF-a方面特別有效。核苷類似物，如(a)艾沙托立賓(Isatorabine)(ANA-245;7-硫雜-8-氧代鳥苷)及其前藥oo;(b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)參考文獻(xiàn)130-132所述的化合物；(f)具有下式的化合物式中Rj和R2各自獨(dú)立地是氫、鹵素、-NRaRb、-OH、C,-6烷氧基、取代的C"烷氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、Q.h)芳基、取代的C6-h)芳基、QV烷基、或取代的C^院基；R3不存在，或者是H、Cl6院基、取代的Cl6院基、Q.u)芳基、取代的C6-k)芳基、雜環(huán)基、或取代的雜環(huán)基；R4和Rs各自獨(dú)立地是氫、鹵素、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、-C(O)-Rd、d.6垸基、取代的Cl6院基、或結(jié)合在一起形成5元環(huán)，如R4-5:、2R4-5在^所示的化學(xué)鍵處實(shí)現(xiàn)結(jié)合，Xj和X2各自獨(dú)立地是N、C、O或S;R8是氫、鹵素、-OH、d.6垸基、C2-6烯基、C2.6炔基、-OH、-NRaRb、陽(CH2VO-Rc、-0-((:1.6垸基)、-SfCOpR^或-C(O)-Rd;R9是氫、Cl6院基、取代的C"垸基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基或R9a，其中R9a是:Rf°^_^R9a在_所示的化學(xué)鍵處實(shí)現(xiàn)結(jié)合，RH)和Ru各自獨(dú)立地是氫、鹵素、CL6垸氧基、取代的CL6烷氧基、-NRaRb、或-OH;Ra和Rb各自獨(dú)立地是氫、C,V烷基、取代的CL6烷基、-C(O)-Ra、C6-,。芳基；Rc各自獨(dú)立地是氫、磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、CL6烷基、或取代的C"6院基；Rd各自獨(dú)立地是氫、鹵素、Cw烷基、取代的Cw烷基、CL6垸氧基、取代的Qv烷氧基、-NH2、->^((:1-6垸基)、-NH(取代的CL6烷基)、->1((:1-6垸基)2、-N(取代的d.6烷基)2、Q.k)芳基、或雜環(huán)基；R^各自獨(dú)立地是氫、Cl6院基、取代的Cl6院基、Cw。芳基、取代的Cwo芳基、雜環(huán)基、或取代的雜環(huán)基；Rf各自獨(dú)立地是氫、cl6烷基、取代的Cl6院基、-C(O)-Rd、磷酸酯、二磷酸酯、或三磷酸酯基；n各自獨(dú)立地是0、1、2或3;p各自獨(dú)立地是0、l或2;或或者(g)(a)-(f)中任一項(xiàng)的藥學(xué)上可接受的鹽，(a)-(f)中任一項(xiàng)的互變異構(gòu)體，或互變異構(gòu)體的藥學(xué)上可接受的鹽。洛索立賓(7-烯丙基-8-氧代鳥苷)[133]。參考文獻(xiàn)134所述化合物，包括?；哙夯衔?、吲哚二酮化合物、四氫異喹啉(THIQ)化合物、苯并環(huán)二酮化合物、氨基氮雜乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[135,136]、水合酞酰胺(hydrapthalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、異噁唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[137]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡哇并嘧啶化合物、和吲哚化合物[138]。聚氧徵(polyoxidonium)聚合物[139,140]或其他N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。參考文獻(xiàn)141所述化合物。氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC-529[142，143]。CDld配體，如a-糖基神經(jīng)酰胺[144-151](例如a-半乳糖基神經(jīng)酰胺)、含植物鞘氨醇的a-糖基神經(jīng)酰胺、OCH、KRN7000[(2S，3S,4R)-l-0-(a-D-吡喃乳糖基)-2-(N-二十六烷基氨基)-l，3,4-十八烷三醇]、CRONY-101、3"-0-硫代-半乳糖基神經(jīng)酰胺，等等。磷腈，如參考文獻(xiàn)152和153中所述的聚[二(羧酸苯氧基)磷腈](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene]，"PCPP")。小分子免疫增強(qiáng)劑(SMIP)，例如N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺27N2-乙基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-戊基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺l-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫代]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙酸乙酯4-氨基-l-(2-甲基丙基)-l，3-二氫-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺l-(4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-基卜2-甲基丙-2-醇l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-基]-2-甲基丙-2-醇N4,N4-二節(jié)基-l-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉墨2,4-二胺。用于本發(fā)明的細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑可以是Toll樣受體(TLR)的調(diào)節(jié)劑和/或激動(dòng)劑。例如，它們可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中一種或多種的激動(dòng)劑。優(yōu)選試劑是TLR7激動(dòng)劑(如咪唑并喹啉)和域TLR9激動(dòng)劑(如CpG寡核苷酸)。這些試劑可用于激活先天性免疫途徑。可以在本發(fā)明組合物生產(chǎn)過程的各個(gè)階段加入細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑。