專利名稱：：激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽及其篩選方法與用途。
背景技術(shù)：
：近年來結(jié)核病(Tuberculosis,TB)在全球范圍內(nèi)又死灰復(fù)燃。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界約有1/3人口約20億人感染了結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)，每年新發(fā)病人約900萬，每年死亡人數(shù)高達(dá)300萬。世界衛(wèi)生組織提出了"全球結(jié)核病緊急狀態(tài)"(globalemergency)。由此可見，結(jié)核病對(duì)人類健康和經(jīng)濟(jì)造成的沖擊和損害難以簡單評(píng)估。結(jié)核病在我國流行的特點(diǎn)是高患病率，高耐藥率，高死亡率，高感染率和低遞降率，嚴(yán)重影響了個(gè)人和家庭的生活質(zhì)量、社會(huì)和國家的建設(shè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。目前控制結(jié)核病的策略主要是直接使用抗生素。然而，需聯(lián)合使用多種抗生素至少達(dá)6個(gè)月以上，而且由于Mtb耐藥菌株的廣泛出現(xiàn)，常造成抗生素治療無效?，F(xiàn)今常用的結(jié)核疫苗一-卡介苗(BCG)具有很大的局限性(1)對(duì)成人結(jié)核的效果并不令人滿意；(2)可在免疫力低下的個(gè)體中引起嚴(yán)重的疾病甚至死亡；(3)可造成皮膚試驗(yàn)陽性，使其失去在結(jié)核桿菌感染中的診斷意義。因此，迫切需要開發(fā)新型高效的保護(hù)性結(jié)核疫苗，開發(fā)檢測、治療和預(yù)防結(jié)核病的新方法，以有效控制結(jié)核病的發(fā)生和病情發(fā)展，這一研究領(lǐng)域具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景。結(jié)核桿菌(Mtb)是一種細(xì)胞內(nèi)病原體，機(jī)體對(duì)其的控制依賴于對(duì)受感染細(xì)胞的識(shí)別和破壞。在小鼠模型中的研究表明，MHCII類限制性CD4+T細(xì)胞，MHCI類限制性CD8+T細(xì)胞，IFN-Y，TNF-a，YST細(xì)胞和CD1限制性T細(xì)胞在體內(nèi)具有積極的保護(hù)性作用。在人體內(nèi)己鑒定了不同型別的CD8+Mtb特異性T細(xì)胞，但其在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中的作用尚不明確。巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞在人體對(duì)Mtb的免疫反應(yīng)中起重要作用。Mtb可存活于未活化的巨噬細(xì)胞中。當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活，可產(chǎn)生IFN-Y等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)N0、活性硝酸鹽介質(zhì)(RNI)以及NO合成酶的產(chǎn)生，從而發(fā)揮免疫效應(yīng)作用。巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗微生物活性的另一條途徑是吞噬小體的融合。但Mtb感染巨噬細(xì)胞可抑制吞噬小體的融合和酸化，而Mtb得以存活于巨噬細(xì)胞內(nèi)。CD4+T細(xì)胞Mtb抗原經(jīng)MHCII類分子遞呈至CD4+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞可產(chǎn)生IFN-Y等細(xì)胞因子發(fā)揮效應(yīng)作用，也可誘導(dǎo)受染細(xì)胞的凋亡，還可協(xié)助B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的激活。但是，Mtb感染巨噬細(xì)胞可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞MHCII類分子表達(dá)下降，從而抑制CD4+T細(xì)胞的免疫效應(yīng)。CD8+T細(xì)胞Mtb被巨噬細(xì)胞的吞噬小體吞噬，其抗原或其分泌的蛋白質(zhì)進(jìn)入吞噬小體中，再透過吞噬小體膜進(jìn)入巨噬細(xì)胞，進(jìn)而被消化處理并由MHCI類分子遞呈至CD8+T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞可產(chǎn)生IFN-Y等細(xì)胞因子發(fā)揮效應(yīng)作用，也可通過Fas/Fasl途徑、granzymeB等直接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。