專利名稱：用于治療丙型肝炎的化合物的制作方法
對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
本申請(qǐng)要求2007年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)USSN 60/894999的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是主要的人類病原體，其在世界范圍內(nèi)感染估計(jì)一億七千萬(wàn)人，大致是1型人類免疫缺陷病毒感染數(shù)量的5倍。這些HCV感染個(gè)體中相當(dāng)大的部分發(fā)展成嚴(yán)重的進(jìn)行性肝臟疾病，包括肝硬化和肝細(xì)胞癌(Lauer，G.M.；Walker，B.D.N.Engl.J.Med.2001，345，41-52)。
HCV是正鏈RNA病毒?；趯?duì)所推斷氨基酸序列進(jìn)行的比較和5’-非翻譯區(qū)的廣泛相似性，已經(jīng)把HCV歸類為黃病毒科中獨(dú)立的屬。黃病毒科的所有成員都具有包封的病毒體，其含有的正鏈RNA基因組通過(guò)翻譯單一的連續(xù)的可讀框而編碼所有已知的病毒專屬性蛋白質(zhì)。
在整個(gè)HCV基因組的核苷酸和所編碼的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)程度的異質(zhì)性。已經(jīng)表征了至少6種主要的基因型，并且已經(jīng)描述了多于50種的亞型。HCV的主要基因型在世界范圍內(nèi)的分布是不同的，并且HCV遺傳異質(zhì)性的臨床重要性仍然是難以確定的，盡管對(duì)基因型對(duì)發(fā)病和治療的可能影響行了大量的研究。
單鏈HCV RNA基因組的長(zhǎng)度大約是9500個(gè)核苷酸，并且具有單一的可讀框(ORF)，其編碼由大約3000個(gè)氨基酸組成的單一的大的多蛋白。在被感染的細(xì)胞中，這種多蛋白在多個(gè)位點(diǎn)被細(xì)胞蛋白酶和病毒蛋白酶裂解，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白。就HCV來(lái)說(shuō)，成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的產(chǎn)生受到兩種病毒蛋白酶的影響。認(rèn)為第一種病毒蛋白酶是金屬蛋白酶，并且在NS2-NS3接合處進(jìn)行裂解；第二種病毒蛋白酶是包含在NS3的N-末端區(qū)域內(nèi)的絲氨酸蛋白酶(也稱為NS3蛋白酶)，并且介導(dǎo)NS3下游的所有隨后裂解，既在NS3-NS4A裂解位點(diǎn)以順式進(jìn)行裂解，又在其余的NS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B位點(diǎn)以反式進(jìn)行裂解。NS4A蛋白似乎具有多種功能，其充當(dāng)NS3蛋白酶的輔因子，并且可能有助于NS3及其它病毒復(fù)制酶組分的膜定位。NS3蛋白與NS4A形成復(fù)合物，這似乎是在所有位點(diǎn)進(jìn)行加工活動(dòng)由此提高蛋白質(zhì)水解效率所必需的。NS3蛋白還顯示出三磷酸核苷酶和RNA解旋酶活性。NS5B(也稱為HCV聚合酶)是依賴于RNA的RNA聚合酶，在HCV的復(fù)制中涉及所述酶。在“Structural Analysis ofthe Hepatitis C Virus RNA Polymerasein Complex with Ribonucleotides(Bressanelli；S.et al.，Journal of Virology 2002，3482-3492)和Defrancesco and Rice，Clinics in Liver Disease 2003，7，211-242中描述了HCV NS5B蛋白。
目前，最有效的HCV療法使用α-干擾素和利巴韋林的組合，其在40％的患者中產(chǎn)生持續(xù)的效果(Poynard，T.et al.Lancet 1998，352，1426-1432)。最新的臨床結(jié)果證明，作為單一療法，PEG化的α-干擾素優(yōu)于未修飾的α-干擾素(Zeuzem，S.et al.N.Engl.J.Med.2000，343，1666-1672)。然而，即使就涉及PEG化α-干擾素和利巴韋林組合的實(shí)驗(yàn)性治療方案而言，相當(dāng)多的患者也沒(méi)有出現(xiàn)病毒載量的持續(xù)減少。因此，就開發(fā)用于治療HCV感染的有效療法而言，存在明顯和迫切的需要。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一個(gè)方面為式I化合物或其可藥用鹽
其中 R1為-CO2R5或-CONR6R7； R2為羥基、烷氧基、-CO2R12、-CON(R13)(R14)、-OCON(R13)(R14)或-N(R15)(R16)； 或者R2為氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、N-(烷基)哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、高哌啶基或高嗎啉基，并且R2被0-3個(gè)烷基取代基取代； 或者R2為
R3為氫、鹵素、烷基、烯基、羥基、芐基氧基或烷氧基； R4為環(huán)烷基； R5為氫或烷基； R6為氫、烷基、烷基SO2-、環(huán)烷基SO2-、鹵代烷基SO2-、(R9)(R10)NSO2-或(R11)SO2-； R7為氫或烷基； R8為氫、烷基、環(huán)烷基、(環(huán)烷基)烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、芐基、芐基氧基羰基或吡啶基； R9為氫或烷基； R10為氫或烷基； R11為氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、N-(烷基)哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、高哌啶基或高嗎啉基，并且R11被0-3個(gè)烷基取代基取代； R12為氫或烷基； R13為氫或烷基； R14為氫或烷基； 或者-N(R13)(R14)一起為氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、N-(烷基)哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、高哌啶基或高嗎啉基，并且-N(R13)(R14)被0-3個(gè)烷基取代基取代； R15為氫、烷基或烷基CO-；以及 R16為氫或烷基。
本發(fā)明另一個(gè)方面為式I化合物，其中R1為-CONR6R7；R6為烷基SO2-、環(huán)烷基SO2-、鹵代烷基SO2-、(R9)(R10)NSO2-或(R11)SO2-；以及R7為氫。
本發(fā)明另一個(gè)方面為式I化合物，其中R3為氫。
本發(fā)明另一個(gè)方面為式I化合物，其中R3為甲氧基。
本發(fā)明另一個(gè)方面為式I化合物，其中R4為環(huán)己基。
本發(fā)明另一個(gè)方面為式I化合物，其中R6為(R9)(R10)NSO2-或(R11)SO2-。
本發(fā)明另一個(gè)方面為式I化合物，其具有如下立體化學(xué)
本發(fā)明另一個(gè)方面為式I化合物，其具有如下立體化學(xué)
任何變量(包括R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15或R16)的任何范圍可獨(dú)立與任何其它變量的范圍一起使用。
除非另有說(shuō)明，這些術(shù)語(yǔ)具有下述意義?！巴榛钡囊馑际怯?至6個(gè)碳所組成的直鏈或支鏈烷基?！跋┗钡囊馑际怯?至6個(gè)碳所組成且具有至少一個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈烷基?！碍h(huán)烷基”的意思是由3至7個(gè)碳所組成的單環(huán)環(huán)系?！傲u基烷基”、“烷氧基”及具有經(jīng)取代烷基部份的其它術(shù)語(yǔ)包括由針對(duì)所述烷基部份的1至6個(gè)碳原子所組成的直鏈與支鏈異構(gòu)體?！胞u代烷基”與“鹵代烷氧基”包括所有鹵化異構(gòu)體，從單鹵素取代的烷基至全鹵素取代的烷基?！胺蓟卑ㄌ辑h(huán)芳族取代基與雜環(huán)芳族取代基。括號(hào)與多重括號(hào)術(shù)語(yǔ)意在向本領(lǐng)域技術(shù)人員闡明鍵合關(guān)系。例如，如((R)烷基)那樣的術(shù)語(yǔ)指進(jìn)一步被取代基R取代的烷基取代基。
本發(fā)明包括所述化合物的所有可藥用鹽形式?？伤幱名}為其中抗衡離子不會(huì)顯著地助長(zhǎng)化合物的生理活性或毒性且其本身作為藥理等價(jià)物的那些可藥用鹽。這些鹽可根據(jù)一般有機(jī)技術(shù)使用商購(gòu)試劑來(lái)制備。一些陰離子鹽形式包括醋酸鹽、醋硬脂酸鹽(acistrate)、苯磺酸鹽、溴化物、氯化物、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、碘化物、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽、甲磺酸鹽、硝酸鹽、雙羥萘酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽及昔萘酸鹽(xinofoate)。一些陽(yáng)離子鹽形式包括銨鹽、鋁鹽、芐星(benzathine)鹽、鉍鹽、鈣鹽、膽堿鹽、二乙胺鹽、二乙醇胺鹽、鋰鹽、鎂鹽、葡甲胺鹽、4-苯基環(huán)己胺鹽、哌嗪鹽、鉀鹽、鈉鹽、丁三醇胺(tromethamine)鹽及鋅鹽。
本發(fā)明的一些化合物具有不對(duì)稱碳原子(參見(jiàn)例如下文中的化合物)。本發(fā)明包括所有立體異構(gòu)形式，包括對(duì)映異構(gòu)體與非對(duì)映異構(gòu)體以及立體異構(gòu)體的混合物如外消旋體。一些立體異構(gòu)體可使用本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)制備。所述化合物的立體異構(gòu)混合物與相關(guān)中間體的立體異構(gòu)混合物可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)分離成單獨(dú)的異構(gòu)體。當(dāng)在以下方案和表格中描繪分子結(jié)構(gòu)時(shí)使用的楔形線(wedge)和虛線(hash)僅意在表示相對(duì)立體化學(xué)，而不應(yīng)該被解釋為暗示絕對(duì)立體化學(xué)指定。

合成方法 所述化合物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法(包括如下所述的那些方法)來(lái)制備。一些試劑和中間體在本領(lǐng)域中是已知的。其它試劑和中間體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法使用容易得到的原料來(lái)制備。用于描述化合物合成的變量(例如所編號(hào)的“R”取代基)僅意在說(shuō)明如何制備，而不應(yīng)該與權(quán)利要求書中或本說(shuō)明書其它段落中所使用的變量相混淆。方案中所使用的縮寫通常符合本領(lǐng)域中所使用的慣用意義。
可將2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸甲酯水解成2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸(參見(jiàn)方案1)。該化合物可在無(wú)水THF(四氫呋喃)中使用例如1，1’-羰基二咪唑(CDI)及1，8-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)而與各種磺酰脲(sulfonyl urea)縮合。所得到的?；蝓０?acyl sulfamide)可使用例如蘇楚基(Suzuki)偶聯(lián)反應(yīng)條件而與各種2-甲酰基苯基硼酸或2-甲?；交鹚狨ミM(jìn)行已知的偶聯(lián)反應(yīng)，從而得到所繪類型的環(huán)狀半縮醛胺中間體(cyclichemiaminal intermediate)?？赏ㄟ^(guò)如下方式將這些化合物轉(zhuǎn)化為吲哚并苯并氮雜

衍生物這些化合物在DMF(二甲基甲酰胺)中用2-(二甲氧基磷酰基)丙烯酸甲酯在碳酸銫的影響下通過(guò)連續(xù)的麥克爾(Michael)反應(yīng)和HornerEmmons反應(yīng)進(jìn)行處理。
相關(guān)的稠合有環(huán)丙基的酯衍生物可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)得到，包括吲哚并苯并氮雜

酯在DMSO中在強(qiáng)堿性條件下用碘化三甲基氧化锍(trimethyl sulfoxonium iodide)處理。所得到的稠合環(huán)丙烷中余下的脂肪族酯殘基可被水解，且產(chǎn)物酸可與各種烷基橋接的哌嗪(alkyl-bridged piperazine)縮合。例如，DMSO中的O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基鑠四氟硼酸鹽和二異丙基乙胺可得到烷基橋接的哌嗪甲酰胺。
方案1.
可用于合成本發(fā)明一些化合物的中間體涉及方案3中所示叔丁酯吲哚并苯并氮雜

的制備。
方案3.
此方法學(xué)涉及對(duì)所示吲哚甲酯進(jìn)行堿催化水解，接著使其與亞硫酰氯及叔丁醇鉀反應(yīng)，或用碳酸銀和叔丁基溴進(jìn)行烷基化反應(yīng)。所得到的化合物可使用與先前所概述相似的化學(xué)方法來(lái)轉(zhuǎn)化，從而得到如上所示的混合酯吲哚并苯并氮雜

如方案3a所示，可將酸中間體轉(zhuǎn)化成本發(fā)明化合物。
方案3a.
這些中間體可用于如下可選擇的方法，所述可選擇的方法可如方案4所示用于制備本發(fā)明的酰基硫酰胺化合物和本發(fā)明的?；酋０坊衔?。中間體叔丁酯吲哚并苯并氮雜

的環(huán)丙烷化及隨后叔丁酯基的斷裂可得到酸，其可與各種磺酰胺和磺酰脲偶聯(lián)。對(duì)酯進(jìn)行還原，這得到醇，所述醇可如方案4a所示提供本發(fā)明化合物，或隨后對(duì)所述醇進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這得到伯碳氯化物(primary chloride)，所述伯碳氯化物可如方案4b所示通過(guò)置換反應(yīng)而轉(zhuǎn)化為本發(fā)明化合物。
方案4.