例如，可將其加入抗原組合物中，然后將此混合物加入水包油乳液中?；蛘?，可將其加入水包油乳液中，在這種情況下可以在乳液組分乳化之前加入該試劑，或者可以在乳液乳化后加入該試劑。相似地，該試劑可以凝聚在乳液液滴中。細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑在最終組合物中的位置和分布將取決于其親水/親脂特性，例如該藥劑可位于水相、油相和/或油水界面上。該細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑可偶聯(lián)于另一種試劑，如抗原(如CRM197)。參考文獻(xiàn)154中提供了有關(guān)小分子偶聯(lián)技術(shù)的綜述?；蛘?，佐劑可與其它試劑非共價(jià)(例如通過疏水作用或離子相互作用)結(jié)合。兩種優(yōu)選的細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑是(a)免疫剌激性寡核苷酸和(b)3dMPL。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或(除RNA外)單鏈。參考文獻(xiàn)155、156和157公開了可能的類似取代，例如用2，-脫氧-7-脫氮鳥苷代替鳥苷。參考文獻(xiàn)158-163中進(jìn)一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可能導(dǎo)向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[164]。CpG序列可特異性誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，例如CpG-AODN(寡脫氧核糖核苷酸)，或更特異地誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，例如CpG-BODN。參考文獻(xiàn)165-167中討論了CpG-A和CpG-BODN。CpG優(yōu)選CpG-AODN。優(yōu)選構(gòu)建CpG寡核苷酸時(shí)使其5'端可為受體所識(shí)別。任選將兩個(gè)CpG寡核苷酸序列的3'端相連接形成"免疫聚體"。參見例如，參考文獻(xiàn)164和168-170。有用的CpG佐劑是CpG7909，也稱為ProMune(科雷制藥集團(tuán)公司(ColeyPharmaceuticalGroup,Inc.))。或者，或此外，除使用CpG序列外，也可使用TpG序列[171]。這些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可能富含嘧啶。例如，它可能含有一個(gè)以上連續(xù)的胸腺嘧啶核苷酸(例如，參考文獻(xiàn)171所公開的TTTT)，和/或它的核苷酸組成中可能含有>25%胸腺嘧啶(例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)。例如，它可能含有一個(gè)以上連續(xù)的胞嘧啶核苷酸(例如，參考文獻(xiàn)171所公開的CCCC)，和/或它的核苷酸組成中可能含有>25%胞嘧啶(例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)。這些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸一般含有至少20個(gè)核苷酸。它們可含有少于100個(gè)核苷酸。3dMPL(也稱為3脫-O-酰化單磷酰脂質(zhì)A或3-0-脫?；?4'-單磷酰脂質(zhì)A)是單磷酰脂質(zhì)A的還原性末端葡糖胺的3位脫?；淖魟?。3dMPL可由明尼蘇達(dá)沙門菌(5"http://0"6//"脂'""^oto)的無庚糖突變體制備，在化學(xué)上類似于脂質(zhì)A，但缺少酸-不穩(wěn)定性磷?；蛪A-不穩(wěn)定性?；Ｋ芗せ顔魏思?xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞，并刺激幾種細(xì)胞因子的釋放，包括IL-I、IL-12、TNF-a和GM-CSF(也參見參考文獻(xiàn)172)。參考文獻(xiàn)173最先描述了3dMPL的制備。3dMPL可以采取?；煌南嚓P(guān)分子(如具有3、4、5或6個(gè)?；湥鼈兊拈L度可以不同)的混合物的形式。兩個(gè)葡糖胺(也稱為2-脫氧-2-氨基-葡萄糖)單糖在其2-位(即2和2'位)碳上N-?；?，3'位上也有O-酰基化。連接于碳2的基團(tuán)具有下式-NH-CO-CHrC^R:連接于碳2'的基團(tuán)具有下式-NH-CO-CH2-CR2R2'。連接于碳3'的基團(tuán)具有下式-0-CO-CHrCR3R3'。代表性結(jié)構(gòu)為基團(tuán)R1、RZ和RS各自獨(dú)立地是-(CH2)n-CH3。n值優(yōu)選為8-16，更優(yōu)選為9-12，最優(yōu)選為10?；鶊F(tuán)R1,、R"和R3'各自獨(dú)立地是(a)-H;(b)-OH;或(c)-O-CO-R4，其中R4是-H或-(CH2)m-CH3，其中m值優(yōu)選為8-16，更優(yōu)選為10、12或14。在2位上，m優(yōu)選為14。在2'位上，m優(yōu)選為10。在3'位上，m優(yōu)選為12。基團(tuán)R、R"和RS'優(yōu)選為來自十二垸酸、十四垸酸或十六垸酸的-O-?；"、R"和W均為-H時(shí)，3dMPL僅含有3條?；?2、2'和3'位置上各有一條)。R"、R2'和R3'中僅有兩個(gè)是-H時(shí)，3dMPL可含有4條?；湣"、R2'和W中僅有一個(gè)是-H時(shí)，3dMPL可含有5條酰基鏈。W、W和W中沒有一個(gè)是-H時(shí)，3D-MPL可含有6條?；?。本發(fā)明所用的3dMPL佐劑可以是含有3-6條?；湹倪@些形式的混合物，但混合物中優(yōu)選包含具有6條?；湹?dMPL，具體說，保證6條酰基鏈的形式占3dMPL總重的至少10%，例如^20%、230%、240%、250%或更多。發(fā)現(xiàn)具有6條?；湹?dMPL是佐劑活性最高的形式。因此，本發(fā)明組合物包含的3dMPL的最優(yōu)選形式具有下式(IV)。以混合物的形式使用3dMPL時(shí)，提到3dMPL在本發(fā)明組合物中的含量或濃度，指混合物中的混合3dMPL物質(zhì)。在水性條件下，3dMPL可形成不同大小，如直徑〈150nm或〉500nm的膠束聚集體或顆粒。其中一種或兩者都可用于本發(fā)明，可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)選擇更好的顆粒。本發(fā)明優(yōu)選使用小顆粒(如小到足以產(chǎn)生澄清的3dMPL水懸液)，因?yàn)樗鼈兓钚愿遊174]。