專利名稱：葡萄球菌腸毒素a基因的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葡萄球菌腸毒素A基因及其編碼蛋白的新用途，特別是涉及葡萄球菌 腸毒素A基因在作為DNA疫苗免疫原性增強佐劑和該基因的編碼蛋白作為重組亞單 位免疫原性增強佐劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葡萄球菌腸毒素A (staphylococcal enterotoxin A， SEA)是金黃色葡萄球菌產(chǎn) 生的葡萄球菌腸毒素家族中的一員，是最有效的T細(xì)胞活化因子之一。SEA是含233個 氨基酸殘基的蛋白質(zhì)分子，富含絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和天門冬氨酸(D)殘基。分子 量較小，約27.8kD，等電點PP7.3，對酸和熱穩(wěn)定。SEA分子中心有一個由二硫鍵形 成的環(huán)，該環(huán)的完整性是SEA活化T淋巴細(xì)胞所必需的。SEA具有超抗原所具有的兩個 特點， 一是SEA不需經(jīng)過抗原加工或蛋白酶解過程，可被直接呈遞給T淋巴細(xì)胞，而產(chǎn) 生相應(yīng)的免疫效應(yīng)。該過程需要表達(dá)MHC II分子的輔佐細(xì)胞參與；二是SEA的呈遞不 受MHC限帝U，人類細(xì)胞可將SEA有效呈遞給鼠T淋巴細(xì)胞，反之亦然。微量(10 —9 10一12 g) SEA能有效激活免疫細(xì)胞，產(chǎn)生一系列淋巴因子，主要有IL-1 ， IL-1 ， IL-2 ， IL-6 ， TNF-a， TNF-0和INF-Y，這些淋巴因子可直接產(chǎn)生抗腫瘤作用，也可繼發(fā) 激活NK細(xì)胞而產(chǎn)生LAK活性。更重要的是，SEA能高效激活某些含有特定TCR V的T細(xì) 胞，主要是CTLs細(xì)胞，對MHC n+細(xì)胞產(chǎn)生
SDCC( staphylococcal-enterotoxin-d印endent cell-mediated cytotoxicity ) 作 用。
DNA疫苗是指攜帶有抗原蛋白基因及表達(dá)必需的調(diào)控元件的質(zhì)粒DNA的表達(dá)載體。 將其導(dǎo)入到宿主的有機體中，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可達(dá)到免疫的目的。優(yōu)點 是易于構(gòu)建；成本低廉；制劑穩(wěn)定；可組建多價復(fù)合疫苗聯(lián)合免疫。但是，有些抗原 基因的免疫原性比較弱，單獨注射這些疫苗不能誘發(fā)足夠的保護(hù)性免疫。因此，尋找 合適的DNA疫苗佐劑，有助于提高其免疫性及免疫效果。
重組亞單位疫苗是指重組抗原表達(dá)載體在原核或真核細(xì)胞表達(dá)的多肽抗原，經(jīng)純 化后制成的蛋白疫苗，與死菌苗和減毒活疫苗相比，副作用減少的同時，其免疫原性 較低，因此，需添加適當(dāng)?shù)拿庖咦魟?發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供葡萄球菌腸毒素A基因在作為DNA疫苗免疫原性增強佐劑 和該基因的編碼蛋白(rSEA)作為重組亞單位免疫原性增強佐劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明發(fā)明人的實驗證實，葡萄球菌腸毒素A基因能夠顯著改善動物對DNA疫苗 的反應(yīng)性，可以用作DNA疫苗免疫原性增強佐劑或重組亞單位；葡萄球菌腸毒素A 基因的編碼蛋白能夠顯著改善動物對重組亞單位疫苗的反應(yīng)性，可以用作重組亞單位 疫苗免疫原性增強佐劑。
在實際應(yīng)用中，葡萄球菌腸毒素A基因與DNA疫苗的基因可以存在于不同的重組 質(zhì)粒中，使用時聯(lián)合注射，也可以使葡萄球菌腸毒素A基因與DNA疫苗的基因融合， 形成一個重組質(zhì)粒，使用起來會更方便。rSEA與重組亞單位疫苗的蛋白可獨立存在， 在使用時聯(lián)合注射，也可以使rSEA與重組亞單位疫苗的蛋白融合，形成融合蛋白。 當(dāng)然，在制備上述佐劑時，也不排除添加其它藥學(xué)上可接受的輔料及載體。
葡萄球菌腸毒素A基因可以使乙肝病毒表面抗原DNA疫苗、瘧疾多表位抗原DNA 疫苗等各種DNA疫苗免疫原性均得到增強，具有廣譜性，是一種不可多得的DNA疫 苗免疫原性增強佐劑，葡萄球菌腸毒素A可以使各種重組亞單位疫苗的免疫原性得 到增強，是一種不可多得的重組亞單位疫苗免疫原性增強佐劑，葡萄球菌腸毒素A 基因及其編碼蛋白在DNA疫苗及重組亞單位疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用中意義重大。


圖1為質(zhì)粒pmSEA的酶切鑒定圖譜
圖2為質(zhì)粒pS2S的酶切鑒定圖譜
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、質(zhì)粒的制備
1、含有葡萄球菌腸毒素A基因的重組質(zhì)粒pmSEA的構(gòu)建
使用上游引物Ph 5' -cgcggatccagcgagaaaagcgaagaaa—3，(帶下劃線堿基為限 制性內(nèi)切酶萬rfl識別位點)和下游引物P2: 5， -