步驟3制備?；蝓０泛王；酋０? 如方案4所示，將酸7(1當(dāng)量)和羰基二咪唑(1.5當(dāng)量)于無(wú)水THF中的混合物在50℃加熱30分鐘，然后使其冷卻至室溫。然后依次加入1當(dāng)量的硫酰胺(R1＝NR2)或磺酰胺(R1＝烷基或芳基)和DBU(2當(dāng)量)。將所得混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。用酸性水溶液處理后，經(jīng)分離的粗制產(chǎn)物通過(guò)制備性HPLC來(lái)純化，得到化合物8。
步驟4將8中的甲酯基團(tuán)還原成相應(yīng)的醇9 在氮?dú)鈿夥障聦⒍惗』鶜浠X溶液(濃度為20％wt的甲苯溶液，5-10當(dāng)量)加到攪拌的冷的(-78℃)化合物8于無(wú)水DCM中的溶液中。使反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝夭⒈３?小時(shí)。用1N NaOH將反應(yīng)淬滅，并用1N HCl酸化，然后用DCM萃取。經(jīng)分離的粗制產(chǎn)物通過(guò)快速柱色譜法來(lái)純化，得到純的所期望的醇9。
步驟5將醇9轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氯化物10 醇9(1當(dāng)量)于氯仿中的溶液用亞硫酰氯(5-10當(dāng)量)在室溫處理2-3小時(shí)。蒸發(fā)過(guò)量的亞硫酰氯和氯仿，得到所期望的氯化物10，并且其不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。
氨基甲酸酯類似物11如方案4a所示通過(guò)如下方式來(lái)制備用NaH使9中的醇基團(tuán)脫質(zhì)子，然后加入相應(yīng)的二烷基氨基甲酰氯。
方案4a.
氨基甲基類似物12如方案4b所示通過(guò)如下方式來(lái)制備在DMF中在三乙胺的存在下對(duì)化合物10與相應(yīng)的胺進(jìn)行加熱。
方案4b.
一些實(shí)施例以立體異構(gòu)混合物的形式存在。本發(fā)明涵蓋所述化合物的所有立體異構(gòu)體。分離立體異構(gòu)混合物的方法是本領(lǐng)域中所熟知的，且包括但不限于制備性手性超臨界流體色譜(SFC)和手性高效液相色譜(HPLC)。使用此手段的實(shí)例顯示在方案5中。
方案5.
實(shí)現(xiàn)所述分離的另一種方法涉及制備非對(duì)映異構(gòu)體的混合物，所述混合物可使用本領(lǐng)域中已知的各種方法來(lái)分離。此方式的一個(gè)實(shí)例顯示在下文中(方案6)。
方案6.
一些非對(duì)映異構(gòu)的酰胺可使用反相HPLC來(lái)分離。在水解作用后，所得到的光學(xué)活性酸可與橋接的哌嗪衍生物偶聯(lián)(方案6)。例如，DMSO中的O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基鑠四氟硼酸鹽和二異丙基乙胺可用于得到烷基橋接的哌嗪甲酰胺。也可使用其它標(biāo)準(zhǔn)的酸-胺偶聯(lián)方法，從而得到具有光學(xué)活性的甲酰胺。
方案6.
生物學(xué)方法 當(dāng)在以下HCV RdRp檢測(cè)中測(cè)定時(shí)，所述化合物展現(xiàn)了對(duì)抗HCV NS5B的活性。
對(duì)HCV NS5B RdRp進(jìn)行克隆、表達(dá)及純化 將對(duì)HCV基因型1b的NS5B蛋白進(jìn)行編碼的cDNA克隆至pET21a表達(dá)載體中。將所述蛋白質(zhì)表達(dá)成截掉C末端的18個(gè)氨基酸(the protein wasexpressed with an 18 amino acid C-terminal truncation)以提高溶解度。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞系BL21(DE3)用于所述蛋白質(zhì)的表達(dá)。使培養(yǎng)物在37℃生長(zhǎng)約4小時(shí)，直到培養(yǎng)物達(dá)到600納米處的光密度為2.0。使培養(yǎng)物冷卻至20℃，并用1mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。加入新鮮的氨芐青霉素至最終濃度為50微克/毫升，并使細(xì)胞在20℃生長(zhǎng)過(guò)夜。
使細(xì)胞沉淀(3升)溶解以供純化，得到15-24毫克經(jīng)純化的NS5B。溶胞緩沖液由20mM Tris-HCl(pH 7.4)、500mM NaCl、0.5％Triton X-100、1mM DTT、1mM EDTA、20％甘油、0.5毫克/毫升溶菌酶、10mM MgCl2、15微克/毫升脫氧核糖核酸酶I及完全TM蛋白酶抑制劑藥片(Roche)所組成。加入溶胞緩沖液后，使用組織勻漿器來(lái)使經(jīng)冷凍的細(xì)胞沉淀重新懸浮。為了降低樣品的粘度，使用與Branson超聲波處理器相連的微尖頭來(lái)使溶胞產(chǎn)物的等分液在冰上接受超聲波處理。經(jīng)超聲波處理的溶胞產(chǎn)物在4℃以100,000×g離心1小時(shí)，并過(guò)濾經(jīng)過(guò)0.2微米濾器單元(Corning)。
使用三個(gè)連續(xù)的色譜步驟來(lái)純化蛋白質(zhì)肝素瓊脂糖CL-6B、PolyU瓊脂糖4B及HiTrap SP瓊脂糖(Pharmacia)。色譜緩沖液與溶胞緩沖液相同，但不含有溶菌酶、脫氧核糖核酸酶I、MgCl2或蛋白酶抑制劑，且緩沖液的NaCl濃度根據(jù)將蛋白質(zhì)加載至色譜柱上的需要而調(diào)整。各色譜柱以NaCl梯度液洗脫，所述梯度液的長(zhǎng)度在5至50個(gè)柱體積之間變化，這取決于色譜柱的類型。在最終色譜步驟后，所得到的酶純度＞90％(基于SDS-PAGE分析)。將酶分成等分液，并貯存在-80℃。
標(biāo)準(zhǔn)HCV NS5B RdRp酶檢測(cè) 在96孔板(Costar 3912)中在最終體積為60微升的情況下進(jìn)行HCV RdRp基因型1b檢測(cè)。檢測(cè)緩沖液由20mM Hepes(pH 7.5)、2.5mM KCl、2.5mMMgCl2、1mM DTT、1.6單位RNAse抑制劑(Promega N2515)、0.1毫克/毫升BSA(Promega R3961)及2％甘油所組成。所有化合物在DMSO中連續(xù)稀釋(3倍)并在水中進(jìn)一步稀釋，以使DMSO在檢測(cè)中的最終濃度為2％。HCV RdRp基因型1b酶在最終濃度為28nM時(shí)使用。聚A(polyA)模板在6nM時(shí)使用，且生物素化的寡dT12引物在最終濃度為180nM時(shí)使用。模板是商購(gòu)得到的(Amersham 27-4110)。生物素化的引物由Sigma Genosys制備。3H-UTP在0.6μCi(0.29μM總UTP)時(shí)使用。通過(guò)加入酶來(lái)引發(fā)反應(yīng)，在30℃孵育60分鐘，并通過(guò)加入25微升含有SPA珠粒(4微克/微升，Amersham RPNQ 0007)的50mM EDTA來(lái)停止。在室溫孵育＞1小時(shí)后，將板在Packard Top Count NXT上讀取。
經(jīng)修改的HCV NS5B RdRp酶檢測(cè) 經(jīng)修改的酶檢測(cè)基本上按照關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)酶檢測(cè)所描述的那樣來(lái)進(jìn)行，不同的是，將生物素化的寡dT12引物預(yù)捕獲在鏈霉抗生物素(streptavidin)涂覆的SPA珠粒上，其方式是將引物與珠粒在檢測(cè)緩沖液中混合，并在室溫孵育一小時(shí)。離心除去未結(jié)合的引物。使與引物結(jié)合的珠粒重新懸浮在20mMHepes緩沖液(pH 7.5)中，并在引物的最終濃度為20nM以及珠粒的最終濃度為0.67微克/微升時(shí)用于檢測(cè)。檢測(cè)中的加入順序如下將酶(14nM)加到經(jīng)稀釋的化合物中，接著加入模板(0.2nM)、3H-UTP(0.6μCi，0.29μM)及與引物結(jié)合的珠粒的混合物，以引發(fā)反應(yīng)，所給濃度為最終濃度。使反應(yīng)在30℃進(jìn)行4小時(shí)。
化合物的IC50值使用七種不同的[I]([I]為抑制濃度)來(lái)確定。使用方程式y(tǒng)＝A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))通過(guò)抑制作用來(lái)計(jì)算IC50值。
FRET檢測(cè)制劑 為了進(jìn)行HCV FRET篩選檢測(cè)，使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。FRET肽(Anaspec，Inc.)(Taliani et al.，Anal.Biochem.1996，240，60-67)在其一端附近含有熒光供體即EDANS，并且在另一端附近含有受體即DABCYL。通過(guò)供體與受體之間的分子間共振能量轉(zhuǎn)移(RET)來(lái)使所述肽的熒光淬滅，但當(dāng)NS3蛋白酶使所述肽裂解時(shí)，產(chǎn)物不再發(fā)生RET淬滅，且供體的熒光變得顯而易見(jiàn)。檢測(cè)試劑如下制備將得自Promega(#E153A)的5×細(xì)胞熒光素酶細(xì)胞培養(yǎng)物溶胞試劑(cell Luciferase cell culture lysis reagent)用dH2O稀釋至1×，加入NaCl至最終為150mM，并且將FRET肽自2mM儲(chǔ)備液稀釋至最終為20μM。
為了制備板，帶有或不帶有海紫羅蘭屬熒光素酶(Renilla luciferase)報(bào)告子基因的HCV復(fù)制子細(xì)胞用胰蛋白酶處理，并置于96孔板的各孔中，其中將經(jīng)滴定的測(cè)試化合物加到第3列至第12列中；第1列和第2列含有對(duì)照化合物(HCV蛋白酶抑制劑)，且最底行含有不帶有化合物的細(xì)胞。然后，將板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中。
檢測(cè) 加入上述測(cè)試化合物(FRET檢測(cè)制劑)后，在不同時(shí)間將板取出，且向每個(gè)孔中加入Alamar藍(lán)色溶液(Trek Diagnostics，#00-100)，作為細(xì)胞毒性的測(cè)量方法。在Cytoflour 4000儀器(PE Biosystems)中讀取后，將板以PBS沖洗，然后通過(guò)向每個(gè)孔中加入30微升上述FRET肽檢測(cè)試劑(FRET檢測(cè)制劑)而用于FRET檢測(cè)。接著，將板置于Cytoflour 4000儀器中，其已被設(shè)定成激發(fā)波長(zhǎng)為340nm/發(fā)射波長(zhǎng)為490nm，以自動(dòng)模式歷時(shí)20次循環(huán)，且板在動(dòng)態(tài)模式中讀取。典型地，在讀取后使用終點(diǎn)分析的信號(hào)對(duì)噪聲為至少三倍?；蛘撸贏lamar藍(lán)色讀取后，將板以PBS沖洗，加入50微升不帶有酚紅的DMEM(高葡萄糖)，然后使用Promega Dual-Glo Luciferase Assay System而將板用于熒光素酶檢測(cè)。
通過(guò)對(duì)相對(duì)的HCV復(fù)制子抑制作用及相對(duì)的細(xì)胞毒性值進(jìn)行定量而對(duì)化合物進(jìn)行分析。為了計(jì)算細(xì)胞毒性值，將得自對(duì)照孔的平均Alamar藍(lán)色熒光信號(hào)設(shè)定為100％無(wú)毒性。接著，將各化合物測(cè)試孔中的各個(gè)信號(hào)除以平均對(duì)照信號(hào)并乘以100％，以確定細(xì)胞毒性百分比。為了計(jì)算HCV復(fù)制子抑制值，平均背景值得自在檢測(cè)結(jié)束時(shí)含有最高量HCV蛋白酶抑制劑的兩個(gè)孔。這些值類似于得自天然Huh-7細(xì)胞的那些值。
然后，將背景值從得自對(duì)照孔的平均信號(hào)中扣除，且將此值用作100％活性。接著，將各化合物測(cè)試孔中的各個(gè)信號(hào)除以背景扣除后的平均對(duì)照值并乘以100％，以確定活性百分比。將就蛋白酶抑制劑滴定而言的EC50值計(jì)算成可使FRET或熒光素酶活性降低50％的濃度。針對(duì)化合物板所得到的兩個(gè)值即細(xì)胞毒性百分比與活性百分比用于確定有待進(jìn)一步分析的重要化合物。
化合物的代表性數(shù)據(jù)報(bào)道在表1中。
表1.