優(yōu)選顆粒的平均直徑小于220nm，更優(yōu)選小于200nm，小于150nm，或小于120nm，它們的直徑甚至可以小于100nm。然而在大多數(shù)情況下，平均直徑不小于50nm。這些顆粒足夠小，以便適合過濾除菌。可用揭示平均粒徑的常規(guī)技術(shù)動(dòng)態(tài)光散射評(píng)價(jià)粒徑。據(jù)稱顆粒的直徑為xnm時(shí)，粒徑通常分布在此平均值附近，但至少50數(shù)量％(例如^60%、270%、280%、290%或更多)顆粒的直徑在x士25M的范圍內(nèi)。3dMPL宜與水包油乳液聯(lián)合使用?；旧纤?dMPL均位于該乳液的水相中。3dMPL可以獨(dú)自使用，或者與一種或多種其它化合物聯(lián)用。例如，已知將3dMP與以下物質(zhì)聯(lián)用QS21皂苷[175](包含在水包油乳液中[176])、免疫刺激性寡核苷酸、QS21和免疫刺激性寡核苷酸、磷酸鋁[177]、氫氧化鋁[178]或磷酸鋁和氫氧化鋁。脂肪佐劑可用于本發(fā)明的脂肪佐劑包括上述水包油乳液，還包括例如式I、n或m的化合物或其鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>如參考文獻(xiàn)179所述，如'ER803058'、'ER803732'、'ER804053'、'ER804058'、'ER804059'、'ER804442'、'ER804680'、'ER804764'、'ER803022'或'ER804057'，如ER-803022:大腸桿菌CEsc/eWc/n'aco/0的脂質(zhì)A的衍生物如OM-174(如參考文獻(xiàn)180和181所述)。陽離子脂質(zhì)與(通常為中性講脂質(zhì)(co-lipid)的制劑，如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基-溴化丙銨-二植?；字?乙醇胺("VaxfectinTM")或氨基丙基-二甲基-雙十二烷基氧基-溴化丙銨-二油酰基磷脂酰-乙醇胺("GAP-DLRIE:DOPE")的制劑。優(yōu)選含有(士)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2,3-雙(順-9-四癸烯氧基)-1-丙銨鹽的制劑[182]。3-0-脫?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(見上)。，含有連接于含磷酸開環(huán)主鏈的脂質(zhì)的化合物，如TLR4拮抗劑E5564[183,184]:微赫可使用稱為氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是常規(guī)名稱，但僅為方便使用，因?yàn)樗鼈兌疾皇撬淼膶?shí)際化合物的準(zhǔn)確描述[例如參見參考文獻(xiàn)104的第9章]。本發(fā)明可采用通常用作佐劑的任何"氫氧化物"或"磷酸鹽"佐劑。稱為"氫氧化鋁"的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽(通常至少部分為晶體)?？刹捎眉t外(IR)光譜將式A10(0H)代表的羥基氧化鋁與其它鋁化合物，如氫氧化鋁A1(0H)3區(qū)別開，具體區(qū)別是1070cm'1處存在吸收條帶和3090-3100cm—1處存在強(qiáng)肩峰[參考文獻(xiàn)104的第9章]。半高時(shí)衍射條帶的寬度(WHH)反映出氫氧化鋁佐劑的結(jié)晶度，結(jié)晶差的顆粒由于結(jié)晶較小而譜線增寬較大。隨著WHH增加，表面積增大，觀察到WHH值較高的佐劑具有較大的抗原吸附能力。纖維形態(tài)(如透射電鏡照片中所見)是氫氧化鋁佐劑的典型形態(tài)。氫氧化鋁佐劑的pl一般約為ll，即該佐劑本身在生理pH下表面帶正電荷。據(jù)報(bào)道，pH7.4時(shí)氫氧化鋁佐劑的吸附容量為1.8-2.6毫克蛋白質(zhì)/毫克Al+++。稱為"磷酸鋁"的佐劑一般是羥基磷酸鋁，也常常含有少量硫酸鹽(即羥基磷酸硫酸鋁)。它們可通過沉淀獲得，沉淀期間的反應(yīng)條件和濃度都會(huì)影響該鹽中磷酸取代羥基的程度。羥基磷酸鹽的P04/A1摩爾比通常為0.3-1.2?？梢酝ㄟ^是否存在羥基將羥基磷酸鹽與嚴(yán)格的A1P04區(qū)別開。例如，3164cm"處的IR譜帶(例如加熱到20(TC)表明存在結(jié)構(gòu)羥基[參考文獻(xiàn)104的第9章]。磷酸鋁佐劑的？04/八13+摩爾比通常為0.3-1.2，優(yōu)選為0.8-1.2，更優(yōu)選為0.95±0.1。磷酸鋁通常是無定形的，尤其是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是PO4/Al摩爾比為0.84-0.92的無定形的羥基磷酸鋁，每毫升包含0.6mgA產(chǎn)。磷酸鋁通常是顆粒(如在透射電子顯微鏡照片上觀察到的板狀形態(tài))?？乖胶箢w粒直徑一般是0.5-2(^im(如約5-l(^m)。據(jù)報(bào)道，pH7.4時(shí)磷酸鋁佐劑的吸附容量為0.7-1.5毫克蛋白質(zhì)廣克八1+++。磷酸鋁的零電荷點(diǎn)(PZC)與磷酸對(duì)羥基的取代程度逆相關(guān)，這種取代程度可能取決于用于通過沉淀制備鹽的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度。也可通過改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(更多磷酸根=偏酸性PZC)或加入緩沖液如組氨酸緩沖液(使PZC偏堿性)來改變PZC。本發(fā)明所用的磷酸鋁的PZC通常為4.0-7.0，更優(yōu)選為5.0-6.5，例如約為5.7。用于制備本發(fā)明組合物的鋁鹽懸浮液可以，但不一定含有緩沖液(如磷酸鹽或組氨酸或Tris緩沖液)。該懸浮液優(yōu)選無菌且無熱原。該懸浮液可含有游離的水性磷酸根離子，如濃度為1.0-20mM，優(yōu)選5-15mM，更優(yōu)選約10mM的磷酸根離子。該懸浮液也可含有氯化鈉。本發(fā)明可使用氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物[65]。在這種情況下，磷酸鋁比氫氧化鋁多，例如重量比為至少2:1，例如^5:1、26:1、27:1、28:1、29:1等。給予患者的組合物中八1+++的濃度優(yōu)選小于10mg/ml，例如S5mg/ml、mg/ml、S3mg/ml、；2mg/ml、Slmg/ml等。優(yōu)選范圍是0.3-1mg/ml。最大值優(yōu)選為0.85毫克/劑量。除包含一種或多種鋁鹽佐劑外，佐劑組分還可包含一種或多種其它佐劑或免疫刺激劑。其它這類組分包括但不限于3-0-脫?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A佐劑('3d-MPL');和/或水包油乳液。