專利名稱：：綠膿桿菌的外膜蛋白pa5158的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及衍生自綠膿桿菌外膜蛋白PA5158的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原和針對(duì)該抗原的抗體。本發(fā)明也涉及包含該抗原的疫苗組合物。本發(fā)明還涉及包含所述抗體的藥物組合物、用于綠膿桿菌感染的診斷劑、用于檢測(cè)綠膿桿菌的試劑盒和增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素的抗綠膿桿菌活性的增效劑。
背景技術(shù)：
：綠膿桿菌(銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa))是廣泛分布于自然環(huán)境例如土壤和水中的革蘭氏陰性桿菌，引起抵抗治療的嚴(yán)重致命感染。綠膿桿菌的主要感染對(duì)象是宿主防御功能減弱的缺乏抵抗力的患者，通常稱作易感染性宿主，包括燒傷、器官移植和癌癥患者。綠膿桿菌是院內(nèi)感染的主要病原菌。此外，由這種細(xì)菌引起的肺部感染對(duì)嚢性纖維化患者是致命的。對(duì)這些患者主要施用具有抗綠膿桿菌活性的抗菌劑，而眾多病例則因綠膿桿菌耐藥性而未能獲得充分的治療效果。另外，也已經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間地研究針對(duì)綠膿桿菌的疫苗或抗體。然而，直接使用該細(xì)菌滅活形式的方法具有缺點(diǎn)，即必須根據(jù)綠膿桿菌的不同血清型制備不同類型的疫苗或抗體。在這種情況下，期待利用具有綠膿桿菌菌林間共同氨基酸序列的綠膿桿菌蛋白被動(dòng)免疫或主動(dòng)免疫來(lái)預(yù)防或治療綠膿桿菌感染。例如，已知其中外膜蛋白OprF和Oprl的部分相互融合的重組蛋白(日本特開(kāi)第245699/1996號(hào)公才艮)和IV型菌毛蛋白(WO2004/099250)作為此種綠膿桿菌蛋白應(yīng)用于疫苗的情形。另外，已經(jīng)才艮道抗IV型菌毛抗體(W02004/099250)、抗PA1706(或PcrV)抗體(美國(guó)專利號(hào)6309561和6827935)等作為靶向綠膿桿菌蛋白的抗體藥物。然而，在顯示多樣血清型的綠膿桿菌臨床分離林間共同擁有的細(xì)菌蛋白可以作為"共同抗原，，應(yīng)用于預(yù)防、診斷或治療綠膿桿菌感染，并且因此一直是需要的。已經(jīng)報(bào)道由PAS158(或opmG)基因編碼的PA5158(也稱作OpmG)蛋白是構(gòu)成直接參與氨基糖苷類抗生素耐藥性的流出泵的外膜蛋白(AntimicrobialAgentsandChemotherapy,2003，47，1101-1111)。然而，該蛋白質(zhì)用作疫苗成分和針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體用作綠膿桿菌感染的治療劑或診斷劑是完全未知的。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明人已經(jīng)嘗試從綠膿桿菌外膜蛋白中鑒定新和有用的"共同抗原"。在多次研究后，本發(fā)明人已經(jīng)通過(guò)基因芯片分析發(fā)現(xiàn)編碼存在于綠膿桿菌外膜中的PA5158(也稱作OpmG)蛋白的基因穩(wěn)定地表達(dá)，無(wú)論人血清存在或不存在(實(shí)施例1)。另外，本發(fā)明人已經(jīng)通過(guò)對(duì)88林綠膿桿菌臨床分離株的基因分析發(fā)現(xiàn)PA5158蛋白的2個(gè)推定胞外區(qū)不存在可檢測(cè)的氨基酸突變并且完全是保守的(實(shí)施例2)。此外，本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)用PA5158重組蛋白免疫獲得的抗血清或抗體在綠膿桿菌感染的才莫型小鼠上顯示強(qiáng)效的抗感染保護(hù)作用(實(shí)施例9-12)，該抗體與PA5158蛋白結(jié)合(實(shí)施例7、8和13)并且該抗體顯示增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素的抗綠膿桿菌活性的作用(實(shí)施例14)。本發(fā)明基于這些發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的目的是提供用作疫苗組合物的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原，其中所述疫苗組合物具有實(shí)質(zhì)的預(yù)防或治療綠膿桿菌感染的能力并且可以對(duì)源自綠膿桿菌感染患者的多種臨床分離林反應(yīng)，或是提供針對(duì)所述抗原的抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了包含可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗綠膿桿菌PA5158蛋白抗體的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原的抗原組合物。根據(jù)本發(fā)明，提供了選自下列的蛋白質(zhì)(本文中此后稱作"本發(fā)明的蛋白質(zhì)")(i)包含序列編號(hào)4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)蛋白質(zhì)，包含序列編號(hào)4中缺失、替換、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，并且與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；(iii)蛋白質(zhì)，由在嚴(yán)格條件下與編碼序列編號(hào)4的氨基*列的多核普酸雜交的多核苷酸編碼，并且與由序列編號(hào)4的氨基^列組成的蛋白質(zhì)功能等同；和(iv)蛋白質(zhì)，包含與序列編號(hào)4的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基酸序列，并且與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同.根據(jù)本發(fā)明，提供了包含序列編號(hào)5的氨基酸序列或含有一個(gè)至數(shù)個(gè)保守性替換的序列編號(hào)5的氨基酸序列的肽(本文中此后稱作"本發(fā)明第一實(shí)施方案的肽")。根據(jù)本發(fā)明，提供了包含序列編號(hào)6的氨基酸序列或含有一個(gè)至數(shù)個(gè)保守性替換的序列編號(hào)6的氨基酸序列的肽(本文中此后稱作"本發(fā)明第二實(shí)施方案的肽，，)(本文中此后有時(shí)將本發(fā)明第一實(shí)施方案的肽和本發(fā)明第二實(shí)施方案的肽統(tǒng)稱為"本發(fā)明的肽")。根據(jù)本發(fā)明，提供了包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)或本發(fā)明肽的抗原組合物(本文中此后將這種抗原組合物和包含可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗綠膿桿菌PA5158蛋白抗體的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原的抗原組合物統(tǒng)稱為"本發(fā)明的抗原組合物")。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的疫苗組合物，包含本發(fā)明的抗原組合物和任選地一種或多種可藥用的載體、稀釋劑和/或佐劑。根據(jù)本發(fā)明，提供了針對(duì)綠膿桿菌PA5158蛋白或其部分的抗體，或其功能性片段(本文中此后稱作"本發(fā)明的抗體")。根據(jù)本發(fā)明，提供了在保藏號(hào)FERMBP-10672下保藏的雜交瘤。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的藥物組合物，包含本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體和任選地一種或多種可藥用的載體和/或稀釋劑。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于綠膿桿菌感染的診斷劑，包含本發(fā)明第一至第三實(shí)施方案的任一抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于檢測(cè)綠膿桿菌的試劑盒，包含本發(fā)明第一至第三實(shí)施方案的任一抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素的抗綠膿桿菌活性的增效劑，包含本發(fā)明第一至第三實(shí)施方案的任一抗體。本發(fā)明提供具有實(shí)質(zhì)的預(yù)防或治療綠膿桿菌感染的能力并且還對(duì)源自綠膿桿菌感染患者的多種臨床分離林反應(yīng)的疫苗組合物和多克隆抗體或單克隆抗體。它們可以應(yīng)用于綠膿桿菌感染的預(yù)防劑或治療劑或用于綠膿桿菌感染的診斷劑。此外，本發(fā)明的抗體與在綠膿桿菌外膜中或在綠膿桿菌胞外存在的PA5158蛋白的胞外區(qū)結(jié)合。此外，據(jù)估計(jì)這些區(qū)域是在菌林間極端高度保守的，與血清型等無(wú)關(guān)，并且與多種臨床分離林反應(yīng)。因此，本發(fā)明的抗體預(yù)期對(duì)綠膿桿菌感染具有高的治療效果。附圖簡(jiǎn)述圖l顯示pET15b質(zhì)粒(pET-PA5158國(guó)l)。發(fā)明詳述PA5158蛋白PA5158蛋白是衍生自綠膿桿菌的外膜PA5158蛋白。該蛋白質(zhì)的氨基酸序列和編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸的核苷酸序列分別在序列編號(hào)3和序列編號(hào)1中描述。在本上下文中，基于信號(hào)序列和有關(guān)與PA5158蛋白高度同源的綠膿桿菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)的立體結(jié)構(gòu)信息、有關(guān)大腸桿菌(E.coli)TolC蛋白(Nature，2000，405，914-919)的立體結(jié)構(gòu)信息和有關(guān)PA5158蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，估計(jì)在作為核苷酸序列序列編號(hào)1的氨基酸編碼區(qū)的1479個(gè)核苷酸中第337位至1479位核苷酸的核苷酸序列編碼PA5158蛋白的細(xì)胞表面暴露部分(序列編號(hào)2)。PA5158蛋白的細(xì)胞表面暴露部分是選自下列的蛋白質(zhì)(i)包含序列編號(hào)4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)蛋白質(zhì)，包含序列編號(hào)4中缺失、替換、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，并且與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；(iii)蛋白質(zhì)，由在嚴(yán)格條件下與編碼序列編號(hào)4的氨基^列的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，并且與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；和(iv)蛋白質(zhì)，包含與序列編號(hào)4的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基酸序列，并且與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同。