專利名稱：一種從麝鼠香中制備具有抗血栓形成活性的物質(zhì)的方法以及由該方法獲得的物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從麝鼠香中制備抗血栓形成劑的方法，以及由該方法 獲得的具有高效能的抗血栓形成劑。更具體地說，本發(fā)明涉及一種從麝鼠 香中制備抗血栓形成劑的方法，以及由該方法獲得的具有高效能的抗血栓 形成劑，該方法包括，用有機(jī)溶劑處理麝鼠香以獲得有機(jī)溶劑提取物，進(jìn) 行兩次正相柱層析和一次反相柱層析以獲得多個(gè)級(jí)分，并且測量每一級(jí)分 的凝血酶時(shí)間。
背景技術(shù)：
麝鼠(OwtorazA"/7/cw)為哺乳動(dòng)物，屬于嚙齒目鼠科，為橢圓形， 身長約35cm，尾長25cm，重約lkg。麝鼠通常鄰近充滿雜草的沼澤和湖泊。 麝鼠在春天至深秋活動(dòng)，冬天活動(dòng)有限。麝鼠為食草動(dòng)物，但也吃魚或水 生動(dòng)物。麝鼠實(shí)行單配偶，并且具有良好的繁殖能力。雌性麝鼠4月至9 月繁殖， 一年產(chǎn)2或3窩。雄性麝鼠通過副生殖腺從位于下腹部的兩個(gè)香 囊分泌麝香，這是它要繁殖的性興奮的征兆。麝鼠香是一種呈膚色的液體， 具有甘甜的氣味，而一只雄性麝鼠平均一年產(chǎn)5至8g麝鼠香。
麝鼠香的組成和藥理作用，與麝鹿的麝香相似。因此，將其作為一種 替代來源于麝鹿的麝香的藥用原料是值得關(guān)注的。
直到最近，大多數(shù)的天然麝香是從麝鹿中獲得的，并且作為藥用原料。 然而，在CITES (瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約)條約中，將麝鹿列為 瀕危動(dòng)物，并將其指定為一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，因此屠殺和繁殖麝鹿以獲取麝香 都是被禁止的。因此，利用從麝貓中獲得的麝貓香作為藥用原料，但是所 能得到的量非常少，并且自從麝貓被認(rèn)為是SARS的來源，目前麝貓已被 屠殺和消毒。
因此，麝鼠具有發(fā)展成為家畜產(chǎn)業(yè)的一種新的動(dòng)物來源的高潛力。更 進(jìn)一步地，由于麝鼠香與來源于麝鹿的麝香具有相似的藥理作用，它具有
4發(fā)展成為替代來源于麝鹿的麝香的藥用原料，以及發(fā)展成為化妝品和香料 的高潛力。
同時(shí)，阿司匹林公知具有抗血栓形成作用，能預(yù)防心力衰竭/血液凝結(jié)， 減弱心臟病發(fā)作時(shí)的心臟損傷，并且它能有效地減輕例如與負(fù)重練習(xí)相關(guān) 的肌肉痛的疼痛，消除輕傷的疼痛、治療炎癥、緩解發(fā)熱、消除頭痛、消 除膝蓋和肩部的慢性痛等等。然而，阿司匹林具有缺點(diǎn)，它會(huì)稀釋血液， 從而導(dǎo)致出血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)，并且會(huì)降低消化能力，長期施用會(huì)導(dǎo)致胃痙 攣。此外，兒童和青少年施用阿司匹林，會(huì)患上致命的雷耶綜合征(一種 在嬰兒中常見的腦損傷)。
施用抗血栓形成劑，以預(yù)防心血管疾病，例如心力衰竭、中風(fēng)等等，
上市藥物例如Plavix片(Sanofi-Aventis)、 Asprinprotect片(Bayer)、培達(dá) 片(Otsuka Pharm.)、 Disgren膠囊(Myoung-In Pharmaceutical Co., Ltd)、 Opalmon片(Dong A Pharmaceutical Co" Ltd.)等等，在韓國，2006-2007 年間被開具抗血栓形成劑處方的患者中有超過半數(shù)施用這些藥物。
