專利名稱：一種綠膿桿菌疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
綠膿肝菌是一種條件致病菌，對外界環(huán)境適應(yīng)能力很強(qiáng)，在潮濕環(huán)境下可 長期存活。人正常皮膚尤其是潮濕部位(如腋下、會陰部、耳道、呼吸道和腸 道等處)均有綠膿肝菌的存在，而完整的皮膚和粘膜作為屏障能夠有效的抵御 綠膿肝菌的入侵，但人體的正常防御機(jī)制下降或受到損傷(如皮膚粘膜損傷、 粒細(xì)胞缺乏、低蛋白血癥、腫瘤的放化療、長期應(yīng)用激素和抗生素、燒傷、嬰 幼兒皮膚、臍帶、腸道，老年人泌尿系統(tǒng))則容易引發(fā)綠膿肝菌感染。
據(jù)報(bào)道綠膿桿菌引起的院內(nèi)感染占10% 31.5%，居病原菌之首，國內(nèi)外 燒傷中心對細(xì)菌感染的臨床調(diào)査中發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌感染占50%以上。目前對綠膿 桿菌感染的治療有抗菌素和免疫兩種治療方法。長期使用抗菌素治療綠膿桿菌 導(dǎo)致大量耐藥菌株的產(chǎn)生，并破壞人體中正常菌群，引起繼發(fā)感染，致使治療 失??；而且綠膿桿菌的耐藥機(jī)理十分復(fù)雜，其中綠膿桿菌細(xì)胞外膜通透性低(僅 為大腸桿菌的0.2%~1.0%)和外排各種物質(zhì)的復(fù)雜主動排出系統(tǒng)(目前研究已 發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌細(xì)胞膜內(nèi)存在著由3種蛋白質(zhì)構(gòu)成的"外排泵"，可以排出對自 身有害的物質(zhì))在多重耐藥中起著致關(guān)重要的作用。因此綠膿桿菌感染已到了 無抗菌素可用的地步，目前患者一旦感染很難治愈，特別是敗血癥，死亡率極 高。目前己檢測出11型(分為1 XI型)綠膿桿菌，因此單一價(jià)態(tài)的綠膿桿菌 疫苗不能滿足臨床免疫的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決目前抗菌素難以治愈綠膿桿菌感染，以及單一價(jià) 態(tài)的綠膿桿菌疫苗不能滿足臨床免疫的需求的問題，而提供的一種綠膿桿菌疫 苗及其制備方法。
本發(fā)明綠膿桿菌疫苗由置于生理鹽水中的綠膿桿菌Pi的內(nèi)毒素、綠膿桿 菌P2的內(nèi)毒素、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素和綠膿桿菌Pn)3的類毒素組成；綠膿桿菌疫苗中綠膿桿菌Pi的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為l/6~l/3mg/mL、綠膿 桿菌P2的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為l/6~l/3mg/mL、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒 素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為l/6~l/3mg/mL、綠膿桿菌P朋的類毒素的濃度以 蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為0.5~lmg/mL;其中綠膿桿菌&保藏于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保 藏管理中心，保藏號為10115;綠膿桿菌P2保藏于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管 理中心，保藏號為10116;綠膿桿菌P6保藏于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中 心，保藏號為10120;綠膿桿菌Pu)3保藏于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心， 保藏號為10103。
上述綠膿桿菌疫苗按以下步驟制備 一、將綠膿桿菌Pi、 P2和P6分別接