研究表明,BCG不能充分刺激CD8+T細(xì)胞，可能由于BCG失去了關(guān)鍵的溶胞膜素，Mtb抗原不能進(jìn)入受感染細(xì)胞的胞液而被遞呈?，F(xiàn)有的研究主要是關(guān)于CD4+T細(xì)胞在結(jié)核病中的保護(hù)性反應(yīng)，特異性CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)與疾病不同階段的相關(guān)性，正在研究中。而結(jié)核病中CD8+T細(xì)胞的作用機(jī)制，尚未明確。CD8+T細(xì)胞被單個(gè)抗原肽激活依賴于許多因素，其中得到公認(rèn)的是，APC表面存在高密度的肽/MHC復(fù)合物是體內(nèi)或體外"初始"T細(xì)胞激活的關(guān)鍵。樹突狀細(xì)胞(DC)表達(dá)高水平MHC，在激活"初始"T細(xì)胞中起重要作用。關(guān)于激活"初始"T細(xì)胞所需的肽/MHC復(fù)合物分子數(shù)的報(bào)道，具有較大差異，從每細(xì)胞300個(gè)到10000個(gè)。但總的來講，"初始"T細(xì)胞的反應(yīng)需要激活記憶細(xì)胞所需肽/MHC復(fù)合物分子數(shù)的100-1000倍。而且有研究表明，90%被CD8+T細(xì)胞識(shí)別的肽，與其MHCI類分子高親合性結(jié)合。從HLAI類分子洗脫的肽多為8-10氨基酸。而用合成肽進(jìn)行的研究表明，長度為15-20氨基酸的肽亦可結(jié)合HLAI類分子而激活T細(xì)胞。HLAII類分子結(jié)合的肽的長度則具有相當(dāng)?shù)娜嵝?目前的TB疫苗可分為4類亞單位疫苗，DNA疫苗，全細(xì)菌疫苗和混合疫苗。亞單位疫苗是基于假設(shè)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)抗原即足以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。已有研究在小鼠模型上對(duì)亞單位疫苗進(jìn)行檢驗(yàn)，包括培養(yǎng)液濾過蛋白，單個(gè)蛋白，蛋白混合物以及融合蛋白。雖然這類疫苗很安全，但這種模式的抗原遞呈只能刺激有限數(shù)量的特異性T細(xì)胞，大多數(shù)是CD4+T細(xì)胞，而且總的來講，這類反應(yīng)比較短暫。DNA疫苗能刺激CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)而且持久，但其安全性仍令人擔(dān)心，包括基因組整合的風(fēng)險(xiǎn)。迄今經(jīng)測試，最成功的TBDNA疫苗是Ag85A。也有許多對(duì)全細(xì)菌疫苗的研究。從Mtb去除單個(gè)基因如毒力因子，可能降低細(xì)菌毒力但仍保持刺激CD4+、CD8+和非傳統(tǒng)T細(xì)胞的能力。對(duì)于這些突變子的安全性仍有爭議?；旌弦呙缡橇D利用上述策略的優(yōu)勢，如BCG可經(jīng)工程改造，過量表達(dá)一個(gè)或多個(gè)免疫原性/保護(hù)性蛋白。如，BCG經(jīng)工程改造可分泌listerlysin，這使BCG蛋白可進(jìn)入受感染細(xì)胞的胞漿，增強(qiáng)其刺激CD8+T細(xì)胞的能力。同樣，經(jīng)工程改造的BCG過量表達(dá)Ag85，在豚鼠實(shí)驗(yàn)中優(yōu)于單獨(dú)用BCG。當(dāng)Mtb以及其他一些細(xì)胞內(nèi)病原體生長在培養(yǎng)基中時(shí)，也釋放蛋白質(zhì)(培養(yǎng)基濾過蛋白)進(jìn)入胞外基質(zhì)中。有學(xué)者用雙相聚丙烯酰胺瓊脂糖電泳分析Mtb培養(yǎng)濾過液，鑒定了200多種不同的蛋白點(diǎn)。將胞內(nèi)產(chǎn)生的和培養(yǎng)基中生長的Mtb產(chǎn)生蛋白用雙相聚丙烯酰胺瓊脂糖電泳進(jìn)行比較分析，可發(fā)現(xiàn)顯著差異。Horwitz等純化并鑒定了在Mtb培養(yǎng)濾過液中最豐富的6種蛋白質(zhì)，包括抗原85A，抗原85B，超氧化物歧化酶，hsp71，Mpt51，Mpt63。用這些純化蛋白質(zhì)免疫豚鼠可使之獲得對(duì)Mtb的免疫力。盡管許多抗原帶有潛在的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)表位，但在初次反應(yīng)中只有少數(shù)能產(chǎn)生CTL反應(yīng)，主要的表位稱為免疫優(yōu)勢決定簇，其它的表位稱為次要決定簇或結(jié)構(gòu)性決定簇。