專利名稱：用于季節(jié)性和大流行保護(hù)的聯(lián)合流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于對(duì)抗流感病毒感染的疫苗領(lǐng)域，尤其是包含來自當(dāng)前季節(jié)性毒株和大流行毒株的抗原的疫苗。
背景技術(shù)：
本發(fā)明流感疫苗接種方案針對(duì)季節(jié)性毒株或大流行毒株。目前，季節(jié)性疫苗一般包含來自兩種甲型流感毒株(Hmi和H3N》和一種乙型流感毒株的抗原。本發(fā)明大流行疫苗針對(duì)H5m甲型流感病毒株。參考文獻(xiàn)1中公開了引起對(duì)季節(jié)性和大流行毒株產(chǎn)生免疫的疫苗。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供制備可引起對(duì)季節(jié)性和大流行毒株免疫的疫苗的深入和改良的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種藥盒，其裝有(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自大流行毒株例如H5毒株，如H5W毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述第一容器中H1N1、H3N2和B抗原的濃度范圍各自是25-35 μ g/ml，例如約 3(^8/!111(通常質(zhì)量比例是1 1 1)。所述第二容器中大流行抗原的理想濃度范圍是 5-20 μ g/ml，例如約15 μ g/ml。如通常用于滅活流感疫苗那樣，這些抗原濃度以流感病毒血凝素表示。與在制造過程中制成4價(jià)疫苗相比，在一個(gè)藥盒內(nèi)分開保存大流行疫苗和季節(jié)性疫苗使得更易于改動(dòng)最終疫苗的毒株特征。因?yàn)榇罅餍胁《镜亩局曜兓?，這點(diǎn)尤其重要。本發(fā)明還提供一種藥盒，其裝有(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自大流行毒株例如H5毒株，如H5W毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述第二容器中大流行抗原的濃度范圍是5-20μ g/ml，例如約15μ g/ml。本發(fā)明還提供一種藥盒，其裝有(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自大流行毒株例如H5毒株，如H5W毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述第一和第二容器中水性疫苗的體積基本相同，各自范圍是約0. 4-0. 6ml, 如約0. 5ml。本發(fā)明還提供一種藥盒，其裝有(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自大流行毒株例如H5毒株，如H5W毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述第一容器中水性疫苗的體積基本是所述第二容器中水性疫苗的兩倍。本發(fā)明還提供一種藥盒，其裝有(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自大流行毒株例如H5毒株，如H5W毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述各容器是硼硅玻璃小瓶。每一小瓶可包含一次或多次(例如10次)給藥的材料。所述小瓶可配有丁基橡膠制成的瓶塞。本發(fā)明還提供一種藥盒，其裝有(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自H5W甲型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述 H5N1甲型流感病毒株屬于進(jìn)化支1、2或者4。本發(fā)明還提供一種藥盒，其裝有(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii) 第二容器，其中裝有含有來自H5W甲型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述H5W毒株選自下組，或者具有引發(fā)與選自下組的毒株的血凝素交叉反應(yīng)的抗血凝素抗體的血凝素A/Vietnam/1203/2004、A/Vietnam/1194/2004、A/ 鴨 /Hunan/795/2002、 A/Indonesia/5/2005, A/ 天鵝 /Mongolia/244/2005、A/ 雞 /lndia/NIV33487/2006、A/ Anhui/1/2005、A/ 斑頭雁 /Quighai/lA/2005、A/ 暗綠繡眼鳥(Japanese white eye) / Hong Kong/1038/2006、A/ 火雞 /Turkey/1/2005、A/ 鵝 /Guiyang/337/2006、A/ 鴨 / Laos/3295/2006、A/Cambodia/R0405050/2007 和 A/ 喜鵲 /Hong Kong/5052/2007。在一些實(shí)施方式中，所述第一容器包含佐劑，但是所述第二容器沒有佐劑。在其它實(shí)施方式中，所述第一容器包含佐劑并且所述第二容器也包含佐劑。在其它實(shí)施方式中，所述第一容器沒有佐劑，但是所述第二容器包含佐劑。在其它實(shí)施方式中，所述第一和第二容器不含佐劑，但是所述藥盒中裝有含有水包油乳液佐劑但不含抗原的第三容器。在其它實(shí)施方式中，所述第一和第二容器不含佐劑，但是所述藥盒中裝有含有水包油乳液佐劑和非流感抗原的第三容器。合適的佐劑詳述如下。使用這些藥盒時(shí)，所述容器中的內(nèi)容物可在使用時(shí)混合，然后作為組合疫苗方便給予病人?？梢匀魏雾樞蚧旌线@些內(nèi)容物。例如，當(dāng)容器為小瓶時(shí)，可以通過針頭將所述第二容器中的內(nèi)容物抽到注射器中，然后注入所述第一容器中?；旌虾?，將混合的內(nèi)容物抽到注射器中(與之前的相同或不同)。抽取的針頭可直接用于注射，或丟棄并利用適合注射 (例如IM注射)的針頭替換。本發(fā)明還提供一種藥盒，其裝有(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、大流行甲型流感病毒株(例如H5毒株，如H5N1)和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有水包油乳液佐劑。本發(fā)明提供一種藥盒，其裝有(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的凍干滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自大流行毒株例如H5毒株，如H5W的抗原。所述第二容器最好包括水包油乳液。本發(fā)明提供一種藥盒，其裝有(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、大流行甲型流感病毒株(例如H5毒株，如H5N1)和乙型流感病毒株的抗原的凍干滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有水包油乳液佐劑。本發(fā)明還提供包含多個(gè)分離室的注射器，其中(i)第一室，其中裝有含有來自 HlNl甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二室，其中裝有含有來自大流行毒株例如H5毒株，如H5W的抗原的水性滅活流感疫苗。因此兩種水性組分可互相分離地裝在同一注射器中，當(dāng)推動(dòng)時(shí)，導(dǎo)致組分混合。 在一些實(shí)施方式中，所述第一室包含佐劑。在其它實(shí)施方式中，所述第二室包含佐劑。在其它實(shí)施方式中，第三小室包含佐劑。多室注射器是已知的，例如可參見參考文獻(xiàn)2-9等。疫苗制備目前可以獲得各種形式的流感病毒疫苗，疫苗通?；诨畈《净驕缁畈《?。滅活疫苗可基于全病毒顆粒、裂解病毒顆粒或基于純化的表面抗原。流感抗原也可以病毒體形式出現(xiàn)。本發(fā)明可與這些疫苗類型結(jié)合使用，但通常與滅活疫苗結(jié)合使用。采用滅活病毒時(shí)，該疫苗可包含完整的病毒顆粒、裂解病毒顆?；蚣兓谋砻婵乖?包括血凝素，通常也包括神經(jīng)氨酸酶)。滅活病毒的化學(xué)方法包括用有效量的以下一種或多種物質(zhì)處理去污劑、甲醛、丙內(nèi)酯、亞甲基藍(lán)、亞甲藍(lán)、補(bǔ)骨脂素、羧基富勒烯 (C60)、二元乙胺、乙酰基乙烯亞胺或它們的組合。本領(lǐng)域已知病毒滅活的非化學(xué)方法，例如 UV射線或Y射線輻射?？赏ㄟ^各種方法由含病毒液體收獲病毒顆粒。例如，純化方法可包括用線性蔗糖梯度溶液(含有去污劑以破壞病毒顆粒)進(jìn)行區(qū)帶離心。任選稀釋后，可通過滲濾純化抗原。用去污劑(如乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、三正丁基磷酸鹽、曲通Χ-100、 曲通Ν101、溴化十六烷基三甲銨、特吉托ΝΡ9等)處理純化的病毒顆粒以獲得裂解病毒顆粒，從而產(chǎn)生亞病毒顆粒制劑，包括'吐溫-醚'裂解方法。裂解流感病毒的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如參見參考文獻(xiàn)10-15等。一般使用破壞濃度的裂解劑破壞或片段化完整病毒來裂解病毒，無論該病毒有無感染性。這種破壞導(dǎo)致病毒蛋白的完全或部分溶解，改變病毒的完整性。優(yōu)選的裂解劑是非離子型和離子型(例如陽離子型)表面活性劑，如烷基糖苷、烷基硫苷、?；?、磺基甜菜堿、甜菜堿、聚氧乙烯烷基醚、N, N-二烷基-葡糖酰胺、 Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季銨化合物、肌氨酰、CTAB (溴化十四烷基三甲銨)、 三正丁基磷酸酯、塞塔隆(Cetavlon)、十四烷基三甲銨鹽、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑 (Iipofectamine)和D0T-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性劑，如曲通 X-100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂解方法利用脫氧膽酸鈉和甲醛的連續(xù)作用，并且裂解可在病毒顆粒初始純化期間(例如在蔗糖密度梯度溶液中)進(jìn)行。因此，裂解過程可包括澄清含病毒顆粒的物質(zhì)(以去除非病毒顆粒物質(zhì))，濃縮收獲的病毒顆粒(例如使用吸附方法，如CaHPO4 吸附)，從非病毒顆粒材料分離全病毒顆粒，用裂解劑在密度梯度離心步驟中裂解病毒顆粒 (例如，用含有裂解劑如脫氧膽酸鈉的蔗糖梯度)，然后過濾(例如超濾)以去除不需要的物質(zhì)。可將裂解的病毒顆粒重懸于磷酸鈉緩沖的等滲氯化鈉溶液中。BEGRIVAC 、FLUARIX 、 FLUZ0NE 和FLUSHIELD 產(chǎn)品是裂解疫苗。純化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，一般還包含神經(jīng)氨酸酶。制備純化形式的這些蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如FLUVIRIN 、AGRIPPAL 和INFLUVAC 產(chǎn)