種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在37 42'C條件下培養(yǎng)18 24h，然后用內(nèi)毒素液體 合成培養(yǎng)基將綠膿桿菌沖洗入搖瓶再在37 42°C、 175 200r/min的條件下振 蕩培養(yǎng)24 30h，之后調(diào)節(jié)內(nèi)毒素液體合成培養(yǎng)基pH值至6.5 8.5，再加入 甲苯放于37 42。C到環(huán)境中靜置48 72h，然后用1000K 3000K的濾板進(jìn)行 超濾，收集濾液；二、分別向?yàn)V液中加入濃度為30 50g/mL的ZnCl2溶液， 然后攪拌、沉淀，再在4。C、 4000r/min的條件下離心20min，棄去上清液，按 飽和Na2HP04溶液與沉淀物5 : 1的體積比向沉淀物中加入飽和的Na2HP04 溶液，再在37 42'C的條件下電磁攪拌2h，然后置于0 4'C環(huán)境8 10h，再 在4°C、 4000r/min的條件下離心20min，取上清液分別得到綠膿桿菌P,、 P2 和P6的粗制內(nèi)毒素；三、分別調(diào)節(jié)綠膿桿菌Pi、 P2和P6的粗制內(nèi)毒素pH值 至7.2，然后流水透析72 120h，再用電風(fēng)扇濃縮透析袋內(nèi)液體體積，之后將 透析袋冰浴并按透析袋內(nèi)液體與丙酮1 :2的體積比加入丙酮，再在4°C、 4000r/min的條件下離心20min，取沉淀物置于37'C環(huán)境中干燥，得到綠膿桿 菌P,、 P2和P6內(nèi)毒素；四、將綠膿桿菌PuB接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基在32 4(TC、 120 150r/min條件下振蕩培養(yǎng)22 28h，然后按1% (體積)的接種量接種于 新鮮的產(chǎn)毒培養(yǎng)基中在32 4(TC、 12(M50r/min條件下振蕩培養(yǎng)22 28h，再 在4匸、7000r/min條件下離心30min，收集上清液并加入硫柳汞，硫柳汞終濃 度為0.2 0.8mL/L，再在4"C環(huán)境中放置24 28h得到無菌粗毒素；五、將粗 毒素流水透析24 72h，再加入濃度為lmol/L、透析液l/2體積乙酸，然后在 4°C、 8000r/min條件下離心30min，再將離心沉淀物溶解于濃度為0.1 0.5mol/L
6的檸檬酸鈉溶液中，再用濃度為0.01mol/L、 pH值為8.0的Tris-HCl緩沖液透 析過夜，之后加入固體硫酸銨至飽和，再在4"C、 7000r/min條件下離心30min， 離心沉淀物用濃度為O.01mol/L的Tris-HCl緩沖液溶解，再在4。C條件下用濃 度為0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液透析過夜，然后加入DE-52纖維素?cái)嚢?30min，再放入4。C環(huán)境中靜置lh，將去除上清液的纖維素裝柱，并依次用pH 值為8.0、 NaCl濃度為0.05mol/L、 0.13mol/L和0.20mol/L的Tris-HCl緩沖液 進(jìn)行階段洗脫，收集NaCl濃度為0.13mol/L階段的洗脫液并加入固體硫酸銨 至硫酸銨30%飽和度，再在4。C、 7000r/min條件下離心30min，取離心上清液 加入固體硫酸銨至硫酸銨70飽和度，再4'C靜止30 min后在4'C、 7000r/min 條件下離心30min，離心沉淀物用濃度為O.01mol/L、 pH值為8.0、 NaCl濃度 為O.05mol/L的Tris-HCl緩沖液溶解；六、用濃度為O.01mol/L、 pH值為8.0、 NaCl濃度為0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液洗滌DE-52纖維素柱，再把步驟五 溶解了離心沉淀物的Tris-HCl緩沖液加入DE-52纖維素柱，然后用濃度為 O.01mol/L、 pH值為8.0、 NaCl濃度為0.05 0.30mol/L的Tris-HCl緩沖液梯度 洗脫，收集洗脫液用聚乙二醇-6000濃縮，得到綠膿桿菌P^的類毒素；七、
將綠膿桿菌Pi的內(nèi)毒素、綠膿桿菌P2的內(nèi)毒素、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素和綠膿
桿菌P1Q3的類毒素置于生理鹽水中，其中綠膿桿菌P,的內(nèi)毒素的濃度以蛋白 質(zhì)質(zhì)量計(jì)為l/6~l/3mg/mL、綠膿桿菌P2的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為 1/6 1/3mg/mL、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/6 1/3mg/mL、 綠膿桿菌PuB的類毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為0.5~lmg/mL，即得到綠膿桿 菌疫苗；步驟一中甲苯純度為分析純，甲苯與內(nèi)毒素液體合成培養(yǎng)的體積比為 0.21 0.52 : 1;步驟一內(nèi)毒素液體合成培養(yǎng)基中含有2.0% (質(zhì)量)的谷氨酸 鈉、0.75% (質(zhì)量)的葡萄糖、0.2% (質(zhì)量)WMgS04.7H20、 0.001% (質(zhì)量) 的Ca(N03) 2、 0.000005% (質(zhì)量)的FeS04'7H20、 0.0252% (質(zhì)量)的KH2P04 和0.563% (質(zhì)量)的Na2HP04'12H20， pH值為7.6;步驟二中每lOOmL濾 液中加入ZnCl2溶液3.2mL;步驟三中丙酮純度為分析純；步驟五Tris-HCl緩 沖液中的三羥甲基氨基甲烷為分析純。