在本說(shuō)明書(shū)中，表述"缺失、替換、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸"意指已經(jīng)根據(jù)熟知技術(shù)方法例如位點(diǎn)定向誘變或通過(guò)替換多個(gè)氨基酸至天然產(chǎn)生的程度實(shí)施了修飾。待修飾氨基酸的數(shù)目可以優(yōu)選地是l-50個(gè)、更優(yōu)選是l-30個(gè)，仍更優(yōu)選是1-10個(gè)，仍就更優(yōu)選是1-5個(gè)并且最優(yōu)選地是1個(gè)或2個(gè)。修飾的氨基酸序列可以優(yōu)選地是其氨基酸序列中具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選地，一個(gè)至幾個(gè)或l、2、3或4個(gè))保守性替換的氨基酸序列。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"保守性替換"意指一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用化學(xué)相似的其它氨基酸殘基替換。此類保守性替換的實(shí)例包括其中某個(gè)疏水性殘基用另一個(gè)疏水性殘基替換的情況，和其中某個(gè)極性殘基用帶相同電荷的另一個(gè)極性殘基替換的情況。對(duì)于每種類型的氨基酸，可以按照如此方式進(jìn)行替換的功能相似氨基酸是本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的。非極性(疏水性)氨基酸的實(shí)例包括丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。極性(中性)氨基酸的實(shí)例包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸。正電荷(堿性)氨基酸的實(shí)例包括精氨酸、組氨酸和賴氨酸。負(fù)電荷(酸性)氨基酸的實(shí)例包括天冬氨酸和谷氨酸。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"在嚴(yán)格條件下"意指其中雜交后的膜洗滌過(guò)程在高溫度于具有低鹽濃度的溶液中實(shí)施的條件。此類洗滌條件可以例如是在60。C的0.5xSSC(lxSSC:15mM檸檬酸三鈉和150mM氯化鈉)持續(xù)15分鐘，并且優(yōu)選地是在60。C的0.5xSSC，0.1%SDS持續(xù)15分鐘。可以4艮據(jù)已知方法實(shí)施雜交。在使用商業(yè)可獲得文庫(kù)的情況下，可以根據(jù)隨該文庫(kù)所包括說(shuō)明書(shū)中描述的方法實(shí)施雜交。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"同一性"就核苷酸序列或氨基^列而言，意指度。在本說(shuō)明書(shū)中所述的這種同一性的數(shù)值可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的同源性檢索程序進(jìn)行計(jì)算。例如，這種數(shù)值如同一性可以容易地使用FASTA或BLAST中的默認(rèn)(初始設(shè)定)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算。與序列編號(hào)4的氨基酸序列具有70。/?；蚋笸恍缘陌被嵝蛄锌梢耘c前述氨基酸序列具有優(yōu)選80%或更大、更優(yōu)選85%或更大、仍更優(yōu)選卯％或更大、仍就更優(yōu)選95%或更大、特別優(yōu)選98%或更大和最優(yōu)選99%或更大同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明中，若給出了序列編號(hào)4的氨基酸序列，則可以容易地確定編碼該氨基酸序列的核苷酸序列。因此，可以選擇編碼序列編號(hào)4的氨基酸序列的多種核苷酸序列。因此，編碼包含序列編號(hào)4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸不僅意指序列編號(hào)2的完整DNA序列的部分，還意指編碼相同氨基酸的DNA序列，其具有簡(jiǎn)并關(guān)系中密碼子作為DNA序列的序列。本發(fā)明還包括與此種DNA序列相對(duì)應(yīng)的RNA序列。編碼包含序列編號(hào)4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的優(yōu)選實(shí)例包括包含序列編號(hào)2的核苷酸序列的多核苷酸。在本說(shuō)明書(shū)中，某種蛋白質(zhì)是否與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同可以通過(guò)評(píng)估生物學(xué)現(xiàn)象或功能而確定，其中所述的生物學(xué)現(xiàn)象或功能與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)。例如，這可以通過(guò)遺傳重組才支術(shù)使這種蛋白質(zhì)表達(dá)并隨后評(píng)估是否可以制備抗PA5158蛋白的抗體而確定。因?yàn)楸景l(fā)明的蛋白質(zhì)暴露在綠膿桿菌的細(xì)胞表面上，因而該蛋白質(zhì)可以用作制備抗綠膿桿菌抗體的抗原(蛋白質(zhì)抗原)使用。在PA5158蛋白的細(xì)胞表面暴露部分中，鑒定了不存在可檢測(cè)的氨基酸突變的以下兩個(gè)部分(本文中此后稱作推定胞外區(qū))包含序列編號(hào)5的氨基酸序列的肽，或包含含有一個(gè)至數(shù)個(gè)保守性替換的序列編號(hào)5的氨基酸序列的肽；和包含序列編號(hào)6的氨基酸序列的肽，或包含含有一個(gè)至數(shù)個(gè)保守性替換的序列編號(hào)6的氨基酸序列的肽。因?yàn)楸景l(fā)明的肽暴露在綠膿桿菌的細(xì)胞表面上并且在綠膿桿菌中保守，因而該肽可以用作制備抗綠膿桿菌抗體的抗原(肽抗原)。已經(jīng)證實(shí)該肽在眾多的綠膿桿菌臨床分離林中不存在可檢測(cè)的氨基酸突變并且因此有利的之處就在于它們用作共同抗原。對(duì)于本發(fā)明的肽而言，可以將封閉基團(tuán)例如添加至肽的氨基末端或羧基末端以防止因電荷所致的聚集。常分別對(duì)氨基末端和狻基末端使用乙?；王０坊?，但不限于這些。本發(fā)明的肽可以例如通過(guò)對(duì)其添加半胱氨酸殘基而修飾以增強(qiáng)與間隔物的結(jié)合?；腔?SMCC(磺基琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來(lái)酰亞胺基曱基環(huán)己烷-l-羧酸酯)等通常用作間隔物，但不限于此?？梢允褂闷鸬介g隔物作用的化合物。對(duì)于本發(fā)明的肽，載體蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、或鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)可以用作載體，但不限于此。[抗原組合物J本發(fā)明的蛋白質(zhì)或本發(fā)明的肽可以用作蛋白質(zhì)抗原或肽抗原。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了包含可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗綠膿桿菌外膜PA5158蛋白抗體的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原的抗原組合物。在本上下文中，蛋白質(zhì)抗原或肽抗原可以優(yōu)選地通過(guò)根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)或本發(fā)明肽而使用。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"抗原組合物，，可以是僅由蛋白質(zhì)抗原或肽抗原組成的組合物或包含此類抗原和其它成分的組合物。根據(jù)本發(fā)明，提供了包含可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗綠膿桿菌PA5158蛋白抗體的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原的抗原組合物。疫苗組合物J本發(fā)明的抗原組合物可以用作疫苗。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了包含可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗綠膿桿菌外膜PA5158蛋白抗體的抗原組合物的疫苗組合物。根據(jù)本發(fā)明，可以制備用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的疫苗組合物，包含本發(fā)明的抗原組合物和任選地一種或多種可藥用的載體、稀釋劑和/或佐劑在本發(fā)明的疫苗組合物中使用的載體基于施用模式和途徑和實(shí)際的標(biāo)準(zhǔn)藥物制劑進(jìn)行選擇，并且可以例如是載體蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)和鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH))、增溶劑(例如乙醇、聚山梨酸酯、CremophorELTM)、等滲劑、防腐劑、抗氧化劑、賦形劑(例如乳糖、淀粉、結(jié)晶纖維素、甘露醇、麥芽糖、磷酸氫鈣、輕質(zhì)無(wú)水硅酸和碳酸鉤)、粘合劑(例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素和阿拉伯膠)、潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石和氬化油)和穩(wěn)定劑(例如乳糖、甘露醇、麥芽糖、聚山梨酸酯、聚乙二醇、和聚氧乙烯氫化蓖麻油)。甘油、二甲基乙酰胺、70%乳酸鈉、表面活性劑或堿性物質(zhì)(例如氬氧化鈉、乙二胺、乙醇胺、碳酸氫鈉、精氨酸、葡曱胺或三氨基甲烷)等可以根據(jù)需要添加。特別地，本發(fā)明的肽可以與作為栽體蛋白的已知KLH溶液(Calbiotec，每亳升50。/。甘油溶液溶解125mg)偶聯(lián)，以增強(qiáng)本發(fā)明疫苗組合物的抗原性。在本發(fā)明疫苗組合物中使用的稀釋劑基于施用模式和途徑和實(shí)際的標(biāo)準(zhǔn)藥物制劑而選擇。稀釋劑的實(shí)例包括水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖生理鹽水和碳酸氫鹽溶液。在本發(fā)明疫苗組合物中使用的佐劑基于施用模式和途徑和實(shí)際的標(biāo)準(zhǔn)藥物制劑而選擇。佐劑的實(shí)例包括霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)、脂質(zhì)體和免疫刺激性復(fù)合體(ISCOM)。施用途徑可以根據(jù)具有綠膿桿菌感染風(fēng)險(xiǎn)的受者的年齡、體重、性別和總體健康而不同，但是施用可以通過(guò)經(jīng)口施用和腸胃外施用(例如靜脈內(nèi)注射、動(dòng)脈內(nèi)注射和局部施用)的任一途徑而實(shí)施。在它們當(dāng)中，優(yōu)選腸胃外施用。用于經(jīng)口施用和腸胃外施用的劑型及其制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。用于經(jīng)口施用和腸胃外施用的劑型可以通過(guò)常規(guī)方法，例如通過(guò)將本發(fā)明的抗原組合物與例如前述可藥用的載體混合而制備。