次要決定簇能被處理和遞呈，但在免疫優(yōu)勢決定簇存在時(shí)，次要決定簇不能激發(fā)CTL反應(yīng)。結(jié)構(gòu)性表位不能被遞呈，可能在抗原處理過程中有問題，包括蛋白小體剪切的特異性以及由于包饒表位的側(cè)面序列。影響免疫優(yōu)勢的因素包括(1)APC的抗原處理無效；(2)缺乏適當(dāng)?shù)腡CR以識(shí)別表位/HLA復(fù)合物分子；(3)CD8+T細(xì)胞抗原遞呈的競爭；(4)由免疫優(yōu)勢CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的對(duì)其它決定簇反應(yīng)的抑制。對(duì)于TB疫苗而言，尤其應(yīng)考慮這些影響因素，因?yàn)閹缀趺總€(gè)人都會(huì)暴露于環(huán)境中的細(xì)菌，BCG和/或Mtb。雖然疫苗研究集中于免疫優(yōu)勢表位，但對(duì)次要決定簇的研究可能將免疫反應(yīng)集中于不能逃避免疫識(shí)別的表位。有報(bào)道，將ESAT-6的次要決定簇免疫小鼠，可誘導(dǎo)顯著的抗TB的保護(hù)性免疫反應(yīng)，而用有的免疫優(yōu)勢表位卻不能產(chǎn)生這樣的保護(hù)性反應(yīng)。因此，研究激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位，包括免疫優(yōu)勢決定簇和次要決定簇，十分必要和迫切。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是篩選出能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽，研究結(jié)核病的保護(hù)性免疫反應(yīng)機(jī)制，進(jìn)一步開發(fā)出新型的多聯(lián)多聚表位結(jié)核疫苗，更有效地預(yù)防和控制結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展。綜合應(yīng)用基因組序列、生物信息學(xué)、功能基因組學(xué)和免疫學(xué)研究，本發(fā)明提供了一種能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽，所述肽含有選自以下的氨基酸序列RLLALLCAAV(SEQIDNO:2)，KLILTQPFDV(SEQIDNO:5)，RLSQSADQYL(SEQIDNO:IO)，F(xiàn)LTREMPAWL(SEQIDNO:12)，KLIA麗TRV(SEQIDNO:14)，GLPVEYLQV(SEQIDNO:15)。本發(fā)明還提供了一種能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽的篩選方法，其特征在于，它包括以下步驟I表位預(yù)測和分子模擬肽合成應(yīng)用數(shù)據(jù)庫SYFPEITHI對(duì)結(jié)核桿菌Rv3840c、Rv0309、Rv0129c、Rv0173進(jìn)行HLA-A*0201限制性CTL表位預(yù)測，以F-moc化學(xué)法合成上述預(yù)測得到的分子模擬肽；II上述分子模擬肽經(jīng)親和力分析、穩(wěn)定性分析、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞活性檢測和特異性抗體檢測，篩選出親和力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、能產(chǎn)生較強(qiáng)增殖反應(yīng)、具有較強(qiáng)細(xì)胞毒活性和免疫后能產(chǎn)生特異性抗體的分子模擬肽。本發(fā)明還提供了上述的能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽在制備免疫原、免疫動(dòng)物、或產(chǎn)生免疫保護(hù)上的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述的能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽在制備多聯(lián)多聚表位結(jié)核疫苗上的用途。該多聯(lián)多聚表位結(jié)核疫苗，它含有上述分子模擬肽SEQIDNO:2，5，10，12,14，15中一個(gè)或多個(gè)直接或間接地連接而成的肽段。本發(fā)明大大有助于對(duì)結(jié)核病的預(yù)防和治療，尤其是對(duì)多耐藥性菌株的控制，也有利于研究結(jié)核病中的分子、細(xì)胞作用機(jī)制，促進(jìn)困擾臨床的多耐藥性難題的解決。