本發(fā)明綠膿桿菌P,、 P2 、 P6和Pu)3保藏于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理
中心(CMCC)，中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心負(fù)責(zé)本門類微生物菌種的選擇、收集、鑒定、保藏、交換和供應(yīng)。本發(fā)明菌種(綠膿桿菌Pi、 P2 、 P6 和P朋)從中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心購買得到。
本發(fā)明綠膿桿菌疫苗屬于多價(jià)態(tài)疫苗，因采用了綠膿桿菌P,、 P2和Pe的 內(nèi)毒素，所以可以免疫己知的11型(分為I XI型)綠膿桿菌，而且由于加入 了綠膿桿菌P1Q3的類毒素，增強(qiáng)了疫苗對綠膿桿菌的免疫效果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方 式間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式綠膿桿菌疫苗由置于生理鹽水中的綠膿桿菌 Pj的內(nèi)毒素、綠膿桿菌P2的內(nèi)毒素、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素和綠膿桿菌Pu)3的
類毒素組成；綠膿桿菌疫苗中綠膿桿菌P,的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為 1/6 1/3mg/mL、綠膿桿菌P2的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/6 1/3mg/mL、 綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為l/6~l/3mg/mL、綠膿桿菌P103 的類毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為0.5~lmg/mL;其中綠膿桿菌P,保藏于中國 醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為10115;綠膿桿菌P2保藏于中國醫(yī)學(xué) 微生物菌種保藏管理中心，保藏號為10116;綠膿桿菌P6保藏于中國醫(yī)學(xué)微生 物菌種保藏管理中心，保藏號為10120;綠膿桿菌PuB保藏于中國醫(yī)學(xué)微生物 菌種保藏管理中心，保藏號為10103。
本實(shí)施方式中所選用的綠膿桿菌P^ P2 、 P6和Pu)3菌株為La型菌株。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式綠膿桿菌疫苗按以下步驟制備 一、將綠膿
桿菌Pi、P2和P6分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在37 42"C條件下培養(yǎng)18 24h，然后用內(nèi)毒素液體合成培養(yǎng)基將綠膿桿菌沖洗入搖瓶再在37 42°C、 175 200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24 30h，之后調(diào)節(jié)內(nèi)毒素液體合成培養(yǎng)基 pH值至6.5 8.5，再加入甲苯放于37 42。C到環(huán)境中靜置48 72h，然后用 1000K 3000K的濾板進(jìn)行超濾，收集濾液；二、分別向?yàn)V液中加入濃度為30 50g/mL的ZnCl2溶液，然后攪拌、沉淀，再在4"C、 4000r/min的條件下離心 20min，棄去上清液，按飽和Na2HP04溶液與沉淀物5 : 1的體積比向沉淀物 中加入飽和的Na2HP04溶液，再在37 42"C的條件下電磁攪拌2h，然后置于 0 4。C環(huán)境8 10h，再在4°C、 4000r/min的條件下離心20min，取上清液分別得到綠膿桿菌Pi、 P2和P6的粗制內(nèi)毒素；三、分別調(diào)節(jié)綠膿桿菌P,、 P2和
P6的粗制內(nèi)毒素pH值至7.2，然后流水透析72 120h，再用電風(fēng)扇濃縮透析 袋內(nèi)液體體積，之后將透析袋冰浴并按透析袋內(nèi)液體與丙酮1 : 2的體積比加 入丙酮，再在4t、 4000r/min的條件下離心20min，取沉淀物置于37"C環(huán)境