用于經(jīng)口施用的劑型實(shí)例包括固體和液體劑型如溶液劑、片劑、顆粒劑、散劑或膠嚢劑。用于腸胃外施用的劑型實(shí)例包括溶液劑、混懸劑、軟膏劑、乳膏劑、栓劑、眼藥劑、滴鼻劑和滴耳劑。若需要本發(fā)明制劑的持續(xù)釋放，則可以添加生物可降解聚合物(例如聚-D，L-丙交酯共乙交酯、或聚乙交酯)作為增容基質(zhì)(見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,417,986、4,675,381和4,450,150)。在經(jīng)口施用的情況下，也可以添加香味劑和著色劑。合適的藥物載體和稀釋劑等以及為了使用它們所需的物質(zhì)在Remington'sPharmaceuticalSciences中描述。本發(fā)明疫苗組合物的劑量由本發(fā)明人基于疫苗抗原的類型、本發(fā)明的抗原是否與佐劑組合施用、與本發(fā)明抗原共同施用的佐劑的類型、施用模式和頻率以及希望的效果(例如預(yù)防或治療效果)而確定，并且通常可以是每個(gè)成人1照/劑量-100mg/劑量。當(dāng)本發(fā)明疫苗與佐劑一起施用時(shí)，劑量可以通常是每個(gè)成人lng/劑量-lmg/劑量。這種劑量可以根據(jù)根據(jù)本發(fā)明人的決定按照需要施用數(shù)次。例如，可以實(shí)施初始接種和間隔1周時(shí)間的后續(xù)3次加強(qiáng)接種。另外，加強(qiáng)注射和第二次加強(qiáng)注射可以使用相同制劑距離首次免疫第8至第12周以及第16至第20周分別實(shí)施。[抗體本發(fā)明的抗體可以識(shí)別綠膿桿菌外膜PA5158蛋白或其部分，并且與綠膿桿菌結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的抗體或其功能性片段，其中綠膿桿菌PA5158蛋白的部分是綠膿桿菌PA5158蛋白的細(xì)胞表面暴露部分。根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的抗體(本文中此后稱作"本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體")，其中綠膿桿菌PA5158蛋白的部分是本發(fā)明的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的抗體(本文中此后稱作"本發(fā)明第二實(shí)施方案的抗體")，其中綠膿桿菌PA5158蛋白的部分是本發(fā)明第一實(shí)施方案的肽。根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的抗體(本文中此后稱作"本發(fā)明第三實(shí)施方案的抗體")，其中綠膿桿菌PA5158蛋白的部分是本發(fā)明第二實(shí)施方案的肽。此種抗體包括識(shí)別本發(fā)明的蛋白質(zhì)并與綠膿桿菌結(jié)合的抗體。該抗體還包括識(shí)別本發(fā)明肽的抗體。的抗原組合物免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而獲得，其中所述的抗原組合物以可以誘導(dǎo)抗體的量施用。這種抗體可以通過(guò)從心臟或動(dòng)脈收集血液、從中分離抗血清并純化獲得的抗血清而作為純抗體使用。本發(fā)明的抗體包括使用PA5158蛋白或肽作為抗原并用所述抗原來(lái)免疫哺乳動(dòng)物例如小鼠而獲得的多克隆抗體或單克隆抗體(其包括由產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體)；由遺傳重組技術(shù)制備的嵌合抗體和人源化抗體；和使用產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等制備的人抗體。當(dāng)本發(fā)明的抗體作為藥物施用至人時(shí)，人抗體因減少的副作用而優(yōu)選地使用。"人抗體，，意指其中全部區(qū)域衍生自人的抗體。本發(fā)明的人抗體可以使用本領(lǐng)域才支術(shù)人員眾所周知的方法制備(見(jiàn)例如Intern.Rev.Immunol,1995，13，65-93;J.Mol.Biol,1991，222，581-597;日本特開(kāi)第146194/1998號(hào)公報(bào)；日本特開(kāi)第155492/1998號(hào)公報(bào)；日本專利號(hào)2938569;日本特開(kāi)第206387/1999號(hào)公報(bào)；日本特表第509612/1"6號(hào)公報(bào)；和日本特表第505107/1999號(hào)公報(bào))。"人源化抗體"是通過(guò)僅移植小鼠抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(CDR;互補(bǔ)決定區(qū))的基因序列至人抗體基因(CDR移植)而制備的抗體。本發(fā)明的人源化抗體可以^吏用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法(見(jiàn)例如EP239400和WO90/07861)制備。"嵌合抗體"是這樣的抗體，其通過(guò)連接某種抗體的可變區(qū)至不同種抗體的恒定區(qū)而制備。具體地，小鼠用抗原免疫，并且與該抗原結(jié)合的抗體可變區(qū)(V區(qū))從小鼠單克隆抗體的基因中被切下。隨后使如此獲得的V區(qū)連接至衍生自人骨髓的抗體恒定區(qū)(c區(qū))基因，以制備嵌合抗體。本發(fā)明的嵌合抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法(見(jiàn)例如日本特開(kāi)第280387/1996號(hào)^^才艮和美國(guó)專利號(hào)4816397，4816567和5807715)制備。本發(fā)明單克隆的抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法制備(見(jiàn)例如抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Antibodies:ALaboratoryManual)，編者Harlow和DavidLane,冷泉港實(shí)驗(yàn)室(ColdSpringHarborLaboratory)(1988);單克隆抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(ExperimentalManualforMonoclonalAntibody)，SakujiToyama等編輯，Kodansha(1987);和單克隆抗體雜交瘤和ELISA(MonoclonalAntibody:HybridomaandELISA)，TatsuoIwasaki等編輯，Kodansha(1987)).本發(fā)明的多克隆抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法制備。"功能性片段"才艮據(jù)本發(fā)明意指抗體的部分(部分片段)，其特異性地識(shí)別本發(fā)明的蛋白質(zhì)。這種功能性片段的具體實(shí)例包括Fab、Fab，、F(ab，)2、可變區(qū)片段(Fv)、二硫鍵連接的Fv和單鏈抗體(scFv)及它們的聚合物。本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體的優(yōu)選實(shí)例包括針對(duì)這樣的蛋白質(zhì)的抗體和其功能性片段，其中所述的蛋白質(zhì)包含序列編號(hào)4的氨基酸序列或包含了含有一個(gè)至數(shù)個(gè)保守性替換的序列編號(hào)4的氨基酸序列。本發(fā)明第二實(shí)施方案的抗體的優(yōu)選實(shí)例包括通過(guò)在FERMBP-BP-10672下l呆藏的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了于2005年10月7日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(T305-8566，日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)的保藏號(hào)為FERMBP-10672(自FERMP-20675移管)的雜交瘤(5158-L1-1)。本發(fā)明的抗體優(yōu)選是單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了這樣的單克隆抗體，其與本發(fā)明雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體所針對(duì)的同一抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，提供了可以與綠膿桿菌結(jié)合的抗體，其由動(dòng)物自身免疫系統(tǒng)應(yīng)答本發(fā)明的抗原組合物而產(chǎn)生。[抗體和藥物組合物的用途與綠膿桿菌相關(guān)的疾病綠膿桿菌是因降低宿主抵抗力而造成致命后果的機(jī)會(huì)感染病原體。另外，綠膿桿菌耐受抗生素并且因此是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌。如稍后在實(shí)施例中顯示，已經(jīng)證實(shí)本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體在巨噬細(xì)胞功能因施用粘蛋白而降低的綠膿桿菌易感性鼠模型上和在中性白細(xì)胞水平因施用一水合環(huán)磷酰胺而降低的綠膿桿菌易感性鼠模型上確實(shí)具有抗感染保護(hù)作用(實(shí)施例9和10)。還證實(shí)本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體在多藥耐藥性綠膿桿菌易感性鼠模型上確實(shí)具有抗感染保護(hù)作用(實(shí)施例ll和l"。因此，本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病。與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的實(shí)例包括由綠膿桿菌感染包括多藥耐藥性綠膿桿菌感染引起的全身感性疾病，例如敗血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎。與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的其它實(shí)例包括耳鼻喉學(xué)領(lǐng)域的中耳炎和鼻竇炎；肺臟學(xué)領(lǐng)域的肺炎、慢性呼吸道感染和氣管感染；外科領(lǐng)域的術(shù)后腹膜炎和膽管術(shù)后感染等；眼科領(lǐng)域的眼瞼膿腫、淚嚢炎、結(jié)膜炎、角膜潰瘍、角膜膿腫、全眼球炎和眼眶感染、和泌尿外科學(xué)領(lǐng)域的泌尿道感染(包括復(fù)雜的泌尿道感染)、導(dǎo)管感染和肛周膿腫。其它實(shí)例包括燒傷(包括重度燒傷和呼吸道燒傷)、褥瘡感染和嚢性纖維化。本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體是有用的，因?yàn)樗A(yù)期有效地預(yù)防或治療難以治療的多藥耐藥性綠膿桿菌感染。根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體的用途，用于產(chǎn)生針對(duì)與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的預(yù)防劑或治療劑。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的方法，包括施用預(yù)防性或治療性有效量的本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體至哺乳動(dòng)物(包括人)的步驟。