A＞0.5至1.0μM；B為0.001μM-0.5μM；C＞0.12μM，但沒(méi)有確定確切值； 使用預(yù)孵育方案來(lái)確定IC50值；使用FRET檢測(cè)來(lái)確定EC50值。
藥物組合物和治療方法 所述化合物展現(xiàn)出對(duì)抗HCV NS5B的活性，且可用于治療HCV與HCV感染。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種組合物，其包含本發(fā)明的化合物或其可藥用鹽及可藥用載體。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種組合物，其還包含具有抗HCV活性的化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種組合物，其中具有抗HCV活性的化合物為干擾素。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述干擾素選自干擾素α2B、PEG化的(pegylated)干擾素α、同感干擾素(consensus interferon)、干擾素α2A及淋巴細(xì)胞樣干擾素τ。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種組合物，其中具有抗HCV活性的化合物為環(huán)孢菌素。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述環(huán)孢菌素為環(huán)孢菌素A。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種組合物，其中具有抗HCV活性的化合物選自白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素12、可提高1型輔助T細(xì)胞應(yīng)答發(fā)展的化合物、干擾RNA、反義RNA、Imiqimod、利巴韋林、5’-單磷酸肌苷脫氫酶抑制劑、金剛烷胺及金剛乙胺。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種組合物，其中具有抗HCV活性的化合物可有效抑制靶標(biāo)的功能以治療HCV感染，所述靶標(biāo)選自HCV金屬蛋白酶(HCVmetalloprotease)、HCV絲氨酸蛋白酶(HCV serine protease)、HCV聚合酶(HCVpolymerase)、HCV解螺旋酶(HCV helicase)、HCV NS4B蛋白(HCV NS4Bprotein)、HCV進(jìn)入(HCV entry)、HCV組裝(HCV assembly)、HCV釋出(HCVegress)、HCV NS5A蛋白(HCV NS5A protein)、IMPDH及核苷類似物(nucleoside analog)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種組合物，其包含本發(fā)明的化合物或其可藥用鹽、可藥用載體、干擾素及利巴韋林。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種抑制HCV復(fù)制子(HCV replicon)功能的方法，其包括使HCV復(fù)制子與本發(fā)明的化合物或其可藥用鹽接觸。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種抑制HCV NS5B蛋白功能的方法，其包括使HCV NS5B蛋白與本發(fā)明的化合物或其可藥用鹽接觸。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為治療患者中HCV感染的方法，其包括向所述患者給予治療有效量的本發(fā)明化合物或其可藥用鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可有效抑制HCV復(fù)制子的功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可有效抑制HCV NS5B蛋白的功能。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為治療患者中HCV感染的方法，其包括向所述患者給予治療有效量的本發(fā)明化合物或其可藥用鹽，并且給予(之前、之后或同時(shí))另一種具有抗HCV活性的化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為其中其它具有抗HCV活性的化合物為干擾素的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為其中所述干擾素選自干擾素α2B、PEG化的干擾素α、同感干擾素、干擾素α2A及淋巴細(xì)胞樣干擾素τ的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為其中其它具有抗HCV活性的化合物為環(huán)孢菌素的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為其中所述環(huán)孢菌素為環(huán)孢菌素A的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為其中其它具有抗HCV活性的化合物選自白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素12、可提高1型輔助T細(xì)胞應(yīng)答發(fā)展的化合物、干擾RNA、反義RNA、Imiqimod、利巴韋林、5’-單磷酸肌苷脫氫酶抑制劑、金剛烷胺及金剛乙胺的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為其中其它具有抗HCV活性的化合物可有效抑制靶標(biāo)功能以治療HCV感染的方法，所述靶標(biāo)選自HCV金屬蛋白酶、HCV絲氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV進(jìn)入、HCV組裝、HCV釋出、HCV NS5A蛋白、IMPDH及核苷類似物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面為其中其它具有抗HCV活性的化合物可有效抑制HCV生命循環(huán)中靶標(biāo)的功能而非抑制HCV NS5B蛋白的功能的方法。
“治療有效”的意思是提供有意義的患者益處所需要的藥物量，如肝炎與HCV感染領(lǐng)域中的執(zhí)業(yè)醫(yī)師所理解的那樣。
“患者”的意思是被HCV病毒感染且適于治療的人們，如肝炎與HCV感染領(lǐng)域中的執(zhí)業(yè)醫(yī)師所理解的那樣。
“治療”、“療法”、“給藥方案”、“HCV感染”及相關(guān)術(shù)語(yǔ)如肝炎與HCV感染領(lǐng)域中的執(zhí)業(yè)醫(yī)師所理解的那樣來(lái)使用。
本發(fā)明的化合物一般以藥物組合物的形式來(lái)給予，所述組合物包含治療有效量的本發(fā)明化合物或其可藥用鹽及可藥用載體，且可含有常規(guī)的賦形劑。治療有效量為提供有意義的患者益處所需要的量?？伤幱幂d體為具有可接受安全性的常規(guī)已知載體。組合物涵蓋所有常見(jiàn)的固體形式與液體形式，包括膠囊劑、片劑、錠劑與粉末劑以及液體混懸劑、糖漿劑、酏劑及溶液劑。組合物使用一般制劑技術(shù)來(lái)制備，且常規(guī)的賦形劑(諸如粘合劑與潤(rùn)濕劑)與介質(zhì)(諸如水與醇)通常用于組合物。
固體組合物通常被配制成劑量單位，且每份劑量提供約1至1000毫克活性成份的組合物是優(yōu)選的。劑量的一些實(shí)例為1毫克、10毫克、100毫克、250毫克、500毫克及1000毫克。一般而言，其它藥物可按與臨床上所使用的經(jīng)典單位范圍相似的單位范圍存在。典型地，其為0.25-1000毫克/單位。
液體組合物通常在劑量單位范圍內(nèi)。一般而言，液體組合物的單位劑量范圍可以是1-100毫克/毫升。劑量的一些實(shí)例為1毫克/毫升、10毫克/毫升、25毫克/毫升、50毫克/毫升及100毫克/毫升。一般而言，其它藥物可按與臨床上所使用的經(jīng)典單位范圍相似的單位范圍存在。典型地，其為1-100毫克/毫升。
本發(fā)明涵蓋所有常規(guī)的給藥模式，且口服方法與腸胃外方法是優(yōu)選的。一般而言，給藥方案可類似于臨床上所使用的其它藥物。典型地，每日劑量可以是每日1-100毫克/公斤體重。一般而言，口服方式需要較多的化合物，而腸胃外方式需要較少的化合物。然而，具體的給藥方案可由醫(yī)師通過(guò)合理的醫(yī)藥判斷來(lái)確定。
本發(fā)明也涵蓋在組合療法中給予所述化合物的方法。即所述化合物可與可用于治療肝炎及HCV感染的其它藥物一起使用，但所述化合物與所述其它藥物分開使用。在這些組合方法中，所述化合物通?？纱钆淦渌幬锒悦咳?-100毫克/公斤體重的每日劑量來(lái)給予。其它藥物一般可按治療上所使用的量來(lái)給予。然而，具體的給藥方案可由醫(yī)師通過(guò)合理的醫(yī)藥判斷來(lái)確定。
適于組合物及方法的化合物的一些實(shí)例列在表2中。
表2.
具體實(shí)施例方式 除非另有說(shuō)明，使用下述柱和條件來(lái)得到下述中間體和實(shí)施例的分析性LCMS數(shù)據(jù)。停止時(shí)間梯度時(shí)間+1分鐘；起始濃度0％B，除非另有說(shuō)明；洗脫劑A5％CH3CN/95％H2O(含有10mM NH4OAc(乙酸銨))(對(duì)于柱A、D和E)，10％MeOH(甲醇)/90％H2O(含有0.1％TFA(三氟乙酸))(對(duì)于柱B和C)；洗脫劑B95％CH3CN/5％H2O(含有10mM NH4OAc)(對(duì)于柱A、D和E)，90％MeOH/10％H2O(含有0.1％TFA)(對(duì)于柱B和C)；柱APhenomenex10μ4.6×50mm C18；柱BPhenomenex C18 10μ3.0×50mm；柱CPhenomenex4.6×50mm C18 10μ；柱DPhenomenex Lina C18 5μ3.0×50mm；柱EPhenomenex 5μ4.6×50mm C18。
中間體1
2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸甲酯 在2℃將新重結(jié)晶的三溴化吡啶鎓(pyridinium tribromide)(在熱AcOH(乙酸)(5mL/1g)中重結(jié)晶，用冷AcOH沖洗，并在高真空下用KOH干燥)逐份(歷時(shí)10分鐘)加到攪拌的3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸甲酯(60g，233mmol)(使用在WO2004/065367中描述的方法來(lái)制備)于CHCl3/THF(四氫呋喃)(1∶1，1.25L)中的溶液中。將反應(yīng)溶液在0-5℃攪拌2.5小時(shí)，并用飽和NaHSO3水溶液(1L)、1N HCl(1L)和鹽水(1L)洗滌。干燥(MgSO4)有機(jī)層并濃縮。將所得紅色油狀物用Et2O(乙醚)稀釋并濃縮。將所得粉色固體溶解在Et2O(200mL)中，用己烷(300mL)處理，并部分濃縮。過(guò)濾收集固體，并用己烷沖洗。將母液濃縮至干，并重復(fù)上述操作。合并固體，得到2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸甲酯(64g，190mmol，82％)，其為蓬松粉色固體，所述固體不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.47(br s，1H)，8.03(d，J＝1.4Hz，1H)，7.74(dd，J＝1.4，8.8Hz，1H)，7.69(d，J＝8.8Hz，1H)，3.92(s，3H)，2.82(tt，J＝3.7，11.7Hz，1H)，1.98-1.72(m，7H)，1.50-1.27(m，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ168.2，135.6，130.2，123.1，120.8，120.3，118.7，112.8，110.7，52.1，37.0，32.2(2)，27.0(2)，26.1。LCMSm/e 334(M-H)-，保留時(shí)間3.34分鐘，柱A，4分鐘梯度。
中間體2
2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸 將2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸甲酯(20g，60mmol)和LiOH(3.8g，160mmol)于MeOH/THF/H2O(1∶1∶1，300mL)中的溶液在90℃加熱2小時(shí)。將反應(yīng)混合物在冰/水浴中冷卻，用濃度為1M的HCl溶液(約160mL)中和，用水(250mL)稀釋，并在室溫?cái)嚢?小時(shí)。過(guò)濾收集沉淀物，用水沖洗，并干燥，得到2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸(定量)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。
可用來(lái)提供2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸的可選擇方法如下所述。
將2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸甲酯(117g，349mmol)和LiOH·H2O(26.4g，629mmol)于MeOH/THF/H2O(1∶1∶1，1.8L)中的溶液回流加熱3小時(shí)。將反應(yīng)混合物在冰/水浴中冷卻至約2℃，用1M HCl(約650mL)中和(加入速度使溫度不超過(guò)5℃)，用水(1L)稀釋，并攪拌，同時(shí)溫?zé)嶂镰h(huán)境溫度。過(guò)濾收集沉淀物，用水沖洗，并干燥，得到2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸的單THF溶劑化物(135.5g，345mmol，99％)，其為黃色固體，所述固體不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ11.01(br s，1H)，8.77(s，1H)，8.07(d，J＝1.5Hz，1H)，7.82(dd，J＝1.5，8.8Hz，1H)，7.72(d，J＝8.8Hz，1H)，3.84-3.74(m，4H)，2.89(m，1H)，1.98-1.72(m，11H)，1.50-1.24(m，3H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)δ172.7，135.5，130.7，122.3，120.9(2)，118.8，113.3，111.1，67.9(2)，37.0，32.2(2)，27.0(2)，26.1，25.5(2)。LCMSm/e 320(M-H)-，保留時(shí)間2.21分鐘，柱A，4分鐘梯度。
中間體3