中干燥，得到綠膿桿菌P" P2和P6內(nèi)毒素；四、將綠膿桿菌P,03接種于產(chǎn)毒
培養(yǎng)基在32 4(TC、 120 150r/min條件下振蕩培養(yǎng)22 28h，然后按1% (體 積)的接種量接種于新鮮的產(chǎn)毒培養(yǎng)基中在32 40°C、 120~150r/min條件下 振蕩培養(yǎng)22 28h，再在4。C、 7000r/min條件下離心30min，收集上清液并加 入硫柳汞，硫柳汞終濃度為0.2~0.8mL/L，再在4'C環(huán)境中放置24 28h得到 無菌粗毒素；五、將粗毒素流水透析24 72h，再加入濃度為lmol/L、透析液 1/2體積乙酸，然后在4"、 8000r/min條件下離心30min，再將離心沉淀物溶 解于濃度為0.1 0.5mol/L的檸檬酸鈉溶液中，再用濃度為0.01mol/L、 pH值為 8.0的Tris-HCl緩沖液透析過夜，之后加入固體硫酸銨至飽和，再在4°C、 7000r/min條件下離心30min，離心沉淀物用濃度為O.01mol/L的Tris-HCl緩沖 液溶解，再在4'C條件下用濃度為O.01mol/L的Tris-HCl緩沖液透析過夜(去 除甲醛)，然后加入DE-52纖維素?cái)嚢?0min，再放入4"C環(huán)境中靜置lh，將 去除上清液的纖維素裝柱，并依次用pH值為8.0、 NaCl濃度為O.05mol/L、 O.13mol/L和0.20mol/L的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行階段洗脫，收集NaCl濃度為 O.13mol/L階段的洗脫液并加入固體硫酸銨至硫酸銨30%飽和度，再在4°C、 7000r/min條件下離心30min，取離心上清液加入固體硫酸銨至硫酸銨70飽和 度，再4。C靜止30min后在4。C、 7000r/min條件下離心30min，離心沉淀物用 濃度為O.01mol/L、 pH值為8.0、 NaCl濃度為O.05mol/L的Tris-HCl緩沖液溶 解；六、用濃度為O.01mol/L、 pH值為8.0、 NaCl濃度為O.05mol/L的Tris-HCl 緩沖液洗滌DE-52纖維素柱，再把步驟五溶解了離心沉淀物的Tris-HCl緩沖 液加入DE-52纖維素柱，然后用濃度為O.01mol/L、 pH值為8.0、 NaCl濃度為 O.05 0.30mol/L的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，收集洗脫液用聚乙二醇-6000濃
縮，得到綠膿桿菌Pu)3的類毒素；七、將綠膿桿菌P,的內(nèi)毒素、綠膿桿菌P2 的內(nèi)毒素、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素和綠膿桿菌P1Q3的類毒素置于生理鹽水中， 其中綠膿桿菌Pi的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為l/6~l/3mg/mL、綠膿桿菌P2的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/6 1/3mg/mL、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素的 濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/6 1/3mg/mL、綠膿桿菌Pub的類毒素的濃度以蛋白 質(zhì)質(zhì)量計(jì)為0.5 lmg/mL，即得到綠膿桿菌疫苗；步驟一中甲苯純度為分析純， 甲苯與內(nèi)毒素液體合成培養(yǎng)的體積比為0.21 0.52: 1;步驟一內(nèi)毒素液體合 成培養(yǎng)基中含有2.0% (質(zhì)量)的谷氨酸鈉、0.75% (質(zhì)量)的葡萄糖、0.2% (質(zhì) 量)的MgS04'7H20、 0.001% (質(zhì)量)的Ca(N03) 2、 0.000005% (質(zhì)量)的FeSO 4'7H20、 0.0252% (質(zhì)量)的KH2P04和0.563% (質(zhì)量)的Na2HP04'12H20， pH值為7.6;步驟二中每100mL濾液中加入ZnCl2溶液3.2mL;步驟三中丙酮 純度為分析純；步驟五Tris-HCl緩沖液中的三羥甲基氨基甲垸為分析純。