另一種形式的滅活流感抗原是病毒體[16](不含核酸的病毒樣脂質(zhì)體顆粒)。病毒體可通過用去污劑溶解流感病毒，然后去除核衣殼和重建含病毒糖蛋白的膜來制備。另一種制備病毒體的方法包括加入病毒膜糖蛋白至磷脂過量，得到膜中具有病毒蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體。本發(fā)明可用于儲(chǔ)存大量病毒體，如INFLEXAL V 和INVAVAC 產(chǎn)品。流感病毒可被減毒。流感病毒可以是溫度敏感型。流感病毒可以是冷適應(yīng)性病毒。 使用活病毒作為抗原時(shí)這三種特征特別有用。HA是現(xiàn)有滅活流感疫苗中的主要免疫原，參照一般由SRID測(cè)定的HA水平來標(biāo)準(zhǔn)化疫苗劑量?，F(xiàn)有的疫苗一般含有約15 μ g HA/毒株，但也可使用更低的劑量，例如在兒科應(yīng)用或大流行狀況中，或者是使用佐劑時(shí)。采用了分?jǐn)?shù)劑量如1/2(即7. 5yg HA/ 毒株)、1/4和1/8，以及較高劑量(如3x或9x劑量[17，18])。除非另有說明，疫苗可包含 0. 1-150 μ g HA/ 流感毒株，優(yōu)選 0. 1-50 μ g，例如 0. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、 0. 1-7. 5μ g、0. 5-5 μ g等。具體劑量包括例如，約45、約30、約15、約10、約7. 5、約5、約 3. 8、約1. 9、約1. 5 μ g等/毒株。除大流行毒株外，疫苗中優(yōu)選包含質(zhì)量基本相同的每種毒株的HA，例如每種毒株的HA質(zhì)量在每種毒株平均HA質(zhì)量的正負(fù)10 %之內(nèi)，優(yōu)選平均值的正負(fù)5%之內(nèi)。大流行毒株的HA質(zhì)量優(yōu)選為非大流行毒株的平均質(zhì)量的1/2或1/4。就活疫苗而言，利用組織培養(yǎng)感染劑量中值(TCID5tl)而非HA含量來衡量劑量， TCID50—般為 106_108(優(yōu)選為 IO6 5-IO7'5)/毒株。本發(fā)明所用的毒株可以具有野生型病毒中的天然HA，或具有修飾HA。例如，已知修飾HA去除決定簇(如HA1/HA2切割位點(diǎn)周圍的超堿性區(qū)域(hyper-basic region))能使病毒在禽類動(dòng)物中具有高度致病性。本發(fā)明所用的乙型流感病毒的血凝素優(yōu)選在氨基酸 197位上具有Asn，以提供糖基化位點(diǎn)[19]。細(xì)胞系除了使用SPF雞蛋作為病毒生長的培養(yǎng)基外(從感染雞蛋的尿囊液中收集病毒)， 還可使用支持流感病毒復(fù)制的細(xì)胞系。細(xì)胞系通常是哺乳動(dòng)物來源。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源包括但不限于倉鼠，牛，靈長類(包括人和猴)及犬細(xì)胞，但不優(yōu)選使用靈長類細(xì)胞。 可使用各種細(xì)胞類型，例如腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肺細(xì)胞等。合適的倉鼠細(xì)胞的例子是稱為BHK21或HKCC的細(xì)胞系。合適的猴細(xì)胞包括例如，非洲綠猴細(xì)胞，例如腎細(xì)胞， 如Vero細(xì)胞系[20-22]。合適的犬細(xì)胞是(例如)腎細(xì)胞，例如CLDK和MDCK細(xì)胞系。因此，合適的細(xì)胞系包括但不限于MDCK、CHO、CLDK、HKCC、293T、BHK、Vero、MRC-5、 PER.C6[23]、FI hL2、WI-38等。合適的細(xì)胞系可由各種來源獲得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) [24]、Coriell細(xì)胞庫[25]或歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC 提供各種不同Vero細(xì)胞，目錄號(hào)為CCL-81、CCL-81. 2、CRL_1586和CRL-1587 ；并提供MDCK 細(xì)胞，目錄號(hào)為CCLH PER. C6可獲自ECACC，保藏號(hào)為9602^40。最優(yōu)選的細(xì)胞系是具有哺乳動(dòng)物類型糖基化的細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的次優(yōu)選替代方式是可以在禽細(xì)胞系上培養(yǎng)病毒[例如參考文獻(xiàn)沈-28]，這些細(xì)胞系包括衍生自鴨(如鴨視網(wǎng)膜)或母雞的細(xì)胞系。禽細(xì)胞系的例子包括禽胚胎干細(xì)胞[26. 29]和鴨視網(wǎng)膜細(xì)胞[27]。合適的禽胚胎干細(xì)胞包括衍生自雞胚胎干細(xì)胞的Ebx細(xì)胞系、EB45、EB14和 EB14-074[30]。也可利用雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)。然而，與使用禽類細(xì)胞相比，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系意味著該疫苗可能不含禽類DNA和雞蛋蛋白質(zhì)(如卵清蛋白和卵類粘蛋白)，從而降低變應(yīng)原性。用于培養(yǎng)流感病毒的最優(yōu)選的細(xì)胞系是來自馬-達(dá)二氏犬腎的MDCK細(xì)胞系[31-34]。原始MDCK細(xì)胞系可購自ATCC (CCL-34)，但也可利用該細(xì)胞系的衍生細(xì)胞系。例如，參考文獻(xiàn)31公開了適合懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系(‘MDCK 33016'， 保藏號(hào)DSM ACC 2219)。類似地，參考文獻(xiàn)35公開了在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的MDCK衍生細(xì)胞系(‘B-702 ‘，保藏號(hào)FERM BP-7449)。參考文獻(xiàn)36公開了非致瘤性 MDCK 細(xì)胞，包括'MDCK-S ‘ (ATCC PTA-6500)、‘ MDCK-SF101 ‘ (ATCC PTA-6501)、' MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502)和'MDCK-SF103' (PTA-6503)。參考文獻(xiàn) 37公開了非常容易感染的MDCK細(xì)胞系，包括‘MDCK. 5F1，細(xì)胞(ATCC CRL12042)?？墒褂萌魏芜@些MDCK細(xì)胞系。可以在貼壁或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中培養(yǎng)病毒。也可使用微載體培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞可能適合懸浮培養(yǎng)。優(yōu)選在無血清培養(yǎng)基和/或無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞系。在本發(fā)明中，如果培養(yǎng)基中沒有人或動(dòng)物血清來源的添加劑，則稱為無血清培養(yǎng)基。生長于此類培養(yǎng)物中的細(xì)胞天然包含蛋白質(zhì)本身，但是無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基理解為在其中細(xì)胞的倍增(例如感染前)發(fā)生于沒有蛋白質(zhì)、生長因子、其它蛋白質(zhì)添加劑和非血清蛋白質(zhì)的條件下，但是可以人選包含病毒生長必須的蛋白質(zhì)，如胰蛋白酶或其它蛋白酶。在病毒復(fù)制過程中，支持流感病毒復(fù)制的細(xì)胞系優(yōu)選在37°C以下(如30_36°C，或約 30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C )培養(yǎng)[38]。在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖流感病毒的方法通常包括以下步驟用待培養(yǎng)毒株接種體接種培養(yǎng)的細(xì)胞；將感染細(xì)胞培養(yǎng)所需時(shí)間以增殖病毒，并根據(jù)病毒效價(jià)或抗原表達(dá)進(jìn)行測(cè)定(例如，在接種后培養(yǎng)對(duì)至168小時(shí))；收集增殖的病毒。用1 500-1 1，優(yōu)選 1 100-1 5，更優(yōu)選1 50-1 10的病毒(由PFU或TCID50測(cè)定)細(xì)胞比接種培養(yǎng)的細(xì)胞。將病毒加入到細(xì)胞懸液中，或施加于單層細(xì)胞，病毒在細(xì)胞上吸收至少60分鐘但通常小于300分鐘，優(yōu)選90-240分鐘，溫度為25°C _40°C，優(yōu)選_37°C?？赏ㄟ^凍融或酶作用去除感染的細(xì)胞培養(yǎng)物(如單層)，以提高收獲的細(xì)胞上清液的病毒含量。然后，可滅活或冷凍儲(chǔ)存收獲的液體?？梢约s0. 0001-10、優(yōu)選0. 002-5、更優(yōu)選0. 001-2的感染復(fù)數(shù)(“m. ο. i.“)感染培養(yǎng)的細(xì)胞。更優(yōu)選以約0.01的m. ο. i.感染細(xì)胞。可以在感染后 30-60小時(shí)收獲感染的細(xì)胞。優(yōu)選在感染后34-48小時(shí)收獲細(xì)胞。更優(yōu)選在感染后38-40 小時(shí)收獲細(xì)胞。通常在細(xì)胞培養(yǎng)期間加入蛋白酶(一般是胰蛋白酶)，以釋放病毒，所述蛋白酶可以在培養(yǎng)過程的任何合適階段加入，例如接種前、接種同時(shí)或接種后[38]。在優(yōu)選實(shí)施方式中，尤其是使用MDCK細(xì)胞時(shí)，來自主工作細(xì)胞庫中的細(xì)胞系傳代不超過40次群體倍增水平。病毒接種體和病毒培養(yǎng)物優(yōu)選不含(即經(jīng)測(cè)試且得到陰性污染結(jié)果)單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、多瘤病毒、雙RNA病毒、環(huán)病毒和/或細(xì)小病毒[39]。特別優(yōu)選不存在單純皰疹病毒。宿主細(xì)胞DNA用細(xì)胞系培養(yǎng)病毒時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐是最大程度減少最終疫苗中殘留的細(xì)胞系DNA的含量，以最大程度降低該DNA的致癌活性。因此，按照本發(fā)明制備的疫苗組合物優(yōu)選含有小于IOng (優(yōu)選小于lng，更優(yōu)選小于IOOpg)殘留的宿主細(xì)胞DNA/劑量，但可能存在痕量宿主細(xì)胞DNA。優(yōu)選每15 μ g血凝素中宿主細(xì)胞DNA含量< IOng(如< lng、< IOOpg)的疫苗， 以及每0.25ml體積中宿主細(xì)胞DNA含量< IOng(如< lng、< IOOpg)的疫苗。更優(yōu)選每 50 μ g血凝素中宿主細(xì)胞DNA含量< IOng (如< lng、< IOOpg)的疫苗，以及每0. 5ml體積中宿主細(xì)胞DNA含量< IOng(如< lng、< IOOpg)的疫苗。任何殘留宿主細(xì)胞DNA的平均長度優(yōu)選小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、 小于200bp、小于IOObp等。在疫苗制備過程中可采用標(biāo)準(zhǔn)純化方法，如層析法等去除污染的DNA?？赏ㄟ^核酸酶處理，例如DNA酶處理來改進(jìn)對(duì)殘留宿主細(xì)胞DNA的清除效果。參考文獻(xiàn)40和41 公開了一種減少宿主細(xì)胞DNA污染的方便方法，該方法包括兩步處理，先使用DNA酶(如 Benzonase)處理(可以在病毒生長過程中使用)，然后使用陽離子去污劑(如CTAB)處理 (可以在病毒顆粒破壞過程中使用)。也可采用β-丙內(nèi)酯去除。現(xiàn)在，殘留宿主細(xì)胞DNA的測(cè)定是生物制品的常規(guī)管理要求，它在技術(shù)人員的普通能力范圍內(nèi)。用于測(cè)定DNA的實(shí)驗(yàn)一般是已驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)W2，43]?？