用于綠膿桿菌感染的診斷劑如稍后在實(shí)施例中所示，已經(jīng)證實(shí)本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體分別與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、本發(fā)明第一實(shí)施方案的肽、本發(fā)明第二實(shí)施方案的肽結(jié)合，并且僅與綠膿桿菌反應(yīng)而不與其它細(xì)菌菌種反應(yīng)(實(shí)施例7和8)。也證實(shí)本發(fā)明第二實(shí)施方案的抗體與本發(fā)明第一實(shí)施方案的肽結(jié)合(實(shí)施例13)。還證實(shí)本發(fā)明第三實(shí)施方案的抗體與本發(fā)明第二實(shí)施方案的肽結(jié)合，并且僅與綠膿桿菌反應(yīng)而不與其它細(xì)菌菌種反應(yīng)(實(shí)施例7)。因此，本發(fā)明的抗體用于診斷綠膿桿菌感染。本發(fā)明的抗體不但可以作為純化產(chǎn)物使用，還可以雜交瘤培養(yǎng)上清液或腹水的形式使用，以區(qū)分綠膿桿菌感染與其它細(xì)菌菌種感染。根據(jù)本發(fā)明，提供了使用本發(fā)明抗體用于診斷綠膿桿菌感染的方法。本發(fā)明的診斷方法可以通過(guò)如此方式實(shí)施，即收集生物樣本，例如來(lái)自哺乳動(dòng)物(包括具有綠膿桿菌感染風(fēng)險(xiǎn)的人)的痰、肺洗出液、膿、淚、血液或尿，隨后將收集的樣品與本發(fā)明的抗體接觸，以及確定是否發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)。用于綠膿桿菌感染的診斷藥試劑盒根據(jù)本發(fā)明，提供了用于檢測(cè)綠膿桿菌存在的試劑盒，其至少包含本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體可以被標(biāo)記。該檢測(cè)試劑盒通過(guò)檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)而檢測(cè)綠膿桿菌的存在。因此，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以含有多種類型的用于實(shí)施抗原-抗體反應(yīng)的試劑、所用的第二抗體(例如在ELISA中)、生色試劑、緩沖液、說(shuō)明書(shū)和/或根據(jù)需要的儀器。用于增強(qiáng)氨14t苷類抗生素的抗綠膿桿菌活性的增效劑如稍后在實(shí)施例中所示，已經(jīng)證實(shí)本發(fā)明抗體的添加增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素慶大霉素的抗微生物活性(實(shí)施例14)。因此，本發(fā)明的抗體可以用作增強(qiáng)抗綠膿桿菌活性的增效劑。根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明抗體用于產(chǎn)生增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素的抗綠膿桿菌活性的增效劑的用途。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素的抗綠膿桿菌活性的方法，包括施用治療性有效量的本發(fā)明抗體至哺乳動(dòng)物(包括人)的步驟。藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物或藥劑可以組合物的形式使用，其中所述的組合物包含本發(fā)明的抗體作為活性成分，優(yōu)選地含有純化的抗體和任選地含有其它成分，例如生理鹽水、葡萄糖水溶液或磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)需要配制成液體或冷凍干燥的形式。此種藥物組合物可以任選地含有可藥用的載體，例如穩(wěn)定劑、防腐劑和等滲劑?？伤幱幂d體的實(shí)例可以包括用于冷凍干燥制劑的甘露醇、乳糖、蔗糖和人白蛋白；和用于液體制劑的生理鹽水、注射用水、磷酸鹽緩沖液和氫氧化鋁，但不限于這些實(shí)例。施用途徑可以根據(jù)受者的年齡、體重、性別和總體健康而不同，但是施用可以通過(guò)經(jīng)口施用和腸胃外施用(例如靜脈內(nèi)注射，動(dòng)脈內(nèi)注射和局部施用)途徑而實(shí)施。在它們當(dāng)中，優(yōu)選腸胃外施用。藥物組合物的劑量根據(jù)患者的年齡、體重、性別和總體健康、綠膿桿菌感染的嚴(yán)重性和待施用的抗體組合物的成分而不同。本發(fā)明抗體組合物的日劑量對(duì)于靜脈內(nèi)注射通常是0.1-1000mg/kg每個(gè)成人體重、優(yōu)選地1-100mg/kg每個(gè)成人體重。優(yōu)選本發(fā)明的藥物組合物應(yīng)當(dāng)事先施用至具有綠膿桿菌感染風(fēng)險(xiǎn)的患者。當(dāng)藥物組合物制備為診斷劑時(shí)，這種診斷劑可以通過(guò)采用適合此目的的任意手段以任意劑型獲得。例如測(cè)定腹水、含有目的抗體的培養(yǎng)液或經(jīng)純化抗體的抗體滴度并且以PBS(含有生理鹽水的磷酸緩沖液)等適度地稀釋，并且隨后對(duì)其添加防腐劑例如0.1%疊氮鈉。另夕卜，還測(cè)定吸附至乳膠等的本發(fā)明抗體的抗體滴度并且適度地稀釋，并對(duì)其添加防腐劑以便使用。這種與乳膠粒子結(jié)合的本發(fā)明抗體是作為診斷劑的優(yōu)選劑型之一。在這種情況下，適宜的樹(shù)脂材料例如聚苯乙烯、聚曱基苯乙烯或聚丁二烯是作為乳膠而適用的。實(shí)施例本文中此后，本發(fā)明將參考用于促進(jìn)理解本發(fā)明的實(shí)施例而描述。然而，本發(fā)明將不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1:基因芯片分析使用基因芯片表達(dá)分析系統(tǒng)(Affymetrix，基因芯片綠膿桿菌基因組陣歹'J)作為用于鑒定在補(bǔ)充了人血清的培養(yǎng)基中所表達(dá)基因的方法。使用綠膿桿菌PA01林(ATCCBAA-47)在3種不同培養(yǎng)條件即在補(bǔ)充0%、20%和50%人血清的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(NacalaiTesque)(在它們中LB培養(yǎng)基的最終組成相同)中在37。C實(shí)施振蕩培養(yǎng)直至吸光度在595nm處達(dá)到1.0。<吏用RNeasyProtectBacteriaMini試劑盒(QIAGENGmbH)，總RNA根據(jù)在該試劑盒所包括的文件中描述的方法提取并使用2100生物分析儀(AgilentTechnologies)定量(AgilentTechnologies)。隨后，實(shí)驗(yàn)根據(jù)隨基因芯片所包括文件中描述的方法進(jìn)行。使用MicroarraySuite5.0(Affymetrix)分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并且計(jì)算信號(hào)及檢測(cè)。在此時(shí)，實(shí)施校正，使來(lái)自全部揮:針組的信號(hào)的平均值是1000。實(shí)施了兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。作為結(jié)果，在全部培養(yǎng)條件下，無(wú)論添加的血清存在或不存在，將顯示檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物確定為作為持家蛋白的PA4761蛋白(DnaK或HSP70)是"存在"的，并且因此證實(shí)該基因表達(dá)。另外，確定作為與PA5158和PA2019(MexX)蛋白結(jié)合以構(gòu)成藥物流出泵的內(nèi)膜跨越蛋白并受到核糖體抑制劑例如四環(huán)素或氨基糖苷類抗生素誘導(dǎo)的PA2018蛋白(MexY)(J.Bacteriology,2005,187，5341-5346)在沒(méi)有前述那些藥物的這些條件下是，，不存在"的，并且因此證實(shí)該基因不表達(dá)。相反，在全部培養(yǎng)條件下，無(wú)論添加的血清存在或不存在，確定PA5158蛋白是"存在"的。因此，PA5158基因當(dāng)然表達(dá)了，并且提出這樣的可能，即PA5158基因產(chǎn)物PA5158蛋白穩(wěn)定地在細(xì)菌表面上存在。這提示綠膿桿菌PA5158蛋白可用作疫苗成分。實(shí)施例2:分析臨床分離抹中的PA5158基因所用的細(xì)菌菌林是88林綠膿桿菌菌株(貯藏于橫濱研究實(shí)驗(yàn)室，MeijiSeikaKaisha)，分離自日本各地臨床機(jī)構(gòu)的多種類型臨床材料并進(jìn)行測(cè)試。這些菌林源自血液、尿、膿、咽粘液等，并且基于根據(jù)日本綠膿桿菌協(xié)會(huì)(1975)所贊助的血清分型委員會(huì)決定，進(jìn)行血清學(xué)分類法，它們的血清型包括A、B、E、G、I等組。(1)基因組DNA的制備88林綠膿桿菌臨床分離抹的每一林在37。C在Mueller-Hinton培養(yǎng)基(BectonDickinson)中培養(yǎng)過(guò)夜并通過(guò)低速離心而收集。使用DNeasy組織試劑盒(QIAGENGmbH),根據(jù)隨該試劑盒所包括的文件中描述的方法，從獲得的細(xì)菌細(xì)胞中制備基因組DNA。(2)通過(guò)PCR方法擴(kuò)增DNA片段使用制備的基因組DNA作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增了含有PA5158基因的區(qū)域。具體而言，用于特異性擴(kuò)增每一基因的引物組(序列編號(hào)7和序列編號(hào)8)基于綠膿桿菌PAOl基因組的序列(NCBI登錄號(hào)NCJ)02516)設(shè)計(jì)。使用GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)，根據(jù)其中所包括的說(shuō)明書(shū)，使用TakaraExTaq(TakaraBio)實(shí)施PCR。如此由PCR擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)具有目的大小(1645bp)。(3)使用DNA測(cè)序儀分析多核苷^列PCR產(chǎn)物4吏用MultiScreenPCR板(MilliporeCorporation)純化并且隨后進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。能夠?qū)γ糠NPCR產(chǎn)物測(cè)序的引物(序列編號(hào)9至序列編號(hào)12)基于PAOl基因組序列(NCJ)02516)設(shè)計(jì)。在測(cè)序反應(yīng)中使用BigDyeTerminatorvl.l循環(huán)測(cè)序試劑盒(AppliedBiosystems)。使用GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)才艮據(jù)其中所包括的說(shuō)明書(shū)實(shí)施測(cè)序反應(yīng)。使用事先以水溶脹的SephadexG-50FineDNAGrade(AmershamBiosciencesAB)所填充的MultiScreen-HV板(MilliporeCorporation)純化測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物。隨后，使用AppliedBiosystems3730DNA分析儀(AppliedBiosystems)分析多核苷#列。將臨床分離林中通過(guò)所述分析而測(cè)定的多核苷酸序列轉(zhuǎn)換成多肽序列，并且這些多肽序列與來(lái)自PAOl菌抹的多肽序列進(jìn)行比較。