本實(shí)施方式設(shè)施與生產(chǎn)質(zhì)量管理按中國《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求實(shí) 施。本實(shí)施方式原料及輔料符合現(xiàn)行《中國藥典》或《中國生物制品主要原輔 材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》的要求，未納入上述標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)試劑，純度應(yīng)不低于分析純。 本實(shí)施方式生產(chǎn)用水源水符合國家飲用水標(biāo)準(zhǔn)；純化水及注射用水應(yīng)符合現(xiàn)行 《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)施方式直接用于生產(chǎn)的器具均為不銹鋼或玻璃器具， 都經(jīng)過嚴(yán)格清洗、去熱原質(zhì)處理及無菌化處理。
本實(shí)施方式中采用硫柳汞對綠膿桿菌P1Q3的外毒素進(jìn)行類毒化。本實(shí)施方 式制備的綠膿桿菌疫苗中硫柳汞含量不高于0.1g/L。
本實(shí)施方式綠膿桿菌疫苗可用于防治綠膿桿菌感染，如燒傷、手術(shù)、截癱 等所致的急、慢性及耐藥性綠膿桿菌感染性疾病。
本實(shí)施方式綠膿桿菌疫苗用于預(yù)防綠膿桿菌感染受傷后或術(shù)后6天內(nèi)第 一次注射綠膿桿菌疫苗(效果最好)，第一次免疫后第一周內(nèi)進(jìn)行第2 3次免 疫注射，之后每周免疫注射1次，共10次。
本實(shí)施方式綠膿桿菌疫苗用于治療綠膿桿菌感染隔日免疫注射l次，7 次為1療程，間隔1周，可進(jìn)行第二療程，直至痊愈為止。
本實(shí)施方式綠膿桿菌疫苗采用肌肉注射，成人每次注射0.5m L，小兒可 酌減。本實(shí)施方式綠膿桿菌疫苗可以有效的預(yù)防和治療已知的11型綠膿桿菌。
本實(shí)施方式綠膿桿菌疫苗使用時(shí)個別人(不到0.1 1.0%)可能產(chǎn)生疫苗 反應(yīng)即局部紅腫、壓痛或全身不舒服等癥狀，若紅腫面積超過7cm,或發(fā)燒 38。C以上，應(yīng)立即停藥。若發(fā)生休克要立即注射0.1%腎上腺素進(jìn)行急救。本實(shí)施方式綠膿桿菌疫苗使用前應(yīng)搖勻后使用。
有藥物過敏史者，有活動性肺結(jié)核及高血壓、冠心病者及孕婦慎用。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二的不同點(diǎn)是步驟三中電 風(fēng)扇的風(fēng)溫為25 50'C。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二的不同點(diǎn)是步驟一中將
經(jīng)過牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)的綠膿桿菌Pp P2和P6分別置于37 42'C的環(huán) 境中擴(kuò)大培養(yǎng)18h，然后再用內(nèi)毒素液體合成培養(yǎng)基將綠膿桿菌沖洗。其它步
驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。 本實(shí)施方式中采用震蕩擴(kuò)大培養(yǎng)。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二的不同點(diǎn)是步驟五中纖 維素裝柱的尺寸為2.6cmX60cm。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二的不同點(diǎn)是步驟三中透
析袋內(nèi)液體體積濃縮至50%。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二的不同點(diǎn)是步驟四中產(chǎn)
毒培養(yǎng)基按以下步驟制備先將45.0g胰蛋白酶大豆肉湯干粉(TSB)溶于 131.0mL水中，再置于4。C、體積為1500mL的水透析8 10h，然后向透析液 內(nèi)加入15mL甘油和9.36g谷氨酸鈉并定容至1500.0mL，即得到產(chǎn)毒培養(yǎng)基。 其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二的不同點(diǎn)是步驟七中綠 膿桿菌Pt的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/6mg/mL、綠膿桿菌P2的內(nèi)毒素 的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/6mg/mL、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì) 量計(jì)為1/6mg/mL、綠膿桿菌PK)3的類毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為0.5mg/mL。 其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二的不同點(diǎn)是步驟七中綠