因?yàn)镻lavix片的專利到期，含有200mg雙嘧達(dá)莫和25mg阿司匹林的 組合藥物AggrenoxR (Behringer Ingelheim)變得備受關(guān)注。AggrenoxR比阿 司匹林更有效，并且其對(duì)中風(fēng)恢復(fù)患者有顯著療效。
然而，沒有任何從麝鼠香中分離具有抗血栓形成活性的物質(zhì)的研究
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明人致力于從麝鼠香中分離具有有效的抗血栓形成活性的物質(zhì)， 己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有比阿司匹林更高的抗血栓形成活性的物質(zhì)。
本發(fā)明的一個(gè)目的，是提供一種從麝鼠香中制備高效的抗血栓形成劑 的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的，是提供一種包含該抗血栓形成劑的抗血栓形成 組合物。 技術(shù)方案
第一方面，本發(fā)明提供了一種從麝鼠香中制備抗血栓形成劑的方法， 該方法包括以下步驟
用選自乙醇、甲醇、己垸和乙酸乙酯的有機(jī)溶劑處理麝鼠香， 行振搖提取，離心有機(jī)溶劑提取物，獲得上清液(第1步)；
對(duì)上清液進(jìn)行第1次正相柱層析，獲得各級(jí)分(第2步)；對(duì)各級(jí)分進(jìn)行薄層層析以確定級(jí)分的物質(zhì)圖譜，并且將其分組(第3
步)；
測量所劃分的各組的凝血酶時(shí)間，并且選擇出顯示最強(qiáng)抗血栓形成活性的一組(第4步)；
對(duì)選擇出的組進(jìn)行第2次正相柱層析，獲得各級(jí)分(第5步)；對(duì)各級(jí)分進(jìn)行薄層層析以確定級(jí)分的物質(zhì)圖譜，并且將其分組(第6
步)；
測量所劃分的各組的凝血酶時(shí)間，并且選擇出顯示最強(qiáng)抗血栓形成活性的一組(第7步)；
對(duì)選擇出的組進(jìn)行第3次反相柱層析，獲得各級(jí)分(第8步)；
對(duì)各級(jí)分進(jìn)行反相薄層層析以確定級(jí)分的物質(zhì)圖譜，并且將其分組(第
9步)；以及
測量所劃分的各組的凝血酶時(shí)間，并且選擇出顯示最強(qiáng)抗血栓形成活
性的一組(第10步)。
第二方面，本發(fā)明提供了一種由上述方法獲得的抗血栓形成劑，其具
有凝血酶時(shí)間超過40秒的高效能。
第三方面，本發(fā)明提供了一種治療血栓形成的組合物，該組合物包含根據(jù)第二實(shí)施方案的具有高效能的抗血栓形成劑。
在下文中，進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。
首先，凈取麝鼠香，并且保存于陰冷的房間。收集的麝鼠香用選自乙醇、甲醇、己垸和乙酸乙酯的有機(jī)溶劑處理，進(jìn)行振搖提取，離心，獲得上清液，作為有機(jī)溶劑提取物。為了達(dá)到提取
效果，100重量份的麝鼠香優(yōu)選使用10至20重量份的有機(jī)溶劑。
離心后的殘?jiān)儆孟嗤娜軇┨幚恚M(jìn)行振搖提取，離心，獲得上清
液，與上述步驟中制備的上清液一起作為有機(jī)溶劑提取物。
為達(dá)到最大的提取效果，采用振搖提取，但不限于以150至200rpm振
搖20至24小時(shí)。特別地，轉(zhuǎn)速低于150rpm振搖力弱，轉(zhuǎn)速高于200rpm