3dMPL也稱為3脫-O-酰化單磷酰脂質(zhì)A或3-0-脫?；?4'-單磷酰脂質(zhì)A。該命名表明單磷酰脂質(zhì)A的還原性末端葡糖胺的3位脫酰化。它是由明尼蘇達(dá)沙門菌(S.m/"""oto)的無庚糖突變體(heptoselessmutant)制備，在化學(xué)上類似于脂質(zhì)A，但缺少酸-不穩(wěn)定性磷?；蛪A-不穩(wěn)定性?；?。它能激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞，并刺激釋放幾種細(xì)胞因子，包括IL-I、IL-12、TNF-a和GM-CSF。最初在參考文獻(xiàn)173中描述了3d-MPL的制備，該產(chǎn)品由考科薩公司(CorixaCorporation)生產(chǎn)并以商品名MPLtm出售。其它詳情可參見參考文獻(xiàn)116-119。藥激教合激本發(fā)明組合物優(yōu)選為藥學(xué)上可接受的組合物。除抗原外，它們通常還包含其它組分，例如它們一般包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。對(duì)這類組分的充分討論參見參考文獻(xiàn)185。該組合物通常是水性形式。該組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗優(yōu)選應(yīng)基本不含(即小于5pg/ml)汞物質(zhì)，如不含硫柳汞[11，186]。更優(yōu)選不含汞的疫苗。特別優(yōu)選不含防腐劑的疫苗。為了控制張力，優(yōu)選包含生理性鹽如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，它的濃度可以是l-20mg/ml。可以存在的其它鹽包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、二水合磷酸氫二鈉、氯化鎂、氯化鈣等。組合物的滲透壓通常為200-400mOsm/kg，優(yōu)選為240-360mOsm/kg，更優(yōu)選為290-310mOsm/kg。雖然以前報(bào)道過滲透壓對(duì)疫苗接種引起的疼痛無影響[187]，但優(yōu)選將滲透壓保持在此范圍內(nèi)。組合物可含有一種或多種緩沖劑。緩沖劑一般包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑；或檸檬酸鹽緩沖劑。包含的緩沖劑的濃度一般是5-20mM。緩沖劑可存在于乳劑水相中。組合物的pH通常為5.0-8.1，更一般為6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本發(fā)明方法可包括在包裝前調(diào)整原料疫苗pH的步驟。該組合物優(yōu)選無菌。該組合物優(yōu)選無熱原，如每劑量含量〈EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)，優(yōu)選每劑量O.IEU。該組合物優(yōu)選不含谷蛋白。疫苗中可包含痕量的殘余組分，如抗生素(例如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。該組合物可含有一次免疫的物質(zhì)，或者可含有多次免疫的物質(zhì)(即'多劑量'組合物)。采用多劑量方式時(shí)優(yōu)選含有防腐劑。作為多劑量組合物中包含防腐劑的替代方案(或除此之外)，該組合物可包裝具有在用于取出物質(zhì)的無菌接頭的容器中。流感疫苗的典型給藥體積約為0.5ml，但也可將一半劑量(即約0.25ml)給予兒童，并相應(yīng)地選擇單位劑量，如將0.5ml的單位劑量給予患者。資合欽或^^^邀分游包麥本發(fā)明的方法可包括將疫苗置入容器內(nèi)、尤其是置入銷售容器以供醫(yī)師使用的步驟。裝入這種容器之后，該容器無需冷藏。適用于該疫苗的容器包括藥瓶、鼻噴霧和一次性注射器等，這些容器應(yīng)無菌。組合物/組分位于藥瓶中時(shí)，該藥瓶優(yōu)選由玻璃或塑料材料制成。在將組合物加入藥瓶之前，優(yōu)選對(duì)其進(jìn)行消毒。為了避免膠乳敏感型患者的問題，優(yōu)選用無膠乳的塞子密封藥瓶，優(yōu)選所有包裝材料中不含膠乳。藥瓶可包括單一劑量的疫苗，或者可以包括一個(gè)以上劑量('多劑量'藥瓶)，如10個(gè)劑量。優(yōu)選的藥瓶由無色玻璃制成。藥瓶可以有適合的帽(如路厄鎖)，以便將預(yù)填裝注射器插入該帽，將注射器的內(nèi)容物推入藥瓶(如在其中重建凍干物質(zhì))，并將藥瓶的內(nèi)容物吸回注射器中。從藥瓶中拔出注射器后，可連上針頭，并將該組合物給予患者。該帽優(yōu)選位于封口或蓋子內(nèi)側(cè)，以便在封口或蓋子打開后才能接觸到該帽。藥瓶，特別是多劑量藥瓶裝有瓶帽，以便無菌地取出其內(nèi)含物。某組分包裝在注射器中時(shí)，該注射器可連有針頭。如果未連接針頭，可隨注射器提供單獨(dú)的針頭以便組裝和使用。這種針頭可裝在護(hù)罩中。優(yōu)選安全性針頭。一般是1-英寸23-號(hào)、1-英寸25-號(hào)和5/8-英寸25-號(hào)針頭?？商峁┯袆冸x標(biāo)簽的注射器，該標(biāo)簽上可打印上批號(hào)、流感季節(jié)和過期日期，以幫助記錄保存。注射器的活塞優(yōu)選帶有抑止裝置，以防止活塞在吸出時(shí)偶然脫出。注射器可以有膠乳橡膠帽和/或活塞。一次性注射器含有單一劑量的疫苗。注射器通常帶有頂帽，以在連接針頭前密封頂端，頂帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如果注射器和針頭分開包裝，那么針頭優(yōu)選裝有丁基橡膠護(hù)罩。優(yōu)選的注射器是以商品名"Tip-Lok"TM銷售的注射器。容器可標(biāo)注有半劑量體積，以便遞送給兒童。例如，含有0.5ml劑量的注射器可標(biāo)有0.25ml體積的標(biāo)記。采用玻璃容器(如注射器或藥瓶)時(shí)，優(yōu)選采用由硼硅酸鹽玻璃，而非鈉鈣玻璃制成的容器?？蓪⑺幒谢蚪M合物與單頁宣傳品包裝在一起(在同一個(gè)箱子中)，所述單頁宣傳品包括疫苗的詳細(xì)情況如給藥說明書、疫苗內(nèi)所含抗原的詳情等。說明書也可包含警告，(例如)準(zhǔn)備好腎上腺素溶液以應(yīng)對(duì)疫苗接種后發(fā)生過敏反應(yīng)的情況等。浙方法滅難繪秀本發(fā)明組合物適合給予人類患者，本發(fā)明提供了在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將本發(fā)明組合物給予患者的步驟。本發(fā)明也提供用作藥物的本發(fā)明藥盒或組合物。這些方法和應(yīng)用引發(fā)的免疫應(yīng)答通常包括抗體應(yīng)答，優(yōu)選保護(hù)性抗體應(yīng)答。