圖1預(yù)測抗原肽與HLA-A*0201的親和力及穩(wěn)定性分析結(jié)果圖2結(jié)核桿菌抗原肽刺激PBMCs產(chǎn)生的增殖反應(yīng)圖3結(jié)核桿菌抗原肽誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生特異性的CTL殺傷活性圖4結(jié)核抗原肽誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例l:1材料與方法1.1研究對(duì)象肺結(jié)核確診患者200例，其中HLA-A*0201陽性100例，HLA-A*0201陰性100例，均經(jīng)放射學(xué)和臨床痰培養(yǎng)檢驗(yàn)。100例HLA-A*0201陽性其他慢性肺病患者為疾病對(duì)照組，100例HLA-A*0201陽性健康志愿者為正常對(duì)照組。1.2試劑和試劑盒淋巴細(xì)胞分離液LymphoprepTM購自挪威AXIS-SHIELD公司；LPS、人重組IL-2、DMSO、BFA、P2-mg均購自Sigma公司；人重組GM-CSF、人重組IL-4購自R&D公司；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；(Sigma);FITC標(biāo)記的抗-CD3、抗-CD8、抗-HLA.A2流式單克隆抗體與檢測細(xì)胞內(nèi)因子FITC標(biāo)記抗體(IFN-Y、TNF-a、IL-10)均為Caltag公司產(chǎn)品；RNA抽提試劑盒購自Qiagen公司；時(shí)間分辨熒光DELFIA細(xì)胞增殖(AD0200)與細(xì)胞毒性(AD0016)檢測試劑盒均購自WallacOy公司；多肽由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；T2細(xì)胞株購自美國ATCC細(xì)胞庫。1.3主要儀器流式細(xì)胞儀(CoulterEPICSXL)時(shí)間分辨熒光檢測儀(DELFIA1235，PerkinElmer)1.4表位預(yù)測和多肽合成應(yīng)用數(shù)據(jù)庫SYFPEITHI對(duì)結(jié)核桿菌Rv3840c、Rv0309、Rv0129c、Rv0173進(jìn)行HLA-A*0201限制性CTL表位預(yù)測，根據(jù)多肽上的氨基酸是否為錨定殘基、輔助殘基或優(yōu)勢殘基進(jìn)行記分，分值高于21分者有可能是T細(xì)胞表位。由上海生工生物工程技術(shù)有限公司以F-moc化學(xué)法合成上述預(yù)測得到的多肽，合成的抗原肽均經(jīng)高效液相色譜純化(純度〉95%)，并經(jīng)質(zhì)譜鑒定。凍干粉保存于4"C，用前以無菌蒸餾水復(fù)蘇多肽(2ug/ul)。1.5抗原肽親和力分析采用T2細(xì)胞株進(jìn)行抗原肽親和力分析，其原理主要是利用T2細(xì)胞系的特點(diǎn)。T2細(xì)胞表面空載的HLA-A2分子表達(dá)極不穩(wěn)定，遞呈后很快降解，抗原肽與之結(jié)合后穩(wěn)定了HLA-A2的表達(dá)，抗原肽與HLA-A2的結(jié)合力越強(qiáng)，T2細(xì)胞表面HLA-A2分子的表達(dá)量就越高。而且由于T2細(xì)胞的內(nèi)源性抗原遞呈途徑中必需的抗原多肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)缺乏，所以T2細(xì)胞表面HLA-A2分子的表達(dá)量的增加直觀的反映了外來抗原肽與HLA-A2的結(jié)合力。具體方法為T2細(xì)胞以pH3.2的檸檬酸鈉一磷酸鹽緩沖液預(yù)處理lmin，使細(xì)胞表面的MHCI類復(fù)合物變性，立即用過量的RPMI1640(GibcoBRL)培養(yǎng)液洗1遍，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至3X105，以lml/孔種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。以抗原肽(20ug/ml)刺激，補(bǔ)充Brefeldin(BFA,10ug/ml)和P2-MG(lug/ml)，37°C5%C02飽和濕度孵育4h，并以未加抗原肽為空白對(duì)照孔。收集細(xì)胞，以FACS(含0.2%FCS和0.1%疊氮鈉的PBS)洗1遍，用FITC標(biāo)記的小鼠抗人HLA-A9150201單克隆抗體染色，常溫暗處反應(yīng)30min，F(xiàn)ACS液洗2遍，以鞘液懸浮，流式細(xì)胞儀(CoulterEPICSXL)檢測平均熒光強(qiáng)度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，平均熒光強(qiáng)度高于空白對(duì)照孔平均熒光強(qiáng)度+3SD的抗原肽具有HLA-A*0201高親和力。