作為結(jié)果，在PA5158蛋白的全長(zhǎng)序列中觀察到21處突變(表1)。不過(guò)，2個(gè)推定胞外區(qū)(序列編號(hào)5和序列編號(hào)6)證實(shí)不存在可檢測(cè)的氨基酸突變，其中所述的推定胞外區(qū)由本發(fā)明人基于有關(guān)與PA5158蛋白高度同源的綠膿桿菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem"2004,279，52816-52819)的立體結(jié)構(gòu)信息、有關(guān)大腸桿菌TolC蛋白(Nature，2000，405,914-919)的立體結(jié)構(gòu)信息和有關(guān)PA5158蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息而預(yù)測(cè)。這提示綠膿桿菌PA5158蛋白可用作"共同抗原"。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實(shí)施例3:PA5158基因DNA片段的克隆在作為綠膿桿菌PA5158基因(序列編號(hào)l)的氨基酸編碼區(qū)的1479個(gè)核苷酸中第337位至1479位核苷酸的DNA片段(序列編號(hào)2)通過(guò)以下方法摻入無(wú)細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)載體pIVEX2.4d(RocheDiagonstics)和大腸桿菌表達(dá)載體pET15b(Novagen)?；谛盘?hào)序列和有關(guān)與PA5158蛋白高度同源的綠膿桿菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)的立體結(jié)構(gòu)信息、有關(guān)大腸桿菌(E.coli)TolC蛋白(Nature，2000，405，914-919)的立體結(jié)構(gòu)信息和有關(guān)PA5158蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，估計(jì)在所述氨基酸編碼區(qū)中第1至336位核苷酸的核普酸序列編碼細(xì)胞表面非暴露區(qū)域，因此，該段核普酸序列從克隆中排除。待克隆的DNA片段從綠膿桿菌PAOl基因組DNA中通過(guò)PCR(GeneAmpPCRSystem9600;Perkin-Elmer)擴(kuò)增。寸吏用Pyrobest(TakaraBio)作為DNA聚合酶。反應(yīng)溶液補(bǔ)充以10%二甲基亞砜。含有用于添加限制性位點(diǎn)XhoI(CTCGAG)和BamHI(GGATCC)的核苷酸的引物(序列編號(hào)13和序列編號(hào)14)用作PCR引物。溫度條件包括在94。C加熱2分鐘，隨后是由94'C-30秒，54°C-1分鐘和72。C-2分鐘構(gòu)成的30次循環(huán)，和在72。C額外5分鐘的終末反應(yīng)。PCR產(chǎn)物使用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)加以純化，并且純化產(chǎn)物用XhoI(NewEnglandBiolabs)和BamHI(Toyobo)消化。pIVEX2.4d用Xhol和BamHI消化。這些DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳，并且使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取和純化。使用T4DNA連接酶(LigationHigh,Toyobo)連接以XhoI-BamHI消化的PCR產(chǎn)物和pIVEX2.4d，并且大腸桿菌DH5a菌林(高感受態(tài)DH5a，Toyobo)以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(Qiagen)純化其中已經(jīng)摻入PA5158基因片段的pIVEX2.4d質(zhì)粒(pIVEX-PA5158-10),并且證實(shí)插入物的核苷酸序列(BigDyeTerminatorvl.l循環(huán)測(cè)序試劑盒，AppliedBiosystems)。接下來(lái)，pET15b用Xhol和BamHI消化并且與pIVEX-PA5158-10的XhoI-BamHI插入片段連接。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得其中已經(jīng)摻入PA5158基因片段的pET15b質(zhì)粒(pET-PA5158-l)(圖1)。實(shí)施例4:PA5158重組蛋白的表達(dá)和純化在重組蛋白的表達(dá)中使用無(wú)細(xì)胞和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中使用了利用T7RNA聚合酶和大腸桿菌裂解物而實(shí)施轉(zhuǎn)錄和翻譯的RTS500ProteoMaster大腸桿菌HY試劑盒(RocheDiagonstic)。無(wú)細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)載體pIVEX-PA5158-10是編碼其中His標(biāo)簽(6個(gè)連續(xù)組氨酸)融合在T7啟動(dòng)子下游的PA5158蛋白的質(zhì)粒(見(jiàn)實(shí)施例3)。無(wú)細(xì)胞反應(yīng)溶液根據(jù)說(shuō)明書(shū)制備。反應(yīng)通過(guò)添加lOjigpIVEX-PA5158-10在30'C實(shí)施20小時(shí)，并且通過(guò)離心收集所產(chǎn)生的不溶性蛋白質(zhì)。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中使用其中已經(jīng)摻入T7RNA聚合酶基因的大腸桿菌BL21(DE3)菌林和具有T7啟動(dòng)子的pET載體表達(dá)系統(tǒng)(Novagen)。在該表達(dá)系統(tǒng)中，在BL21(DE3)菌抹染色體中摻入的T7RNA聚合酶基因的轉(zhuǎn)錄受lacl阻抑蛋白抑制，并且這種轉(zhuǎn)錄抑制通過(guò)添加誘導(dǎo)物異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)解除以誘導(dǎo)T7RNA聚合酶的表達(dá)。另外，摻入pET載體中T7啟動(dòng)子下游的基因的轉(zhuǎn)錄也受lacl阻抑蛋白抑制，并且這種轉(zhuǎn)錄抑制通過(guò)添加IPTG解除，以通過(guò)轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)摻入基因的表達(dá)，其中所述的轉(zhuǎn)錄由從宿主中提供的T7RNA聚合酶引起。大腸桿菌表達(dá)載體pFT-PA5158-l是編碼其中組氨酸標(biāo)簽已經(jīng)在T7啟動(dòng)子下游融合的PA5158蛋白的質(zhì)粒(見(jiàn)實(shí)施例3)。BL21(DE3)菌林用氯化鈣處理(見(jiàn)MolecularCloning,第二版，Sambrook等(1989))并以pET-PA5158-l轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體在含有50jig/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，并且將它們?cè)谛迈r培養(yǎng)基中懸浮(200倍稀釋)并在37。C培養(yǎng)4小時(shí)。隨后添加IPTG至終濃度0.5mM，并且培養(yǎng)繼續(xù)進(jìn)行額外的3小時(shí)。細(xì)胞通過(guò)離心收集并在-20。C冷凍。細(xì)胞在BugBuster蛋白質(zhì)提取試劑(Novagen)中溶解，并且包涵體根據(jù)包含的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行收集。在該方法中，還實(shí)施超聲破碎，并且使用終濃度200jig/mL的溶菌酶(卵清溶菌酶，SeikagakuCorporation)。在蛋白質(zhì)純化中使用了利用His-標(biāo)簽的Ni螯合層析。在無(wú)細(xì)胞或大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的不溶性蛋白質(zhì)用溶解緩沖液(補(bǔ)充有8M尿素、5mM咪唑、200mMNaCl和0.1。/。NP-40的Dulbecco磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS))溶解。溶解的蛋白質(zhì)結(jié)合至Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)并用40體積的溶解緩沖液洗滌。蛋白質(zhì)進(jìn)一步用40體積的洗滌緩沖液(除NP-40外，具有如溶解緩沖液那樣的相同組成)洗滌。隨后，His-標(biāo)簽-融合蛋白用洗脫緩沖液(補(bǔ)充有8M尿素、300mM咪唑和200mMNaCl的PBS)洗脫，隨后收集。作為結(jié)果，最終從無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的1ml反應(yīng)溶液和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的100ml培養(yǎng)物中分別獲得1.5mg蛋白質(zhì)和9.0mg蛋白質(zhì)。實(shí)施例5:用抗原免疫和制備血清綠膿桿菌PA103菌林(ATCC29260)在37。C在Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜。將幾個(gè)菌落在LB培養(yǎng)基中懸浮并且隨后在"。C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，并將它們用PBS洗滌，隨后重懸。隨后，通過(guò)添加1%福爾馬林進(jìn)行滅活處理24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，并且使用如此滅活的菌林。為在免疫中使用，將PA5158重組蛋白溶解在8M尿素溶液中，產(chǎn)生100ng/ml的濃度。PA5158蛋白胞外區(qū)的氨基i^列由本發(fā)明人基于有關(guān)與PA5158蛋白高度同源的綠膿桿菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem"2004，279，52816-52819)的立體結(jié)構(gòu)信息、有關(guān)大腸桿菌TolC蛋白(Nature，2000，405，914-919)的立體結(jié)構(gòu)信息和有關(guān)PA5158蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息而估計(jì)。含有所估計(jì)氨基酸序列(序列編號(hào)5和序列編號(hào)6)的肽通過(guò)使用Fmoc的固相合成法合成。將半胱氨酸殘基添加至序列編號(hào)5和序列編號(hào)6的每個(gè)氨基酸序列的氨基末端。合成了具有乙?；被┒撕王０坊然┒说碾?。通過(guò)質(zhì)譜在含有序列編號(hào)5的氨基酸序列的合成肽(序列編號(hào)15)中觀察到[M+llm/z1664.2(計(jì)算值m/z1663.9)，并且由HPLC分析對(duì)這種合成肽給出在l5.469分鐘保留時(shí)間處具有面積比88.25%的峰。另外，通過(guò)質(zhì)語(yǔ)在含有序列編號(hào)6的氨基酸序列的合成肽(序列編號(hào)16)中觀察到[M+1m/z1540.6(計(jì)算值m/z1538.7)，并且由HPLC分析對(duì)這種合成肽給出在12.524分鐘保留時(shí)間處具有面積比76.47%的峰。合成肽通過(guò)間隔物與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)，以制備綴合的肽?