則損傷儀器，這都不是優(yōu)選的。振搖提取優(yōu)選重復(fù)三次或更多。
為得到最多的沉淀，在提取效果和經(jīng)濟(jì)因素方面最優(yōu)選的是，離心采用但不限于以8,000至20，000rmp離心10至20分鐘。
關(guān)于第2步，對(duì)有機(jī)溶劑提取物進(jìn)行第1次正相柱層析，獲得柱級(jí)分。柱填料采用正相硅膠(230至400目)，作為流動(dòng)相的有機(jī)溶劑包括但不限于己垸和極性高于己垸的另一種溶劑的溶劑組合，例如，己垸和乙酸乙酯、己垸和氯仿、己烷和丙酮、己烷和乙腈、乙酸乙酯和乙醇、或乙酸乙酯和甲醇，其中所述溶劑的組合比例由400:1增至1:1以獲得眾多級(jí)分。
關(guān)于第3步，第2步中所獲得的各級(jí)分進(jìn)行薄層層析以確定級(jí)分的物質(zhì)圖譜，并且將其分組。在展開效果(提取效果)方面優(yōu)選的是，薄層層析的展開劑為10:1至10:2的己烷:乙醚，或3:1至3的己垸:乙酸乙酯。
各級(jí)分的物質(zhì)圖譜的形成通過下列三個(gè)步驟按順序進(jìn)行
a) 將各級(jí)分暴露于短波長(254nm)燈和長波長(365nm)紫外燈，鑒別物質(zhì)圖譜；
b) 用10%硫酸處理薄層層析板，加熱以顯示著色的點(diǎn)，再一次鑒別物質(zhì)圖譜；以及
c) 根據(jù)步驟a)和b)所鑒別的圖譜，將具有相似移動(dòng)距離的物質(zhì)分組。
關(guān)于第4步，測量第3步中所劃分的各組的凝血酶時(shí)間，并且選擇顯示最強(qiáng)抗血栓形成活性的一組。凝血酶時(shí)間是指直至纖維蛋白原凝塊形成的時(shí)間，ia不限于此。例如，用Thrombitimer2 (Behnk Elektronik，德國)計(jì)數(shù)的加入凝血酶(T46481KU-59NIH單位/mg)和纖維蛋白原后直至形成纖維蛋白原凝塊的時(shí)間。
關(guān)于第5步，用第4步中所選擇的具有最高抗血栓形成活性的組進(jìn)行第2次正相柱層析，獲得柱級(jí)分。在提取效果和經(jīng)濟(jì)因素方面優(yōu)選的是，柱填料采用正相硅膠(230至400目)，并且如上所示，作為流動(dòng)相的溶劑選自己烷和乙酸乙酯、己垸和氯仿、己垸和丙酮、己垸和乙腈、乙酸乙酯和乙醇、乙酸乙酯和甲醇等等，其中所述溶劑的組合比例由70:1增至1:1。
關(guān)于第6步，第5步中所獲得的各級(jí)分進(jìn)行薄層層析以確定級(jí)分的物質(zhì)圖譜，并且將其分組。如上所示，薄層層析的展開劑為10:1至10:2的己垸:乙醚，或3:1至3的己烷:乙酸乙酯。
各級(jí)分的物質(zhì)圖譜的形成通過下列三個(gè)步驟按順序進(jìn)行
a)將各級(jí)分暴露于短波長(254nm)燈和長波長(365nm)紫外燈，鑒別物質(zhì)圖譜；
b) 用10%硫酸處理薄層層析板，加熱以顯示著色的點(diǎn)，再一次鑒別物質(zhì)圖譜；以及
c) 根據(jù)步驟a)和b)所鑒別的圖譜，對(duì)具有相似移動(dòng)距離的物質(zhì)分組。
關(guān)于第7步，測量第6步中所劃分的各組的凝血酶時(shí)間，并且選擇顯示最強(qiáng)抗血栓形成活性的一組。凝血酶時(shí)間是指纖維蛋白原凝塊形成的時(shí)間，但不限于此。例如，用Thrombitimer2 (Behnk Elektronik,德國)計(jì)數(shù)的加入凝血酶(T46481KU-59NIH單位/mg)和纖維蛋白原后，直至形成纖維蛋白原凝塊的時(shí)間。