赏ㄟ^數(shù)學(xué)和可以量化的條件來描述驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的性能特征，并鑒定可能的誤差來源。通常測(cè)試該實(shí)驗(yàn)的某些特征，如精確性、準(zhǔn)確性、特異性。一旦校正(例如用已知標(biāo)準(zhǔn)量的宿主細(xì)胞DNA校正)并檢測(cè)了某個(gè)實(shí)驗(yàn)，則可按常規(guī)進(jìn)行定量DNA測(cè)定。可采用三種DNA定量的基本技術(shù)雜交方法，如Southern印跡或狹線印跡[44]；免疫測(cè)定方法，如Threshold 系統(tǒng)[45]；和定量PCR[46]。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些方法，但各方法的準(zhǔn)確特征，例如雜交探針的選擇、 引物的選擇和/或用于擴(kuò)增的引物等可能取決于所研究的宿主細(xì)胞。來自分子設(shè)備公司 (Molecular Devices)的Threshold 系統(tǒng)是皮克水平總DNA的定量實(shí)驗(yàn)，已用于監(jiān)測(cè)生物藥品中污染DNA的水平W5]。典型實(shí)驗(yàn)包括生物素化ssDNA結(jié)合蛋白、脲酶偶聯(lián)的抗 ssDNA抗體和DNA之間以非序列特異性方式形成反應(yīng)復(fù)合物。購自生產(chǎn)商的總DNA測(cè)定試劑盒(Total DNA Assay Kit)中包含所有實(shí)驗(yàn)組分。多個(gè)商業(yè)生產(chǎn)商均提供用以檢測(cè)殘留宿主細(xì)胞DNA的定量PCR實(shí)驗(yàn)，例如AppTec 實(shí)驗(yàn)室服務(wù)公司(AppTec Laboratory Services)、BioReliance 公司奧西科技公司(Althea Technologies)等。對(duì)測(cè)定人病毒疫苗的宿主細(xì)胞DNA污染的化學(xué)發(fā)光雜交實(shí)驗(yàn)和總DNA Threshold 系統(tǒng)的比較參見參考文獻(xiàn)47。毒株選擇按照本發(fā)明產(chǎn)生的疫苗至少包括四種流感病毒株。一般單獨(dú)培養(yǎng)不同毒株，收獲病毒并制備抗原后將它們混合在一起。因此，本發(fā)明方法可包括混合一種以上流感毒株的抗原的步驟。因此，本發(fā)明方法可包括混合一種以上流感毒株的抗原的步驟。甲型流感病毒目前展示十六種HA亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、 H12、H13、H14、H15和H16。本發(fā)明可保護(hù)免受一種或多種流感A病毒NA亞型Ni、N2、N3、 N4、N5、N6、N7、N8或N9的感染。本文提供的疫苗至少包含Hl毒株、H3毒株和大流行毒株。 在一些實(shí)施方式中，所述H3毒株與A/Moscow/10/99發(fā)生交叉反應(yīng)。在其它實(shí)施方式中，所述H3毒株與A/Fujian/411/2002發(fā)生交叉反應(yīng)。
大流行流感毒株的特征是(a)與目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即有數(shù)十年在人群中沒有發(fā)現(xiàn)的血凝素(如H2)，或者從未在人群中發(fā)現(xiàn)的血凝素(如通常只出現(xiàn)在鳥群體中的H5、H6或H9)，以至于疫苗接受者和普通人群未曾免疫接觸過該毒株的血凝素；(b)它能夠在人群中水平傳播；和(c)它對(duì)人有致病性。大流行毒株可包括H2、H5、H7或H9亞型毒株，例如H5N1,H5N3,H9N2,H2N2,H7N1和H7N7毒株。通常是 H5W毒株。本發(fā)明使用的其它大流行毒株可來自2009年從豬傳播至人的Hmi毒株。因此大流行毒株可以是具有相對(duì)于SEQ ID NO 15與SEQ ID NO 14更相關(guān)的血凝素的Hl毒株 (即使用相同算法和參數(shù)進(jìn)行比對(duì)時(shí)，相對(duì)于SEQ ID N0:15與SEQ ID N0:14具有更高的序列相同性)。乙型流感病毒目前不顯示不同的HA亞型，但乙型流感病毒株分為兩種不同的譜系。這些譜系出現(xiàn)于1980年代晚期，并且具有在抗原/遺傳上可彼此區(qū)分的H/U48]。當(dāng)前乙型流感病毒株是B/Victoria/2/87-樣或B/Yamagata/16/88-樣。通常可從抗原性區(qū)分這些毒株，但氨基酸序列的不同也可以區(qū)分這兩種譜系，例如B/Yamagata/16/88-樣毒株常常(但并非總是)具有氨基酸殘基164缺失(相對(duì)'Lee40' HA序列進(jìn)行編號(hào))的HA 蛋白W9]。在一些實(shí)施方式中，所述乙型流感毒株是B/Victoria/2/87樣毒株。在其它實(shí)施方式中，所述乙型流感毒株是B/Yamagata/16/88樣毒株。本發(fā)明所用的流感病毒可以是重配病毒，并可通過逆向遺傳學(xué)技術(shù)獲得。逆向遺傳學(xué)技術(shù)[如50-54]能夠用質(zhì)粒在體外制備含有所需基因組節(jié)段的流感病毒。該技術(shù)一般包括表達(dá)(a)例如，由poll啟動(dòng)子或噬菌體RNA聚合酶啟動(dòng)子編碼所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如，由polll啟動(dòng)子編碼病毒蛋白的DNA分子，以便在細(xì)胞中表達(dá)兩種類型的DNA，導(dǎo)致組裝成完整的感染性病毒顆粒。DNA優(yōu)選提供所有病毒RNA和蛋白質(zhì)， 但也可能用輔助病毒提供一些RNA和蛋白質(zhì)?？刹捎貌煌|(zhì)粒產(chǎn)生各病毒RNA的質(zhì)粒方法 [55-57]，這些方法也包括使用質(zhì)粒表達(dá)所有或一些病毒蛋白(例如僅PBl、PB2、PA和NP 蛋白)，一些方法中至多使用12種質(zhì)粒。為了降低所需的質(zhì)粒數(shù)量，近期方法[58]將多個(gè) RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒(用于合成病毒RNA)合并到同一質(zhì)粒(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種流感A vRNA節(jié)段的序列)上，并且將多個(gè)蛋白編碼區(qū)與RNA聚合酶II啟動(dòng)子合并到另一個(gè)質(zhì)粒(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種流感A mRNA轉(zhuǎn)錄物的序列)上。參考文獻(xiàn)58方法的優(yōu)選方面包括(a)在單一質(zhì)粒上的PBl、PB2和PA mRNA編碼區(qū)域；和(b) 在單一質(zhì)粒上的所有8種vRNA編碼區(qū)段。一個(gè)質(zhì)粒上包含NA和HA節(jié)段而另外六個(gè)節(jié)段位于另一質(zhì)粒上也可能是有利的。作為使用poll啟動(dòng)子編碼病毒RNA節(jié)段的替換方式，可能使用噬菌體聚合酶啟動(dòng)子[59]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的啟動(dòng)子。因?yàn)閜oll啟動(dòng)子的物種特異性，對(duì)于許多細(xì)胞類型Gf^BMDCK)更宜使用噬菌體聚合酶啟動(dòng)子，但必須用編碼外源性聚合酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在其它技術(shù)中，可能使用poll和polll雙啟動(dòng)子由一個(gè)模板同時(shí)編碼病毒RNA和可表達(dá)的mRNA [60，61]。因此，流感A病毒可包含來自A/PR/8/34病毒(一般是來自A/PR/8/34的6個(gè)節(jié)段，HA和N節(jié)段來自疫苗毒株，即6 2重配毒株)的一個(gè)或多個(gè)RNA節(jié)段。也可包含來自A/WSN/33病毒，或用于產(chǎn)生疫苗制劑的重配病毒的任何其它毒株的一個(gè)或多個(gè)RNA節(jié)段。甲型流感病毒可包括不到6個(gè)(即0、1、2、3、4或5個(gè))來自AA/6/60流感病毒(A/Ann Arbor/6/60)的病毒區(qū)段。乙型流感病毒可包括不到6個(gè)(即0、1、2、3、4或5個(gè))來自AA/1/66流感病毒(B/Arm Arbor/1/66)的病毒區(qū)段。本發(fā)明一般保護(hù)免受能夠在人之間傳播的毒株的感染，因此該毒株的基因組通常包含在哺乳動(dòng)物(如人)流感病毒中起源的至少一個(gè)RNA區(qū)段。它可包含在禽流感病毒中起源的NS區(qū)段。其抗原可包含在本發(fā)明組合物中的毒株可以是對(duì)抗病毒治療有抗性(例如對(duì)奧塞米韋W2]和/或扎那米韋有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株W3]。在從患者中分離到細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中復(fù)制之間的任何階段未通過雞蛋進(jìn)行傳代的那些毒株尤其有用。MDCK細(xì)胞可專門用于從分離至病毒復(fù)制的所有步驟。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所用毒株具有血凝素，該血凝素具有與含Sia(a2，3) Gal末端二糖的寡糖相比，更偏向于結(jié)合含Sia(a2，6)Gal末端二糖的寡糖的結(jié)合偏好。人流感病毒結(jié)合具有Sia (α-2，6) Gal末端二糖(α-2，6連接至半乳糖的唾液酸)的受體寡糖，而蛋和Vero細(xì)胞具有含Sia(a _2，3)Gal末端二糖的受體寡糖。人流感病毒在細(xì)胞如 MDCK中的生長提供了血凝素選擇壓，從而維持了天然的Sia(a 2，6)Gal結(jié)合，這點(diǎn)與雞蛋傳代不同。為了確定病毒是否具有相對(duì)于含Sia(a2，3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含 Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的結(jié)合偏好，可利用各種分析試驗(yàn)。例如，參考文獻(xiàn)64 描述了測(cè)定流感病毒受體-結(jié)合活性的固相酶聯(lián)試驗(yàn)，以便對(duì)親合常數(shù)進(jìn)行靈敏的定量測(cè)定。參考文獻(xiàn)65采用固相試驗(yàn)，該試驗(yàn)評(píng)估病毒與兩種不同的唾液酸糖蛋白的結(jié)合 (卵類粘蛋白，具有Sia(a2，3)Gal決定簇；和豬α 2巨球蛋白，具有Sia ( α 2，6) Gal決定簇)，也描述了評(píng)價(jià)針對(duì)兩種受體類似物游離唾液酸(Neu5Ac)和3'-唾液酸乳糖 (Neu5Ac α 2_3Gal β l_4Glc)的病毒結(jié)合試驗(yàn)。參考文獻(xiàn)66報(bào)道了采用能夠清楚區(qū)分α 2,3 或α 2，6連接受體偏好的聚糖試驗(yàn)。參考文獻(xiàn)67報(bào)道了一種基于經(jīng)酶促修飾包含Sia(a 2， 6) Gal或Sia (α 2，3) Gal的人紅細(xì)胞的凝集的試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)類型，可利用病毒本身直接進(jìn)行試驗(yàn)，或者可利用從病毒純化的血凝素間接進(jìn)行試驗(yàn)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所用流感毒株具有與雞蛋來源的病毒糖基化模式不同的糖蛋白(包括血凝素)。因此，所述糖蛋白包含雞蛋中未見的糖形。當(dāng)使用大流行毒株時(shí)，除非另有表明，通常為來自Η5血凝素亞型的甲型流感病毒，如Η5Ν1毒株。