；腔?SMCC(磺基琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來(lái)酰亞胺基甲基環(huán)己烷-l-羧酸酯；Pierce)用作間隔物。委托ThermoELECTRON進(jìn)行肽的合成和KLH-綴合肽的制備。為在免疫中使用，將KLH-綴合的肽溶解在8M尿素溶液中，產(chǎn)生lOOjig/ml的濃度。在免疫方法中，雄性BN大鼠(從日本CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi))或雌性新西蘭白兔(從日本CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi))以總計(jì)6次注射進(jìn)行皮下或肌內(nèi)免疫，首次注射聯(lián)合使用弗氏完全佐劑并且后續(xù)注射聯(lián)合使用不完全佐劑，間隔時(shí)間2周。對(duì)于這樣的免疫，每只動(dòng)物分別使用20jig的福爾馬林滅活菌林、PA5158重組蛋白和實(shí)施例5中所述的KLH-綴合肽。最后一次免疫l周后，從腹主動(dòng)脈或頸動(dòng)脈收集全血，并且全血在室溫下擱置1小時(shí)并在1500G離心20分鐘，以獲得具有約5ml/大鼠血清或50ml/兔血清的上清液。實(shí)施例6:從抗血清中純化IgG級(jí)分才艮才居例長(zhǎng)口McCauleyR&Racker，F(xiàn);MolecularandCellularBiochemistry1，73-81(1973)的方法從大鼠抗血清和兔抗血清中純化IgG級(jí)分。添加冰冷的飽和硫酸銨溶液(pH8)以制備43(v/v)。/?；鞈乙?，并且獲得的混懸液在室溫?cái)嚢?5分鐘。沉淀物通過(guò)在10，000xg離心20分鐘而收集并且在補(bǔ)充有10%甘油的10mM磷酸鉀緩沖液(pH8)中溶解。隨后，沉淀物通過(guò)添加》K冷的飽和石克酸銨溶液(pH8)以制備50(v/v)V。溶液而再次沉積，從而完成2次洗滌。沉淀物在補(bǔ)充有10%甘油的10mM磷酸鉀緩沖液(pH8)中溶解，并且隨后對(duì)該緩沖液透析過(guò)夜。將透析液離心并且隨后進(jìn)行陰離子交換層析(DEAE-Toyopearl650M(Tosoh))。將流過(guò)的體積通過(guò)測(cè)定在280nm的紫外吸收而作為IgG級(jí)分收集。收集的級(jí)分使用AmicoiiUltra-15(MiUipore)予以濃縮，并且緩沖液最終與PBS(-)溶液交換，以獲得最終樣品。3.0-8.0mg和30-50mg蛋白質(zhì)作為IgG級(jí)分分別從3ml大鼠抗血清和15ml兔抗血清中通過(guò)純化獲得。蛋白質(zhì)根據(jù)基于Lowry法的DC蛋白質(zhì)測(cè)試法(Bio-Rad)定量，并且通過(guò)SDS-PAGE評(píng)估IgG純度。作為備選方法，在從兔抗血清純化IgG級(jí)分時(shí)使用蛋白G親和柱層析。該方法根據(jù)隨HiTrap蛋白GHP(Amersham)所包括的說(shuō)明書(shū)實(shí)施。將兔抗血清添加至用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7)平衡的HiTrap蛋白GHP柱，并且該柱用相同的緩沖液洗滌。使用0.1M甘氨酸-HCI緩沖液(pH2.7)實(shí)施洗脫，并且洗脫液立即用事先放置在分步收集管內(nèi)1/20體積的1.0Mtris-HCl緩沖液(pH9)中和。待收集的體積通過(guò)測(cè)定在280nm的紫外吸收而確定。收集的級(jí)分使用AmiconUltra-15(Millipore)予以濃縮，并且緩沖液最終與PBS(-)溶液交換，以獲得最終樣品。從10ml兔抗血清中通過(guò)純化獲得作為IgG級(jí)分的60mg蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)根據(jù)基于Lowry法的DC蛋白質(zhì)測(cè)試法(Bio-Rad)定量，并且通過(guò)SDS-PAGE評(píng)估IgG純度。實(shí)施例7:完整細(xì)胞ELISA(wholecellELISA)試驗(yàn)對(duì)于完整細(xì)胞ELISA,在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的PA103菌林的細(xì)菌混懸液分配至ELISA板(MaxiSorpType,NUNC),隨后在4°C固定。該板隨后用含有0.05%吐溫20的TBS洗滌并以含有2%牛血清白蛋白和0.05%吐溫20的TBS封閉。此后，血清或在實(shí)施例5中獲得的純化IgG級(jí)分以生理鹽水稀釋并且作為第一抗體樣品添加至板，并且使該樣品與所述菌林在37。C反應(yīng)1小時(shí)。洗滌后，4吏用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體(5000倍稀釋，Sigma)或過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(5000倍稀釋，Sigma)作為第二抗體，并且酶反應(yīng)通過(guò)添加顯色底物(TMB微孔過(guò)氧化物酶底物系統(tǒng)，KPL)而實(shí)施并且隨后用0.18M疏酸終止。測(cè)定在450nm處的吸光度。作為結(jié)果，就PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清而言，免疫前陰性對(duì)照大鼠血清(100倍稀釋)的吸光度是0.031，而PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清(IOO倍稀釋)的吸光度是0.399。這表明在PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清中含有識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞表面暴露的PA5158蛋白胞外區(qū)的抗體(IgG)。另外，就從PA5158重組蛋白免疫的兔血清中所獲得純化的IgG級(jí)分而言，從陰性對(duì)照兔假血清中純化的IgG級(jí)分(5照/ml)的吸光度是0.15，而從PA5158重組蛋白免疫的兔血清中純化的IgG級(jí)分(5jig/ml)的吸光度是0.9卯。這表明源自PA5158重組蛋白免疫的兔血清的IgG級(jí)分中含有識(shí)別細(xì)胞表面暴露的PA5158蛋白胞外區(qū)的抗體(IgG)。此外，就從PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清中所獲得純化的IgG級(jí)分而言，從作為陰性對(duì)照的假手術(shù)大鼠血清中純化的IgG級(jí)分(50pg/ml)的吸光度是0.132,而從PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清中純化的IgG級(jí)分(50ng/ml)的吸光度是0.370。另外，用KLH-綴合的序列編號(hào)16的肽免疫的大鼠血清中純化的IgG級(jí)分(50jig/ml)的吸光度是0.322。這表明源自PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清和KLH-綴合肽免疫的大鼠血清的IgG級(jí)分含有識(shí)別細(xì)胞表面暴露的PA5158蛋白胞外區(qū)的抗體(IgG)。在相同條件下，完整細(xì)胞ELISA使用如同綠膿桿菌那樣也是革蘭氏陰性細(xì)菌的大腸桿菌(ATCC25922)實(shí)施。作為結(jié)果，從作為陰性對(duì)照的假手術(shù)大鼠血清中純化的IgG級(jí)分(50ng/ml)的吸光度是0.118，而從PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清中純化的IgG級(jí)分(50jig/ml)的吸光度是O.O卯。另夕卜，用KLH-綴合的序列編號(hào)16的肽免疫的大鼠的血清中純化的IgG級(jí)分(50ng/ml)的吸光度是0.072。這表明源自PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清和KLH-綴合肽免疫的大鼠血清的IgG級(jí)分中不含有識(shí)別大腸桿菌細(xì)胞表面暴露的抗原的抗體(IgG)。因此，該結(jié)果表明這些IgG級(jí)分可以在綠膿桿菌的檢測(cè)中使用。實(shí)施例8:ELISA試驗(yàn)(l)檢測(cè)與PA5158重組蛋白結(jié)合的抗體為了通過(guò)ELISA方法檢測(cè)與PA5158重組蛋白結(jié)合的抗體，將PA5158重組蛋白溶解在補(bǔ)充有8M尿素的PBS中，并以0.5jig/孔的蛋白質(zhì)濃度放置在96孔鎳板(HIS-選擇高敏感性(HS)鎳包被板，Sigma)。該板置于室溫l小時(shí)，以引起所述蛋白質(zhì)與板結(jié)合。板隨后用洗滌緩沖液(補(bǔ)充有0.05%吐溫20、5mM咪唑和500mMNaCl的PBS)洗滌并以封閉緩沖液(補(bǔ)充有0.5%明膠的洗滌緩沖液)封閉。隨后，在實(shí)施例5中獲得的含抗體樣品添加至孔內(nèi)并且允許反應(yīng)30分鐘，并且隨后洗滌該板。將第二抗體(過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體，10000倍稀釋，Sigma)添加至板并且允許其反應(yīng)30分鐘，并且隨后洗滌板。酶反應(yīng)通過(guò)添加顯色底物(TMB微孔過(guò)氧化物酶底物系統(tǒng)，KPL)而實(shí)施，并且隨后用1M磷酸終止。測(cè)定在450nm處的吸光度。作為結(jié)果，免疫前陰性對(duì)照血清(10，000倍稀釋)的吸光度是0.058，而PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清(10，000倍稀釋)的吸光度是0.410。這表明在PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清中含有與作為免疫原的PA5158重組蛋白相結(jié)合的抗體。另外，從僅施用佐劑的大鼠所獲得的血清中純化的陰性對(duì)照大鼠假I(mǎi)gG(10jig/ml)的吸光度是0.190，而從PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清中純化作為IgG級(jí)分的大鼠抗PA5158IgG(10fig/ml)的吸光度是2.918。這表明在大鼠抗PA5158IgG中含有與作為免疫原的PA51S8重組蛋白相結(jié)合的抗體。(2)檢測(cè)與PA5158蛋白的推定胞外區(qū)肽結(jié)合的抗體為了通過(guò)ELISA方法檢測(cè)與PA5158蛋白的推定胞外區(qū)肽(序列編號(hào)5、序列編號(hào)6)結(jié)合的抗體，將實(shí)施例5中合成的每種肽溶解在碳酸鹽緩沖液(0.15%Na2C03和0.3%NaHCO;0中，并以lfig/孔或2jig/孔的肽濃度置于96孔板(MaxiSorp，Nunc)。該板在4。C放置過(guò)夜，以引起肽吸附在板上。板隨后用PBS洗滌并以補(bǔ)充0.5。/。牛血清白蛋白的PBS封閉。隨后，將實(shí)施例5中獲得的含抗體樣品在稀釋后添加至孔內(nèi)并且允許與所述肽反應(yīng)1小時(shí)，并且板隨后用含有0.05%吐溫20的PBS洗滌。將第二抗體添加至孔內(nèi)并且允許其反應(yīng)30分鐘，并且板隨后用含有0.05%吐溫20的PBS洗滌。顯色反應(yīng)和吸光度的測(cè)定以如上相同方式實(shí)施。作為結(jié)果，免疫前陰性對(duì)照血清(100倍稀釋)的吸光度在用ljigPA5158蛋白推定胞外區(qū)肽(序列編號(hào)5)包被的孔內(nèi)是0.053，而PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清(100倍稀釋)的吸光度在這種孔內(nèi)是0.445。