atgaattcagaattcacttgtatataatatAGCaata tgcat -3，(帶下戈機堿基為限制性內(nèi)切 酶^ct^ I識別位點)，以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 13565的基因組DNA為模板， PCR擴增SEA基因，反應(yīng)條件為(1) 96°C IO分鐘；(2) 94°C 60秒，50°C 90秒， 72°C 90秒，共30個循環(huán)；(3) 72°C IO分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳后回收702bp的目的片段，再用限制性內(nèi)切酶^3威I和I對回收的基 因片段酶切，將酶切產(chǎn)物克隆入經(jīng)同樣酶酶切的質(zhì)粒載體pcDNA3 (Invitrogen， USA) 上，得到重組質(zhì)粒，命名為pmSEA。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑選陽性 克隆，對其進(jìn)行DNA序列分析，分析結(jié)果表明所克隆的葡萄球菌腸毒素A基因序列正確(序列l(wèi))，其編碼的氨基酸殘基序列為序列表中的序列2。對該重組 質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶"朋W I和^boT I作進(jìn)一步酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖1 ^f示
(泳道1為Marker DL-2000;泳道2為pmSEA的I和fco7 I酶切產(chǎn)物，小片段 約700bp;泳道3為未酶切的pmSEA)，表明獲得了含有葡萄球菌腸毒素A基因的重 組質(zhì)粒。
2、 含有乙肝表面抗原基因的重組質(zhì)粒pS2S的構(gòu)建
使用上游引物B2: 5， -GGAAGATCTCAGGCCATG CAGTGGAATT-3，(帶下劃線堿基為 限制性內(nèi)切酶i^7 II識別位點)和下游引物S3:
5， -AGGGGGCCCAGCCCATGAAGTTTAGGGAA-3，(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶^oa I識別 位點)，以質(zhì)粒HBV2 (張彤等；中華微生物和免疫學(xué)雜志。1997， 16 (6) : 421-424) 為模板，PCR擴增乙肝表面抗原中蛋白preS2-S的基因片段，反應(yīng)條件為(1) 95°C 5分鐘；(2) 95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 50秒，共25個循環(huán)；(3) 72°C 5分 鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收回收843bp的目的片段，再用 限制性內(nèi)切酶萬a/^I和^^ I對回收的基因片段酶切，將酶切產(chǎn)物克隆入質(zhì)粒載體 pcDNA3 (Invitrogen, USA)的多克隆位點^a歷〃 I和^ a I之間，得到重組質(zhì)粒，命 名為pS2S。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑選陽性克隆，對其進(jìn)行DNA序列 分析，分析結(jié)果表明所克隆的乙肝表面抗原preS2-S基因序列正確(序列3)，其編 碼的氨基酸殘基序列為序列表中的序列4。對該重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶v9朋W I和 ^ds I作進(jìn)一步酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖2所示(泳道1為pS2S的Aa/z^I和^ a I酶切產(chǎn)物，約843bp;泳道2為Marker DL-2000)，表明獲得了含有乙肝表面抗原
基因的重組質(zhì)粒。
3、 含有瘧疾多表位抗原基因的重組質(zhì)粒AWTE的構(gòu)建
使用上游引物5， -cgcggatccatgaacgctaaccctgg tgat-3，(帶下劃線堿基為限 制性內(nèi)切酶5朋 ^ I識別位點)，下游引物5' agggggcccttacgatggtaccacaacgtt-3， (帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶^ 3l識別位點)。以重組質(zhì)粒CTB-AWTE (鐘輝等。科 學(xué)通報.43(13):1417-1422.)為模板，PCR擴增瘧疾多表位抗原AWTE基因片段，反應(yīng) 條件為(1) 95°C 5分鐘；(2) 45°C 20秒，72°C 30秒，共5個循環(huán)；(3) 95°C 30秒，55°C 20秒，72°C 30秒，共25個循環(huán)；(4) 72°C 5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收366bp的目的片段，再用限制性內(nèi)切酶5a威I和 力pa I對回收的基因片段酶切，將酶切產(chǎn)物克隆入質(zhì)粒載體pcDNA3的多克隆位點Aa歷vY I和」pal之間，得到重組質(zhì)粒，命名為AWTE。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)藍(lán)白斑篩選 后挑選陽性克隆，對其進(jìn)行DNA序列分析，分析結(jié)果表明所克隆的瘧疾多表位抗原AWTE 基因序列正確(序列5)。