1.6抗原肽穩(wěn)定性分析T2細(xì)胞同前預(yù)處理，將抗原肽濃度提高至80ug/ml，37°C5%C02飽和濕度孵育18h，補(bǔ)充BFA至終濃度為10ug/ml，繼續(xù)孵育3h。收集細(xì)胞，同前測平均熒光強(qiáng)度。平均熒光強(qiáng)度高于空白對(duì)照孔平均熒光強(qiáng)度+3SD的抗原肽進(jìn)行細(xì)胞增殖反應(yīng)及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。1.7抗原肽誘導(dǎo)CTL制備密度梯度離心法分離經(jīng)EDTA抗凝的靜脈血中的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)，分離得到的PBMCs種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37°C5%C02孵育1.5h。收集懸浮細(xì)胞(主要為淋巴細(xì)胞)，以10%二甲亞砜900/^小牛血清保存于液氮備用。貼壁細(xì)胞為抗原提呈細(xì)胞一樹突狀細(xì)胞(DC)，補(bǔ)充含GM-CSF(1000U/ml,R&D)、IL-4(1000U/ml,R&D)及含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，37°C5%C02培養(yǎng)7d，需要時(shí)補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液。5d后，加入LPS(lUg/ml，Sigma)培養(yǎng)2d后，Y照射使其失去增殖活性。將經(jīng)過照射的DC與抗原肽(10umol/L)在培養(yǎng)液中，37'C5XC02共孵過夜。將1乂105負(fù)載有抗原肽的DC與1X106自體PBMCs種于含10%FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)液的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37。C5XC02混合培養(yǎng)3d后，加入rlL-2(20U/ml,Sigma)繼續(xù)培養(yǎng)10d，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞活性檢測。1.8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用時(shí)間分辨熒光DELFIA細(xì)胞增殖檢測試劑盒(AD0200，Wallaroy)，將經(jīng)輻射的5X103負(fù)載抗原肽的DC100ul與5X104抗原肽誘導(dǎo)的自體CTL100ul種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并以未負(fù)載抗原肽的DC作為陰性對(duì)照。加入20uffirdU標(biāo)記液孵育10h,離心1遍，加入Eu標(biāo)記的抗BrdU單抗，室溫孵育2h，洗滌，固定。時(shí)間分辨熒光檢測儀(DELFIA1235)檢測熒光強(qiáng)度，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值為檢測結(jié)果。增殖系數(shù)(SI)=含抗原肽的平均熒光強(qiáng)度/陰性對(duì)照的平均熒光強(qiáng)度，SI>2的抗原肽視為能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖。1.9細(xì)胞毒性分析采用時(shí)間分辨熒光DELFIAEUTDA細(xì)胞毒性試驗(yàn)(AD0116,Wallaroy)，抗原肽誘導(dǎo)CTL為效應(yīng)細(xì)胞(E)，負(fù)載抗原肽的T2細(xì)胞為耙細(xì)胞(T)，檢測殺傷活性。參照說明書進(jìn)行操作，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例為40:1，培養(yǎng)4h。時(shí)間分辨熒光檢測儀(DELFIA1235)檢測熒光強(qiáng)度，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值為檢測結(jié)果。細(xì)胞殺傷活性=(待測孔熒光強(qiáng)度一自然釋放孔熒光強(qiáng)度)/(最大釋放孔熒光強(qiáng)度一自然釋放孔熒光強(qiáng)度)X100%。