這表明在PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清中含有與PA5158蛋白的細(xì)胞外肽(序列編號(hào)5)結(jié)合的抗體。另外，從僅施用佐劑的大鼠的血清中純化作為IgG級(jí)分的陰性對(duì)照大鼠假I(mǎi)gG(10ng/ml)的吸光度在用2jigPA5158蛋白推定胞外區(qū)肽(序列編號(hào)5)包被的孔內(nèi)是0.135,而從PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清中純化作為IgG級(jí)分的大鼠抗PA5158IgG(10jig/ml)的吸光度在這種孔內(nèi)是0.368。這表明在大鼠抗PA5158IgG中含有與PA5158蛋白的細(xì)胞外肽(序列編號(hào)5)結(jié)合的抗體。此外，在檢測(cè)與PA5158蛋白推定胞外區(qū)肽(序列編號(hào)6)結(jié)合的抗體時(shí)，使用其中6個(gè)氨基酸添加至氨基末端以改善蛋白質(zhì)溶解度的肽(序列編號(hào)17)來(lái)以2jig肽/孔包,皮孔。作為結(jié)杲，從僅施用佐劑的大鼠的血清中純化作為IgG級(jí)分的陰性對(duì)照大鼠假I(mǎi)gG(100jig/ml)的吸光度是0.160，而從PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清中純化作為IgG級(jí)分的大鼠抗PA5158IgG(100fig/ml)的吸光度是0.589。這表明在大鼠抗PA5158IgG中含有與PA5158蛋白的細(xì)胞外肽(序列編號(hào)6)結(jié)合的抗體。實(shí)施例9:PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清防御PA103菌株感染的能左將懸浮在lOOjil含有5%粘蛋白的生理鹽水中的活PA103菌抹以劑量1.0xl05cfu/小鼠(20個(gè)LDso)腹膜內(nèi)施用至4周齡CD-1小鼠(從曰本CharlesRiver實(shí)-驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi))，此后，PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清(全部血清樣品用生理鹽水稀釋2.5倍)立即以劑量10ml/kg從尾靜脈施用。7天后，基于存活而確定抗感染的保護(hù)性活性。作為結(jié)果，7只施用陰性對(duì)照大鼠假血清的小鼠中5只死亡，而在施用以福爾馬林滅活的PA103菌林免疫的兔血清的組中全部小鼠存活。因此證實(shí)以福爾馬林滅活的PA103菌株免疫的兔血清具有抗感染的保護(hù)性活性。在這種條件下，在施用以PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清的組中7只小鼠有6只存活。因此證實(shí)PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清具有抗感染的保護(hù)性活性。實(shí)施例10:PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清在中性白細(xì)胞減少癥小鼠中防御PA103菌株感染的能力制備12.5mg/ml(生理鹽水)的一7jc合環(huán)磷酰胺(本文中此后稱作CY，Sigma-Aldrich)并以劑量125mg/kg在第-5、-2和0天^M內(nèi)施用至4周齡CD-1小鼠，以降低外周血的中性白細(xì)胞水平。隨后，將活PA103菌林以劑量1.83x105cfu/小鼠(136個(gè)LDso)腹膜內(nèi)施用至所述小鼠。此后，PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清(全部血清樣品用生理鹽水稀釋2.5倍)立即以劑量10ml/kg從尾靜脈施用。7天后，基于存活而確定抗感染的保護(hù)性活性。作為結(jié)果，全部7只施用陰性對(duì)照大鼠假血清的小鼠死亡，而在施用以福爾馬林滅活的PA103菌抹免疫的大鼠血清的組中7只小鼠有4只存活。因此證實(shí)以福爾馬林滅活的PA103菌林免疫的大鼠血清具有抗感染的保護(hù)性活性。在這種條件下，在施用以PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清的組中7只小鼠有3只存活。因此證實(shí)PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清具有抗感染的保護(hù)性活性。實(shí)施例lhPA5158重組蛋白免疫的大鼠血清在中性白細(xì)胞減少癥小鼠中防御多藥耐藥性綠膿桿菌感染的能力多種類型抗菌劑對(duì)多藥耐藥性綠膿桿菌MSC06120菌林的最小抑制濃度是亞胺青霉烯(imipenem):32jig/ml，丁胺卡那霉素64ng/ml，和環(huán)丙沙星>256|ig/ml。制備12.5mg/ml(生理鹽水)的CY并以劑量125mg/kg在第-5、-2和0天腹膜內(nèi)施用至4周齡CD-1小鼠，以降低外周血的中性白細(xì)月包水平。隨后，將活MSC06120菌抹以劑量1.23x10scfu/小鼠(ll個(gè)LDso)腹膜內(nèi)施用至所述小鼠。此后，PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清(全部血清樣品用生理鹽7JC稀釋2.5倍)立即以劑量10ml/kg從尾靜脈施用。7天后，基于存活而確定抗感染的保護(hù)性活性。作為結(jié)果，7只施用陰性對(duì)照大鼠假血清的小鼠中有5只死亡，而在施用以福爾馬林滅活的PA103菌林免疫的大鼠血清的組中7只小鼠有6只存活。因此證實(shí)以福爾馬林滅活的PA103菌抹免疫的大鼠血清具有抗感染的保護(hù)性活性。在這種條件下，在施用以PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清的組中7只小鼠有6只存活。因此證實(shí)PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清具有抗感染的保護(hù)性活性。實(shí)施例12:大鼠抗PA5158抗體在中性白細(xì)胞減少癥小鼠中防御多藥耐藥性綠膿桿菌感染的能力將活MSC06120菌林以劑量1.18x105cfu/小鼠(10個(gè)0)5())腹膜內(nèi)施用至小鼠。從PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清中純化作為IgG級(jí)分的大鼠抗PA5158IgG立即以劑量1mg/小鼠從尾靜脈施用。7天后，基于存活而確定抗感染的保護(hù)性活性。作為結(jié)果，7只施用陰性對(duì)照大鼠假I(mǎi)gG(1mg/小鼠)的小鼠中有4只死亡，而施用從用福爾馬林滅活的PA103菌抹免疫的大鼠血清中純化的作為IgG級(jí)分的大鼠抗PA103IgG的組中全部7只小鼠存活。因此證實(shí)大鼠抗PA103IgG具有抗感染保護(hù)性活性。在這種條件下，在施用從PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清中純化的作為IgG級(jí)分的大鼠抗PA5158IgG的組中7只小鼠有6只存活。因此證實(shí)大鼠抗PAS158IgG具有抗感染的保護(hù)性活性。實(shí)施例13:單克隆抗體(MAb)的制備在用實(shí)施例5中制備的PA5158重組蛋白終末免疫1周后，將脾臟在麻醉下無(wú)菌取出。獲得的脾臟用RPMI-l640培養(yǎng)基(Gibco)洗滌，并且隨后把脾臟夾在載玻片之間并壓碎，以獲得作為細(xì)小片的脾細(xì)胞試驗(yàn)樣品。通過(guò)使用RPMI-1640培養(yǎng)基在1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘洗滌獲得的脾細(xì)月包。另一方面，骨髓瘤細(xì)胞(P3X63Ag8Ul細(xì)胞)在5。/。C02、相對(duì)濕度100%和37。C條件下在含有10%FCS(胎牛血清)的RPMI-1640培養(yǎng)基中事先培養(yǎng)，并且將如此培養(yǎng)的在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期間的骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)4吏用RPMI-1640培養(yǎng)基離心洗滌并且與前述脾細(xì)胞混合，使脾細(xì)胞數(shù)對(duì)骨髓瘤細(xì)胞數(shù)的比例變成約4:1?；旌系募?xì)胞在1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。棄去上清液并充分地使細(xì)胞疏松。對(duì)含有細(xì)胞的離心管，溫和地添加1mL由2g聚乙二醇(分子量1000，WakoPureChemicalIndustries)、2mLRPMI-1640培養(yǎng)基和0.2mLDMSO(NacalaiTesque)組成的溶液。細(xì)胞通過(guò)緩慢地旋轉(zhuǎn)離心管而混合。l分鐘后，緩慢地旋轉(zhuǎn)離心管，同時(shí)15mLRPMI-1640培養(yǎng)基經(jīng)3分鐘添加至該離心管。細(xì)胞在1000轉(zhuǎn)/分鐘離心7分鐘。隨后，棄去上清液并充分地使細(xì)胞疏松。此后，使用HAT培養(yǎng)基(Gibco)，將細(xì)胞濃度按脾細(xì)胞調(diào)節(jié)至1.6Xl(^個(gè)細(xì)胞/mL。得到的細(xì)胞以濃度0.2mL/孔分散至96孔微量板(SumitomoBakelite)。細(xì)胞在5%C02、相對(duì)濕度100%和37°C條件下培養(yǎng)。約l-2周后，在顯孩支鏡下觀察孔內(nèi)生長(zhǎng)的雜交瘤。(1)目的抗體的篩選與綠膿桿菌細(xì)胞表面結(jié)合的抗體通過(guò)實(shí)施例7中描述的完整細(xì)胞(wholecell)ELISA檢測(cè)。另外，與PA5158重組蛋白或PA5158蛋白推定胞外區(qū)(序列編號(hào)5或序列編號(hào)6)結(jié)合的抗體通過(guò)實(shí)施例8中描述的ELISA檢測(cè)。(2)克隆產(chǎn)生目的抗體的細(xì)胞^使用10%FCS/HT培養(yǎng)基將BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞的濃度調(diào)整至2x107個(gè)細(xì)胞/mL。得到的細(xì)胞以濃度0.1mL/孔分散至96孔微量板(SumitomoBakdite)。細(xì)胞在5%C02、相對(duì)濕度100%和37。C條件下培養(yǎng)過(guò)夜。在次日，對(duì)通過(guò)篩選確定的產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤使用10%FCSHT(Gibco)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至5個(gè)雜交瘤/0.1mL，并且以濃度0.1mL/孔分散至其中已經(jīng)在前一日分散有胸腺細(xì)胞的孔內(nèi)。l至2周后，可以在顯微鏡下觀察克隆的生長(zhǎng)?？寺⊥ㄟ^(guò)在"篩選"段落中所述的方法分析，以選擇到產(chǎn)生目的抗體的克隆。將具有由前述方法使用10。/。FCS/HT(Gibco)培養(yǎng)基調(diào)整至1個(gè)雜交瘤/0.1mL濃度的雜交瘤以O(shè).lmL/孔的濃度分散至其中已經(jīng)在前一日分散有胸腺細(xì)胞的孔內(nèi)。l至2周后，可以在顯微鏡下觀察克隆的生長(zhǎng)?？寺⊥ㄟ^(guò)在"篩選"段落中所述的方法分析，以選擇到產(chǎn)生目的抗體的單克隆。