2-溴-3-環(huán)己基-N-[(二甲基氨基)磺酰基]-1H-吲哚-6-甲酰胺 在22℃將1，1’-羰基二咪唑(1.17g，7.2mmol)加到攪拌的2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸(2.03g，6.3mmol)于THF(6mL)中的溶液中。立即有CO2放出，當(dāng)放出減慢時(shí)，將溶液在50℃加熱1小時(shí)，然后冷卻到22℃。加入N，N-二甲基硫酰胺(0.94g，7.56mmol)，然后滴加DBU(1.34g，8.8mmol)于THF(4mL)中的溶液。繼續(xù)攪拌24小時(shí)。將混合物在乙酸乙酯和稀HCl之間分配。乙酸乙酯層先后用水和鹽水洗滌，并用Na2SO4干燥。將萃取物濃縮至干，留下標(biāo)題化合物，其為淺黃色易碎泡沫狀物(2.0g，74％，通過(guò)NMR估計(jì)純度＞90％)。1H NMR(300MHz，DMSO-D6)δppm 1.28-1.49(m，3H)1.59-2.04(m，7H)2.74-2.82(m，1H)2.88(s，6H)7.57(dd，J＝8.42，1.46Hz，1H)7.74(d，J＝8.78Hz，1H)7.91(s，1H)11.71(s，1H)12.08(s，1H)。
制備2-溴-3-環(huán)己基-N-[(二甲基氨基)磺酰基]-1H-吲哚-6-甲酰胺的可選擇方法描述如下。
在氮?dú)鈿夥障孪蚺鋫溆袡C(jī)械攪拌器、溫度控制器、氮?dú)膺M(jìn)口和冷凝器的1L四頸圓底燒瓶中加入2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸(102.0g，0.259摩爾)和無(wú)水THF(300mL)。攪拌10分鐘后，逐份加入CDI(50.3g，0.31摩爾)。然后將反應(yīng)混合物加熱至50℃并保持2小時(shí)。冷卻到30℃后，一次性加入N，N-二甲基氨基磺酰胺(41.7g，0.336摩爾)，然后歷時(shí)1小時(shí)滴加DBU(54.1mL，0.362摩爾)。然后將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?0小時(shí)。真空除去溶劑，并將殘余物在EtOAc(乙酸乙酯)和1N HCl(1∶1，2L)之間分配。分離有機(jī)層，并且水層用EtOAc(500mL)萃取。合并的有機(jī)層用鹽水(1.5L)洗滌并用MgSO4干燥。過(guò)濾溶液，并真空濃縮，得到粗產(chǎn)物(111.0g)。在60℃將粗產(chǎn)物懸浮在EtOAc(400mL)中。向懸浮液中緩慢加入庚烷(2L)。攪拌所得懸浮液并冷卻到0℃。然后對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾。濾餅用少量庚烷沖洗，并真空風(fēng)干(house vacuum air dry)2天。收集產(chǎn)物，其為白色固體(92.0g，83％)。1HNMR(MeOD，300MHz)δ7.89(s，H)，7.77(d，J＝8.4Hz，1H)，7.55(dd，J＝8.4和1.8Hz，1H)，3.01(s，6H)，2.73-2.95(m，1H)，1.81-2.05(m，8H)，1.39-1.50(m，2H)。m/z 429(M+H)+。
中間體4
3-環(huán)己基-N-[(二甲基氨基)磺酰基]-2-(2-甲?；?4-甲氧基苯基)-1H-吲哚-6-甲酰胺 將2-溴-3-環(huán)己基-N-[(二甲基氨基)磺?；鵠-1H-吲哚-6-甲酰胺(4.28g，0.01摩爾)、4-甲氧基-2-甲?；交鹚?2.7g，0.015摩爾)、2-二環(huán)己基膦基-2’，6’-二甲氧基-聯(lián)苯(41mg，0.0001摩爾)、乙酸鈀(11.2mg)和經(jīng)微細(xì)研磨的碳酸鉀(4.24g，0.02摩爾)于甲苯(30mL)中的混合物在氮?dú)鈿夥障禄亓鲾嚢?0分鐘，此時(shí)LC/MS分析顯示反應(yīng)完成。然后反應(yīng)混合物用乙酸乙酯和水稀釋，然后用過(guò)量稀HCl酸化。然后收集乙酸乙酯層，并用稀HCl、水和鹽水洗滌。然后干燥(硫酸鎂)有機(jī)溶液，過(guò)濾并濃縮，得到膠狀物。膠狀物用己烷(250ml)和乙酸乙酯(25mL)稀釋，并將混合物在22℃攪拌20小時(shí)，在此期間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成亮黃色顆粒狀固體(4.8g)，所述固體不經(jīng)進(jìn)一步純化即直接使用。
制備3-環(huán)己基-N-[(二甲基氨基)磺?；鵠-2-(2-甲?；?4-甲氧基苯基)-1H-吲哚-6-甲酰胺的可選擇方法如下提供。
向漿化的2-溴-3-環(huán)己基-N-[(二甲基氨基)磺酰基]-吲哚-6-甲酰胺(54.0g，126mmol)、4-甲氧基-2-甲?；交鹚?29.5g，164mmol)和LiCl(13.3g，315mmol)于EtOH(乙醇)/甲苯(1∶1，1L)中的溶液中加入Na2CO3(40.1g，379mmol)的水(380mL)溶液。將反應(yīng)混合物攪拌10分鐘，然后加入Pd(PPh3)4(四(三苯基膦)鈀)(11.3g，10.0mmol)。反應(yīng)溶液用氮?dú)鉀_洗，并在70℃(內(nèi)部監(jiān)測(cè))加熱過(guò)夜，然后冷卻至室溫。反應(yīng)混合物用EtOAc(1L)和EtOH(100mL)稀釋，用1N HCl水溶液(1L)和鹽水(500mL)小心洗滌，干燥(MgSO4)，過(guò)濾并濃縮。將殘余固體與Et2O(乙醚)(600mL)一起攪拌1小時(shí)，并過(guò)濾收集，得到3-環(huán)己基-N-[(二甲基氨基)磺酰基]-2-(2-甲?；?4-甲氧基苯基)-1H-吲哚-6-甲酰胺(52.8g，109mmol，87％)，其為黃色粉末，所述粉末不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ11.66(s，1H)，8.17(s，1H)，7.75(d，J＝8.4Hz，1H)，7.74(d，J＝8.4Hz，1H)，7.59(dd，J＝1.4，8.4Hz，1H)，7.23-7.16(m，2H)，7.08(dd，J＝2.6，8.4Hz，1H)，6.54(d，J＝8.8Hz，1H)，3.86(s，3H)，3.22-3.08(m，1H)，2.91(s，6H)，2.00-1.74(m，7H)，1.60-1.38(m，3H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)δ165.7，158.8，147.2，139.1，134.3，132.0，123.4，122.0，119.2，118.2，114.8，112.3，110.4，109.8，79.6，45.9，37.2(2)，34.7，32.0(2)，25.9(2)，24.9。LCMSm/e 482(M-H)-，保留時(shí)間2.56分鐘，柱A，4分鐘梯度。
中間體5
11-環(huán)己基-N-[(二甲基氨基)磺?；鵠-6-乙氧基-8-甲氧基-6H-異吲哚并[2，1-a]吲哚-3-甲酰胺 向配備有溫度控制器、冷凝器、氮?dú)膺M(jìn)口和機(jī)械攪拌器的5L四頸圓底燒瓶中加入甲苯(900mL)、EtOH(900mL)、2-溴-3-環(huán)己基-N-(N，N-二甲基氨磺?；?-1H-吲哚-6-甲酰胺(90g，0.21摩爾)、2-甲?；?4-甲氧基苯基硼酸(49.2g，0.273摩爾)和LiCl(22.1g，0.525摩爾)。所得溶液用氮?dú)夤呐?5分鐘。加入Na2CO3(66.8g，0.63摩爾)的水(675mL)溶液，并且反應(yīng)混合物用氮?dú)庠俟呐?0分鐘。加入Pd(PPh3)4(7.0g，6.3mmol)，并將反應(yīng)混合物加熱至70℃并保持20小時(shí)。冷卻至35℃后，緩慢加入1N HCl溶液(1.5L)。將所得混合物轉(zhuǎn)移到6L分液漏斗中，并用EtOAc(2×1.5L)萃取。合并的有機(jī)萃取物用鹽水(2L)洗滌，用MgSO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮，得到黃色固體，所述黃色固體用20％EtOAc/己烷(450mL，50℃至0℃)研磨，得到3-環(huán)己基-N-(N，N-二甲基氨磺?；?-2-(2-甲?；?4-甲氧基苯基)-1H-吲哚-6-甲酰胺(65.9g)，其為黃色固體。HPLC純度為98％。
將來(lái)自研磨的母液真空濃縮。將殘余物與EtOH(50mL)一起回流3小時(shí)。然后將溶液冷卻至0℃。過(guò)濾沉淀物，并用經(jīng)冷卻的TBME(叔丁基甲基醚)(5℃)(20mL)洗滌。將濾餅真空風(fēng)干，得到額外量的標(biāo)題化合物，其為白色固體(16.0g)。HPLC純度為99％。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.75(s，1H)，7.96(s，1H)，7.73(d，J＝8.4Hz，1H)，7.67(d，J＝8.4Hz，1H)，7.45(dd，J＝8.4和1.4Hz，1H)，7.09(d，J＝2.2Hz，1H)，6.98(dd，J＝8.4和2.2Hz，1H)，6.50(s，1H)，3.86(s，3H)，3.05(s，6H)，2.92-3.13(m，3H)，1.85-1.93(m，7H)，1.40-1.42(m，3H)，1.05(t，J＝7.1Hz，3H)。m/z 512(M+H)+。
中間體4
3-環(huán)己基-N-[(二甲基氨基)磺?；鵠-2-(2-甲?；?4-甲氧基苯基)-1H-吲哚-6-甲酰胺 將11-環(huán)己基-N-(N，N-二甲基氨磺酰基)-6-乙氧基-8-甲氧基-6H-異吲哚并[2，1-a]吲哚-3-甲酰胺溶解在THF(75mL)中。向溶液中加入2N HCl溶液(300mL)。在室溫將混合物在氮?dú)鈿夥障聞×覕嚢?6小時(shí)。過(guò)濾所得懸浮液，并用經(jīng)冷卻的TBME(2×30mL)洗滌。將濾餅真空風(fēng)干(vacuum air dry)過(guò)夜，得到標(biāo)題化合物，其為黃色固體。HPLC純度為99％。1HNMR(DMSO-d6，300MHz)δ11.65(s，1H)，8.16(s，1H)，7.76(d，J＝5.9Hz，1H)，7.73(d，J＝5.9Hz，1H)，7.58(dd，J＝8.5和1.5Hz，1H)，7.17-7.20(m，2H)，7.08(dd，J＝8.5和1.4Hz，1H)，6.55(d，J＝8.6Hz，1H)，3.86(s，3H)，3.14-3.18(m，1H)，2.91(s，6H)，1.75-1.99(m，7H)，1.48-1.60(m，3H)。m/z 484(M+H)+。
中間體6
13-環(huán)己基-10-[[[(二甲基氨基)磺?；鵠氨基]羰基]-3-甲氧基-7H-吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-6-甲酸甲酯 將3-環(huán)己基-N-(N，N-二甲基氨磺?；?-2-(2-甲?；?4-甲氧基苯基)-1H-吲哚-6-甲酰胺(4.8g，0.01摩爾)、2-(二甲氧基磷?；?丙烯酸甲酯(9.7g，0.02摩爾)和碳酸銫(7.1g，0.02摩爾)于DMF(28mL)中的混合物在油浴溫度55℃攪拌20小時(shí)。將混合物倒入冰-水中并用稀HCl酸化，從而使粗產(chǎn)物沉淀。收集固體，干燥并進(jìn)行硅膠(110g)快速色譜(使用含有2％乙酸的乙酸乙酯和二氯甲烷(1∶10)溶液)。合并同質(zhì)的級(jí)分(homogeneous fraction)并蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物，其為淺黃色固體(3.9g，71％收率)。MS552(M＝H+)。
制備13-環(huán)己基-10-[[[(二甲基氨基)磺?；鵠氨基]羰基]-3-甲氧基-7H-吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-6-甲酸甲酯的可選擇方法如下提供。
將11-環(huán)己基-N-[(二甲基氨基)磺?；鵠-6-羥基-8-甲氧基-6H-異吲哚并[2，1-a]吲哚-3-甲酰胺(環(huán)狀半縮醛胺)(63.0g，130mmol)、2-(二甲氧基磷?；?丙烯酸甲酯(60g，261mmol)、碳酸銫(106g，326mmol)于DMF(400mL)中的溶液在60℃(浴溫)加熱4.5小時(shí)。加入額外的2-(二甲氧基磷?；?丙烯酸甲酯(15g，65mmol)和碳酸銫(21.2g，65mmol)，將反應(yīng)混合物在60℃加熱過(guò)夜，然后冷卻至室溫。攪拌的反應(yīng)混合物用H2O(1L)稀釋，用1N HCl水溶液(800mL)緩慢中和，攪拌3小時(shí)，然后過(guò)濾收集沉淀物。固體用Et2O(800mL)研磨，并干燥，得到13-環(huán)己基-10-[[[(二甲基氨基)磺酰基]氨基]羰基]-3-甲氧基-7H-吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-6-甲酸甲酯(70.2g，127mmol，98％)，其為黃色固體，所述固體不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.67(s，1H)，8.09(s，1H)，7.86(d，J＝8.4Hz，1H)，7.80(s，1H)，7.50(d，J＝8.4Hz，1H)，7.42(d，J＝8.8Hz，1H)，7.08(dd，J＝2.6，8.8Hz，1H)，6.98(d，J＝2.6Hz，1H)，5.75-5.51(m，1H)，4.29-4.01(m，1H)，3.89(s，3H)，3.82(s，3H)，3.05(s，6H)，2.87-2.73(m，1H)，2.11-1.12(m，10H)。LCMSm/e 550(M-H)-，保留時(shí)間3.21分鐘，柱A，4分鐘梯度. 中間體7
(+/-)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺酰基]氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸甲酯. 在圓底燒瓶中將DMSO(5毫升)加到碘化三甲基氧化锍(199毫克，0.906毫摩爾)與NaH(38毫克，濃度為60％的油分散液，0.953毫摩爾)的混合物中。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)。然后加入13-環(huán)己基-10-[[[(二甲基氨基)磺?；鵠氨基]羰基]-3-(甲氧基)-7H-吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-6-甲酸甲酯(125毫克，0.227毫摩爾)，并將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)，接著在50℃再攪拌3小時(shí)。然后以水使反應(yīng)淬滅，并以1N HCl溶液酸化。然后，粗產(chǎn)物以淡黃色固體的形式沉淀，其通過(guò)過(guò)濾來(lái)收集，及風(fēng)干(106毫克，83％產(chǎn)率)。接著，6毫克此物質(zhì)通過(guò)制備性HPLC來(lái)純化，得到標(biāo)題化合物，其為淡黃色固體(1.8毫克)。MS m/z 566(MH+)，保留時(shí)間為3.850分鐘。1HNMR(500MHz，MeOD)δppm 0.28(m，0.36H)1.19-2.20(m，11.64H)2.70-3.02(m，2H)3.03(s，2.16H)3.05(s，3.84H)3.49(d，J＝15.26Hz，0.64H)3.54(s，1.92H)3.83(s，1.08H)3.91(s，3H)4.08(d，J＝15.26Hz，0.36H)5.29(d，J＝15.26Hz，0.36H)5.50(d，J＝14.95Hz，0.64H)6.98-7.06(m，1H)7.16(d，J＝2.44Hz，0.36H)7.23(d，J＝2.44Hz，0.64H)7.30(d，J＝8.55Hz，0.64H)7.34(d，J＝8.55Hz，0.36H)7.56(dd，J＝8.55，1.53Hz，0.64H)7.63(dd，J＝8.55，1.53Hz，0.36H)7.88(d，J＝8.55Hz，0.64H)7.91(d，J＝8.55Hz，0.36H)8.12(s，0.36H)8.33(d，J＝1.53Hz，0.64H)。