在Η5亞型中，毒株可以屬于進(jìn)化支0、1、2、3、4、5、6、7、8或9。自2003以來在禽類中流行的H5W病毒中大多數(shù)的血凝素(HA)序列屬于兩個(gè)不同的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化支。在柬埔寨、泰國和越南流行的進(jìn)化支1病毒引起了 2004年和2005 年期間那些國家的以及2006年的泰國的人感染。進(jìn)化支2病毒自2003年起在中國和印度尼西亞的鳥類中流行，在2005年和2006年期間向西傳播至中東、歐洲和非洲。自2005年晚期，進(jìn)化支2病毒主要引起人感染。已區(qū)分出進(jìn)化支2的多種亞進(jìn)化支；其中三種亞進(jìn)化支1、2和3地理分布不同，迄今主要引起人病例感染。并且已知進(jìn)一步的細(xì)分，例如進(jìn)化支 2.3中有四種細(xì)分，包括2. 3. 2和2. 3.4。在2006年8月至2007年3月期間，在禽類中持續(xù)流行或再次出現(xiàn)并已經(jīng)與非洲、 亞洲和歐洲散發(fā)人感染相聯(lián)系的H5m病毒的HA序列中大部分落入以前指定的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化支和亞進(jìn)化支。進(jìn)化支1病毒引起泰國和越南的鳥類爆發(fā)，以及泰國的人感染。進(jìn)化支 2. 1病毒繼續(xù)在家禽中循環(huán)，并引起印度尼西亞的人感染。進(jìn)化支2. 2病毒引起非洲、亞洲和歐洲一些國家的鳥類爆發(fā)，并且與埃及、伊拉克和尼日利亞的人感染有關(guān)。在亞洲零星分離出進(jìn)化支2. 3病毒，引起中國和老撾的人感染。此外，在亞洲的局部爆發(fā)期間從家禽體內(nèi)分離出一些不在這些分類中的病毒。這些病毒落入新興進(jìn)化支，以A/鵝/Guiyang/337/2006 (進(jìn)化支4)和A/雞/ a!anxi/2/2006(進(jìn)化支7)為代表。目前總共定義了 10個(gè)進(jìn)化支，編號(hào)為0_9。作為本文參考，每一進(jìn)化支的原型毒株及其血凝素基因的編碼序列如下本文中從系統(tǒng)發(fā)育的角度將進(jìn)化支1H5病毒定義為這樣一種甲型流感病毒，利用如I^hylip軟件包W8]中所用DNADIST算法進(jìn)行評(píng)估時(shí)(例如，使用Kimura 2-參數(shù)距離和方陣)，其血凝素編碼序列與A/HongKong/213/03毒株的編碼序列(SEQ ID N0:1)相關(guān)性高于進(jìn)化支0以及2-9中任何毒株的任何編碼序列(SEQ ID NO 2-10)。相似的，進(jìn)化支 2病毒的血凝素編碼序列與AAndonesia/5/05毒株編碼序列(SEQ ID NO 2)的相關(guān)性高于進(jìn)化支0、1和3-9中任何毒株的任何編碼序列(SEQ ID N0:1和3_10)。其它進(jìn)化支的系統(tǒng)發(fā)育定義相似，血凝素的編碼序列與來自SEQ ID NO :1-10的相關(guān)編碼序列的相關(guān)性高于SEQ ED NO 1-10中的其它序列。從核酸序列觀點(diǎn)出發(fā)，本文可將進(jìn)化支1病毒定義為這樣一種甲型流感病毒，其具有的血凝素編碼序列與A/HongKong/213/03毒株(SEQ ID NO 1)的序列相同性高于SEQ ID NO :2-10的任何序列。其它進(jìn)化支的定義相似，血凝素編碼序列與來自SEQ ID NO=I-IO 的相關(guān)編碼序列的相關(guān)性高于SEQ ED NO 1-10中的其它序列。從氨基酸序列的觀點(diǎn)出發(fā)，參考特征性HA突變，本文可將H5病毒定義為屬于一特定的進(jìn)化支W9]。例如，進(jìn)化支3病毒可具有一個(gè)或多個(gè)下列氨基酸殘基，這些殘基不同于進(jìn)化支 1 和 2 :Asn-45、Ser-84, Asn-94、Asn-124, Leu-138、Ser-144, Glu-212、Ser-223, 和/或Arg-325。進(jìn)化支2的病毒可以包含進(jìn)化支1和3所沒有的Asp-124。進(jìn)化支1病毒可具有一個(gè)或多個(gè)下列氨基酸殘基，這些殘基不同于進(jìn)化支2和3 :Ser-lM、LeU-U9。進(jìn)化支2內(nèi)部至少鑒定到三種亞進(jìn)化支2. 1,2. 2和2. 3。從系統(tǒng)發(fā)育觀點(diǎn)出發(fā)，本文將進(jìn)化支2. 1H5病毒定義為血凝素編碼序列與AAndonesia/5/05毒株的編碼序列(SEQ ID NO :2)的相關(guān)性高于 A/Anhui/1/2005 毒株(SEQ ID NO 11)或 A/火雞/Turkey/1/05 毒株(SEQ IDNO 12)。相似的，從系統(tǒng)發(fā)育觀點(diǎn)出發(fā)，本文將進(jìn)化支2. 2H5病毒定義為血凝素編碼序列與A/火雞/Turkey/1/05毒株的編碼序列(SEQ ID NO 12)的相關(guān)性高于A/ Anhui/1/2005 毒株(SEQ ID NO 11)或 A/hidonesia/5/05 毒株(SEQ ID NO :2)。最后，從系統(tǒng)發(fā)育觀點(diǎn)出發(fā)，本文將進(jìn)化支2. 3H5病毒定義為血凝素編碼序列與A/Anhui/1/O毒株的編碼序列(SEQ ID NO: 11)的相關(guān)性高于A/火雞/Turkey/1/05 (SEQ ID NO :11)或A/ hdonesia/5/05 毒株(SEQ ID NO :2)。在一些實(shí)施方式中，亞進(jìn)化支2. 2中的毒株的HA包含一個(gè)或多個(gè)下列序列 Ile-223、Ile-230、Ile-517、Δ^5 ·-133 ；具有 REGRRRKR 序列(SEQ ID NO 13)的切割位點(diǎn)。 HA 基因可包含一個(gè)或多個(gè)下列核苷酸Α-41、Α-142、Α-209、A-295, G-433、Α-467、Α-496、 C-610、A-627、A-643、C-658、T-661、T-689、T-727、G-880、C-937、G-1006、Τ-1012、Α-1019、 T-1177、A-1235、T-1402、C-1415、T-1480、C-1510、T-1614、C-1615、A-1672、G-1708 (其中任何核苷酸可能改變或不改變相關(guān)密碼子的編碼氨基酸)。NA基因可包含核苷酸Α-743，它不改變相關(guān)密碼子的編碼氨基酸。
有用的是，本發(fā)明4-價(jià)混合物中包括來自三種不同甲型流感病毒血凝素亞型(例如，HI、H3、H5)，但少于三種不同的甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶亞型(例如兩種附和N2)的抗原。這種安排來自使用多種共有某神經(jīng)氨酸酶亞型的甲型流感病毒株，如Hmi和H5W。 該共有的N亞型能夠增強(qiáng)交叉保護(hù)[70]。藥物組合物本發(fā)明藥盒可用于臨用前制備免疫原性藥物組合物(例如，疫苗)。除流感抗原外，這類組合物通常還包含其它組分，例如它們一般包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。對(duì)這類組分的充分討論參見參考文獻(xiàn)71。在許多實(shí)施方式中，也可包含佐劑。在給藥時(shí)，本發(fā)明組合物通常是水性形式。組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。疫苗優(yōu)選應(yīng)基本不含(如 < 10yg/ml)含汞物質(zhì)，如硫柳汞[14，72]。更優(yōu)選無汞的疫苗。特別優(yōu)選無防腐劑的疫苗，可包含琥珀酸α-生育酚以替代含汞化合物[14]。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)藥盒中的多于一個(gè)容器中裝有抗原時(shí)，這些容器各自包含防腐劑，但是在其它實(shí)施方式中，僅有一個(gè)含有抗原的容器包含防腐劑。當(dāng)佐劑與抗原儲(chǔ)存于不同的容器時(shí)，佐劑最好不含汞。然而混合后，防腐劑的來源通常不明確。為了控制張度，優(yōu)選包含生理性鹽如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，它的濃度可以是 l-20mg/ml?？梢源嬖诘钠渌}包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和/或氯化鎂等。當(dāng)佐劑和抗原存儲(chǔ)于不同的容器時(shí)，兩個(gè)容器中均可含有氯化鈉。組合物的滲透壓可以為200m θ sm/kg-400m θ sm/kg,優(yōu)選為M0_360m θ sm/kg,也可以在^0-310ι Θ sm/kg的范圍內(nèi)。組合物可含有一種或多種緩沖劑。緩沖劑一般包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑； 硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑(特別是與氫氧化鋁佐劑聯(lián)用時(shí))；或檸檬酸緩沖劑。包含的緩沖劑的濃度一般是5-20mM。當(dāng)佐劑和抗原存儲(chǔ)于不同的容器時(shí)，兩種容器中均可含有緩沖液。組合物的pH通常為5. 0-8. 1，更一般為6.0-8. 0，例如6. 5-7. 5，或者7. 0-7. 8。因此，本發(fā)明方法可包括在包裝前調(diào)整散裝疫苗PH的步驟。該組合物優(yōu)選無菌。該組合物優(yōu)選無熱原，如每劑量含有< 1EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)，優(yōu)選每劑量< 0. IEU0該組合物優(yōu)選不含谷蛋白。本發(fā)明組合物可包含去污劑，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(稱為'吐溫')、辛苯聚糖(如辛苯聚糖-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲銨(‘CTAB')或脫氧膽酸鈉，特別用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污劑可僅以痕量存在。因此，疫苗中辛苯聚糖-10和聚山梨醇酯80各自的含量可以小于lmg/ml。其它痕量殘留組分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。當(dāng)佐劑與抗原存儲(chǔ)于不同的容器時(shí)，含有抗原的容器常常包含去污劑(例如，包含抗原與聚山梨酯80和辛苯聚醇 10)。該組合物可含有一次免疫的物質(zhì)，或者可含有多次免疫的物質(zhì)(即多劑量藥盒)。 多劑量配置優(yōu)選含有防腐劑。作為多劑量組合物中包含防腐劑的替代方案(或除此之外)， 該組合物可包含在裝有用于取出物質(zhì)的無菌接頭的容器中。流感疫苗的給藥劑量體積一般為約0. 5ml，但可將一半劑量(即約0. 25ml)給予兒童。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，可以更高劑量給予組合物，例如，約1ml，例如混合兩個(gè) 0. 5ml的體積后。組合物和藥盒優(yōu)選儲(chǔ)存于2-8°C。不應(yīng)冷凍。理想地，應(yīng)避光保存。佐劑在使用時(shí)，本發(fā)明組合物宜包含佐劑，佐劑的作用是增強(qiáng)在接受該組合物的患者中引起的免疫應(yīng)答(體液免疫和/或細(xì)胞免疫)。水包油乳液佐劑(尤其是含有鯊烯的佐劑)的存在被證明可增強(qiáng)季節(jié)性[73]和大流行[74，75]流感疫苗的免疫應(yīng)答毒株交叉反應(yīng)性。乳液佐劑可包含在3-價(jià)季節(jié)性藥盒組分中、1-價(jià)大流行藥盒組分中，或作為單獨(dú)的藥盒組分。