膿桿菌P,的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/3mg/mL、綠膿桿菌P2的內(nèi)毒素 的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/3mg/mL、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì) 量計(jì)為1/3mg/mL、綠膿桿菌P1C3的類毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為lmg/mL。 其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二的不同點(diǎn)是步驟七中綠膿桿菌Pi的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為0.25mg/mL、綠膿桿菌P2的內(nèi)毒 素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為0.25mg/mL、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素的濃度以蛋白 質(zhì)質(zhì)量計(jì)為0.25mg/mL、綠膿桿菌P1Q3的類毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為 0.8mg/mL。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。
對具體實(shí)施方式
八、九和十中制備得到的綠膿桿菌疫苗進(jìn)行檢測
綠膿桿菌疫苗為無色或淡黃色澄明液體，澄明度符合藥典要求；綠膿桿菌 疫苗的pH值為6.0 7.5。
綠膿桿菌疫苗的效價(jià)均高于1 : 64。用具體實(shí)施方式
八、九和十中制備得 到的綠膿桿菌疫苗免疫體重為1.7 2.0Kg的家兔(自然抗體效價(jià)為1 : 10)， 每隔3天免疫一次，共免疫3次(每次注射綠膿桿菌疫苗0.75 1.25mg)，末 次免疫后第7天耳靜脈采血，接受免疫的家兔效價(jià)均高于1 : 64。
按《生物制品異常毒性試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行測試，實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成3組，第 一組每只小鼠注射具體實(shí)施方式
八制備得到的綠膿桿菌疫苗0.5mL，第二組每 只小鼠注射具體實(shí)施方式
九制備得到的綠膿桿菌疫苗0.5mL，第三組每只小鼠 注射具體實(shí)施方式
十制備得到的綠膿桿菌疫苗0.5mL。免疫注射7天后實(shí)驗(yàn)小 鼠全部存活，說明本發(fā)明綠膿桿菌疫苗無異常毒性。
具體實(shí)施方式
八、九和十中制備得到的綠膿桿菌疫苗于2 8t:避光保存 或運(yùn)輸有效期達(dá)2年。
選用體重為14 16g昆明種小鼠60只，隨機(jī)分成6組(第1組每只小鼠 注射具體實(shí)施方式
八制備得到的綠膿桿菌疫苗，第2組每只小鼠注射具體實(shí)施 方式九制備得到的綠膿桿菌疫苗，第3組每只小鼠注射具體實(shí)施方式
十制備得 到的綠膿桿菌疫苗)，第1至第3組每只小鼠皮下注射0.5mL綠膿桿菌疫苗， 共免疫注射2次(間隔為7天)，末次免疫后第9 11天進(jìn)行綠膿桿菌攻擊。 第1至第3組小鼠每只腹腔注射1MLD銅綠假單胞菌(含于0.5mL中)，第4 組小鼠每只腹腔注射2MLD銅綠假單胞菌(含于0.5mL中)，第5組小鼠每只 腹腔注射1MLD銅綠假單胞菌(含于0.5mL中)，第6組小鼠每只腹腔注射 0.5MLD銅綠假單胞菌(含于0.5mL中)。觀察3天，第4及第5組小鼠全部 死亡，第6組小鼠部分死亡，第l、第2及第3組中存活的小鼠數(shù)量均大于7 只(存活率〉70°/0)。同樣采用MLD(最小致死量)攻擊法，攻擊用菌為已知的11型綠膿桿菌，
分別進(jìn)行攻擊；分別接種具體實(shí)施方式
八、九和十中制備的綠膿桿菌疫苗的小 鼠存活率都高于70%。
權(quán)利要求