關(guān)于制備標(biāo)題化合物的可選擇操作如下提供。
在N2下向配備有機(jī)械攪拌器、N2入口管及溫度計(jì)的經(jīng)火焰干燥的1升四頸圓底燒瓶中加入氫化鈉(95％)(3.09克，129.2毫摩爾)與無(wú)水DMF(200毫升)。在劇烈攪拌下分批加入碘化三甲基氧化锍(32.5克，147.3毫摩爾)，在此期間溫度上升至30℃。攪拌30分鐘后，迅速加入13-環(huán)己基-10-[[[(二甲基氨基)磺?；鵠氨基]羰基]-3-(甲氧基)-7H-吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-6-甲酸甲酯(33.8克，61.3毫摩爾)在無(wú)水DMF(70毫升)中的溶液。將反應(yīng)混合物在30℃之下攪拌30分鐘，然后分批倒入1N HCl(130毫升)在H2O(2升)中的冰冷溶液中。將所得到的懸浮液以機(jī)械方式攪拌1小時(shí)后，過(guò)濾沉淀物，并以H2O(100毫升)洗滌濾餅。使濾餅在EtOAc與0.5N HCl(1∶1，4升)之間作分配處理。分離有機(jī)相，以H2O(1升)與鹽水(1升)洗滌，以MgSO4干燥，過(guò)濾，及在真空中濃縮。使殘留物溶于EtOAc(150毫升)中，并使溶液經(jīng)過(guò)硅膠墊(300克，在己烷中)過(guò)濾，且以50％EtOAc/己烷(5升)沖洗。使濾液在真空中濃縮，得到微黃色固體，將其與50℃至0℃的10％EtOAc/TBME(220毫升)一起研磨，得到(+/-)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺酰基]氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸甲酯，其為白色固體(26.1克，75％產(chǎn)率)。HPLC純度為100％。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ11.61(s，1H)，8.47(s，0.5H)，8.25(s，0.5H)，7.81-7.88(m，1H)，7.57-7.63(m，1H)，7.23-7.29(m，2H)，7.01-7.07(m，1H)，5.43(d，J＝15.0Hz，0.5H)，5.22(d，J＝15Hz，0.5H)，4.04(dd，J＝15.4和6.6Hz，0.5H)，3.83(s，3H)，3.75(s，1H)，3.08-3.47(m，0.5H)，3.29(s，3H)，2.73-2.92(m，8H)，1.11-1.99(m，10.5H)，0.20(m，0.5H)。m/z 566(M+H)+。
中間體8
(-)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺?；鵠氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸甲酯. 使(+/-)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺酰基]氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸甲酯的樣品以50毫克/毫升的濃度溶于EtOH/CH3CN 1/1+0.5％DEA(二乙胺)中。[DEA的加入確保所述化合物在注射過(guò)程中留在溶液中]。然后在下文所示的條件下將此溶液注射至Thar SFC-350制備性SFC上。
在Thar SFC-350上的制備條件色譜柱為Chiralcel OJ-H 5×25厘米；流動(dòng)相為25％[MeOH/CH3CN(1/1)]/CO2；壓力(巴)為100；流速(毫升/分鐘)為240；溶液濃度(毫克/毫升)為50；注射量(毫升)為4.5-5；循環(huán)時(shí)間(分鐘/注射)為6.5-7；溫度(℃)為45；通量(克/小時(shí))為約2；檢測(cè)器波長(zhǎng)(納米)為254。
從371.4克外消旋起始原料得到總計(jì)177.3克所要第二洗脫的(-)異構(gòu)體，其含有約1摩爾當(dāng)量的二乙胺。此物質(zhì)使用下述程序來(lái)純化。將溶于二氯甲烷(800毫升)中的混合物(24.7克)以0.5N HCl(1×400毫升，1×240毫升)、H2O(2×240毫升)及鹽水(2×240毫升)相繼洗滌。然后，使有機(jī)層干燥(無(wú)水Na2SO4)，過(guò)濾，并蒸發(fā)，得到22.33克(-)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺?；鵠氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸甲酯，其為黃色固體(92％收率)。HPLC1＞99％(保留時(shí)間2.38分鐘)；LC/MS(ES+)566.51(M+H，100)。[α]D25C-194.64°(c 1.03，MeOH)。對(duì)C30H35N3O6S·0.33H2O的分析計(jì)算值C，63.04、H，6.29、N，7.35、S，5.61、H2O，1.04；實(shí)測(cè)值C，63.07、H，6.01、N，7.24、S，5.58、H2O，1.03。NMR顯示不存在Et2NH(二乙胺)。此物質(zhì)的EE(對(duì)映體過(guò)量)使用下述分析性HPLC程序來(lái)確定(＞99％)。
在Thar分析性SFC上確定對(duì)映體過(guò)量的分析條件分析性色譜柱為Chiralcel OJ(0.46×25厘米，10μl)；BPR壓力為100巴；溫度為35℃；流速為3.0毫升/分鐘；流動(dòng)相為15％[MeOH/CH3CN(1/1)]/CO2；檢測(cè)器波長(zhǎng)為254納米；保留時(shí)間(分鐘)為4和6.5。
中間體9
(-)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺酰基]氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸. 向(-)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺?；鵠氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸甲酯(22.33克，39.5毫摩爾)在MeOH(300毫升)中的溶液中歷時(shí)20分鐘緩慢加入1N NaOH(120毫升)，同時(shí)保持反應(yīng)溫度＜30℃。在N2下將混合物在室溫?cái)嚢?8小時(shí)。HPLC顯示反應(yīng)完成。向反應(yīng)溶液中加入1N HCl(130毫升)。加入完成后，反應(yīng)混合物的pH為約2。對(duì)反應(yīng)混合物中的甲醇進(jìn)行蒸發(fā)。將水(300毫升)加到混合物中，然后將其以CH2Cl2(1×600毫升，1×200毫升)萃取。合并的萃取物以H2O(2×300毫升)及鹽水(2×300毫升)洗滌，干燥(Na2SO4)，并蒸發(fā)，得到20.82克(96％產(chǎn)率)標(biāo)題化合物，其為黃色固體。HPLC條件色譜柱為PhenomenoexSynergi Polar-RP 4微米4.6×50毫米；UV為220納米；梯度時(shí)間為4分鐘；流速為4毫升/分鐘；75-100％B；溶劑A為含有0.2％H3PO4的10％MeOH/90％H2O；溶劑B為含有0.2％H3PO4的90％MeOH/10％H2O。HPLC＞99％(保留時(shí)間1.80分鐘)。LC/MS(ES+)552.25(M+H，100)。[α]D25C-166.99°(c 1.00，MeOH)。GC(氣相色譜)分析CH2Cl2 4.94％。對(duì)C29H33N3O6S·0.16H2O·0.35CH2Cl2的分析計(jì)算值C，60.37、H，5.87、N，7.20、S，5.49、H2O，0.49、CH2Cl2，5.02；實(shí)測(cè)值C，59.95、H，5.89、N，7.03、S，5.38、H2O，0.47、CH2Cl2，4.94。
中間體10
(+/-)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺?；鵠氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸. 向(+/-)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺酰基]氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸甲酯(100毫克，0.177毫摩爾)在THF/甲醇混合物(2.0毫升/2.0毫升)中的溶液中加入2N NaOH溶液(1.0毫升)。在微波條件下將反應(yīng)混合物在90℃加熱5分鐘。然后使其濃縮，以1N HCl溶液酸化，并以乙酸乙酯(2×20毫升)萃取。合并有機(jī)層，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，及濃縮。使殘留物通過(guò)制備性HPLC來(lái)純化，得到所要產(chǎn)物，其為淡黃色固體(59毫克，60％產(chǎn)率)。MS m/z 552(MH+)，保留時(shí)間為3.850分鐘。1H NMR(300MHz，MeOD)δppm 0.25(m，0.38H)1.14-2.22(m，11.62H)2.69-2.98(m，2H)3.02(s，2.28H)3.02(s，3.72H)3.41(d，J＝15.00Hz，0.62H)3.88(s，3H)4.01(d，J＝15.00Hz，0.38H)5.26(d，J＝15.00Hz，0.38H)5.45(d，J＝14.64Hz，0.62H)6.94-7.02(m，1H)7.13(d，J＝2.56Hz，0.38H)7.21(d，J＝2.20Hz，0.62H)7.26(d，J＝8.42Hz，0.62H)7.30(d，J＝8.78Hz，0.38H)7.53(dd，J＝8.42，1.46Hz，0.62H)7.61(dd，J＝8.60，1.65Hz，0.38H)7.85(d，J＝8.42Hz，0.62H)7.89(d，J＝8.42Hz，0.38H)8.10(s，0.38H)8.28(d，J＝1.46Hz，0.62H)。
中間體11
(1aR)-[部分]-8-環(huán)己基-N5-[(二甲基氨基)磺?；鵠-1，12b-二氫-N1a-[(2R，3S)-3-羥基-4，7，7-三甲基二環(huán)[2.2.1]庚-2-基]-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a，5(2H)-二甲酰胺. 將TBTU(437毫克，1.36毫摩爾)與DIPEA(二異丙基乙胺)(0.95毫升，5.436毫摩爾)加到(+/-)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺?；鵠氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸(500毫克，0.906毫摩爾)在DMSO(20.0毫升)中的溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?5分鐘。然后加入(2S，3R)-3-氨基-1，7，7-三甲基二環(huán)[2.2.1]庚-2-醇(280毫克，1.36毫摩爾)，并將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。以水使反應(yīng)混合物淬滅，并以1N HCl溶液酸化。褐色固體分離出來(lái)，其通過(guò)過(guò)濾來(lái)收集。接著，此物質(zhì)通過(guò)制備性HPLC在下述條件下來(lái)分離色譜柱為Waters Sunfire 19毫米×100毫米；溶劑A為10％CH3CN-90％H2O-0.1％TFA；溶劑B為90％CH3CN-10％H2O-0.1％TFA；程序?yàn)橐?5％溶劑B開始，最初保持時(shí)間為5分鐘，然后歷時(shí)30分鐘逐漸增加至90％溶劑B；流速為25毫升/分鐘；加載量為50-60毫克/操作。
在上述HPLC條件下洗脫(1aR)-[部分]-8-環(huán)己基-N5-[(二甲基氨基)磺?；鵠-1，12b-二氫-N1a-[(2R，3S)-3-羥基-4，7，7-三甲基二環(huán)[2.2.1]庚-2-基]-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a，5(2H)-二甲酰胺，接著洗脫(1aS)-[部分]-8-環(huán)己基-N5-[(二甲基氨基)磺?；鵠-1，12b-二氫-N1a-[(2R，3S)-3-羥基-4，7，7-三甲基二環(huán)[2.2.1]庚-2-基]-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a，5(2H)-二甲酰胺。所得產(chǎn)物為淡黃色固體(230毫克，36％產(chǎn)率)。MS m/z 703(MH+)，保留時(shí)間為3.936分鐘。1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 0.14-0.24(m，2.64H)0.51(s，2.46H)0.72-2.21(m，20.9H)2.49(m，0.18H)2.62(m，0.82H)2.85(m，0.18H)2.96(m，0.82H)3.03(s，6H)3.39(m，0.82H)3.49-3.58(m，1.64H)3.71-3.80(m，0.36H)3.90(s，3H)4.17(d，J＝14.65Hz，0.18H)5.06(d，J＝14.65Hz，0.18H)5.37(d，J＝14.95Hz，0.82H)6.73(d，J＝5.49Hz，0.82H)6.98-7.05(m，1H)7.08(d，J＝4.58Hz，0.18H)7.10(d，J＝2.44Hz，0.18H)7.21(d，J＝2.44Hz，0.82H)7.31(d，J＝8.55Hz，0.82H)7.34(d，J＝8.55Hz，0.18H)7.59-7.64(m，1H)7.87-7.93(m，1H)7.99(s，0.18H)8.09(d，J＝1.22Hz，0.82H)。
中間體12
(1aS)-[部分]-8-環(huán)己基-N5-[(二甲基氨基)磺酰基]-1，12b-二氫-N1a-[(2R，3S)-3-羥基-4，7，7-三甲基二環(huán)[2.2.1]庚-2-基]-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a，5(2H)-二甲酰胺. 將TBTU(437毫克，1.36毫摩爾)與DIPEA(0.95毫升，5.436毫摩爾)加到(+/-)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺酰基]氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸(500毫克，0.906毫摩爾)在DMSO(20.0毫升)中的溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?5分鐘。然后加入(2S，3R)-3-氨基-1，7，7-三甲基二環(huán)[2.2.1]庚-2-醇(280毫克，1.36毫摩爾)，并將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。以水使反應(yīng)混合物淬滅，接著以1N HCl溶液酸化。帶有褐色的固體分離出來(lái)，其通過(guò)過(guò)濾來(lái)收集。接著，將此物質(zhì)通過(guò)制備性HPLC在下述條件下來(lái)分離色譜柱為Waters Sunfire 19毫米×100毫米；溶劑A為10％CH3CN-90％H2O-0.1％TFA；溶劑B為90％CH3CN-10％H2O-0.1％TFA；程序?yàn)橐?5％溶劑B開始，最初保持時(shí)間為5分鐘，接著歷時(shí)30分鐘逐漸增加至90％溶劑B；流速為25毫升/分鐘；加載量為50-60毫克/操作。