本發(fā)明所用的水包油乳液通常包含至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油和表面活性劑是生物可降解(可代謝)和生物相容的。乳液中的油滴直徑通常小于5μπι，甚至可具有亞微米直徑，通過微流化床實(shí)現(xiàn)這種小尺寸以提供穩(wěn)定乳液。優(yōu)選小于220nm的液滴，因?yàn)樗鼈兛蛇M(jìn)行過濾除菌。本發(fā)明可使用的油諸如動(dòng)物油(如魚油)或植物油。植物油的來源包括堅(jiān)果、種籽和谷物。最常見的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅(jiān)果油的代表例子。也可使用獲自 (例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常見的是玉米油，但也可以使用來自其它谷類，如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫眉草 (teff)、黑小麥(triticale)等的油。可從堅(jiān)果和種籽油開始，通過水解、分離和酯化合適物質(zhì)制備甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯(不是種籽油中天然產(chǎn)生的)。來自哺乳動(dòng)物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用于實(shí)施本發(fā)明。由動(dòng)物來源獲得純油的過程中必需的分離、純化、皂化和其它方法的步驟是本領(lǐng)域眾所周知的。大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和如鯨蠟的鯨油是可以用于本發(fā)明的幾種魚油的代表例子。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，它們總稱為萜類。鯊魚肝油含有稱為鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物，即2,6,10，15，19，23-六甲基-2,6,10，14， 18，22-二十四碳六烯。也可采用鯊烯的飽和類似物鯊?fù)?。魚油，包括鯊烯和鯊?fù)?，易于從商業(yè)來源獲得，或可以通過本領(lǐng)域已知的方法獲得。優(yōu)選鯊烯。其他有用的油是生育酚，它宜包含在針對(duì)老年患者(如年齡大于60歲或更大的患者)的疫苗中，因?yàn)閾?jù)報(bào)道維生素E在此患者群體中對(duì)免疫應(yīng)答有正面作用[76]。它們也具有抗氧化特性，這種特性有助于穩(wěn)定該乳液[77]。存在各種生育酚(α、β、Y、δ、ε或 ξ )，但通常使用α -生育酚。優(yōu)選的α -生育酚是DL- α -生育酚。已知琥珀酸α -生育酚與流感疫苗相容，并且是有用的替代含汞化合物的防腐劑[14]。可使用油的混合物，例如，鯊烯和α -生育酚的混合物。油含量通常為2-20% (體積)?？赏ㄟ^'HLB'(親水/親脂平衡)對(duì)表面活性劑分類。本發(fā)明優(yōu)選的表面活性劑的HLB為至少10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16?？梢耘c本發(fā)明一起使用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20 和聚山梨酯80;以商品名D0WFAX 出售的環(huán)氧乙烷(EO)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷 (BO)的共聚物，如直鏈ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；重復(fù)的乙氧基(氧-1，2-乙二基)數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9 (曲通X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如Tergitol NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤(Brij)表面活性劑)，如三甘醇單月桂基醚(芐澤30)；以及去水山梨糖醇酯(通常稱為司盤(SPAN))，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和去水山梨糖醇單月桂酸酯。優(yōu)選非離子型表面活性劑。用于乳液的最優(yōu)選的表面活性劑是聚山梨酯80(聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯；吐溫80)。可使用表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和辛苯聚醇的組合也適用。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚-9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。優(yōu)選的表面活性劑的用量(重量％ )為聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐溫 80)0. 01-1%，特別是約0. ；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污劑)0. 001-0. 1%，特別是0. 005-0. 02% ；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚 9)0. 1-20%，優(yōu)選 0. 1-10%，特別是 0. 1-1%或約 0.5%。優(yōu)選含鯊烯的水包油乳液，特別是含有聚山梨酯80的那些乳液。本發(fā)明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于·鯊烯、聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯的亞微米乳液。該乳液的體積組成可以是約5%鯊烯、約0. 5%聚山梨酯80和約0. 5%司盤85。以重量計(jì)，這些比例為4. 3% 角鯊烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盤85。這種佐劑稱為‘MF59，[78-80]，參考文獻(xiàn)81 的第10章和參考文獻(xiàn)82的第12章更詳細(xì)地描述了該佐劑。MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。 鯊烯、生育酚和聚山梨酯80的亞微米乳液。這些乳液可含有2-10%鯊烯、2-10% 生育酚和0. 3-3%聚山梨酯80，鯊烯生育酚的重量比優(yōu)選< 1(例如0.90)，因?yàn)檫@能提供更穩(wěn)定的乳液_。角鯊烯和聚山梨酯80的體積比可以約為5 2，或者重量比約為 11 5?？赏ㄟ^下述方法制備一種這樣的乳液將吐溫80溶解于PBS得到2%溶液，然后將90ml該溶液與5g DL- α -生育酚和5ml鯊烯的混合物混合，然后使該混合物微流體化。 得到的乳液含有(如)平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約ISOnm的亞微米油滴。該乳液也可含有3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A ( ‘3d-MPL’)。此種類型的另一種有用乳液可包含(每個(gè)人用劑量)0. 5-10mg鯊烯、0. 5-1 Img生育酚和0. Hmg聚山梨酯80 [83]。 鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。該乳液也可包含3d_MPL (見下)。該乳液可含有磷酸鹽緩沖液。含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污劑(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸 α-生育酚)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75 11 10(如750yg/ ml聚山梨酯80，110 μ g/ml曲通X-100和100 μ g/ml琥珀酸α -生育酚)，這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。該乳液還可包含鯊烯。該乳液也可包含3d-MPL。水相可含有磷酸鹽緩沖液。鯊烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401 (〃普流羅尼克 L121")的乳液?？梢杂昧姿猁}緩沖鹽水，PH 7. 4配制該乳液。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽的遞送載體，已與蘇氨酰-MDP—起使用，例如"SAF-I “佐劑(0. 05-1% Thr-MDP、5%鯊烯、2. 5%普流羅尼克L121和0. 2%聚山梨酸酯80) [84]。也可不與Thr-MDP 一起使用，例如"AF"佐劑(5%鯊烯、1. 25%普流羅尼克L121和0. 2%聚山梨酸酯80) [85]。優(yōu)選微流體化?！ず絮徬?、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧乙烯(1 十六十八醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如去水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如去水山梨糖醇單油酸酯或‘司盤80’)的乳液。該乳劑優(yōu)選為熱可逆的和/或其中至少90%油滴(以體積計(jì))的尺寸小于200nm[86]。該乳劑也可含有以下一種或多種物質(zhì)糖醇；低溫保護(hù)劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷 (alkylpolyglycoside)。該乳液可包含TLR4激動(dòng)劑[87]。這類乳液可以被凍干?！そ酋徬?、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[88]。含佐劑疫苗中這些組分的終濃度(重量)是5%鯊烯、4%泊洛沙姆-105(普流羅尼克多元醇)和2% Abil-Care 85 (雙-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。含有0. 5-50%油、0. 1-10%磷脂和0. 05_5%非離子型表面活性劑的乳液。如參考文獻(xiàn)89述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴尺寸。·不可代謝油(如輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液?？砂砑觿?，例如QuilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂體偶聯(lián)物(如通過葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫?；碥丈隙a(chǎn)生的GPI-0100，參見參考文獻(xiàn) 90、二甲基二-十八烷基溴化銨和/或N，N-二-十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺。 皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如膽固醇)結(jié)合成螺旋膠束的乳液[91]?！ぐV物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如， 乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[92]。·包含礦物油、非離子親水性乙氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(例如， 乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[92]。不管是以獨(dú)立形式存在還是已經(jīng)與至少一種抗原混合，乳液可在遞送時(shí)即時(shí)與包含抗原的獨(dú)立組分混合。這兩種組分是液體時(shí)，混合兩種液體的體積比可變(例如 5:1-1: 5)，但通常約為1 1?？乖妥魟┗旌虾?，血凝素抗原通常保留在水溶液中，但其本身可分布于油/水界面附近。通常，很少(如果有)血凝素會(huì)進(jìn)入該乳液的油相。藥盒組分的包裝適用于本發(fā)明藥盒組分的容器包括藥瓶、注射器(如一次性注射器)等。這些容器應(yīng)無菌。可將容器包裝在一起成為藥盒，如裝在同一個(gè)盒子里。組分裝在藥瓶中時(shí)，藥瓶可由玻璃或塑料制成。在將組合物加入藥瓶之前，優(yōu)選對(duì)其進(jìn)行滅菌。為了避免膠乳過敏患者可能產(chǎn)生的問題，藥瓶優(yōu)選用無膠乳塞子密封，且優(yōu)選所有包裝材料均不含膠乳。藥瓶可包括單一劑量的疫苗，或者可以包括一個(gè)以上劑量('多劑量'藥瓶)，如10個(gè)劑量。有用的藥瓶由無色玻璃制成。與鈉鈣玻璃相比，更優(yōu)選硼硅酸鹽玻璃。藥瓶可具有由丁基橡膠制成的瓶塞。藥瓶可以有適合的帽(如Luer鎖)，以便將注射器插入該帽。該瓶帽可以位于密封層或覆蓋物內(nèi)側(cè)，以便在去除密封層或覆蓋物后才能接觸到該帽。藥瓶，特別是多劑量藥瓶裝有瓶帽，以便無菌地取出其內(nèi)含物。