4、 含有葡萄球菌腸毒素A和人表皮生長因子融合基因5S4的重組質(zhì)粒 pEGF-SEA的構(gòu)建利用引物l: 5， -AACATATGAATTCCGACTCTGAATGCCC -3，和引物2: 5 ， -AAGGATCCGGCCAGGAGGTCCGCATGCTCGCAGCGTGCACCAACGTAGCCAGAATGG-3 ，(帶下劃 線堿基為限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I識別位點)，以重組質(zhì)粒pET22b (+) -Ang-EGF (許 偉立，陳東立，馬清鈞。中國專利"抗腫瘤作用的融合蛋白及該蛋白的應(yīng)用"，申請 號01120099.5;授權(quán)號CN 1161467C)為模板，PCR擴增人表皮生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF)多肽編碼基因，反應(yīng)條件為(1) 95°C 5分鐘；(2) 94°C 60 秒，64°C 30秒，72°C 30秒，72°C 10分鐘，共30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn) 物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收147bp的目的片段，克隆至原核表達(dá)載體pmTSA上(胥全 彬，博士論文，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2003)，得到重組質(zhì)粒，命名為pEGF-SEA。轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5a，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑選陽性克隆，對其進(jìn)行DNA序列分析，分析結(jié)果表 明所克隆的EGF基因序列(序列6)正確，其編碼的氨基酸殘基序列為序列表中的序 列7。
實施例2、 pmSEA對乙肝病毒表面抗原DNA疫苗免疫原性的增強作用 小鼠Balb/c，雌性，4-6周齡。
分組(1)空載體組(pcDNA3)， 10只；(2)乙肝蛋白疫苗組(rHBsAg)， 10只； (3)pS2S組，10只;(4) pS2S+pmSEA佐劑組，10只。
免疫方案(1)空載體組(pcDNA3):200ug/只/次；(2)乙肝蛋白疫苗組(rHBsAg): 400ng/只/次；(3) pS2S組100ugpS2S + 100ugpcDNA3/只/次；(4) pS2S+pmSEA 佐劑組100ug pS2S+100ug pmSEA /只/次。
在小鼠麻醉狀態(tài)下(75mg/kg sodium pentobarbital IP)，在小鼠的兩后肢的 股四頭肌肉各注射50uL樣品，然后用活體基因?qū)雰x(浙江新芝公司)，在注射部 位進(jìn)行電擊，電壓為120V/cm，時長2ms， 2次。
免疫次數(shù)共兩次，初次免疫后，在第14天加強免疫一次。初次免疫后，每隔2 周，取血檢測抗HBsAg抗體產(chǎn)生的滴度。用ELISP0T法檢測IFN- y產(chǎn)生情況。
結(jié)果表明，含有pmSEA質(zhì)粒佐劑的第4組初次免疫后2周的HBsAb陽性率為37. 5 %，加強免疫后2周，HBsAb陽性率為75X;而未加佐劑的第3組初次免疫后2周的 HBsAb陽性率為10%，加強免疫后2周，HBsAb陽性率為27X。 14周后，第4組的 HBsAb陽性率均為100%，而未加佐劑的第3組的HBsAb陽性率僅為50X。 ELISPOT 檢測結(jié)果:第4組產(chǎn)生的IFN-y是第3組的2-3倍，表明pmSEA可顯著增強乙肝表 面抗原質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)激發(fā)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實施例3、 pmSEA對瘧疾多表位抗原DNA疫苗免疫原性的增強作用
小鼠Balb/c，雌性，4-6周齡。分組(1)空載體組(pcDNA3) ， 6只；(2)AWTE質(zhì)粒組，6只；(3)AWTE質(zhì) 粒+pmSEA質(zhì)粒佐劑組，6只。
免疫方案(l)空載體組(pcDNA3): 200ug/只/次；(2) AWTE質(zhì)粒組100ug AWTE +100ug pcDNA3 /只/次；(3) AWTE質(zhì)粒+pmSEA質(zhì)粒佐劑組100ug AWTE +100ug pmSEA/ 只/次。
在小鼠麻醉狀態(tài)下(75mg/kg sodium pentobarbital IP)，在小鼠的兩后肢的 股四頭肌肉各注射50ul樣品，然后用活體基因?qū)雰x(浙江新芝公司)，在注射部 位進(jìn)行電擊，電壓為120V/cm，時長2ms， 2次。