在上述HPLC條件下，在(1aR)-[部分]-8-環(huán)己基-N5-[(二甲基氨基)磺?；鵠-1，12b-二氫-N1a-[(2R，3S)-3-羥基-4，7，7-三甲基二環(huán)[2.2.1]庚-2-基]-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a，5(2H)-二甲酰胺后洗脫(1aS)-[部分]-8-環(huán)己基-N5-[(二甲基氨基)磺?；鵠-1，12b-二氫-N1a-[(2R，3S)-3-羥基-4，7，7-三甲基二環(huán)[2.2.1]庚-2-基]-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a，5(2H)-二甲酰胺。所得產(chǎn)物為淡黃色固體(215毫克，34％產(chǎn)率)。MS m/z 703(MH+)，保留時(shí)間為4.038分鐘。1H NMR(500MHz，MeOD)δppm0.20(m，0.38H)0.75(s，1.86H)0.76(s，1.86H)0.84(s，1.86H)0.85(s，1.14H)0.89-2.18(m，18.9H)2.52(m，0.38H)2.70(m，0.62H)2.85(m，0.38H)2.97(m，0.62H)3.03(s，2.28H)3.04(s，3.72H)3.33-3.39(m，0.62H)3.43-3.51(m，1.24H)3.73-3.77(m，0.38H)3.78-3.84(m，0.38H)3.90(s，1.86H)3.90(s，1.14H)4.14(d，J＝14.65Hz，0.38H)5.11(d，J＝14.65Hz，0.38H)5.44(d，J＝15.26Hz，0.62H)6.68(d，J＝4.88Hz，0.62H)6.96-7.03(m，1H)7.07(d，J＝5.19Hz，0.38H)7.12(d，J＝2.44Hz，0.38H)7.23(d，J＝2.14Hz，0.62H)7.27(d，J＝8.54Hz，0.62H)7.33(d，J＝8.54Hz，0.38H)7.55(dd，J＝8.39，1.68Hz，0.62H)7.62(dd，J＝8.55，1.53Hz，0.38H)7.87(d，J＝8.54Hz，0.62H)7.91(d，J＝8.55Hz，0.38H)8.08(d，J＝1.22Hz，0.38H)8.10(d，J＝1.22Hz，0.62H)。
中間體9
(-)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺?；鵠氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸. 將10N NaOH溶液(2.0毫升，20毫摩爾)與4毫升水加到(1aR)-[部分]-8-環(huán)己基-N5-[(二甲基氨基)磺?；鵠-1，12b-二氫-N1a-[(2R，3S)-3-羥基-4，7，7-三甲基二環(huán)[2.2.1]庚-2-基]-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a，5(2H)-二甲酰胺(160毫克，0.228毫摩爾)在THF(四氫呋喃)/MeOH(甲醇)(7毫升/7毫升)中的溶液中。在微波條件下將反應(yīng)混合物在120℃加熱1小時(shí)。然后使其濃縮，以濃HCl溶液酸化，并以乙酸乙酯萃取兩次(2×30毫升)。合并有機(jī)層，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，及在真空中濃縮成橙色油狀物。接著，使粗產(chǎn)物通過(guò)制備性HPLC色譜柱來(lái)純化，得到產(chǎn)物，其為淡黃色固體(80毫克，64％產(chǎn)率)。平均旋光率(average specific rotation)-130.85°；溶劑MeOH；波長(zhǎng)589納米；50厘米樣品池。MS m/z 552(MH+)，保留時(shí)間為3.760分鐘。1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 0.27(m，0.38H)1.14-2.22(m，11.62H)2.76(m，0.38H)2.80-2.92(m，1H)2.92-3.09(m，6.62H)3.45(d，J＝14.95Hz，0.62H)3.90(s，1.86H)3.91(s，1.14H)4.04(d，J＝15.26Hz，0.38H)5.28(d，J＝15.26Hz，0.38H)5.47(d，J＝15.26Hz，0.62H)6.95-7.05(m，1H)7.15(d，J＝2.75Hz，0.38H)7.23(d，J＝1.83Hz，0.62H)7.28(d，J＝8.55Hz，0.62H)7.33(d，J＝8.54Hz，0.38H)7.54(dd，J＝8.39，1.68Hz，0.62H)7.63(dd，J＝8.55，1.53Hz，0.38H)7.86(d，J＝8.55Hz，0.62H)7.91(d，J＝8.55Hz，0.38H)8.11(d，J＝1.22Hz，0.62H)8.29(d，J＝1.22Hz，0.38H)。
中間體13
(+)-8-環(huán)己基-5-[[[(二甲基氨基)磺酰基]氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸. 將10N NaOH溶液(1.8毫升，18毫摩爾)與4毫升水加到(1aS)-[部分]-8-環(huán)己基-N5-[(二甲基氨基)磺酰基]-1，12b-二氫-N1a-[(2R，3S)-3-羥基-4，7，7-三甲基二環(huán)[2.2.1]庚-2-基]-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a，5(2H)-二甲酰胺(130毫克，0.185毫摩爾)在THF/MeOH(7毫升/7毫升)中的溶液中。在微波條件下將反應(yīng)混合物在120℃加熱1小時(shí)。使其濃縮，以濃HCl溶液酸化，并以乙酸乙酯萃取兩次(2×30毫升)。合并有機(jī)層，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，及在真空中濃縮，得到橙色油狀物。然后，使粗產(chǎn)物通過(guò)制備性HPLC色譜柱來(lái)純化，得到產(chǎn)物，其為淡黃色固體(68毫克，67％產(chǎn)率)。平均旋光率+174.73°；溶劑MeOH；波長(zhǎng)589納米；50厘米樣品池。MS m/z 552(MH+)，保留時(shí)間為3.773分鐘。1H NMR(500MHz，MeOD)δppm0.27(m，0.38H)1.14-2.22(m，11.62H)2.76(m，0.38H)2.80-2.92(m，1H)2.92-3.09(m，6.62H)3.45(d，J＝14.95Hz，0.62H)3.90(s，1.86H)3.91(s，1.14H)4.04(d，J＝15.26Hz，0.38H)5.28(d，J＝15.26Hz，0.38H)5.47(d，J＝15.26Hz，0.62H)6.95-7.05(m，1H)7.15(d，J＝2.75Hz，0.38H)7.23(d，J＝1.83Hz，0.62H)7.28(d，J＝8.55Hz，0.62H)7.33(d，J＝8.54Hz，0.38H)7.54(dd，J＝8.39，1.68Hz，0.62H)7.63(dd，J＝8.55，1.53Hz，0.38H)7.86(d，J＝8.55Hz，0.62H)7.91(d，J＝8.55Hz，0.38H)8.11(d，J＝1.22Hz，0.62H)8.29(d，J＝1.22Hz，0.38H)。
中間體14
2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸(1，1-二甲基乙基)酯. 向機(jī)械攪拌的2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸(80g，0.24mol)于無(wú)水二氯甲烷(1.2L)和THF(100mL)中的溶液中加入活化的分子篩(

80g)和碳酸銀(275g，0.99mol)。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，并滴加叔丁基溴(142g，1.04mol)。將混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并通過(guò)TLC(己烷-乙酸乙酯80∶20，Rf(產(chǎn)物)＝0.7)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如果留有任何溴代酸未發(fā)生轉(zhuǎn)化，則加入額外的10％碳酸銀，并再繼續(xù)攪拌2-4小時(shí)。結(jié)束后，將反應(yīng)混合物過(guò)濾通過(guò)薄的硅藻土床。濾渣(filtrand)用二氯甲烷(500mL)洗滌。真空濃縮合并的濾液，由此得到的粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠色譜(230-400目)(用0-2％乙酸乙酯/石油醚的梯度進(jìn)行洗脫)進(jìn)行純化。合并同質(zhì)的級(jí)分，并減壓蒸發(fā)，得到80g(85％)標(biāo)題化合物。HPLC90.1％(RT＝6.56分鐘)，柱C18BDS，(50×4.6mm)，流動(dòng)相0.1％TFA/水ACN(乙腈)的梯度(30→100→30)，流速0.8mL/分鐘。LCMS99.8％(RT＝4.44min)，柱Geneis，C18 50×4.6mm，流動(dòng)相0.1％甲酸/水ACN的梯度(70→95→70)，流速0.8mL/分鐘，M-1＝376.5。1HNMR(CDCl3)(400MHz)δ1.37-1.40(m，3H，環(huán)己基)，1.62(s，9H，叔丁基)，1.80-1.94(兩組多重峰，分別是3H和4H，環(huán)己基部分)，2.81(m，1H，環(huán)己基的CH-芐型的(CH of cyc.Hexyl-benzylic))，7.70-7.75(m，2H，吲哚-H4和H5)，8.04(s，1H，吲哚-H7)，8.52(s，1H，吲哚-NH)。
中間體15
3-環(huán)己基-2-(2-甲酰基-4-甲氧基苯基)-1H-吲哚-6-甲酸(1，1-二甲基乙基)酯 將2-溴-3-環(huán)己基-1H-吲哚-6-甲酸叔丁酯(72g，0.19mol)溶解在甲苯和乙醇的1∶1混合物(720mL)中并脫氣。然后加入LiCl(23.9g，0.51mol)，接著加入碳酸鈉(720mL，經(jīng)單獨(dú)脫氣的濃度為1.0M的溶液)和Pd-tetrakis(13.1g，0.011mol)。攪拌0.25小時(shí)后，加入2-甲酰基-4-甲氧基苯基硼酸(41.1g，0.22mol)，并將反應(yīng)混合物加熱至85℃并保持4小時(shí)。然后通過(guò)TLC(己烷-乙酸乙酯80∶20，Rf(產(chǎn)物)＝0.55)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。結(jié)束后，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入水(1.0L)，然后加入乙酸乙酯(1.0L)。有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥并真空濃縮，得到標(biāo)題化合物，其為黃色固體。收率75g(74％)。HPLC99.7％(RT＝6.30min)，柱C18 BDS(4.6×50mm)，SC-307，流動(dòng)相0.1％TFA/水ACN的梯度(30→100→30)，流速0.8mL/分鐘。LCMS98.0％(RT＝5.28min)，柱Geneis，C18(50×4.6mm)，流動(dòng)相0.1％甲酸/水ACN的梯度(70→95→70)，流速0.8mL/分鐘，M-1＝432.2。1HNMR(DMSO-d6)(400MHz)δ1.40-1.48(m，3H，環(huán)己基)，1.57(s，9H，叔丁基)，1.84-1.90(m，7H，環(huán)己基部分)，3.09(m，1H，環(huán)己基的CH-芐型的)，3.84(s，3H，OCH3)，6.55(d，J＝4Hz，1H，芳基H2’)，7.06(d，1H，芳基H3’)，7.08(s，1H，芳基H6’)，7.23(d，1H，吲哚-H5)，7.53(d，J＝8Hz，1H，吲哚-H4)，7.70-7.75(m，2H，NH+吲哚-H7)，8.06(s，1H，CHO)。
中間體16
13-環(huán)己基-3-甲氧基-7H-吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-6，10-二甲酸10-(1，1-二甲基乙基)酯·6-甲酯. 將3-環(huán)己基-2-(2-甲酰基-4-甲氧基苯基)-1H-吲哚-6-甲酸叔丁酯(62.5g，0.144mol)溶解在無(wú)水DMF(1.2L)中并機(jī)械攪拌。然后加入碳酸銫(84g，0.17mol)和2-(二甲氧基磷?；?丙烯酸甲酯(GC純度為65-70％，56.2g，0.18mol)，將反應(yīng)混合物加熱至65℃并保持4小時(shí)，并且通過(guò)TLC(己烷-乙酸乙酯80∶20，Rf(產(chǎn)物)＝0.7)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。結(jié)束后，將混合物冷卻至室溫，然后用水(1.0L)淬滅。黃色固體沉淀出來(lái)，過(guò)濾收集所述固體并風(fēng)干。然后將該物質(zhì)在甲醇中漿化，過(guò)濾，并真空干燥，得到產(chǎn)物，其為黃色粉末(70g，90％)。HPLC99.1％(RT＝6.45分鐘)，柱C18BDS(4.6×50mm)，流動(dòng)相0.1％TFA/水ACN的梯度(30→100→30)，流速0.8毫升/分鐘。LCMS100％(RT＝7.00分鐘)，柱Geneis，C18(50×4.6mm)，流動(dòng)相0.1％甲酸/水ACN的梯度(70→95→70)，流速0.8毫升/分鐘，M+1＝502.2。1HNMR(CDCl3)(400MHz)δ1.10-1.30(m，3H，環(huán)己基)，1.64(s，9H，叔丁基)，1.77-2.07(m，7H，環(huán)己基部分)，2.80(m，1H，環(huán)己基的CH-芐型的)，3.84(s，3H，OCH3)，3.93(s，3H，COOCH3)，4.15和5.65(兩個(gè)寬峰，各為1H，烯丙酰基的CH2(allylic CH2))，6.95(s，1H，芳基H6’)，7.01(d，1H，芳基H2’)，7.53(d，J＝8Hz，1H，芳基H3’)，7.70(d，J＝4Hz，1H，吲哚-H5)，7.84(s+d，2H，烯基的H+吲哚-H4)，8.24(s，1H，吲哚-H7)。13C NMR(CDCl3)(100.0MHz)δ166.92，165.71，158.96，142.28，136.47，13.50，134.61，132.43，132.01，129.73，124.78，124.68，120.33，119.39，119.04，115.62，115.05，111.27，80.27，55.49，52.50，39.09，36.81，33.40，28.38，27.15，26.28。