關(guān)于第8步，對(duì)所選擇的組進(jìn)行第3次反相柱層析，獲得柱級(jí)分。在提取效果和經(jīng)濟(jì)因素方面優(yōu)選的是，柱填料采用反相硅膠(63至212)，作為流動(dòng)相的溶劑為選自乙腈、甲醇、乙醇和丙酮的有機(jī)溶劑與水混合而成，其中所述有機(jī)溶劑與水的組合比例由20:1增至1:1。
關(guān)于第9步，對(duì)第8步中所獲得的各級(jí)分進(jìn)行反相薄層層析以確定其物質(zhì)圖譜，并且將其分組。薄層層析的展開劑為40:1至60:1的乙腈:水，或1:1至2:1的乙酸乙酯:甲醇。
如上所示，各級(jí)分的物質(zhì)圖譜的形成通過下列三個(gè)步驟按順序進(jìn)行
a) 將各級(jí)分暴露于短波長(254nm)燈和長波長G65nm)紫外燈，鑒別物質(zhì)圖譜；
b) 用10%硫酸處理薄層層析板，加熱，顯色，再一次鑒別物質(zhì)圖譜；
并且
c) 根據(jù)步驟a)和b)鑒別的圖譜，將具有相似移動(dòng)距離的物質(zhì)分組。關(guān)于第10步，測量第9步中所劃分的各組的凝血酶時(shí)間，并且選擇顯
示最強(qiáng)抗血栓形成活性的組。
凝血酶時(shí)間是指直至纖維蛋白原凝塊形成的時(shí)間，但不限于此。例如，用 Thrombitimer2 ( Behnk Elektronik，德國)計(jì)數(shù)的加入凝血酶(T46481KU-59NIH單位/mg)和纖維蛋白原后直至形成纖維蛋白原凝塊的時(shí)間。
如圖8所示，在稀釋50倍的情況下，所獲得的抗血栓形成劑每0.002mg具有至少40秒的凝血酶時(shí)間，與阿司匹林每O.lmg具有15秒凝血酶時(shí)間
8相比，其顯示了超過三倍的顯著優(yōu)良的抗血栓形成效果，。
雖然該抗血栓形成劑的確切結(jié)構(gòu)還未確定，但假定其屬于具有25個(gè)碳原子、48個(gè)氫原子和2個(gè)氧原子的脂肪酸類。
此外，本發(fā)明提供了一種治療血栓形成的組合物，該組合物包含具有高效能的抗血栓形成劑。將已知的具有抗血栓形成作用的作為藥物的常規(guī)成分與該組合物混合，可以預(yù)期在治療血栓形成方面具有協(xié)同作用。有益效果
如上所述，本發(fā)明提供了一種從麝鼠香中獲得的、與阿司匹林相比具有高效能的抗血栓形成劑，以及一種包含該抗血栓形成劑的用于治療血栓形成的組合物，因此，這可以增加麝鼠香的附加價(jià)值。


圖1表示從麝鼠香中獲得溶劑提取物的流程圖。圖2表示從麝鼠香中分離抗血栓形成物質(zhì)的流程圖。圖3表示第1次正相柱層析所獲得的級(jí)分的薄層層析結(jié)果，其中該結(jié)果分組。
圖4表示在圖3中顯示的第1次正相柱層析所獲得的級(jí)分的凝血酶時(shí)間的圖表。
圖5表示在圖4中顯示的Bl-5級(jí)分的第2次正相柱層析所獲得的級(jí)分的薄層層析結(jié)果，其中該結(jié)果分組。
圖6表示在圖5中顯示的第2次正相柱層析所獲得的級(jí)分的凝血酶時(shí)間的圖表。
圖7表示在圖6中顯示的B2-6級(jí)分的第3次反相柱層析所獲得的級(jí)分的反相薄層層析結(jié)果，其中該結(jié)果分組。
圖8表示在圖7中顯示的第3次柱層析所獲得的級(jí)分的凝血酶時(shí)間的圖表。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式材料
本發(fā)明所必須使用的麝鼠香，是從釜山大學(xué)附屬的麝鼠機(jī)構(gòu)(muskrat-run)的麝鼠中獲取的。正相柱所用的柱填料為Merck (德國)硅膠(230至400目，美國試驗(yàn)與材料協(xié)會(huì))，并且反相柱所用的柱填料為Wako(日本)RP-18 (63至212口)硅膠。Thrombitimer2 (Behnk Elektronik，德