某組分包裝到注射器中時(shí)，該注射器可連有針頭。如果未連接針頭，可隨注射器提供單獨(dú)的針頭以便組裝和使用。這種針頭可裝在護(hù)罩中。注射器的活塞可帶有抑止裝置， 以防止活塞在吸出時(shí)偶然脫出。注射器可以有膠乳橡膠帽和/或活塞。一次性注射器含有單一劑量的疫苗。注射器通常帶有頂帽，以在連接針頭前密封頂端，頂帽可由丁基橡膠制成。如果注射器和針頭分開包裝，那么針頭優(yōu)選裝有丁基橡膠護(hù)罩。有用的注射器是以商品名〃 Tip-Lok" "^銷售的注射器。容器可標(biāo)注有半劑量體積，以利于遞送給兒童。例如，含有0. 5ml劑量的注射器可標(biāo)有0. 25ml體積的標(biāo)記?？蓪⑺幒谢蚪M合物與單頁宣傳品包裝在一起(在同一個(gè)盒子中)，所述單頁宣傳品包括疫苗的詳細(xì)情況如給藥說明書、疫苗內(nèi)所含抗原的詳情等。通常多組分產(chǎn)品包含多于病人給藥所需的材料，以便在材料傳送中出現(xiàn)損失時(shí)， 仍可以得到完全的最終劑量體積。因此獨(dú)立的容器可包含過度灌裝的材料，例如超過 5-20%體積的材料。治療方法和疫苗的給藥混合后，本發(fā)明組合物適合給予人類患者，本發(fā)明提供了一種在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括將混合的本發(fā)明組合物給予患者的步驟。本發(fā)明也提供一種在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括混合本發(fā)明藥盒中容器 (或注射器室)內(nèi)容物和將混合的內(nèi)容物給予患者的步驟。本發(fā)明也提供用作藥物的本發(fā)明藥盒。本發(fā)明還提供A和B在制備在病人中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用，其中A是第一容器的內(nèi)容物，B是第二容器的內(nèi)容物，如上所述。所述應(yīng)用還可包含使用C，其中C是第三容器的內(nèi)容物，如上所述。這些方法和應(yīng)用通常用于產(chǎn)生抗體應(yīng)答，優(yōu)選保護(hù)性抗體應(yīng)答。評(píng)價(jià)接種流感病毒疫苗后抗體應(yīng)答、中和能力和保護(hù)水平的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。人類研究表明，對(duì)人流感病毒血凝素的抗體效價(jià)與保護(hù)作用相關(guān)聯(lián)(約30-40的血清樣品血凝反應(yīng)-抑制效價(jià)對(duì)同源病毒感染產(chǎn)生約50%保護(hù)作用)[93]。一般通過血凝反應(yīng)抑制、微量中和、單徑向免疫擴(kuò)散和/或單徑向溶血(SRH)來測(cè)定抗體應(yīng)答。本領(lǐng)域熟知這些測(cè)定技術(shù)。可以各種方式給予本發(fā)明組合物。最優(yōu)選的免疫途徑是肌肉內(nèi)注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)[94-96]、口服[97]、口頰、舌下、皮內(nèi) [98，99]、經(jīng)皮、透皮[100]給藥等?？衫冒凑毡景l(fā)明制備的疫苗治療兒童和成年人。目前，推薦將流感疫苗用于年齡大于6個(gè)月的兒童和成年人免疫。因此，患者可以小于1歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接受該疫苗的優(yōu)選患者是老年人(例如> 50歲、> 60歲，優(yōu)選> 65歲)、年輕人(如< 5歲)、住院患者、健康護(hù)理工作人員、軍隊(duì)服務(wù)人員和軍人、妊娠婦女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者、在接受該疫苗前7天接受過抗病毒化合物(如奧塞米韋或扎那米韋化合物；見下)的患者、對(duì)雞蛋過敏的人和出國旅行者。然而該疫苗不只適用于這些人群，可以在更廣泛的人群中使用。本發(fā)明優(yōu)選組合物的功效滿足CHMP標(biāo)準(zhǔn)的1、2或3。在成年人(18_60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是(1)彡70%血清保護(hù)；(2)彡40%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT增加彡2. 5倍。在老年人(>60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是(1)彡60%血清保護(hù)；( 彡30%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3) GMT增加彡2倍。這些標(biāo)準(zhǔn)基于至少50位患者的開放標(biāo)記研究?？梢酝ㄟ^單劑量方案或多劑量方案進(jìn)行治療。多劑量可以用于初免方案和/或加強(qiáng)免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同途徑給予各種劑量，例如初免采用胃腸道外途徑而加強(qiáng)免疫采用粘膜途徑，或者初免采用粘膜途徑而加強(qiáng)免疫采用胃腸道外途徑等。給予一個(gè)以上劑量(一般是兩個(gè)劑量)特別可用于免疫未曾免疫接觸的患者，例如從未接受過流感疫苗的人，或者用于包含新HA亞型的疫苗。一般以至少1周(例如約2周、 約3周、約4周、約6周、約8周、約12周、約16周等)的間隔給予多個(gè)劑量。在一個(gè)典型的免疫計(jì)劃中，在給予本發(fā)明的組合物(包含至少4種流感毒株，包括 A-H3、A-H1、A-H5和B)之前，分別給予病人至少一次三價(jià)季節(jié)性流感疫苗(包括Α_Η3、Α_Η1 和B抗原)，以及至少一次大流行流感疫苗(通常是單價(jià)Α-Η5疫苗)?？墒褂迷?-價(jià)疫苗對(duì)這兩種免疫應(yīng)答進(jìn)行加強(qiáng)。因此病人可能已經(jīng)具有可分化為抗體分泌型漿細(xì)胞的記憶B 細(xì)胞，所述抗體對(duì)抗Α-Η3、A-Hl、B和Α-Η5血凝素中的每一種。通常至少預(yù)先給予Α-Η5疫苗兩次。本發(fā)明提供了一種在病人中產(chǎn)生對(duì)抗4種流感病毒株(Η1Ν1甲型流感病毒株、 Η3Ν2甲型流感病毒株、大流行流感病毒如H5W甲型流感病毒株和乙型流感病毒株)的免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟(i)給予第一種流感病毒疫苗，包含來自Hmi甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原；(ii)給予第二種流感病毒疫苗，包含來自大流行流感病毒，如H5W甲型流感病毒的抗原；和(iii)給予第三種流感病毒疫苗，包含來自Hmi甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、大流行流感病毒和乙型流感病毒的抗原，其中步驟(i)和(ii)可(a)同時(shí)或(b)以任一順序進(jìn)行，但在步驟(iii)之前。本發(fā)明還提供用于本方法的第一疫苗和第二疫苗。第一疫苗通常為3-價(jià)，第二疫苗為1-價(jià)，第三疫苗為 4-價(jià)。本發(fā)明還提供一種在病人中產(chǎn)生(如加強(qiáng))免疫應(yīng)答的方法，包括給予病人流感病毒疫苗，所述疫苗包含來自Hmi甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、大流行流感病毒(例如H5甲型流感病毒，如H5N1)和乙型流感病毒的抗原，其中病人以前分別接受過(a)包含來自Hmi甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原的流感病毒疫苗(例如，3-價(jià))，以及(b)包含來自大流行流感病毒的抗原的流感病毒疫苗(例如，1-價(jià))。本發(fā)明還提供一種在病人中產(chǎn)生(如加強(qiáng))免疫應(yīng)答的方法，包括給予病人流感病毒疫苗，所述疫苗包含來自Hmi甲型流感病毒，H3N2甲型流感病毒，大流行流感病毒 (例如H5甲型流感病毒，如H5W)和乙型流感病毒的抗原，之后分別給予病人(a)包含來自Hmi甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原的流感病毒疫苗(例如， 3-價(jià))，以及(b)包含來自大流行流感病毒的抗原的流感病毒疫苗(例如，1-價(jià))?？蓪⒈景l(fā)明產(chǎn)生的疫苗與其它疫苗基本上同時(shí)(在健康護(hù)理專業(yè)人員或疫苗接種中心的同一用藥咨詢或訪問期間)給予患者，例如與麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、 MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶聯(lián)的B型流感嗜血桿菌疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗(如四價(jià)A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶聯(lián)疫苗等同時(shí)給藥。在老年患者中特別有用的是與肺炎球菌疫苗和/或腦膜炎球菌疫苗基本上同時(shí)給藥。
相似地，可將本發(fā)明疫苗與抗病毒化合物，具體是對(duì)流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奧塞米韋和/或扎那米韋)基本上同時(shí)給予患者(在對(duì)健康護(hù)理專業(yè)人員進(jìn)行的同一用藥咨詢或訪問期間)。這些抗病毒化合物包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑，如(3R， 4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)環(huán)己烯羧酸或5-(乙?；被?-4-[(氨基亞氨基甲基)_氨基]-2，6-脫水-3，4，5-三脫氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括它們的酯(如乙酯)和鹽(如磷酸鹽)。優(yōu)選的抗病毒化合物是(3R， 4R，5S) -4-乙?；被?5-氨基-3 (1-乙基丙氧基)環(huán)己烯-1-羧酸的乙酯和磷酸鹽 (1 1)，也稱為磷酸奧塞米韋(TAMIFLU )。第一和第二容器的