中間體17
2-(二甲氧基氧膦基)-2-丙烯酸甲酯. 向配備有機(jī)械攪拌器、冷凝器、溫度控制器和氮?dú)膺M(jìn)口的5L四頸圓底燒瓶中加入低聚甲醛(40.5g，1.35摩爾)、MeOH(甲醇)(2L)和哌啶(2mL)。將反應(yīng)混合物在氮?dú)鈿夥障录訜嶂粱亓鞑⒈３?小時(shí)。冷卻到50℃后，一次性加入2-(二甲氧基磷?；?乙酸甲酯(150g，0.824摩爾)。將反應(yīng)混合物繼續(xù)回流18小時(shí)。冷卻到室溫后，真空濃縮反應(yīng)溶液，得到透明無(wú)色油狀物。在配備有溫度控制器、氮?dú)膺M(jìn)口、磁力攪拌器和迪安-斯托克分水器(Dean-Starkapparatus)的3L四頸圓底燒瓶中將上述油狀物溶解在無(wú)水甲苯(1L)中。向溶液中加入TsOH·H2O(5.2g)。然后將反應(yīng)混合物共沸回流18小時(shí)，從而除去甲醇。冷卻到室溫后，將溶液真空濃縮，得到黃色油狀物，將其在150-155℃/0.2mm Hg的條件下真空蒸餾，得到產(chǎn)物，其為無(wú)色油狀物(135.0g)。根據(jù)1H NMR確定純度為90％。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.0(dd，J＝42.4和1.5Hz，1H)，6.73(dd，J＝20.5和1.8Hz，1H)，3.80(s，6H)，3.76(s，3H)。
中間體18
(+/-)-8-環(huán)己基-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a，5(2H)-二甲酸5-(1，1-二甲基乙基)酯·1a-甲酯. 在氮?dú)庀聦浠c(96毫克，4毫摩爾)加到攪拌的氯化三甲基氧化锍(567毫克，4.4毫摩爾)在無(wú)水DMSO(10毫升)中的懸浮液中。將所得到的混合物在室溫?cái)嚢?0-45分鐘，然后以小份分批加入純凈的13-環(huán)己基-3-甲氧基-7H-吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-6，10-二甲酸10-(1，1-二甲基乙基)酯·6-甲酯(1.0克，2毫摩爾)。懸浮液以DMSO(5毫升)稀釋，并在50℃加熱3-4小時(shí)。使反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并加入水。固體分離出來(lái)，其通過(guò)過(guò)濾來(lái)收集，并以水洗滌，接著風(fēng)干過(guò)夜，得到1.15克粗產(chǎn)物。使此物質(zhì)通過(guò)快速柱色譜(硅膠，3％MeOH/DCM(二氯甲烷))來(lái)純化，得到純標(biāo)題化合物(0.96克)。LC/MS保留時(shí)間3.816分鐘；m/e 516(MH+)。1H NMR(400MHz，CDCl3)基于化合物的NMR光譜，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物以相互轉(zhuǎn)化的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體(rotamer)的形式存在。
下述程序?yàn)閷?duì)外消旋的(+/-)-8-環(huán)己基-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a，5(2H)-二甲酸5-(1，1-二甲基乙基)酯·1a-甲酯進(jìn)行拆分的方法的實(shí)施例。使(+/-)-8-環(huán)己基-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a，5(2H)-二甲酸5-(1，1-二甲基乙基)酯·1a-甲酯的樣品溶于異丙醇與乙腈的混合物(8∶2)中，所得到的最終濃度為20毫克/毫升。將此混合物注射至使用下述條件的制備性手性SFC色譜系統(tǒng)上Chiralcel OJ-H色譜柱，4.6×250毫米，5微米；流動(dòng)相為8％MeOH/CO2；溫度為35℃；流速為2毫升/分鐘并保持16分鐘；UV監(jiān)測(cè)在260納米；注射量為5微升濃度為約20.0毫克/毫升的IPA∶ACN(8∶2)溶液。
中間體19
(+/-)-8-環(huán)己基-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a，5(2H)-二甲酸1a-甲酯. 將TFA(三氟乙酸)(5毫升)加到(+/-)-8-環(huán)己基-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-(甲氧基羰基)-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酸叔丁酯(515毫克，1毫摩爾)在無(wú)水DCM(二氯甲烷)(10毫升)中的溶液中。將所得到的溶液在室溫?cái)嚢璐蠹s8至12小時(shí)。然后，使反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，得到標(biāo)題化合物(0.47克，100％)。LC/MS保留時(shí)間2.245分鐘；m/e 460(MH+)。1HNMR(400MHz，CDCl3)基于化合物的NMR光譜，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物以相互轉(zhuǎn)化的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物的形式存在。
中間體20
8-環(huán)己基-1，12b-二氫-11-甲氧基-5-[[[(甲基氨基)磺酰基]氨基]羰基]-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸甲酯. 將8-環(huán)己基-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-(甲氧基羰基)-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酸(140毫克，0.31毫摩爾)與CDI(64毫克，0.40毫摩爾)在THF(3毫升)中的溶液在60℃攪拌1小時(shí)。加入N-甲基硫酰胺(68毫克，0.62毫摩爾)與DBU(71.6毫克，0.47毫摩爾)，并將混合物在60℃攪拌過(guò)夜。然后，將反應(yīng)混合物倒入冷水中，以稀鹽酸酸化，并萃取到乙酸乙酯中。將萃取物以稀鹽酸(0.1N)與鹽水相繼洗滌，接著干燥(無(wú)水硫酸鈉)，過(guò)濾，及蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物，其為褐色固體。ESI-MS m/e 552(MH+)。使用此物質(zhì)而無(wú)需進(jìn)一步純化。
中間體21
8-環(huán)己基-1，12b-二氫-11-甲氧基-5-[[[(甲基氨基)磺酰基]氨基]羰基]-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸. 使8-環(huán)己基-5-[[[(甲基氨基)磺?；鵠氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸甲酯溶于THF和MeOH的混合物(2毫升，2毫升)中。然后加入2.5M NaOH(水溶液)(1.2毫升，3毫摩爾)，并將反應(yīng)混合物在22℃振蕩2小時(shí)。接著以1M HCl(水溶液)(3毫升)使溶液中和，及濃縮，從而除去有機(jī)溶劑。殘留物以H2O漿化，并通過(guò)過(guò)濾來(lái)收集固體，以H2O洗滌，且干燥，得到標(biāo)題化合物(160毫克，0.30毫摩爾)。ESI-MSm/e 538(MH+)。使用此物質(zhì)而無(wú)需進(jìn)一步純化。
中間體22
(+/-)-8-環(huán)己基-5-[[[(芐基氨基)磺酰基]氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-(甲氧基)-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸甲酯. 將(+/-)-8-環(huán)己基-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-(甲氧基羰基)-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酸(200毫克，0.44毫摩爾)與CDI(92毫克，0.57毫摩爾)在THF(5毫升)中的溶液在60℃攪拌1小時(shí)。然后加入N-芐基硫酰胺(164毫克，0.88毫摩爾)與DBU(100毫克，0.66毫摩爾)，并將所得到的混合物在60℃攪拌過(guò)夜。接著，將反應(yīng)混合物倒入冷水中，以稀鹽酸酸化，并萃取到乙酸乙酯中。將有機(jī)相以鹽酸(0.1N)及鹽水洗滌，并干燥(硫酸鈉)，及在真空中蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物，其為褐色固體。ESI-MS m/e 628(MH+)。
中間體23
(+/-)-8-環(huán)己基-1，12b-二氫-11-甲氧基-5-[[[[(苯基甲基)氨基]磺酰基]氨基]羰基]-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸. 標(biāo)題化合物使用與就8-環(huán)己基-5-[[[(甲基氨基)磺?；鵠氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸所述相似的程序從(+/-)-8-環(huán)己基-5-[[[(芐基氨基)磺酰基]氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-(甲氧基)-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸甲酯開始來(lái)制備。ESI-MS m/e 613(MH+)。1H NMR(500MHz，MeOD)δppm1.22-2.20(m，13H)3.27-3.31(m，1H)3.47(d，J＝14.95Hz，0.6H)3.92(d，J＝2.44Hz，3H)4.04(d，0.4H)4.31(d，J＝2.75Hz，2H)5.24(d，0.4H)5.48(d，0.6H)7.02(d，1H)7.17(d，J＝2.75Hz，1H)7.19-7.35(m，5H)7.39(t，J＝7.48Hz，2H)7.45-7.52(m，1H)7.80(d，J＝1.53Hz，0.4H)7.85(dd，J＝8.39，6.87Hz，1H)8.22(d，J＝1.53Hz，0.6H)。
中間體24
(+/-)-8-環(huán)己基-5-[[(環(huán)丙基磺?；?氨基]羰基]-1，12b-二氫-11-甲氧基-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-1a(2H)-甲酸 將(+/-)-8-環(huán)己基-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-(甲氧基羰基)-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酸(1當(dāng)量)與羰基二咪唑(1.5當(dāng)量)在無(wú)水THF中的混合物在50℃加熱30分鐘，然后使其冷卻至室溫。然后連續(xù)加入1當(dāng)量的環(huán)丙基磺酰胺與1，8-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(2當(dāng)量)。將所得到的混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。用酸性水溶液處理后，使經(jīng)分離的粗產(chǎn)物通過(guò)制備性HPLC來(lái)純化。接著，使用1N NaOH的THF-MeOH溶液來(lái)水解中間體酯，得到標(biāo)題化合物。LC/MS保留時(shí)間為2.030分鐘；m/e 549(MH+)。1HNMR(400MHz，CDCl3)基于化合物的NMR光譜，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物以相互轉(zhuǎn)化的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的形式存在。
化合物24(+/-)-8-環(huán)己基-N-(環(huán)丙基磺?；?-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-(2-(4-(2-嗎啉代-2-氧代乙基))-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酰胺
在-10℃向酸(1.9g，3.78mmol)于DCM(10mL)中的溶液中滴加草酰氯(0.43mL，4.9mmol)和DMF(0.03mL)。在0℃攪拌1.5小時(shí)后，真空濃縮混合物，并用甲苯(20mL)共沸。將棕色殘余物溶解在CH3CN/THF(14mL，1/1)中并在溫度為-45℃的浴中冷卻。加入TMSCHN2(2M/乙醚(ether)，3.8mL，7.6mmol)和Et3N(1.1mL，7.9mmol)于CH3CN/THF(3mL，1/1)中的混合物。將混合物在0℃攪拌1.5小時(shí)，并加入另一份TMSCHN2(2M/乙醚，3.8mL，7.6mmol)。攪拌2.5小時(shí)后，反應(yīng)混合物用EtOAc稀釋并用冷的10％檸檬酸溶液、飽和NaHCO3、鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，除去溶劑并通過(guò)快速色譜(3％至40％EtOAc/己烷)來(lái)純化，得到化合物24-1，其為淺黃色泡沫狀物(1.47g，74％)。LC-MS保留時(shí)間3.916；MS m/z 526(M+H)。
1H NMR(400MHz，ppm 1.11-1.66(m，13H)，1.66-1.83(m，3H)，1.84-2.15(m，5H)，2.50(dd，J＝10.07，7.05Hz，1H)，2.69-2.82(m，1H)，2.85-2.95(m，1H)，3.68(s，1H)，3.87(s，3H)，4.03-4.15(m，1H)，5.00(d，J＝14.35Hz，1H)，5.35(s，1H)，6.86-6.93(m，1H)，6.97(d，J＝2.77Hz，1H)，7.26(d，J＝8.56Hz，1H)，7.70(dd，J＝8.31，1.26Hz，1H)，7.78-7.85(m，1H)，8.02(s，1H). 化合物24-1(1.47g，2.8mmol)和PhCOOAg(0.20g，0.86mmol)于MeOH/THF(15mL，2/1)中的混合物用超聲波處理2.5小時(shí)，除去溶劑，并且殘余物通過(guò)快速色譜法(3％至30％EtOAc/己烷)來(lái)純化，得到化合物24-2(0.72g，50％)，其為白色泡沫狀物。LC-MS保留時(shí)間4.12；MS m/z530(M+H)。