1.10動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.10.1動(dòng)物及分組C57BL/6小鼠20只，2月齡，體重(18土2)g，雌雄不限，隨機(jī)分為4組，每組5只。1.10.2免疫方法以體外實(shí)驗(yàn)篩選出的結(jié)核抗原肽為免疫原，共注射3次，每次間隔2周，首次以CFA為佐劑，加強(qiáng)免疫以IFA為佐劑。小鼠首次及加強(qiáng)免疫量為50ug/只，與0.3ml佐劑完全乳化后，在腋窩、腹股溝、腋部皮下及腹腔多點(diǎn)注射。1.10.3標(biāo)本的采集與分離在首次免疫、二次免疫和三次免疫后21天，分別對(duì)5只/組小鼠在眼眶采血，分離血清，并凍存于-2(TC冰箱備用。1.10.4檢測特異性抗體采用標(biāo)準(zhǔn)間接ELISA法測定血清中抗體滴度，分別測定每組動(dòng)物特異性抗體滴度。按100孔包被96孔酶聯(lián)板，抗原濃度為20ug/ml，4'C過夜；以5%BSA-PBS37'C封閉120min,洗滌3次，3min/次；加倍比稀釋的被測動(dòng)物血清，100孑L，37t:孵育90min。洗滌3次后，加入HRP酶標(biāo)二抗，37°C30min;洗滌3次后，加入DAB底物，37°C10min，終止反應(yīng)。酶聯(lián)儀于490nm測定吸光度A值，以正常小鼠血清作陰性對(duì)照。結(jié)果以雙復(fù)孔A值均值表示。以待測標(biāo)本A值/陰性對(duì)照A值〉2為陽性標(biāo)準(zhǔn)，以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度作為該樣本中抗體滴度。1.10.5免疫小鼠的攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)對(duì)每組剩下5只C57BL/6鼠免疫三次后間隔8周攻毒，攻毒注射部位為小鼠尾靜脈，注射劑量為1X106CFU，攻毒株為H37Rv。攻毒后8周殺死小鼠，將肺臟、脾臟勻漿稀釋接種到固體羅氏培養(yǎng)基上，四周后活菌計(jì)數(shù)。2結(jié)果2.1表位預(yù)測及多肽合成結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測，選擇以下肽序列進(jìn)行合成。合成的多肽經(jīng)質(zhì)譜鑒定，純度經(jīng)高壓液相色譜(HPLC)分析均大于95%。Rv0309:VLAPVSLAV(SEQIDNO:l)RLLALLCAAV(SEQIDN0:2)SLAVVNPWFA(SEQIDNO:3)VLAPVSLAVV(SEQIDNO:4)Rv0173:KLILTQPFDV(SEQIDNO:5)FLGKLDTFT(SEQIDNO:6)VLLVLALLL(SEQIDNO:7)RVMVADVWV(SEQIDNO:8)YLVGALKLI(SEQIDNO:9)RLSQSADQYL(SEQIDNO:IO)Rv0129c:GLPVEYLQV(SEQIDNO:ll)FLTREMPAWL(SEQIDNO:12)Rv3804c:AIYGPQQFV(SEQIDNO:13)KLIA畫TRV(SEQIDNO:14)GLPVEYLQV(SEQIDNO:15)2.2抗原肽親和力及穩(wěn)定性分析結(jié)果99%培養(yǎng)的T2細(xì)胞都表達(dá)HLA-A*0201分子，但平均熒光強(qiáng)度較弱。上述合成的抗原肽與HLA-A*0201結(jié)合活性見表1。經(jīng)抗原肽1-15處理后的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度出現(xiàn)升高，其中以抗原肽2和14升高最為明顯。T2細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度經(jīng)抗原肽處理后的增長倍數(shù)=抗原肽處理后的平均熒光強(qiáng)度/無抗原肽的平均熒光強(qiáng)度，以抗原肽14處理的最高，抗原肽15其次?？乖呐cHLA-A*0201分子結(jié)合的穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，抗原肽與T2細(xì)胞上的HLA-A*0201分子結(jié)合后，抗原肽2、3、5、7、8、10、12、14、15能使T2細(xì)胞HLA-A*0201分子表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)(見圖l)。根據(jù)結(jié)合力和穩(wěn)定性結(jié)果，選擇抗原肽2、3、5、7、8、10、12、14、15繼續(xù)下游實(shí)驗(yàn)。