免疫次數(shù)共兩次，初次免疫后，在第14天加強免疫一次。初次免疫后，每隔2 周，取血檢測抗AWTE抗體產(chǎn)生的滴度。末次免疫3周后，取脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行CTL細(xì) 胞活性檢測。
結(jié)果表明，含有pmSEA質(zhì)粒佐劑的第3組初次免疫后2周的AWTE滴度為1:400， 加強免疫后2周，AWTE陽性率為1:5000;第2組初次免疫后2周的AWTE滴度檢測不 到，加強免疫后2周，AWTE陽性率為1:100。 CTL活性檢測在效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞為 100: l時，第3組為67%，第2組為20%，表明pmSEA可顯著增強瘧疾多表位抗原
免疫原性，誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實施例4、 rSEA對重組亞單位疫苗EGF的佐劑作用 小鼠C57BL/6，雌性，5周齡。
分組(1) EGF-SEA融合蛋白組，IO只；(2) EGF多肽陽性對照組，IO只；(3) 生理鹽水陰性對照組，10只。
免疫方案(1) EGF-SEA融合蛋白組10ug/只/次；(2) EGF多肽陽性對照組 10ug/只/次；(3)生理鹽水陰性對照組200uL/只/次。
免疫次數(shù)共四次，初次免疫前采血，然后連續(xù)免疫4次，每次間隔10天；免
疫前均采小鼠尾血，ELISA檢測血清效價。
結(jié)果表明在EGF-SEA融合蛋白組檢測到高滴度的抗EGF的抗體(1: 32,000)， 而單獨用EGF多肽免疫小鼠的血清，未檢測到抗EGF的抗體，表明EGF與SEA融合后， 可顯著提高抗EGF的抗體滴度，證明SEA具有較強的免疫佐劑效應(yīng)。序列表
<160〉7
<210〉1
〈211〉702
<212〉腿
<213>金黃色葡萄球菌(5Y3p力/iococciAs swreszAsO
<400〉1
gcgaagaaataaatgaaaaagatttgcgaaaaaagtctga3ttgC3ggg￡L60
3CELgCttta^ggcaatcttaaacaaat c t attatt3C肌tgaaaaagctaa120
aaagagag1xtttacagcatactatattgttta^ggcttttttacagat180
cattcgtggtataacgatttattagtagattttgattcaa3ggat3ttgttgataaatat240
aagtagacttgtatggtgcttattatggttatcaatgtgcgggtggtaca300
cagcttgtatgtatggtggtgtaacgttaca^gataataatcgattgacc360
gaagag^aaaagtgccga/tcaatttatggctageicggtaagtacctttg420
gaaacggttaaaacgaataagaaaaatgtaactgttxaggagttggatcttca^gc^ga<480
cgttatttac3ggaa^aatataatttatataactctgatgtttttgatggg鄉(xiāng)gttC3g540
aggggattaatcgtgtttcatacttctacagaaccttcggttaattacgatttatttggt600
gctcaaggacagtattcaaaagaatatatagagataataaaacgattaac660
tctgaaaacatgcatattgctatatatttat3taca^gtt702
〈210>2
〈211〉243
<212〉PRT
〈213>金黃色葡萄球菌(6Ya/ i^/ococciAs 3wresiAs0 〈400>2
Thr Leu Thr Thr Ser Pro Leu Val Asn Gly Ser Glu Lys Ser Glu Glu
15 10 15
lie Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gin Gly Thr Ala
20 25 30
Leu Gly Asn Leu Lys Gin lie Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr 35 40 45Glu Asn Lys 50
Lys Gly Phe 65
Phe Asp Ser
Leu Tyr Gly
Lys Thr Ala 115
Leu Thr Glu 130
Gin Asn Thr 145
Thr Val Gin
Tyr Asn Leu
Leu lie Val 195
Phe Gly Ala
210 Asp Asn Lys 225
Tyr Thr Ser
〈210>3 〈211〉843 <212>DNA <213〉人工序列
<220> <223>
Glu Ser Phe Thr
Lys Asp
85 Ala Tyr 100
Cys Met
Glu Lys Val Pro
Glu Leu 165 Tyr Asn 180
Phe His
Gin Gly Thr lie
His
Asp
70
lie
丁yr
Tyr
Lys
Leu 150 Asp
Ser
Thr
Gin
Asn 230
Asp
55
His
Val
Gly
Gly
Val 135 Glu
Leu
Asp
Ser
Tyr 215 Ser
Gin Phe Leu Gin Trp Tyr
Ser
Asp
Tyr
Gly 120 Pro
Thr
Gin
Val