國)用于計(jì)數(shù)凝血酶時(shí)間，以確定柱層析所獲得的各級(jí)分的抗血栓形成活性。
實(shí)施例l:麝鼠香的乙醇提取物
參見圖1，麝鼠香采用有機(jī)溶劑進(jìn)行連續(xù)提取，所述麝鼠香凈取自麝鼠并保存于陰冷房間。
具休地，將40g麝鼠香加入錐形瓶中，向其中加入乙醇(麝鼠香重量的5倍，200ml)，并且以150rpm振搖混合物24小時(shí)，以20，000rpm離心，
獲得上清液。
殘?jiān)屑尤胂嗟攘康囊掖贾貜?fù)進(jìn)行乙醇提取，得到除了上述乙醇提取物之外的另一乙醇提取物。
殘?jiān)屑尤?00ml乙酸乙酯，按照乙醇提取中所示方法，收集乙酸乙酯提取物。殘?jiān)羞M(jìn)一步加入200ml己垸，按照乙醇提取中所示方法，收集己垸提取物。
本發(fā)明的實(shí)施方式
實(shí)施例2:麝鼠香乙醇提取物的第1次正相柱層析和薄層層析參見圖2，實(shí)施例1中獲得的乙醇提取物經(jīng)由第1次正相柱層析進(jìn)行細(xì)分。
柱填料為正相硅膠(230至400目)，并且作為流動(dòng)相的溶劑為己烷和乙酸乙酯，其中所述溶劑的組合比例由400:1增至1:1，獲得116個(gè)級(jí)分。
采用薄層層析鑒別各級(jí)分的物質(zhì)圖譜，所用展開溶劑為己烷和乙醚(10:1.5)。
通過短波紫外燈(254nm)和長波紫外燈(365nm)進(jìn)一步鑒別各級(jí)分的圖譜。用10。%硫酸處理薄層層析板并加熱后，通過著色的點(diǎn)再一次鑒別圖譜。
根據(jù)上述鑒別圖譜，將各級(jí)分劃分成具有相似移動(dòng)距離的7組，即Bl-l至Bl-7組，如圖3所示。
研究這7組的抗血栓形成活性。按照Choi等人，Kor. J. Pharmacogn. 26, 154-158， 1995和Son等人，Kor. J. Pharmacogn. 34(1):52-61， 2004中描述的方法，通過計(jì)數(shù)凝血酶時(shí)間測量其 活性。
具體地，用Thrombitimer2 (Behnk Elektronik,德國)測量凝血酶時(shí)間， 將固定濃度的樣品溶于10口 二甲亞砜(DMSO)，將該溶液和50口硼酸鹽 緩沖液(pH7.8)加入試管中，再將1單位/50口的凝血酶(T46481KU-59NIH 單位/mg固體，Sigma Co.， USA)與該溶液混合，混合物于37匸加熱5分鐘， 加入200口的纖維蛋白原(0.33%, Sigma Co.，USA)，計(jì)數(shù)直到出現(xiàn)凝結(jié)的 吋間。
與柱分離的級(jí)分相比，將用于溶解樣品的水和二甲亞砜作為對(duì)照組， 阿司匹林(Sigma Co., USA)作為試驗(yàn)對(duì)照組。
通過計(jì)數(shù)凝血酶時(shí)間測量抗血栓形成活性，并且計(jì)算至少3次實(shí)驗(yàn)的 平均值。該結(jié)果顯示在圖4中。
Bl-5組顯示了高于阿司匹林的抗血栓形成活性。
實(shí)施例3:第1級(jí)分的第2次正相柱層析和薄層層析
參見圖2，在實(shí)施例2中Bl-5組顯示了高于阿司匹林的抗血栓形成活 性，該組通過第2次正相柱層析進(jìn)行細(xì)分。
作為流動(dòng)相的溶劑為己烷和乙酸乙酯，其中所述溶劑的組合比例由 70:1增至1:1，獲得172個(gè)級(jí)分。
按照實(shí)施例2中所示的方法，鑒別以上獲得的各級(jí)分的圖譜，并且將 結(jié)果列于圖5中。按照移動(dòng)距離將各級(jí)分劃分成9組(B2-l至B2-9)，并 且用于測量抗血栓形成活性。