具體實(shí)施例方式在一些實(shí)施方式中，所述第一容器(或注射器室)包括含有來自甲型流感病毒 HlNl和H3N2毒株的抗原以及來自乙型流感病毒的抗原的3-價(jià)流感疫苗，并且所述第二容器(或注射器室)包括含有來自甲型流感病毒H5W毒株，例如A/VietNam/1194/2004毒株 (如NIBRG-14)或A/火雞/Turkey/1/05毒株(如NIBRG-23)的抗原的1_價(jià)流感疫苗。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述3-價(jià)疫苗是從雞蛋或MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的病毒中制備的純化表面抗原疫苗，并且所述1-價(jià)疫苗也是從雞蛋或MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的病毒中制備的純化表面抗原疫苗。 所述3-價(jià)疫苗不含佐劑，但是所述1-價(jià)疫苗含有水包鯊烯乳液作為佐劑。所述3-價(jià)疫苗包含15 μ g HA/毒株，但所述1-價(jià)疫苗包含7. 5 μ g HA。給予人時(shí)將3-價(jià)和1-價(jià)疫苗以 1 1體積比混合，例如得到Iml的給藥體積。所述1-價(jià)疫苗的制備如下將0. 25ml乳液Qx強(qiáng)度)與0. 25ml散裝抗原混合得到所需的最終濃度，例如與FLUAD 類似，但含有1/2抗原劑量的H5W毒株。在另一實(shí)施方式中，所述3-價(jià)疫苗是從雞蛋培養(yǎng)的病毒中制備的滅活疫苗(通常是裂解疫苗)，并且所述1-價(jià)疫苗是從雞蛋培養(yǎng)的病毒中制備的裂解疫苗。所述3-價(jià)疫苗不含佐劑，所述1-價(jià)疫苗含有佐劑，但是它們均與水包鯊烯乳液混合。所述3-價(jià)疫苗每一劑量包含15 μ g HA/毒株，但所述1-價(jià)疫苗每一劑量包含3. 75 μ g HA。因此每一劑量的4-價(jià)混合產(chǎn)品包含H1N1、H3N2和乙型流感病毒HA各15 μ g以及3. 75 μ g H5N1病毒 HA。所述1-價(jià)容器中的抗原濃度可以是15 μ g/ml。所述1-價(jià)疫苗可包含硫柳汞(例如， 20 μ g/ml或10 μ g/ml)。所述乳液包含鯊烯、DL- α -生育酚和聚山梨酯80，質(zhì)量比例分別為2. 2 2.45 1，例如1068 1186 485。人用劑量由3-價(jià)和1-價(jià)疫苗和乳液混合得到，例如由0. 5ml 3-價(jià)、0. 25ml 1-價(jià)和0. 25ml乳液混合得到。給藥方案本發(fā)明還提供了 4-價(jià)流感疫苗的給藥方案，其中在6-18個(gè)月間分別給予病人兩次4-價(jià)疫苗。所述4-價(jià)疫苗可如上所述即時(shí)制備，或者預(yù)混(例如，廠商以4-價(jià)混合疫苗進(jìn)行發(fā)售)。因此本發(fā)明提供了一種對(duì)人進(jìn)行免疫的方法，包括以下步驟(a)給予該人第一 4-價(jià)流感疫苗；然后在180天至540天后(b)給予同一人第二 4-價(jià)流感疫苗。本發(fā)明還提供了通過該方法對(duì)人進(jìn)行免疫的第一和第二 4-價(jià)流感疫苗。本發(fā)明還提供了第一和第二 4-價(jià)流感疫苗在制備對(duì)人進(jìn)行免疫的藥物中的應(yīng)用，其中第一和第二疫苗以180天至540天的間隔給予同一人。本發(fā)明還提供第一 4-價(jià)流感疫苗在制備對(duì)人進(jìn)行預(yù)先免疫的藥物的應(yīng)用，其中在180天至540天后給予所述人第二 4-價(jià)流感疫苗。本發(fā)明還提供了第二 4-價(jià)流感疫苗在制備對(duì)人進(jìn)行免疫的藥物的應(yīng)用，其中在第一次給予疫苗前180天至540天給予所述人第一 4-價(jià)流感疫苗。第一 4-價(jià)疫苗通常包括的免疫原來自(i)Hmi甲型流感病毒株；(ii)H3N2甲型流感病毒株；(iii)H5m甲型流感病毒株；和(iv)乙型流感病毒株。第二 4-價(jià)疫苗通常包括的免疫原也來自(i)Hmi甲型流感病毒株；(ii)H3N2甲型流感病毒株；(iii)H5m甲型流感病毒株；和(iv)乙型流感病毒株。第一和第二疫苗可以相同，但是通常有至少一種毒株不同，例如，它們可包含來自不同A/Hmi毒株和/或不同A/H3N2毒株和/或不同A/H5m 毒株和/或不同B毒株的血凝素。因此在一些實(shí)施方式中，第一 4-價(jià)疫苗和第二 4-價(jià)疫苗中僅有一種血凝素相同。在一些實(shí)施方式中，第一 4-價(jià)疫苗和第二 4-價(jià)疫苗中僅有兩種血凝素相同。在一些實(shí)施方式中，第一 4-價(jià)疫苗和第二 4-價(jià)疫苗中僅有三種血凝素相同。在比較不典型的實(shí)施方式中，第一 4-價(jià)疫苗和第二 4-價(jià)疫苗中四種血凝素都相同。如果不包含來自H5W甲型流感病毒的免疫原，第一和第二疫苗可包含來自另一種非-Hl和非-H3甲型流感亞型的免疫原；例如來自H2、H5 (但不是H5N1)、H7或H9甲型流感病毒，例如H5N3、H9N2、H2N2、H7N1或H7N7毒株的免疫原。第一和第二 4-價(jià)疫苗通常類型相同，即都是活病毒疫苗，都是全病毒顆粒疫苗， 都是裂解病毒顆粒疫苗，都是純化表面抗原疫苗，或者都是病毒體疫苗。通常第一和第二疫苗都是滅活的。第一和第二 4-價(jià)疫苗可以都包含佐劑。合適的佐劑如上所述。然而在一些實(shí)施方式中，僅第一疫苗含有佐劑。在比較不典型的實(shí)施方式中，兩種疫苗都不含佐劑。通常兩種疫苗在連續(xù)流感季節(jié)進(jìn)行給藥，例如相距10-14個(gè)月，如相距11、12或13 個(gè)月給藥。概述術(shù)語“含有”包括“包含”以及“由…組成”，例如“含有” X的組合物可僅由X組成或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。術(shù)語〃基本上〃不排除〃完全〃，如〃基本上不含〃 Y的組合物可能完全不含Y。 必要時(shí)，可從本發(fā)明定義中刪去術(shù)語"基本上"。與數(shù)值χ相關(guān)的術(shù)語“約”是任選的，其表示(例如)x士 10%。除非另有說明，包括混合兩種或更多種組分的步驟的方法不要求任何特定的混合順序。因此，可以任何順序混合這些組分。有三種組分時(shí)，兩種組分可以相互混合，然后將混合的組分再與第三種組分混合等。將動(dòng)物(特別是牛)材料用于培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，它們應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀腦病 (TSE)，特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來源。總之，優(yōu)選在完全不含動(dòng)物來源物質(zhì)的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)某化合物作為組合物的一部分給予人體時(shí)，該化合物可被合適的前藥所替換。當(dāng)細(xì)胞底物用于重配或反向遺傳學(xué)方法時(shí)，或用于培養(yǎng)病毒時(shí)，優(yōu)選批準(zhǔn)用于人類疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞底物，例如Wi Eur總綱5. 2. 3所述的細(xì)胞底物。附圖
簡述無附圖。
具體實(shí)施例方式制備包含來自A/H1N1、A/H3N2和乙型流感毒株的純化表面糖蛋白的季節(jié)性流感疫苗。抗原濃度為每毫升30 μ g HA/毒株，相當(dāng)于15 μ g/毒株/劑量。基于來自甲型流感病毒H5W毒株(進(jìn)化支1)的純化表面糖蛋白制備前大流行疫苗。最終抗原濃度為15yg HA/ml，相當(dāng)于7.5yg/劑量。將h強(qiáng)度的散裝抗原與MF59水包油乳液佐劑( 強(qiáng)度)以1 1體積比混合得到最終疫苗(Ix強(qiáng)度)。使用時(shí)將這兩種疫苗各0. 5ml混合，以組合形式給予病人，總體積為1ml。為了比較，其它病人在不同手臂上分別接受這兩種疫苗。給予兩組對(duì)照季節(jié)性疫苗或者前大流行疫苗。將總共405個(gè)健康成人(年齡18-40歲)隨機(jī)等分為8個(gè)治療組個(gè)對(duì)象 /組)。在第1天，三組在一只手臂接受前大流行疫苗，另一手臂同時(shí)接受季節(jié)性疫苗(‘ 錐形'組)，另外三組接受前大流行疫苗和季節(jié)性疫苗的即時(shí)混合物和(‘混合'組)。在第22天，來自'錐形'和'混合'組的對(duì)象僅接受前大流行疫苗、混合疫苗，或者不接受疫苗。兩個(gè)交叉對(duì)照組在第1天接受前大流行或季節(jié)性疫苗，并在第22天換成接受另一疫
田ο在第1、22和43天，通過血凝反應(yīng)(HI)、微量中和(MN)和單徑向溶血(SRH)評(píng)價(jià)抗體。以用于評(píng)價(jià)季節(jié)性疫苗的CHMP標(biāo)準(zhǔn)(CPMP/BWP/214/96)對(duì)結(jié)果進(jìn)行詮釋。除過去接受過流感疫苗的對(duì)象比例(總體平均15% )外，研究組間的基線特征通常相似。在HI分析中，在接受季節(jié)性疫苗的7組中，在所有三種季節(jié)性毒株首次接種免疫后，均達(dá)到了用于評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的所有三個(gè)CHMP標(biāo)準(zhǔn)。接受兩次前大流行疫苗的4組中，在第二次疫苗接種后，H5N1毒株的SRH實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿足所有CHMP標(biāo)準(zhǔn)，而與共同給予季節(jié)性疫苗所用的方法無關(guān)。在MN H5W實(shí)驗(yàn)中觀察到的結(jié)果相當(dāng)。當(dāng)與季節(jié)性流感疫苗組合給予時(shí)，含佐劑的H5W前大流行疫苗具有免疫原性且耐受良好。單獨(dú)、同時(shí)或者與前大流行疫苗混合給予季節(jié)性疫苗時(shí)，對(duì)季節(jié)性流感病毒株的免疫應(yīng)答相似。在單獨(dú)的工作中，作為擴(kuò)大研究的一部分，18-40歲間的99名健康成人在季節(jié)性疫苗(2007季節(jié))給藥前或者給藥后3周接受一次前大流行疫苗的給藥。1年后使用混有季節(jié)性疫苗(2008季節(jié))的來自不同毒株(進(jìn)化支幻的抗原給予加強(qiáng)H5W劑量。在1、2 和3周后通過HI、MN和SRH測(cè)量對(duì)抗兩種H5毒株的抗體以評(píng)價(jià)交叉反應(yīng)性，并評(píng)價(jià)血清轉(zhuǎn)化(SC)和血清保護(hù)(彡40，SP)。在單劑量初免后，接種3周后前大流行疫苗得到相似的對(duì)抗同源和異源病毒的 SC( > 40% )和SP( > 40% )率。異源加強(qiáng)免疫在一周內(nèi)明顯產(chǎn)生回憶應(yīng)答，表明在超過 90%對(duì)象中產(chǎn)生免疫記憶，得到的SC和SP率與雙劑量同源初免后觀察到的相同。同源和異源毒株產(chǎn)生的SC和SP均達(dá)到并超過了 CHMP標(biāo)準(zhǔn)。因此，單次給予前大流行疫苗足以啟動(dòng)免疫記憶，持續(xù)至少一年。而且，異源加強(qiáng)免疫引起超過CHMP許可標(biāo)準(zhǔn)的回憶免疫應(yīng)答。因此可將H5W的異源毒株與季節(jié)性疫苗聯(lián)用，在單次前大流行初免給藥后1年進(jìn)行加強(qiáng)免疫。