Thr 200 Ser
Glu
Lys
Gin 105 Val
lie
Val
Ala
Phe 185 Glu
Asn
Asn
Tyr
90
Cys
Thr
Asn
Lys
Arg 170 Asp
Pro
Thr
Met
Asn 75 Lys
Ala
Leu
Leu
Thr 155 Arg
Gly
Ser
Leu
His 235
His
60
Asp
Gly
Gly
His
Trp 140 Asn
Tyr
Lys
Val
Leu 220 lie
Thr lie Leu Phe Leu Leu Val
Lys
Gly
Asp 125 Leu
Lys
Leu
Val
Asn 205 Arg
Ala
Lys
Thr 110 Asn
Asp
Lys
Gin
Gin 190
Tyr
lie lie
Val
95
Pro
Asn
Gly
Asn
Glu 175
Arg
Asp Tyr Tyr
Asp 80 Asp
Asn
Arg
Lys
Val 160 Lys
Gly
Leu
Arg
Leu 240〈400〉3
atgcagtggaactccacgac attccaccaagctctgctagatcccagagtgaggggccta60
tattttcctgctggtggctc cagttccggaacagtaaaccctgttccgactactgcctca120
cccatatcgtc犯tcttctc gaggactggggaccctgcaccgaacatggagagcacaaca180
tcaggattcctaggacccct gctcgtgttac鄉(xiāng)cggggtttttcttgttgacaagaatc240
ctcacaataccacagagtct agactcgtggtggacttctctcaattttctagggggagca300
cccacgtgtcctggccaaaa ttcgcagtcccca^cctxca<atcactcaccaacctcttgt360
cctccaacttgtcctggcta tcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctcttc420
atcctgctgctatgcctcat cttcttgttggttcttctggactaccaaggtatgttgccc480
gtttgtcctctacttccagg aacatcaactaccagcacgg gaccatgcaa gacctgcacg540
attcctgctcaaggaacctc tatgtttccctcttgttgctgtacaaaaccttcggacgga600
aactgcacttgtattcccat cccatcatcctgggctttcgcaagattcctatgggagtgg660
gcctcagtccgtttctcctg gctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtaggg720
ctttcccccactgtttggct ttcagttatatggatgatgtggcWtgggggccaagtctg780
tacaacatcttgagtccctt tttacctctattaccaattttcttttgtctctgggtatac840
att843
〈210>4 <211>281 <212>PRT 〈213〉人工序列
<220〉 〈223〉
<400〉4
Met Gin Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gin Ala Leu Leu Asp Pro Arg
15 10 15
Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val
20 25 30
Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro lie Ser Ser lie Phe Ser Arg
35 40 45
Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Ser Thr Thr Ser Gly Phe Leu50 Gly Pro 65
Leu Thr
Leu Gly
Ser Asn
Trp Met 130 Cys Leu 145
Val Cys
Lys Thr
Cys Cys
Ser Ser 210 Phe Ser 225
Leu Ser Gly Pro lie Phe
Leu Leu Val
lie Pro
Gly
His 115 Cys
Ala 100
Ser
Leu
Gin
85
Pro
Leu
70
Ser
Thr
lie Phe
Pro Leu
Cys
Thr 195 Trp
Trp
Pro
Ser
Phe 275
Thr 180 Lys
Arg
Leu
Leu 165 lie
Pro Ser
Leu Ser
Thr
Leu 260 Cys
Val 245 Tyr
Leu 230 Trp
55 Gin
Ala
Leu Asp Cys
Pro Thr
Arg
Leu 150 Pro
Pro
Ala Phe Ala
Ser
Phe 135 Val
Gly
Ala
Asp
Arg 215 Leu
Pro
Cys 120 lie
Gly
Ser
Gly 105 Pro
Gin
Gly 200 Phe
Gly 185 Asn
Leu
Val Pro
Leu Ser Val
Asn lie Leu
Leu Trp Val