評(píng)價(jià)接種流感病毒疫苗后抗體應(yīng)答、中和能力和保護(hù)作用的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。人體研究表明，對(duì)人流感病毒血凝素的抗體效價(jià)與保護(hù)作用相關(guān)聯(lián)(約30-40的血清樣品血凝反應(yīng)-抑制效價(jià)對(duì)同源病毒感染產(chǎn)生約50%保護(hù)作用)[18S]。一般通過血凝反應(yīng)抑制、微量中和、單徑向免疫擴(kuò)散和/或單徑向溶血(SRH)來測定抗體應(yīng)答。本領(lǐng)域熟知這些測定技術(shù)。可以各種方式給予本發(fā)明組合物。最優(yōu)選的免疫途徑是肌內(nèi)注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)[189-191]、口服[192]、皮內(nèi)[193,194]、經(jīng)皮、透皮[195]等?？刹捎冒凑毡景l(fā)明制備的疫苗來治療兒童和成年人。目前，推薦將流感疫苗用于年齡>6個(gè)月的兒童和成年人免疫。因此，患者可以小于l歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接受該疫苗的優(yōu)選患者是老年人(例如SO歲、260歲，優(yōu)選^65歲)、年輕人(如2歲)、住院患者、健康護(hù)理工作人員、軍隊(duì)服務(wù)人員和軍人、妊娠婦女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者、在接受該疫苗前7天接受過抗病毒化合物(如奧塞米韋或扎那米韋化合物；見下)的患者、對(duì)雞蛋過敏的人和出國旅行者。然而，該疫苗不只適用于這些人群，還可以在更廣泛的人群中使用。就大流行毒株而言，優(yōu)選給予所有年齡的人。本發(fā)明優(yōu)選組合物滿足CPMP的功效標(biāo)準(zhǔn)1、2或3。在成年人(18-60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是(1)^70%血清保護(hù)；(2)^40%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT增加22.5倍。在老年人(>60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是(1)^60%血清保護(hù)；(2)^30%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT增加^2倍。這些標(biāo)準(zhǔn)基于至少50位患者的標(biāo)簽公開研究?？梢酝ㄟ^單劑量方案或多劑量方案進(jìn)行治療。多劑量可用于初免方案和/或加強(qiáng)免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同途徑給予各種劑量，例如初免采用胃腸外途徑而加強(qiáng)免疫采用粘膜途徑，等等。給予一個(gè)以上劑量(一般是兩個(gè)劑量)特別可用于免疫未曾免疫接觸的患者，例如從未接受過流感疫苗的人，或者用于免疫對(duì)抗新的HA亞型(如大流行爆發(fā)中的亞型)。多劑量的給予一般至少間隔1周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約10周、約12周、約16周等)?？蓪⒈景l(fā)明產(chǎn)生的疫苗與其它疫苗基本上同時(shí)給予患者(在對(duì)健康護(hù)理專業(yè)人員或疫苗接種中心的同一次用藥咨詢或訪問期間)，例如與麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶聯(lián)的乙型流感嗜血桿菌疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗(如四價(jià)A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶聯(lián)疫苗等同時(shí)給藥。相似地，可將本發(fā)明疫苗與抗病毒化合物，具體是對(duì)流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奧塞米韋和/或扎那米韋)基本上同時(shí)給予患者(在對(duì)健康護(hù)理專業(yè)人員的同一次用藥咨詢或訪問期間)。這些抗病毒化合物包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑，如(3R,4R，5S)-4-乙?；被?5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-環(huán)己烯-l-羧酸或5-(乙?；被?-4-[(氨基亞氨基甲基)-氨基]-2,6-脫水-3,4，5-三脫氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括它們的酯(如乙酯)和鹽(如磷酸鹽)。優(yōu)選的抗病毒化合物是(3R，4R，5S)-4-乙?；被?5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-環(huán)己烯-l-羧酸的乙酯禾口磷酸鹽(l:l)，也稱為磷酸奧塞米韋(TAMIFLUTM)。撒述術(shù)語"含有"包括"包含"以及"由......組成"，例如"含有"X的組合物排他性地由X組成或者可包含其他物質(zhì)，例如X+Y。術(shù)語"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的組合物可能完全不含Y。必要時(shí)，可從本發(fā)明定義中刪去術(shù)語"基本上"。與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語"約"表示，例如xil(P/。。除非另有說明，包括混合兩種或多種組分的步驟的方法不要求任何特定的混合順序。因此，可以任何順序混合這些組分。有三種組分時(shí)，兩種組分可以相互混合，然后將混合的組分再與第三種組分混合，等等。將動(dòng)物(特別是牛)材料用于培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，它們應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀腦病(TSE)，特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來源?？傊?，優(yōu)選在完全不含動(dòng)物來源物質(zhì)的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)某化合物作為組合物的一部分給予人體時(shí)，該化合物可選地由合適的前藥所替換。