(3)細(xì)胞的體外培養(yǎng)和MAb的產(chǎn)生在96孔微量板中充分增殖的目的克隆在24-孔板、50-mL燒瓶和250-mL燒瓶逐階段放大并在100%FCS-RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對(duì)如此獲得細(xì)胞的培養(yǎng)上清中產(chǎn)生的MAb由實(shí)施例8中描述的ELISA檢測(cè)。實(shí)施這種ELISA以檢測(cè)對(duì)孔的結(jié)合作用，其中實(shí)施例5的合成肽(序列編號(hào)15)已經(jīng)吸附在所述孔上，所述的合成肽含有序列編號(hào)5的胞外區(qū)，所述的胞外區(qū)基于有關(guān)綠膿桿菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)的立體結(jié)構(gòu)信息、有關(guān)大腸桿菌TolC蛋白(Nature，2000，405，914-919)的立體結(jié)構(gòu)信息和有關(guān)PA5158蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息而估計(jì)。作為結(jié)果，在這種ELISA中，吸光度在作為陰性對(duì)照的10%FCS-RPMI培養(yǎng)基中是0.053，而吸光度在雜交瘤的培養(yǎng)上清液中是0.903，其中所述的雜交瘤以保藏號(hào)FERMBP-10672保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心。因此表明產(chǎn)生了與所迷肽結(jié)合的MAb。實(shí)施例14:增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素的抗綠膿桿菌活性已經(jīng)報(bào)道PA5158蛋白是一種構(gòu)成直接參與氨基糖苷類抗生素耐藥性的;充出泵的夕卜膜蛋白(AntimicrobialAgentsandChemotherapy,2003，47，1101-1111)。這種蛋白質(zhì)中的缺損突變林具有對(duì)氨基糖苷類抗生素增加的敏感性。因此，測(cè)試了由本發(fā)明人獲得的識(shí)別這種蛋白質(zhì)的多種類型抗體是否具有對(duì)氨基糖苷類抗生素流出泵的抑制作用。綠膿桿菌PA103菌株(ATCC29260)在37。C在Mudler-Hinton液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜并用相同培養(yǎng)基稀釋至lxl0Scfu/ml。隨后，將菌株在37。C振蕩培養(yǎng)。2小時(shí)后，以濃度0.125ng/ml添加慶大霉素。類似地，PBS以濃度300fig/ml添加至陰性對(duì)照組。以濃度300jig/ml分別添加由在保藏號(hào)FERM-BP-10672下保藏的雜交瘤產(chǎn)生的作為單克隆抗體的大鼠抗PA5158L1IgG、從KLH-綴合肽(序列編號(hào)6)免疫的大鼠血清中純化的作為IgG級(jí)分的大鼠抗PA5158L2IgG和從PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清中純化的作為IgG級(jí)分的大鼠抗PA5158IgG至抗體添加組。隨后，振蕩培養(yǎng)在37。C實(shí)施4小時(shí)，并且測(cè)定了每個(gè)組中的活菌株數(shù)目。作為結(jié)果，菌林在對(duì)照組中增殖至1.05xl()Scfu/ml，而菌抹在陰性對(duì)照組中增殖至5.4xl06cfu/ml。此外，菌抹在添加抗體的組中分別增殖至6.4x105cfu/ml、7.5x105cfu/ml和6.3x10scfu/ml，其中全部組比陰性對(duì)照組中的活菌林?jǐn)?shù)目更低。因此證實(shí)每一種抗體均具有增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素慶大霉素的抗微生物活性的作用。全部抗體具有能夠與構(gòu)成氨基糖苷類抗生素流出泵的PA5158蛋白或其序列的部分相結(jié)合的特性。因此估計(jì)本發(fā)明增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素的抗綠膿桿菌活性的作用因抑制流出泵而產(chǎn)生。權(quán)利要求1.抗原組合物，其包含能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗綠膿桿菌PA5158蛋白抗體的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原。2.蛋白質(zhì)，其選自(i)包含序列編號(hào)4的氨基^列的蛋白質(zhì)；(ii)蛋白質(zhì)，包含序列編號(hào)4中缺失、替換、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，并且與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；(iii)蛋白質(zhì)，由在嚴(yán)格條件下與編碼序列編號(hào)4的氨基^列的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，并且與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；和(iv)蛋白質(zhì)，包含與序列編號(hào)4的M酸序列具有70%或更大同一性的氨基酸序列，并且與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同。3.肽，其包含序列編號(hào)5的氨基酸序列或含有一個(gè)至數(shù)個(gè)保守性替換的序列編號(hào)5的氨基,列。4.肽，其包含序列編號(hào)6的氨基酸序列或含有一個(gè)至數(shù)個(gè)保守性替換的序列編號(hào)6的氨基*列。5.抗原組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的肽。6.用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的疫苗組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的抗原組合物，和任選地一種或多種可藥用的載體、稀釋劑和/或佐劑。7.針對(duì)綠膿桿菌PA5158蛋白或其部分的抗體或其功能性片段。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體或其功能性片段，其中綠膿桿菌PA5158蛋白的部分是綠膿桿菌PA5158蛋白的細(xì)胞表面暴露部分。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體或其功能性片段，其中綠膿桿菌PA5158蛋白的細(xì)胞表面暴露部分選自(i)包含序列編號(hào)4的氨基^列的蛋白質(zhì)；(ii)蛋白質(zhì)，包含序列編號(hào)4中缺失、替換、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，并且與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；(iii)蛋白質(zhì)，由在嚴(yán)格條件下與編碼序列編號(hào)4的氨基M列的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，并且與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；和(iv)蛋白質(zhì)，包含與序列編號(hào)4的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基酸序列，并且與由序列編號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體或其功能性片段，其中綠膿桿菌PA5158蛋白的細(xì)胞表面暴露部分是包含序列編號(hào)5的氨基酸序列的肽或包含序列編號(hào)5的含有一個(gè)至數(shù)個(gè)保守性替換的氨基酸序列的肽。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或其功能性片段，其通過(guò)在保藏號(hào)FERMBP-10672下保藏的雜交瘤產(chǎn)生。12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體或其功能性片段，其中綠膿桿菌PA5158蛋白的細(xì)胞表面暴露部分是包含序列編號(hào)6的氨基酸序列的肽或包含序列編號(hào)6的含有一個(gè)至數(shù)個(gè)保守性替換的氨基酸序列的肽。13.根據(jù)權(quán)利要求7至12任一項(xiàng)中所述的抗體或其功能性片段，其中抗體是單克隆抗體。14.在保藏號(hào)FERMBP-10672下保藏的雜交瘤。15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體或其功能性片段，其是與由權(quán)利要求14所述雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的相同抗原發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體。16.用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的藥物組合物，其包含才艮據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的抗體或其功能性片段，和任選地一種或多種可藥用的載體和/或稀釋劑。17.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物或根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其中與綠膿桿菌相關(guān)的疾病是由綠膿桿菌感染所引起的全身性感染疾病。18.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物或根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其中綠膿桿菌感染是多藥耐藥性綠膿桿菌感染。19.用于綠膿桿菌感染的診斷劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求7至13和15任一項(xiàng)中所述的抗體或其功能性片段。20.用于檢測(cè)綠膿桿菌的試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求7至13和15任一項(xiàng)中所述的抗體或其功能性片段。21.增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素的抗綠膿桿菌活性的增效劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求7至13和15任一項(xiàng)中所述的抗體或其功能性片段。全文摘要本發(fā)明的目的旨在提供用于診斷、預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原和抗所述抗原的抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了衍生自綠膿桿菌外膜蛋白PA5158的蛋白質(zhì)或肽和針對(duì)它們的抗體，用于診斷、預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病。文檔編號(hào)C07K16/12GK101351221SQ20068004961公開(kāi)日2009年1月21日申請(qǐng)日期2006年10月27日優(yōu)先權(quán)日2005年10月28日發(fā)明者大冢圭子,大澤福市,奧富隆文,熊谷正志,田中二朗,鈴木貴久,長(zhǎng)曾宏申請(qǐng)人:明治制果株式會(huì)社