表1抗原肽刺激后的T2細(xì)胞HLA-A*0201平均熒光強(qiáng)度抗原肽SECIDNO氨基酸序列模擬來源:氨基酸位置平均熒光強(qiáng)度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.3抗原肽刺激細(xì)胞增殖以細(xì)胞增殖反應(yīng)評(píng)價(jià)抗原肽2、3、5、7、8、10、12、14和15在結(jié)核病患者PBMC中誘導(dǎo)抗原特異性CTL的能力，進(jìn)一步鑒定其是否為特異性細(xì)胞表位。其中，HLA-A*0201陽性結(jié)核病患者100例，HLA-A*0201陰性結(jié)核病患者100例，100例HLA-A*0201陽性其他慢性肺病患者為疾病對(duì)照組，100例HLA-A*0201陽性健康志愿者為正常對(duì)照組。設(shè)以刺激系數(shù)(SI)〉3為增殖反應(yīng)陽性。結(jié)果表明，結(jié)核病患者(HLA-A*0201陽性和陰性患者)PBMC對(duì)抗原肽2、5、10、12、14和15均產(chǎn)生較強(qiáng)的陽性增殖反應(yīng)，而在疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組未出現(xiàn)顯著的增殖反應(yīng)(見圖2)。2.4抗原肽誘導(dǎo)CTL殺傷毒性以負(fù)載抗原肽的T2細(xì)胞為靶細(xì)胞，抗原肽誘導(dǎo)的CD8+CTL為效應(yīng)細(xì)胞，效靶比(E/T)為20:1，經(jīng)時(shí)間分辨熒光DELFIAEUTDA細(xì)胞毒性試驗(yàn)分析結(jié)核桿菌抗原肽誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞毒活性。結(jié)果表明，經(jīng)抗原肽2、5、10、12、14和15刺激的CD8+CTL為效應(yīng)細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性(見圖3)。2.5小鼠抗體滴度的動(dòng)態(tài)測定首次免疫后2周始，取血l次/周，分離血清，以結(jié)核抗原肽為包被抗原，ELISA間接法測定特異性抗體滴度，首次免疫3周后即可檢出特異性抗體，抗體滴度在測定時(shí)間內(nèi)，抗體滴度逐漸增高，首次免疫后8周，抗體滴度達(dá)最高1:64?？贵w滴度隨免疫次數(shù)和時(shí)間升高，而陰性對(duì)照組未檢測到抗體(見圖4)。2.6疫苗對(duì)免疫鼠的保護(hù)效果分析以攻毒8周后的小鼠為實(shí)驗(yàn)材料，研究了各疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)效力。實(shí)驗(yàn)表明，各免疫組小鼠肺臟和脾臟的細(xì)菌數(shù)顯著減少。其保護(hù)效率如表2。表2疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性應(yīng)答能力<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*保護(hù)率的計(jì)算方法為陰性組細(xì)菌數(shù)對(duì)數(shù)值減去疫苗或BCG組的細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)值而得到。數(shù)值越大保護(hù)效率越高。3結(jié)論綜合應(yīng)用基因組序列、生物信息學(xué)、功能基因組學(xué)和免疫學(xué)研究，結(jié)果證實(shí)，以下抗原表位的分子模擬肽，可以激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)1.RLLALLCAAV(SEQIDNO:2)，模擬來源Rv0309:aa.312;2.KLILTQPFDV(SEQIDNO:5)，模擬來源Rv0173:aa.302311;3.RLSQSADQYL(SEQIDNO:IO)，模擬來源Rv0173:aa.260269;4.FLTREMPAWL(SEQIDNO:12)，模擬來源Rv0129c:aa.l44153;5.KLIANNTRV(SEQIDNO:14)，模擬來源Rv3804c:aa.242250;6.GLPVEYLQV(SEQIDNO:15),模擬來源Rv3804c:aa.48~56。