當(dāng)使用細(xì)胞底物進(jìn)行病毒再造或逆向遺傳學(xué)方法時(shí)，優(yōu)選批準(zhǔn)用于人類疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞底物，例如歐洲藥典總綱5么3所述的細(xì)胞底物。優(yōu)選通過MPSRCH程序(牛津分子科技公司(OxfordMolecular))執(zhí)行的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索測定多肽序列之間的相同性，其中參數(shù)為缺口開放罰分=12、缺口延伸罰分=1。附圖簡述圖l-7顯示了隨時(shí)間(2-8'C的月數(shù)；37'C的天數(shù))測得的以下樣品的HA水(嗎/mL):_甲型流感乙型流感溫度(°c)圖NewCaledoniaPanamaGuangdongShangdong1X2-82X2-83X374X375XXX2-86XXX2-87XXX37圖8將23-27°。時(shí)B/Jiangsu的HA含量0ig/ml)外推到80周。數(shù)據(jù)采用獨(dú)立或均一(homogeneous)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，該圖顯示的回歸線采取95%置信限。將乙型流感病毒的數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)2的數(shù)據(jù)比較顯示，本發(fā)明的材料具有較長保存期。本發(fā)明的實(shí)施方式各種流感病毒株在MDCK細(xì)胞底物上培養(yǎng)[30]:A/Panama(H3N2);A/NewCaledonia(H1N1);A/Wyoming(H3N2);A/Wellington(H3N2);B/Shangdong;B/Guangdong;和B/Jiangsu。各毒株單獨(dú)培養(yǎng)，并單獨(dú)制備單價(jià)抗原原料。選擇并混合毒株以得到供臨床使用的最終的三價(jià)產(chǎn)品。最終產(chǎn)品中包含吐溫80(聚山梨酯80)去污劑(<25pg/gHA)且不含汞。還存在裂解病毒時(shí)殘余的CTAB。單價(jià)原料和最終的三價(jià)產(chǎn)品在冷藏條件(2-8t:)或非冷藏條件(23-27t:)下儲(chǔ)存，并通過SRID測定各時(shí)間點(diǎn)的HA含量。各單價(jià)原料的HA濃度是不同的，但在最終的三價(jià)材料中，規(guī)定的起始HA水平(0時(shí)刻)為15pg/毒株/劑，即30pg/ml/毒株。圖l-7顯示了當(dāng)在不同溫度儲(chǔ)存時(shí)，隨時(shí)間測得的各種單價(jià)或三價(jià)材料的HA水平的例子。圖1-7中的疫苗在2-8'C儲(chǔ)存12個(gè)月以及在37'C儲(chǔ)存4周顯示出極好的穩(wěn)定性。此外，對(duì)于所有批次，包括未顯示數(shù)據(jù)的批次，在各個(gè)測量時(shí)間點(diǎn)上都達(dá)到穩(wěn)定性要求，沒有批次無法滿足穩(wěn)定性規(guī)定。因此，所有單價(jià)原料都可在2-8°0儲(chǔ)存12個(gè)月，或在37。C儲(chǔ)存4周，最終的三價(jià)產(chǎn)品亦是如此。但在2-8'C儲(chǔ)存時(shí)，數(shù)據(jù)提示儲(chǔ)存期為39個(gè)月。下表顯示了在23-27t:儲(chǔ)存最長達(dá)15個(gè)月的各種單價(jià)疫苗產(chǎn)品的HA水不存在HA水平低于起始濃度80%的情況<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>基于隨時(shí)間測得的HA水平，可以將HA水平外推。這樣可得到預(yù)計(jì)儲(chǔ)存期，即HA濃度下降至24pg/ml以下、或起始量80%以下的時(shí)間。下表中給出了各種臨床三價(jià)材料的預(yù)計(jì)儲(chǔ)存期，表示為在2-8。C儲(chǔ)存的月數(shù)。各種毒株為<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>對(duì)于所有臨床材料，預(yù)計(jì)儲(chǔ)存期至少為15個(gè)月。預(yù)計(jì)臨床前毒性檢測所用材料的儲(chǔ)存期也是15個(gè)月。將HA數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)2的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較以得到HA降解速率和預(yù)計(jì)儲(chǔ)存期。然而，由于流感季節(jié)的改變，所有情況下都不可能進(jìn)行直接的毒株-毒株比較。圖8顯示了參考文獻(xiàn)2的研究和本發(fā)明之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較的一個(gè)例子。當(dāng)在23-27"C儲(chǔ)存時(shí)，參考文獻(xiàn)2的數(shù)據(jù)顯示HA的降解率在11.37pg/ml/年和33.71pg/ml/年之間。相反，測試疫苗顯示出的HA降解率低得多在1.71pg/ml/年和4.52pg/ml/年之間。尤其對(duì)于A/NewCaledonia毒株，參考文獻(xiàn)2中觀察到的速率為11.37pg/ml/年，而測試疫苗中觀察到的速率為2.67ng/ml/年。在4'C儲(chǔ)存時(shí)疫苗的降解速率也較低。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>該數(shù)據(jù)標(biāo)明，即便在23-27。C儲(chǔ)存，三價(jià)混合物的儲(chǔ)存期也長達(dá)15個(gè)月，遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于參考文獻(xiàn)2中建議的儲(chǔ)存期。在4'C儲(chǔ)存時(shí)，儲(chǔ)存期可長達(dá)42-45個(gè)月。即便將三價(jià)疫苗儲(chǔ)存于40°C，預(yù)計(jì)B/Jiangsu組分的儲(chǔ)存期也約為6個(gè)月。在較低儲(chǔ)存溫度(25'C)下，儲(chǔ)存期可延長至至少9個(gè)月，有可能為18個(gè)月或更長。與參考文獻(xiàn)2相比，穩(wěn)定性提高的可能原因包括(i)本發(fā)明的疫苗是從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物而不是從雞蛋制備的，參考文獻(xiàn)2中看到的降解可能是由于殘余的雞蛋衍生組分(如酶類，例如蛋白酶類和/或糖苷酶類)和/或由于糖基化作用的差異；或(ii)本發(fā)明疫苗中存在高水平的吐溫80，它可以穩(wěn)定HA。