按照實(shí)施例2中的方法測量第2次正相柱所獲得的物質(zhì)的抗血栓形成 活性，并且如圖6所示，在稀釋250倍的情況下，B2-6組物質(zhì)顯示了高于 阿司匹林超過2倍的抗血栓形成活性。
實(shí)施例4:第2級(jí)分的第3次反相柱層析和薄層層析 參見圖2，在實(shí)施例3中B2-6組顯示了高于阿司匹林的抗血栓形成活 性，該組通過反相柱層析進(jìn)行細(xì)分。
用作填料的是反相硅膠(63至212口)，作為流動(dòng)相的溶劑是乙腈和7jC，
ii其中所述溶劑的組合比例由20:1增至1:0，獲得234個(gè)級(jí)分。
采用反相薄層層析鑒別各級(jí)分的物質(zhì)圖譜，并且通過短波紫外燈 (254nm)和長波紫外燈(365nm)鑒別各級(jí)分的圖譜。用10%硫酸處理薄 層層析板并加熱后，然后通過著色的點(diǎn)再一次鑒別圖譜。
根據(jù)上述所鑒別圖譜，將各級(jí)分劃分成具有相似移動(dòng)距離的7組，即 B3-l至B3-7組，如圖7所示。
按照實(shí)施例2所示方法測量抗血栓形成活性，如圖8所示，B3-4和B3-5 組顯示了高于阿司匹林的抗血栓形成活性。值得注意的是，在稀釋50倍的 情況下，每0.002mg B3-4和B3-5組的樣品顯示至少40秒的凝血酶時(shí)間， 與阿司匹林每O.lmg具有15秒凝血酶時(shí)間相比，其顯示了超過三倍的顯著 優(yōu)良的抗血栓形成效果。
工業(yè)應(yīng)用性
本發(fā)明提供了一種從麝鼠香中獲得的、與阿司匹林相比具有高效能的 抗血栓形成劑，以及一種包含該抗血栓形成劑的抗血栓形成組合物，因此， 這可以增加麝鼠香的附加價(jià)值。
權(quán)利要求
1、一種從麝鼠香中制備抗血栓形成劑的方法，其包括下列步驟用選自乙醇、甲醇、己烷和乙酸乙酯的有機(jī)溶劑處理麝鼠香，進(jìn)行振搖提取，離心有機(jī)溶劑提取物，獲得上清液(第1步)；對(duì)上清液進(jìn)行第1次正相柱層析，獲得各級(jí)分(第2步)；對(duì)各級(jí)分進(jìn)行薄層層析以確定其物質(zhì)圖譜，并且將其分組(第3步)；測量所劃分的各組的凝血酶時(shí)間，并且選擇顯示最強(qiáng)抗血栓形成活性的一組(第4步)；對(duì)所選擇的組進(jìn)行第2次正相柱層析，獲得各級(jí)分(第5步)；對(duì)各級(jí)分進(jìn)行薄層層析以確定其物質(zhì)圖譜，并且將其分組(第6步)；測量所劃分的各組的凝血酶時(shí)間，并且選擇顯示最強(qiáng)抗血栓形成活性的一組(第7步)；對(duì)所選擇的組進(jìn)行第3次反相柱層析，獲得各級(jí)分(第8步)；對(duì)各級(jí)分進(jìn)行反相薄層層析以確定其物質(zhì)圖譜，并且將其分組(第9步)；以及測量所劃分的各組的凝血酶時(shí)間，并且選擇顯示最強(qiáng)抗血栓形成活性的一組(第10步)。
2、 權(quán)利要求l的方法，其中第l步振搖提取中，每100重量份的麝 鼠香使用10至20重量份的有機(jī)溶劑。
3、 權(quán)利要求1的方法，其中第1步中的振搖提取以150至200rpm 振搖20至24小時(shí)。
4、 權(quán)利要求1的方法，其中第1步中的離心以8,000至20,000rmp 離心10至20分鐘。
5、 權(quán)利要求l的方法，其中離心后的殘?jiān)儆门c之前振搖提取步驟 所用的相同的溶劑進(jìn)行處理，然后離心提取物，獲得上清液，與之前提 取步驟中制備的上清液一起用于第2步驟。
