一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素sem的雙抗夾心法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEM的方法，屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng) 域，具體設(shè)及的是一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEM的雙抗夾屯、法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcalenterotoxins，簡(jiǎn)稱SEs)，是一種由金 黃色葡萄球菌分泌的細(xì)胞外毒素，其會(huì)導(dǎo)致中毒休克、食物中毒及一系列過(guò)敏性及免疫學(xué) 疾病。目前已發(fā)現(xiàn)的腸毒素有23種血清型，其中沈A-S邸稱為傳統(tǒng)腸毒素，SEG-SEX為新 型腸毒素。沈M屬于新型腸毒素類型，其理論分子量為24. 842KD。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，S細(xì)基因W 基因簇（egc)的形式存在。由于腸毒素基因簇受同一操縱子調(diào)控。據(jù)調(diào)查顯示，目前在多 藥耐藥性菌株中約77.8%含有基因簇（端T)。基于5細(xì)基因流行的廣泛性，新型腸毒素SEM 也潛在威脅人類的健康。因此，食品及原料中SEM的檢出，對(duì)于控制由金黃色葡萄球菌新型 腸毒素SEM引起的食源性疾病具有重要意義。
[0003] 目前檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素的方法主要有免疫學(xué)法、分子生物學(xué)法和生物傳 感器法?；赑CR技術(shù)的分子生物學(xué)方法從基因水平進(jìn)行診斷，可W檢測(cè)大量樣品，具有高 靈敏度和特異性，可檢測(cè)各類金黃色葡萄球菌的腸毒素基因。但PCR法只能判斷葡萄球菌 攜帶腸毒素的基因型，胞外腸毒素蛋白的表達(dá)往往受時(shí)間、水分活度（AW0. 85~0. 99)、酸堿 度（pH4. 0~7. 0)和溫度（8°C~30°C)等因素的影響，用PCR方法很難準(zhǔn)確測(cè)定食品或臨床 樣本中腸毒素蛋白的含量。
[0004] 生物傳感器技術(shù)因其具有自動(dòng)化、檢樣量少、分析速度快、生物功能膜可多次使 用等優(yōu)點(diǎn)受到國(guó)內(nèi)學(xué)者的親睞。目前檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素用的較多的生物感應(yīng)器 主要為免疫感應(yīng)器。最新研發(fā)的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)B型腸毒素，其最低檢出限可達(dá) 0. 017ng/mL。該技術(shù)目前也僅限于檢測(cè)傳統(tǒng)的腸毒素，并且由于該方法檢測(cè)成本高，檢測(cè)穩(wěn) 定性較差，該方法的發(fā)展受到限制。
[0005] 免疫學(xué)檢測(cè)法依靠抗原抗體的結(jié)合，只發(fā)生在抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)之間。 由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，因此，免疫學(xué)檢測(cè)法具有高度的特異性。酶 聯(lián)免疫吸附（ELISA)法因其具有操作簡(jiǎn)單、低成本、靈敏度高，特異性強(qiáng)、重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定性 高等優(yōu)點(diǎn)，成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。
[0006] 對(duì)于金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)，現(xiàn)有的利用雙抗體夾屯、法檢測(cè)傳統(tǒng)A型腸毒 素的技術(shù)較為成熟，其靈敏度高達(dá)〇.〇282ng/mL。但利用雙抗體夾屯、法檢測(cè)新型腸毒素的報(bào) 道不多，對(duì)于一系列新型腸毒素（SEG-沈X)如沈M等的雙抗夾屯、檢測(cè)方法的研究將具有相 當(dāng)廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種即可定性分析、也可定量檢測(cè)，且靈敏度高、準(zhǔn)確 度高的檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素沈M的雙抗夾屯、法。
[000引為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下； 一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEM的雙抗夾屯、法，包括W下步驟： (1) 用包被抗體包被酶標(biāo)板，洗板，用于洗去未與酶標(biāo)板結(jié)合的包被抗體，該包被抗體 為沈M單克隆抗體； (2) 加入封閉液對(duì)酶標(biāo)板上多余結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉，洗板，用于洗去酶標(biāo)板上多余封閉 液； (3) 在酶標(biāo)板上加入樣品，解育后洗板； (4) WSEM兔抗血清為一抗加入酶標(biāo)板，反應(yīng)后洗板，再W辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗 兔IgG為酶標(biāo)二抗，反應(yīng)后洗板； (5) 加入顯色液使酶標(biāo)板顯色，然后加入硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)004。。， (6) 將檢測(cè)得到的0045。值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求得樣品中沈M的含量； 當(dāng)樣品中SEM濃度> 0. 5ng/mU樣品中SEM被配對(duì)抗體捕獲與酶標(biāo)二抗結(jié)合，并催化 底物在450nm產(chǎn)生吸收值時(shí)，被判定為陽(yáng)性； 當(dāng)樣品中SEM濃度< 0. 5ng/mU樣品中SEM不被配對(duì)抗體捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足W引起足夠的信號(hào)時(shí)，被判定為陰性。