應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，可以進(jìn)行修改而仍在本發(fā)明的范圍和構(gòu)思內(nèi)。參考文獻(xiàn)(通過引用將其全文納入本文)[1]W02008/068631.[2]W02005/089837.[3]美國專利 6，692，468.[4]W000/07647.[5]W099/17820.[6]美國專利 5，971，953.[7]美國專利 4，060，082.[8]EP-A-0520618.[9]W098/01174.[10]W002/28422.[ll]W002/067983.[12]W002/074336.[14]W002/097072.[15]W02005/113756.[16]Huckriede 等 O003)Methods Enzymol 373 :74-91.[17]Treanor ^ (1996) J Infect Dis 173:1467-70.[18]Keitel 等(1996)Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10.[19]Saito 等(2004) J Med Virol 74(2) :336-43.[20]Kistner 等(1998)Vaccine 16 :960-8.[21]Kistner 等(1999)Dev Biol Stand 98:101-110.[22]Bruhl 等 QOOO) Vaccine 19:1149-58.[23]Pau 等 O001) Vaccine 19:2716-21.[24]http://www. atcc. org/[25] http://locus, umdnj. edu/[26]W003/076601.[27]W02005/042728.[28]W003/043415.[29]W001/85938.[30]W02006/108846.[31]W097/37000.[32]Brands 等(1999)Dev Biol Stand 98 :93-100.[33]Halperin 等 Q002) Vaccine 20:1240-7.[34]Tree 等 O001) Vaccine 19:3444-50.[35]EP-A-1260581 (WOO1/64846).[36]W02006/071563.[37]W02005/113758.[38]W097/37001.
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權(quán)利要求
1.一種藥盒，其包括(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2 甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自H5W甲型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述第一容器中 HlNU H3N2和乙型流感抗原各自的濃度范圍是25-35 μ g/ml (血凝素)。
2.如權(quán)利要求1所述的藥盒，其特征在于，所述第二容器中H5W抗原的濃度范圍是 5-20 μ g/ml (血凝素)，例如范圍是10-20 μ g/ml (血凝素)。
3.一種藥盒，其包括(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2 甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自H5W甲型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述第二容器中 H5N1血凝素抗原的濃度范圍是5-20 μ g/ml。
4.一種藥盒，其包括(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自H5W甲型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述第一和第二容器中水性疫苗的體積基本相同，各自范圍是約0. 4-0. 6ml。
5.一種藥盒，其包括(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自H5W甲型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述第一容器中水性疫苗的體積基本是所述第二容器中水性疫苗體積的兩倍。
6.一種藥盒，其包括(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自H5W甲型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述每種容器是硼硅玻璃小瓶。
7.一種藥盒，其包括(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自H5W甲型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗，其特征是所述H5m甲型流感病毒株屬于進(jìn)化支1、2或者4。
8.如權(quán)利要求7所述的藥盒，其特征在于，所述H5W甲型流感病毒株屬于進(jìn)化支2.1、 2. 2 或 2. 3。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的藥盒，其特征在于，所述第一容器不含佐劑，但是所述第二容器含有佐劑。
10.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的藥盒，其特征在于，所述第一和第二容器均不含佐劑，并且所述藥盒包含含有水包油乳液佐劑的第三容器。
11.一種藥盒，其包括(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2 甲型流感病毒株、H5N1甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和 (ii)第二容器，其中裝有水包油乳液佐劑。
12.一種藥盒，其包括(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2 甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的凍干滅活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中裝有含有來自H5W甲型病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗。
13.如權(quán)利要求12所述的藥盒，其特征在于，所述第二容器包含水包油乳液。
14.一種藥盒，其包括(i)第一容器，其中裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2 甲型流感病毒株、H5N1甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的凍干滅活流感疫苗；和 ( )第二容器，其中裝有水包油乳液佐劑。
15.一種含有多個(gè)分離室的注射器，其中(i)第一室裝有含有來自Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗；和(ii)第二室裝有含有來自H5W甲型病毒株的抗原的水性滅活流感疫苗。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的藥盒或注射器，其特征在于，所述Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、乙型流感病毒株和H5W甲型流感病毒株都是用雞蛋培養(yǎng)的。
17.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的藥盒或注射器，其特征在于，所述Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、乙型流感病毒株和H5W甲型流感病毒株都是用細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)的。
18.如權(quán)利要求17所述的藥盒或注射器，其特征在于，所述容器中不含禽類DNA、卵清蛋白和卵類粘蛋白。
19.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的藥盒或注射器，其特征在于，所述Hmi甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株用第一基材培養(yǎng)，H5W甲型流感病毒株用第二基材培養(yǎng)，其中所述基材中一種是雞蛋，另外一種是細(xì)胞培養(yǎng)物。
20.—種在病人中產(chǎn)生對(duì)抗4種流感病毒株(H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、H5W甲型流感病毒株和乙型流感病毒株)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以下步驟⑴給予第一種流感病毒疫苗，其包含來自Hmi甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原；(ii)給予第二種流感病毒疫苗，其包含來H5W甲型流感病毒，如H5m 甲型流感病毒的抗原；和(iii)給予第三種流感病毒疫苗，其包含來自Hmi甲型流感病毒、 H3N2甲型流感病毒、H5N1甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原，其中步驟(i)和(ii)可 (a)同時(shí)或(b)以任一順序進(jìn)行，但在步驟(iii)之前進(jìn)行。
21.一種在病人中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予病人含有來自HlN 1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、H5W甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原的流感病毒疫苗，其中所述病人以前分別接受過(a)含有來自Hmi甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原的3-價(jià)流感病毒疫苗，以及(b)含有來自H5W甲型流感病毒的抗原的單價(jià)流感病毒疫苗。
22.—種在病人中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予病人含有來自Hmi甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、H5W甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原的流感病毒疫苗， 之后分別給予所述病人(a)含有來自Hmi甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原的3-價(jià)流感病毒疫苗，以及(b)含有來自H5W甲型流感病毒的抗原的單價(jià)流感病毒疫苗。
全文摘要
本發(fā)明流感疫苗接種方案針對(duì)季節(jié)性毒株或大流行毒株。目前，季節(jié)性疫苗一般包含來自兩種甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一種乙型流感毒株的抗原。本發(fā)明大流行疫苗針對(duì)H5N1甲型流感病毒株。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供制備可引起對(duì)季節(jié)性和大流行毒株免疫的疫苗的深入和改良的途徑。
文檔編號(hào)A61K39/39GK102245203SQ200980123098
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日
發(fā)明者A·班佐夫, R·克萊門斯 申請(qǐng)人:諾華有限公司