6、 權(quán)利要求1的方法，其中第2步中第1次正相柱層析采用正相硅 膠(230至400目)，并且作為流動(dòng)相的有機(jī)溶劑組合選自己垸和乙酸乙酯、己烷和氯仿、己垸和丙酮、己垸和乙腈、乙酸乙酯和乙醇、或乙酸乙酯和甲醇，其中所述溶劑的組合比例由400:1增至1:1。
7、 權(quán)利要求1的方法，其中第3和6步中用于薄層層析的展開劑為 10:1至10:2的己烷:乙醚，或3:1至3:2的己垸:乙酸乙酯。
8、 權(quán)利要求1的方法，其中第9步中用于薄層層析的展開劑為40:1 至60:1的乙腈:水，或1:1至2:1的乙酸乙酯:甲醇。
9、 權(quán)利要求1的方法，其中第3、 6和9步中各級(jí)分的物質(zhì)圖譜的 形成通過下列三個(gè)步驟進(jìn)行a) 將各級(jí)分暴露于短波長(254nm)燈和長波長(365nm)紫外燈， 鑒別物質(zhì)圖譜；b) 用10%硫酸處理薄層層析板，加熱以顯示著色的點(diǎn)，再一次鑒別 物質(zhì)圖譜；以及c) 根據(jù)步驟a)和b)所鑒別的圖譜，將具有相似移動(dòng)距離的物質(zhì) 分組。
10、 權(quán)利要求1的方法，其中第4、 7或10步中的凝血酶時(shí)間是通 過計(jì)數(shù)加入Thrombitimer2產(chǎn)品的凝血酶和纖維蛋白原后直至形成纖維蛋 白原凝塊的時(shí)間測量的。
11、 權(quán)利要求1的方法，其中第5步第2次正相柱層析采用正相硅 膠(230至400目)，并且作為流動(dòng)相的有機(jī)溶劑組合選自己烷和乙酸乙 酯、己垸和氯仿、己烷和丙酮、己烷和乙腈、乙酸乙酯和乙醇、或乙酸 乙酯和甲醇，其中所述溶劑的組合比例由70:1增至1:1。
12、 權(quán)利要求1的方法，其中第8步反相柱層析采用反相硅膠(63 至212口)，并且作為流動(dòng)相的溶劑組合由選自乙腈、甲醇、乙醇和丙酮 的有機(jī)溶劑與水組成，其中所述溶劑的組合比例由20:1增至1:1。
13、 一種根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)方法制備的抗血栓形成劑，其 中該抗血栓形成劑具有大于40秒的凝血酶時(shí)間。
14、 一種包含權(quán)利要求13的抗血栓形成劑的用于治療血栓形成的組 合物。
全文摘要
本文公開了一種從麝鼠香中制備抗血栓形成劑的方法，以及由該方法獲得的具有高效能的抗血栓形成劑。其中，抗血栓形成劑的制備方法包括用乙醇處理麝鼠香，獲得乙醇提取物；采用遞增的己烷和乙酸乙酯組合比例進(jìn)行兩次正相柱層析，獲得多個(gè)級(jí)分；進(jìn)行薄層層析，并采用紫外燈和10％硫酸鑒別各級(jí)分的物質(zhì)圖譜，將具有相似移動(dòng)距離的物質(zhì)分組；測量每一組的凝血酶時(shí)間，分離具有高效的抗血栓形成活性的一組；采用遞增的乙腈和水組合比例進(jìn)行一次反相柱層析，獲得多個(gè)級(jí)分；并且從中分離具有高效能的抗血栓形成劑物質(zhì)。本發(fā)明提供了一種從麝鼠香中獲得的具有高效能的抗血栓形成劑，這增加了麝鼠香的附加價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K35/48GK101641107SQ200780046591
公開日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2007年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月16日
發(fā)明者全尚珢, 姜韓錫, 崔勇株, 李宰浩, 申澤順, 金勇均, 金根基, 金研玖 申請(qǐng)人:瑪斯科蘭德有限公司