1、一種綠膿桿菌疫苗，其特征在于綠膿桿菌疫苗由置于生理鹽水中的綠膿桿菌P1的內(nèi)毒素、綠膿桿菌P2的內(nèi)毒素、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素和綠膿桿菌P103的類毒素組成；綠膿桿菌疫苗中綠膿桿菌P1的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/6～1/3mg/mL、綠膿桿菌P2的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/6～1/3mg/mL、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/6～1/3mg/mL、綠膿桿菌P103的類毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為0.5～1mg/mL；其中綠膿桿菌P1保藏于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為10115；綠膿桿菌P2保藏于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為10116；綠膿桿菌P6保藏于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為10120；綠膿桿菌P103保藏于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為10103。
2、 如權(quán)利要求1所述的綠膿桿菌疫苗的制備方法，其特征在于綠膿桿菌疫苗按以下步驟制備 一、將綠膿桿菌P,、 P2和P6分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在37 42t條件下培養(yǎng)18 24h，然后用內(nèi)毒素液體合成培養(yǎng)基將綠膿 桿菌沖洗入搖瓶再在37 42°C、 175 200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24 30h， 之后調(diào)節(jié)內(nèi)毒素液體合成培養(yǎng)基pH值至6.5 8.5，再加入甲苯放于37 42"C 到環(huán)境中靜置48 72h，然后用1000K 3000K的濾板進(jìn)行超濾，收集濾液；二、 分別向?yàn)V液中加入濃度為30 50g/mL的ZnCl2溶液，然后攪拌、沉淀， 再在4X:、 4000r/min的條件下離心20min，棄去上清液，按飽和Na2HP04溶 液與沉淀物5 : 1的體積比向沉淀物中加入飽和的Na2HP04溶液，再在37 42 ""C的條件下電磁攪拌2h，然后置于0 4'C環(huán)境8 10h，再在4。C、 4000r/min 的條件下離心20min，取上清液分別得到綠膿桿菌P,、 P2和P6的粗制內(nèi)毒素；三、 分別調(diào)節(jié)綠膿桿菌Ph P2和P6的粗制內(nèi)毒素pH值至7.2，然后流水透析 72 120h，再用電風(fēng)扇濃縮透析袋內(nèi)液體體積，之后將透析袋冰浴并按透析袋 內(nèi)液體與丙酮1 : 2的體積比加入丙酮，再在4°C、 4000r/min的條件下離心 20min，取沉淀物置于37t:環(huán)境中干燥，得到綠膿桿菌P!、 P2和P6內(nèi)毒素；四、 將綠膿桿菌Pu)3接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基在32 4(rC、 120 150r/min條件下振 蕩培養(yǎng)22 28h，然后按1% (體積)的接種量接種于新鮮的產(chǎn)毒培養(yǎng)基中在 32 40°C、 120 150r/min條件下振蕩培養(yǎng)22 28h，再在4。C、 7000r/min條件下離心30min，收集上清液并加入硫柳汞，硫柳汞終濃度為0.2 0.8mL/L，再 在4'C環(huán)境中放置24 28h得到無菌粗毒素；五、將粗毒素流水透析24 72h， 再加入濃度為lmol/L、透析液l/2體積乙酸，然后在4。C、 8000r/min條件下 離心30min，再將離心沉淀物溶解于濃度為0.1 0.5mol/L的檸檬酸鈉溶液中， 再用濃度為0.01mol/L、 pH值為8.0的Tris-HCl緩沖液透析過夜，之后加入固 體硫酸銨至飽和，再在4。C、 7000r/min條件下離心30min，離心沉淀物用濃度 為0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液溶解，再在4匸條件下用濃度為0.01mol/L的 Tris-HCl緩沖液透析過夜，然后加入DE-52纖維素?cái)嚢?0min，再放入4'C環(huán) 境中靜置1 5h，將去除上清液的纖維素裝柱，并依次用pH值為8.0、 NaCl 濃度為0.05mol/L、 0.13mol/L和0.20mol/L的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行階段洗脫， 收集NaCl濃度為0.13mol/L階段的洗脫液并加入固體硫酸銨至硫酸銨30%飽 和度，再在4。