Tyr 280
Ser 265 lie
Phe
Trp
90
Gin
Phe
75
Trp
60 Leu
Leu Thr
Thr Ser Leu
Asn Ser Gin
Pro Thr Cys lie Phe Leu
Leu Leu Asp Thr Ser
Thr 170 Thr
Cys
Trp
Phe
lie 250 Pro
Tyr 155 Thr
Phe 140 Gin
Ser
Pro 125 lie
Gly
Thr
Ser Met Phe
Thr Cys Glu
Val 235 Trp
Trp 220 Gin
Met
lie 205 Ala
Trp
Met
Ser 110 Gly
Leu
Met
Gly
Pro 190 Pro
Arg lie
80 Asn Phe 95
Pro Thr
Tyr Arg
Leu Leu
Leu Pro 160 Pro Cys 175
Ser Cys lie Pro
Ser Val Arg Phe
Phe Leu Pro
Trp
Leu 270
Val Gly 240 His Trp 255
Leu Pro
〈210〉5 <211〉366<212>DNA <213〉人工序列
<220> <223〉
<400〉5
accctggtga tgaactggaa acccagaacgtgtacgcagccccgaatgcg60
a^tccgta^gcctgttgca gaaagagaaa atggtgctgccgaacgccaacccgccggcg120
aacaagaaga3cgcgggtcc ca^c犯g犯c gatga^a^c3agaacgatgataacaagaac180
agaacgatga taacaagaac gatgataacaagaacgatgataacaagaac240
gatgataacaagaacgatga taacaagggg犯acctaaagdCg^tt￡Lg￡Lttatgaagat300
agatcgctaa gatggaaaag gctagcagtgttttcaacgttgtggtacca360
tcgtaa366
<210>6 <211〉843 〈212>腿 <213〉人工序列
<220〉 <223〉
<400〉6
aattccgact ctgaatgccc gctgtctcac gacggttact gcctacacga tggtgtttgc 60
atgtatatcg aagctctgga caaatacgcg tgcgtgtgcc attctggcta cgttggtgca 120
cgctgcgagc atgcggacct cctggcc 147
<210>7 <211〉49 <212〉PRT <213〉人工序列
<220> <223><400>7
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
15 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr lie Glu Ala Leu A印Lys Tyr Ala Cys Val
20 25 30
Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu 35 40 45
Ala
權(quán)利要求
1. 葡萄球菌腸毒素A基因作為DNA疫苗免疫原性增強佐劑的應(yīng)用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述葡萄球菌腸毒素A基因與DNA 疫苗的基因存在于不同的重組質(zhì)粒中。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述DNA疫苗為乙肝病毒表面抗 原DNA疫苗或瘧疾多表位抗原DNA疫苗。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述葡萄球菌腸毒素A基因與DNA 疫苗的基因是融合基因，存在于同一重組質(zhì)粒中。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述DNA疫苗為乙肝病毒表面抗 原DNA疫苗或瘧疾多表位抗原DNA疫苗。
6、 葡萄球菌腸毒素A基因在制備DNA疫苗免疫原性增強佐劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了葡萄球菌腸毒素A基因的新用途。本發(fā)明發(fā)明人的實驗證實，葡萄球菌腸毒素A基因能夠顯著改善動物對DNA疫苗的反應(yīng)性，可以用作DNA或重組亞單位疫苗免疫原性增強佐劑。葡萄球菌腸毒素A基因可以使乙肝病毒表面抗原DNA疫苗、瘧疾多表位抗原DNA疫苗等各種DNA疫苗免疫原性均得到增強，具有廣譜性，是一種不可多得的DNA疫苗免疫原性增強佐劑。因此，葡萄球菌腸毒素A基因在DNA疫苗及重組亞單位疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用中意義重大。
文檔編號A61P31/20GK101297967SQ20081011091
公開日2008年11月5日 申請日期2005年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月26日
發(fā)明者誠 曹, 胥全彬, 靳彥文, 馬清鈞 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所