[0009]本發(fā)明記載的方法對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)沈M進(jìn)行0〇45。值檢測(cè)后，得到的線性范圍良 好，可W直接做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)對(duì)樣品的〇〇45。值檢測(cè)后，用該值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對(duì)應(yīng)的 濃度，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的定量檢測(cè)。
[0010] 兔抗血清中存在非特異性蛋白，因而其很難達(dá)到較高的特異性，若單獨(dú)選作包被 抗體，易造成假陽(yáng)性，不利于SEM抗原蛋白檢測(cè)，導(dǎo)致檢測(cè)準(zhǔn)確率較低。本發(fā)明將僅針對(duì)一 種抗原決定簇的SEM單克隆抗體作為包被抗體，將SEM兔抗血清作為一抗加入反應(yīng)體系中， 不僅克服了直接使用兔抗血清所帶來(lái)特異性問(wèn)題，還提高了方法的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0011] 目前常采用的Dot-ELISA檢測(cè)法W硝酸纖維膜（NC)為固相載體，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，硝 酸纖維膜對(duì)蛋白的固定易受到非特異性蛋白、氨鍵作用干擾物、疏水作用干擾物的影響，從 而使膜上蛋白物理吸附能力變?nèi)酰自斐杉訇幮?。而本發(fā)明采用聚苯己締酶標(biāo)板作為固相 載體，其物理吸附能力較強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，因而能克服因蛋白吸附問(wèn)題而造成的假陰性。
[0012] 進(jìn)一步，本發(fā)明優(yōu)化了抗體包被濃度、一抗稀釋度、酶標(biāo)二抗稀釋度、包被液、封閉 時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)品解育時(shí)間、酶標(biāo)抗體解育時(shí)間、3. 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB)顯色時(shí)間等。 通過(guò)該條件的設(shè)置可使最低檢測(cè)限為0. 5ng/mL，R2達(dá)到0. 9985。
[0013]本發(fā)明中各步驟的具體工作條件和過(guò)程如下： 所述步驟（1)的具體過(guò)程如下：用1.8~2. 7yg/mL的SEM單克隆抗體包被酶標(biāo)板并在 4°C過(guò)夜，該SEM單克隆抗體的加入量?jī)?yōu)選為100yL/孔； 所述步驟（2)的具體過(guò)程如下；^59(^20%脫脂奶粉為封閉液，在37°C下封閉比~化，該 封閉液的加入量?jī)?yōu)選為200yL/孔； 所述步驟（3)中解育的溫度為37°C，解育的時(shí)間為60~90min; 所述步驟（4)中一抗加入后在37°C下反應(yīng)比；所述酶標(biāo)二抗加入后在37°C下反應(yīng) 30~45min。該一抗和酶標(biāo)二抗的加入量均優(yōu)選為100uL/孔； 所述步驟（5)中顯色液加入后在37°C避光顯色7~10min;所述硫酸濃度為2mol/L。 該顯色液和硫酸的加入量均優(yōu)選為100yL/孔； 其中，所述步驟（1)中的包被抗體、步驟（2)中的封閉液、W及步驟（4)中的一抗和酶標(biāo) 二抗均采用抑=7. 4的1XPBS進(jìn)行稀釋，一抗的稀釋比例為1:2000~1:4000,酶標(biāo)二抗的稀 釋比例為1:6000~1:8000 ; 所述步驟（1)~步驟（4)中洗板的操作過(guò)程如下；倒去酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍 干，用含0. 05%Tween-20的PBST加滿孔，靜置3min,反復(fù)洗漆3~5次。
[0014] 所述顯色液由10mL顯色液A、125yL顯色液B、15yL3%的&〇2配置而成；其 中顯色液A由3. 5g的化2冊(cè)〇4.12&0、1. 1g的巧樣酸混合后加水至200ml，并調(diào)節(jié)抑值 至5. 0后制得；顯色液B由6mg的3. 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB)加入1血二甲基亞諷 (DMS0)混合制得。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有W下優(yōu)點(diǎn)及有益效果： 1、 本發(fā)明不僅能有效對(duì)新型腸毒素SEM進(jìn)行定性分析，還能有效對(duì)新型腸毒素M進(jìn)行 定量檢測(cè)，且檢測(cè)準(zhǔn)確度高； 2、 本發(fā)明中的試劑穩(wěn)定、易保存，且操作簡(jiǎn)單、低成本、靈敏度高，特異性強(qiáng)、重復(fù)性強(qiáng)、 穩(wěn)定性高；且本發(fā)明能同時(shí)檢測(cè)大量樣品，適用于金黃色葡萄球菌腸毒素SEM蛋白的檢測(cè) 和流行病學(xué)調(diào)查，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為本發(fā)明方法檢測(cè)得到的SEM標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例及其附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式 不限于此。 實(shí)施例
[0018] 一、準(zhǔn)備階段 本階段用于配置好相應(yīng)濃度的各試劑物品等，本發(fā)明中所用試劑物品包括；包被抗體、 封閉液、樣品、一抗、酶標(biāo)二抗、顯色液、硫酸。其中，酶標(biāo)板為96孔聚苯己締可拆酶標(biāo)板；該 包被抗體為SEM單克隆抗體，SEM單克隆抗體濃度為1.8~2. 7yg/mU封閉液濃度為5%~20% 的脫脂奶粉溶液，該SEM單克隆抗體和封閉液均采用抑=7. 4的1XPBS配置而成。樣品包 括檢測(cè)樣品和濃度分別為 0. 5ng/mL、lng/mL、2. 5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、 20ng/血的沈M標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。一抗為沈M兔抗血清，酶標(biāo)二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 羊抗兔IgG，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為市售產(chǎn)品，購(gòu)自武漢=鷹生物技術(shù)有限公 司。硫酸濃度為2mol/L。
[0019] 二、測(cè)定階段 首先，繪制出沈M的標(biāo)準(zhǔn)曲線。本階段采用一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素沈M的雙抗夾心法，用于檢測(cè)出不同樣品的〇〇45。值，具體操作方法如下： (1) 在酶標(biāo)板上加入包