應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，可在本發(fā)明的范圍和構(gòu)思內(nèi)進(jìn)行<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>[43[44[45[46[47[48[49WO01/21152.[89]WO02/072012.Signorelli和Hadden(2003)/"〃附m朋op/anwaco/3(8):1177-86.[91]WO2004/064715.Cooper(1995)P/z頻跑ec/mo/6:559-80.WO2005層837.美國專利6,692,468.WO00/07647.WO99/17820.美國專利5,971,953.美國專利4,060,082.EP-A-0520618.WO98/01174.WO90/14837.Podda和DelGiudice(2003)五;c/eWievFacc/wes2:197-203.[103]Podda(2001)7固力e19:2673-2680,Facc/"e趟wawW.-/Ve戸ra"owMeAocfeAesearc//Votoco&凍薪乾抓劍吝方法浙研J^^^)(分f皮學(xué)^"法(MeAo^/"A/o/ecw/arMe力W"^系列叢書的第42巻)，ISBN:1-59259-083-7，O'Hagan編Allison和Byars(1992)/www"o/143:519-25.Hariharan等(1995)Ca"cer7^55:3486-9.WO95/11700.美國專利6,080,725.WO2006A13373.WO2005/097181.Han等(2005)/附pa"o/FiYamZw五o"/附wwweFwwcriow/"/fecriowjD/seoses/"f/ze爿ge浙楚主素￡il/老牟乂:^iS"勸激浙傳染^^游嚴(yán)〃場，A^r"/o",/附ww"e/wwc"oraWeaW/五woCo"/emjce卩欲浙,養(yǎng)、免資勸激浙If犬會(huì)人巴黎，2005年6月9-10日.[113]US-6630161.Hayden等(1998)JCZ/w/"veW101(3):643陽9.[115]Tassignon等(2005)J/附twm"o/Af"/z305:188-98.Myers等(1990)CW/w/ar附o/ecw/woxpec"o/"o"/ora(7^^^^^Zl^^y應(yīng)莉分f方蹄第145-156頁.Ulrich(2000)參考文獻(xiàn)105的第16章(第273-282頁).Johnson等(1999)JAfeafC/jew42:4640-9.Baldrick等(2002)Wegw/a,0/^rcw'co/尸/arwaco/35:398-413.US4,680,338.US4,988,815.W092/15582.Stanley(2002)C〃"~￡固她/27:571-577.Wu等(2004)爿""wra/64(2):79-83.Vasilakos等(2000)Ce〃細(xì)ww"o/.204(1):64-74.美國專利4689338,4929624,5238944，5266575，5268376,5346905，5352784,5389640,5395937,5482936,5494916，5525612,6083505,6440992，6627640，6656938,6660735，6660747,6664260,6664264,6664265,6667312，6670372，6677347,6677348，6677349,6683088,6703402,6743920，6800624，6809203，6888000和6924293.Thompson等(2005)JZewfoc所o/78:'Thelow-toxicityversionsofLPS,MPLadjuvantandRC529,areefficientadjuvantsforCD4+Tcells'(LPS、MPL⑧佐劑和RC529的低毒變體是CD4+T細(xì)胞的有效佐劑).英國專利申請(qǐng)GB-A-2220211.WO94/21292.WO95/17210.W096/26741.WO03/011223,Meraldi等(2003)Fbcc/"e21:2485-2491.[181]Pajak等(2003)racc/"e21:836-842.[182]US-6586409.Wong等(2003)JC7!'"尸/KWW。co/43(7):735-42[184]US2005/0215517.Gennaro(2000)腸/"g亂'7TzeSWece"Prac"ce。/泡畫c;vf,剪頓藥激辨學(xué)浙實(shí)錄.第20版，ISBN:0683306472.Banzhoff(2000)/附/ww"o/ogyl欲era71:91-96.Nony等(2001)J^zcd"e27:3645-51.Potter和Oxford(1979)份Mec5w〃35:69—75.Greenbaum等(2004)Facdwe22:2566-77.Zurbriggen等(2003)iev2:295-304.Piascik(2003)尸/z畫hoc(WaWZ)C」.43:728-30.Mann等(2004)F。cc!'"e22:2425-9.Halperin等(1979)■/A/Mc//ea她69:1247-50.Chen等(2003)F麵"e21:2830-6.權(quán)利要求1.一種儲(chǔ)存水性流感疫苗的方法，包括將疫苗在10℃以上儲(chǔ)存超過10周的步驟。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述疫苗是原料疫苗。3.如權(quán)利要求2所述的方法，還包括從原料中提取單位劑量疫苗并將該單位劑量置入容器內(nèi)的步驟。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述疫苗是包裝的疫苗。5.—種銷售多份包裝的水性流感疫苗的方法，包括在非冷藏條件下將疫苗從第一地點(diǎn)運(yùn)輸?shù)降诙攸c(diǎn)的步驟。6.—種銷售原料水性流感疫苗的方法，包括在非冷藏條件下將疫苗從第一地點(diǎn)移動(dòng)到第二地點(diǎn)的步驟。7.如權(quán)利要求6所述的方法，還包括從原料中提取單位劑量疫苗并將該單位劑量置于容器內(nèi)的步驟。8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述原料是單價(jià)原料。9.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述原料是多價(jià)原料。10.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述第一和第二地點(diǎn)相隔1公里以上。11.一種銷售多份包裝的水性流感疫苗的方法，包括將疫苗從第一地點(diǎn)運(yùn)輸?shù)降诙攸c(diǎn)的步驟，且其中所述疫苗在非冷藏條件下在所述第二地點(diǎn)儲(chǔ)存至少100小時(shí)。12.