SEQUENCELISTING〈110〉中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)〈120〉激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位及其用途〈130〉說明書，權(quán)利要求書〈160〉15〈170>Patentlnversion3.1〈210〉1〈211>9〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉1ValLeuAlaProValSerLeuAlaVal15〈210〉2〈211〉10〈212〉PRT〈213〉人工序列<400>2ArgLeuLeuAlaLeuLeuCysAlaAlaVal1510<210>3〈211〉10〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉3SerLeuAlaValValAsnProTrpPheAla1510〈210〉4〈211〉10〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉4ValLeuAlaProValSerLeuAlaValVal1510〈210〉5〈211〉10<212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉5LysLeulieLeuThrGinProPheAspVal1510〈210〉6〈211〉9<212>PRT〈213〉人工序列〈400〉6PheLeuGlyLysLeuAspThrPheThr15<210>7〈211〉9〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉7ValLeuLeuValLeuAlaLeuLeuLeu15〈210>8〈211〉9〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>8ArgValMetValAlaAspValTrpVal15〈210>9〈211〉9<212>PRT〈213>人工序列〈400〉9TyrLeuValGlyAlaLeuLysLeulie15〈210〉10〈211〉10〈212〉PRT〈213〉人工序列<400〉10ArgLeuSerGinSerAlaAspGinTyrLeu1510〈210〉11<211>9〈212〉PRT〈213>人工序列〈400〉11GlyLeuProValGluTyrLeuGinVal15〈210〉12〈211〉10〈212〉PRT<213>人工序列〈400〉12PheLeuThrArgGluMetProAlaTrpLeu1510〈210〉13〈211〉9〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉13AlalieTyrGlyProGinGinPheVal15〈210〉14〈211〉9〈212〉PRT〈213〉人工序列<400〉14LysLeulieAlaAsnAsnThrArgVal15〈210〉15〈211>9<212>PRT〈213〉人工序列〈400>15GlyLeuProValGluTyrLeuGinVal1權(quán)利要求1、能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列如SEQIDNO10所示。2、如權(quán)利要求1所述的能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽在制備免疫原上的應(yīng)用。3、如權(quán)利要求1所述的能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽在制備多聯(lián)多聚表位結(jié)核疫苗上的用途。全文摘要本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)領(lǐng)域，近年來結(jié)核病在全球范圍內(nèi)又死灰復(fù)燃，由于耐藥菌株的出現(xiàn)，抗生素治療常常無效；常用的結(jié)核疫苗——卡介苗也具有局限性。本發(fā)明的目的是篩選出能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽，研究結(jié)核病的保護(hù)性免疫反應(yīng)機(jī)制，進(jìn)一步開發(fā)出新型的多聯(lián)多聚表位結(jié)核疫苗。本發(fā)明提供了一種能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽，所述肽的氨基酸序列如SEQIDNO10所示。本發(fā)明還提供了上述肽的篩選方法和用途。本發(fā)明將更有效地預(yù)防和控制結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展。文檔編號(hào)A61P37/00GK101298471SQ20081012732公開日2008年11月5日申請(qǐng)日期2006年6月6日優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日發(fā)明者仲人前,吳傳勇,曄周,婁加陶,蔣廷旺,鄧安梅,錢,波陳,燕陳,陳孫孝申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)