C、 7000r/min條件下離心30min，取離心上清液加入固體硫酸銨 至硫酸銨70飽和度，再4"C靜止30 min后在4°C 、7000r/min條件下離心30min， 離心沉淀物用濃度為0.01mol/L、pH值為8.0、NaCl濃度為0.05mol/L的Tris-HCl 緩沖液溶解；六、用濃度為0.01mol/L、 pH值為8.0、 NaCl濃度為0.05mol/L 的Tris-HCl緩沖液洗滌DE-52纖維素柱，再把步驟五溶解了離心沉淀物的 Tris-HCl緩沖液加入DE-52纖維素柱，然后用濃度為0.01mol/L、 pH值為8.0、 NaCl濃度為0.05 0.3Omol/L的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，收集洗脫液用聚乙二醇-6000濃縮，得到綠膿桿菌Pu)3的類毒素；七、將綠膿桿菌Pi的內(nèi)毒素、 綠膿桿菌P2的內(nèi)毒素、綠膿桿菌P6的內(nèi)毒素和綠膿桿菌Pu)3的類毒素置于生理鹽水中，其中綠膿桿菌Pi的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/6 1/3mg/mL、 綠膿桿菌P2的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/6 1/3mg/mL、綠膿桿菌P6 的內(nèi)毒素的濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為1/6 1/3mg/mL、綠膿桿菌P1()3的類毒素的 濃度以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為0.5~lmg/mL，即得到綠膿桿菌疫苗；步驟一中甲苯純 度為分析純，甲苯與內(nèi)毒素液體合成培養(yǎng)的體積比為0.21 0.52: 1;步驟一 內(nèi)毒素液體合成培養(yǎng)基中含有2.0% (質(zhì)量)的谷氨酸鈉、0.75% (質(zhì)量)的葡 萄糖、0.2% (質(zhì)量)的MgS04'7H20、 0.001% (質(zhì)量)的Ca(N03)2、 0.000005% (質(zhì)量)的FeS0 4'7H20、 0.0252% (質(zhì)量)的KH2PO^n 0.563% (質(zhì)量) 的Na2HP04'12H20， pH值為7.6;步驟二中每lOOmL濾液中加入ZnCl2溶液3.2mL;步驟三中丙酮純度為分析純；步驟五Tris-HCl緩沖液中的三羥甲基氨 基甲烷為分析純。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的綠膿桿菌疫苗的制備方法，其特征在于步驟三 中電風(fēng)扇的風(fēng)溫為25 50°C，透析袋內(nèi)液體體積濃縮至50%。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的綠膿桿菌疫苗的制備方法，其特征在于步驟一 中將經(jīng)過牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)的綠膿桿菌Pi、 &和P6分別置于37 42°C 的環(huán)境中擴(kuò)大培養(yǎng)18h，然后再用內(nèi)毒素液體合成培養(yǎng)基將綠膿桿菌沖洗。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的綠膿桿菌疫苗的制備方法，其特征在于步驟五 中纖維素裝柱的尺寸為2.6cmX60cm。
全文摘要
一種綠膿桿菌疫苗及其制備方法，它涉及一種疫苗及其制備方法。它解決了目前抗菌素難以治愈綠膿桿菌感染，以及單一價(jià)態(tài)的綠膿桿菌疫苗不能滿足臨床免疫的需求的問題。疫苗由置于生理鹽水中的綠膿桿菌P₁的內(nèi)毒素、綠膿桿菌P₂的內(nèi)毒素、綠膿桿菌P₆的內(nèi)毒素和綠膿桿菌P₁₀₃的類毒素組成。制備方法制備綠膿桿菌內(nèi)毒素，制備綠膿桿菌類毒素，混合，即得到綠膿桿菌疫苗。本發(fā)明綠膿桿菌疫苗屬于多價(jià)態(tài)疫苗，因采用了綠膿桿菌P₁、P₂和P₆的內(nèi)毒素，所以可以免疫已知的11型綠膿桿菌，而且由于加入了綠膿桿菌P₁₀₃的類毒素，增強(qiáng)了疫苗對綠膿桿菌的免疫效果。
文檔編號A61K39/07GK101406697SQ20081013759
公開日2009年4月15日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日
發(fā)明者沖 于, 于麗萍, 劉宇峰, 夏海華, 奚新偉, 孫建華, 張?jiān)坪? 曲曉軍, 沙長青, 王金英, 王雪嬌 申請人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所