—種從疫苗原料制備包裝的水性疫苗的方法，包括在非冷藏條件下從原料中取出單位劑量的疫苗并置于容器內(nèi)的步驟。13.—種稀釋濃縮的流感抗原原料的方法，包括在非冷藏條件下用水性介質(zhì)稀釋濃縮原料的步驟。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述原料是單價(jià)原料。15.如權(quán)利要求14所述的方法，還包括將所述稀釋的抗原與一種或多種其他流感病毒株的抗原混合的步驟，從而提供多價(jià)組合物。16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述原料是多價(jià)原料。17.—種制備多價(jià)流感疫苗的方法，包括在非冷藏條件下將包含第一流感病毒株抗原的水性制劑與包含第二流感病毒株抗原的水性制劑混合的步驟。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，將三種毒株的抗原混合以得到三價(jià)流感疫苗。19.一種將包含流感病毒的組合物滅活的方法，其特征在于，該方法包括在非冷藏條件下將所述組合物與滅活劑混合的步驟。20.—種制備含佐劑的流感病毒疫苗的方法，包括在非冷藏條件下將流感病毒抗原與佐劑混合的步驟。21.—種通過上述任一權(quán)利要求所述方法可獲得的或者獲得的疫苗。22.—種藥盒，其中裝有(a)含有至少一種流感病毒株的血凝素的水性疫苗，和(b)標(biāo)明該疫苗可以(i)在非冷藏條件下儲(chǔ)存和/或(ii)在室溫儲(chǔ)存的書面材料。23.—種已經(jīng)在非冷藏條件下儲(chǔ)存至少IOO小時(shí)的水性流感病毒疫苗，前提是，該疫苗不是(i)包含毒株A/Panama/2007/99RESVIR-17再造株和A/NewCaledonia/20/99IVR-116再造株和B/Yamanashi/166/98的三價(jià)疫苗；(ii)包含毒株A/Panama/2007/99RESVIR-17再造株和A/NewCaledonia/20/99IVR-116再造株和B/Guangdong/120/00的三價(jià)疫苗；或(iii)包含毒株A/Panama/2007/99RESVIR-17再造株和A/NewCaledonia/20/99IVR-116再造株和B/Shangdong/7/97的三價(jià)疫苗。24.—種已經(jīng)在非冷藏條件下儲(chǔ)存至少IOO小時(shí)的水性流感病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗是從生長在細(xì)胞培養(yǎng)物中的流感病毒制備的。25.—種已經(jīng)在非冷藏條件下儲(chǔ)存至少IOO小時(shí)的水性流感病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗不含雞DNA、卵清蛋白和卵類黏蛋白。26.—種已經(jīng)在非冷藏條件下儲(chǔ)存至少IOO小時(shí)的水性流感病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗不含汞。27.—種已經(jīng)在非冷藏條件下儲(chǔ)存至少IOO小時(shí)的水性流感病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗是裂解病毒顆粒疫苗、完整的病毒顆粒疫苗、活病毒疫苗或病毒體疫苗。28.—種含有至少一種流感病毒株的血凝素的水性疫苗，其特征在于，當(dāng)所述疫苗在25。C儲(chǔ)存時(shí)，血凝素的降解速率低于33%/年/毒株。29.流感病毒抗原在制造由執(zhí)業(yè)醫(yī)師給予患者的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物在藥物制造和被執(zhí)業(yè)醫(yī)師收到之間無需冷藏。30.流感病毒抗原在制造由執(zhí)業(yè)醫(yī)師給予患者的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物在被執(zhí)業(yè)醫(yī)師收到和給予患者之間無需冷藏。31.—種將流感病毒疫苗給予患者的方法，其特征在于，在給藥前24小時(shí)內(nèi)，該疫苗已在非冷藏條件下儲(chǔ)存至少12小時(shí)。32.—種將流感病毒疫苗給予患者的方法，其特征在于，該疫苗在非冷藏條件下儲(chǔ)存至少12小時(shí)后再給予患者。33.如上述任一權(quán)利要求所述的方法、疫苗或應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗從生長在細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒制備。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)物在選自下組的細(xì)胞系上MDCK;CHO;293T;BHK;Vero;MRC-5;PER.C6;或WI-38。35.如上述任一權(quán)利要求所述的方法、疫苗或應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗包含去污劑。36.如上述任一權(quán)利要求所述的方法、疫苗或應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗從滅活病毒制備。37.如權(quán)利要求36所述的方法、疫苗或應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗從裂解病毒制備。38.如權(quán)利要求36所述的方法、疫苗或應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗是純化的表面糖蛋白疫苗。39.如上述任一權(quán)利要求所述的方法、疫苗或應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗能抵抗HA亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16中的一種或多種。40.如上述任一權(quán)利要求所述的方法、疫苗或應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗包含佐劑。全文摘要來自個(gè)體流感病毒株的抗原在組合以制造多價(jià)流感病毒疫苗之前無需冷藏。此外，流感疫苗在包裝和給藥之間無需冷藏。因此，對(duì)冷藏的需求被最小化，且在疫苗制造和給藥之間無需維持冷鏈。文檔編號(hào)A61K39/145GK101448523SQ200780017932公開日2009年6月3日申請(qǐng)日期2007年3月23日優(yōu)先權(quán)日2006年3月24日發(fā)明者H·舍弗茲克申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷有限兩合公司