將化合物24-2(0.52g，0.98mmol)于TFA/DCM(4mL，1/1)中的混合物在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)，然后真空除去溶劑，得到化合物24-3，其為黃色泡沫狀物(0.465g，100％)。LC-MS保留時(shí)間3.593；MS m/z 474(M+H)。
將化合物24-3(0.465g，0.98mmol)和CDI(0.245g，1.57mmol)于THF(2mL)中的混合物在50℃加熱0.5小時(shí)，冷卻下來(lái)并加入N，N-二甲基硫酰胺(0.194g，157mmol)和DBU(0.264mL，1.77mmol)。將混合物攪拌過(guò)夜。加入另一份DBU(0.13mL，0.9mmol)，并將混合物再攪拌3天。混合物用EtOAc稀釋，用冷的1N HCl、鹽水洗滌，干燥，除去溶劑并通過(guò)快速色譜法來(lái)純化，得到化合物24-4(0.52g，91％)。LC-MS保留時(shí)間3.470；MS m/z 579(M+H)。
將化合物24-4(0.40g 0.69mmol)于THF(8mL)、MeOH(4mL)和NaOH(1N，4mL，4mmol)中的混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)，除去溶劑，將殘余物溶解在EtOAc中并用冷的1N HCl、鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，除去溶劑，得到化合物24-5，其為淺黃色泡沫狀物(0.372g，96％)。1H NMR(400MHz，ppm 1.02(t，J＝5.04Hz，1H)，1.26(dd，J＝8.81，5.29Hz，1H)，1.30-2.19(m，11H)，2.51(d，J＝14.86Hz，1H)，2.88-2.97(m，1H)，2.99(s，6H)，3.43(d，J＝15.11Hz，1H)，3.87(s，3H)，5.21(d，J＝15.11Hz，1H)，6.92(dd，J＝8.44，2.64Hz，1H)，7.08(d，J＝2.27Hz，1H)，7.27(d，J＝8.56Hz，1H)，7.61(dd，J＝8.44，1.39Hz，1H)，7.89(d，J＝8.56Hz，1H)，8.20(s，1H)，9.64(s，1H)。
以與就1-1所述相似的方法以相似的方法從酸24-5(0.056g，0.11mmol)制備化合物24(0.0394g，63％)。LC-MS保留時(shí)間3.338；MS m/z 635(M+H)。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.09(t，J＝5.16Hz，1H)，1.15(dd，J＝8.94，5.41Hz，1H)，1.20-2.14(m，12H)，2.50(d，J＝16.12Hz，1H)，2.89-2.98(m，2H)，3.05(s，6H)，3.28-3.53(m，4H)，3.66-3.74(m，4H)，3.87(s，3H)，4.97(d，J＝15.11Hz，1H)，6.91(dd，J＝8.56，2.52Hz，1H)，7.08(d，J＝2.01Hz，1H)，7.22-7.27(m，1H)，7.47(dd，J＝8.44，1.38Hz，1H)，7.87(d，J＝8.56Hz，1H)，8.02(s，1H)，9.00(s，1H). 化合物25(+/-)-8-環(huán)己基-N-(環(huán)丙基磺?；?-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-(2-(4-(2-((2S，6R)-2，6-二甲基嗎啉代)-2-氧代乙基))-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酰胺
以與就1-1所述相似的方法以相似的方法從酸24-5(0.056g，0.11mmol)制備化合物25(0.0394g，63％)。LC-MS保留時(shí)間3.436；MS m/z 663(M+H)。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 0.89-1.56(m，9H)，1.65-2.15(m，9H)，2.24-2.58(m，3H)，2.62-3.24(m，5H)，3.03-3.07(m，6H)，3.31-3.64(m，2H)，3.87(s，3H)，4.40-4.49(m，1H)，5.03(t，J＝14.10Hz，1H)，6.91(dd，J＝8.44，2.64Hz，1H)，7.08(s，1H)，7.22-7.31(m，1H)，7.43-7.57(m，1H)，7.87(d，J＝8.31Hz，1H)，7.93-8.20(m，1H)。
化合物26(+/-)-8-環(huán)己基-N-(環(huán)丙基磺?；?-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-(N-甲基-2-(4-(2-(3-甲基-3，8-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-8-基)-2-氧代乙基))-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酰胺
以與就1-1所述相似的方法以相似的方法從酸24-5(0.056g，0.11mmol)制備化合物26的TFA鹽(0.0394g，63％)。LC-MS保留時(shí)間3.116；MS m/z674(M+H)。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.02-1.61(m，6H)，1.64-1.85(m，3H)，1.86-2.22(m，7H)，2.36(d，J＝11.08Hz，1H)，2.48(d，J＝17.37Hz，1H)，2.86(s，3H)，2.91-3.07(m，1H)，3.00(s，6H)，3.40-3.56(m，2H)，3.59-3.71(m，1H)，3.88(s，3H)，4.15-5.57(m，4H)，4.99(d，J＝6.04Hz，1H)，5.10(d，J＝15.11Hz，1H)，6.93(dd，J＝8.56，2.52Hz，1H)，7.10(d，J＝2.27Hz，1H)，7.27(d，J＝8.56Hz，1H)，7.32(d，J＝8.31Hz，1H)，7.89(d，J＝8.56Hz，1H)，7.98(s，1H)。
用于制備環(huán)丙基醇9和相應(yīng)的環(huán)丙基氯化物10的一般程序
步驟3制備?；蝓０泛王；酋０? 如方案2所示，將酸7(1當(dāng)量)和羰基二咪唑(1.5當(dāng)量)于無(wú)水THF中的混合物在50℃加熱30分鐘，然后使其冷卻至室溫。然后依次加入1當(dāng)量的硫酰胺(R1＝NR2)或磺酰胺(R1＝烷基或芳基)和DBU(2當(dāng)量)。將所得混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。用酸性水溶液處理后，經(jīng)分離的粗制產(chǎn)物通過(guò)制備性HPLC來(lái)純化，得到化合物8。
步驟4將8中的甲酯基團(tuán)還原成相應(yīng)的醇9 在氮?dú)鈿夥障聦⒍惗』鶜浠X溶液(濃度為20％wt的甲苯溶液，5-10當(dāng)量)加到攪拌的冷的(-78℃)化合物8于無(wú)水DCM中的溶液中。使反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝夭⒈３?小時(shí)。用1N NaOH將反應(yīng)淬滅，并用1N HCl酸化，然后用DCM萃取。經(jīng)分離的粗制產(chǎn)物通過(guò)快速柱色譜法來(lái)純化，得到純的所期望的醇9。
步驟5將醇9轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氯化物10 醇9(1當(dāng)量)于氯仿中的溶液用亞硫酰氯(5-10當(dāng)量)在室溫處理2-3小時(shí)。蒸發(fā)過(guò)量的亞硫酰氯和氯仿，得到所期望的氯化物10，并且其不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。
所有化合物通過(guò)如下方法來(lái)分析 分析條件 柱 PHENOMENNEX-LUNA 3.0×50mm S10 流動(dòng)相(A)10∶90甲醇-水；(B)90∶10甲醇-水 緩沖液 0.1％TFA 梯度范圍0-100％B 梯度時(shí)間2分鐘 流速4mL/分鐘 分析時(shí)間3分鐘 檢測(cè) 檢測(cè)器1 UV(220nm) 檢測(cè)器2 MS(ESI+) (+/-)-8-環(huán)己基-N-(二甲基氨基磺?；?-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-(羥基甲基)-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酰胺(9a)
化合物9a通過(guò)制備性HPLC來(lái)純化并分離為灰白色固體。LC/MS保留時(shí)間3.276分鐘；m/e 538(MH+)。通過(guò)1H NMR(400MHz，CDCl3)發(fā)現(xiàn)化合物9a以相互轉(zhuǎn)化的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的形式存在。1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 0.12(t，J＝5.67Hz，0.2H)0.64(dd，J＝9.57，6.04Hz，0.2H)0.91-1.00(m，0.8H)1.19(dd，J＝9.06，4.78Hz，1H)1.23-1.85(m，4H)1.86-2.13(m，6H)2.77-2.96(m，2H)3.07(s，6H)3.36(d，J＝14.60Hz，0.8H)3.52(dd，J＝11.21，1.13Hz，0.8H)3.60(d，J＝11.33Hz，0.2H)3.80(d，J＝11.33Hz，0.2H)3.88，3.88(2s，3H)4.05(d，J＝14.86Hz，0.2H)4.82(d，J＝14.60Hz，0.2H)5.02(d，J＝14.86Hz，0.8H)6.86(dd，J＝8.44，2.64Hz，0.2H)6.91(dd，J＝8.44，2.64Hz，0.8H)6.98(d，J＝2.01Hz，0.2H)7.11(d，J＝2.01Hz，0.8H)7.21-7.29(m，1H)7.37-7.45(m，1H)7.83-7.90(m，1H)7.98(d，J＝1.51Hz，0.2H)8.04(d，J＝1.51Hz，0.8H)8.67(s，0.2H)8.79(s，0.8H)。
(+/-)-8-環(huán)己基-N-(二甲基氨基磺?；?-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-(氯甲基)-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酰胺(10a)
化合物10a通過(guò)快速柱色譜法來(lái)純化并分離為米色固體。LC/MS保留時(shí)間3.427分鐘；m/e 556(MH+)。1H NMR(400MHz，CDCl3)觀察到化合物10a以相互轉(zhuǎn)化的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的形式存在。
氨基甲酸酯類似物11如方案3所示通過(guò)如下方式來(lái)制備用NaH使9中的醇基團(tuán)脫質(zhì)子，然后加入相應(yīng)的二烷基氨基甲酰氯。
方案3
(+/-)-8-環(huán)己基-N-(二甲基氨基磺?；?-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-[嗎啉-4-羰基氧基)甲基]-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酰胺(11a)
化合物11a通過(guò)快速柱色譜法來(lái)純化并分離為米色固體。LC/MS保留時(shí)間2.098分鐘；m/e 651(MH+)。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 0.97(t，J＝4.78Hz，1H)1.17-2.16(m，11H)2.86-2.97(m，1H)3.01-3.73(m，11H)3.05(s，6H)3.88(s，3H)4.23(d，J＝12.09Hz，1H)4.84(d，J＝15.36Hz，1H)6.92(dd，J＝8.56，2.77Hz，1H)7.11(d，J＝2.27Hz，1H)7.23-7.31(m，1H)7.52(dd，J＝8.44，1.38Hz，1H)7.87(d，J＝8.56Hz，1H)8.03(d，J＝1.26Hz，1H)9.41(s，1H)。
氨基甲基類似物12如方案4所示通過(guò)如下方式來(lái)制備在DMF中在三乙胺的存在下對(duì)化合物10與相應(yīng)的胺進(jìn)行加熱。
方案4
(+/-)-8-環(huán)己基-N-(二甲基氨基磺?；?-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-(嗎啉代甲基)-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酰胺(12a)
化合物12a通過(guò)制備性HPLC來(lái)純化并分離為白色固體。LC/MS保留時(shí)間1.795分鐘；m/e 607(MH+)。1H NMR(400MHz，CDCl3)觀察到化合物12a以相互轉(zhuǎn)化的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的形式存在。
(+/-)-8-環(huán)己基-N-(二甲基氨基磺?；?-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-[(3-甲基-3，8-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-8-基)甲基]-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酰胺(12b)
化合物12b通過(guò)制備性HPLC來(lái)純化并分離為白色固體。LC/MS保留時(shí)間1.903分鐘；m/e 646(MH+)。1H NMR(400MHz，CDCl3)觀察到化合物12b以相互轉(zhuǎn)化的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的形式存在。
(+/-)-8-環(huán)己基-N-(二甲基氨基磺?；?-1，1a，2，12b-四氫-11-甲氧基-1a-[(N-乙基乙酰氨基)甲基]-環(huán)丙并[d]吲哚并[2，1-a][2]苯并氮雜

-5-甲酰胺(13a)
化合物13a通過(guò)制備性HPLC來(lái)純化并分離為米色固體。LC/MS保留時(shí)間2.590分鐘；m/e 607(MH+)。1H NMR(400MHz，CDCl3)觀察到化合物13a以相互轉(zhuǎn)化的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的形式存在。
權(quán)利要求
1.式I化合物或其可藥用鹽
其中
R1為-CO2R5或-CONR6R7；
R2為羥基、烷氧基、-CO2R12、-CON(R13)(R14)、-OCON(R13)(R14)或-N(R15)(R16)；
或者R2為氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、N-(烷基)哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、高哌啶基或高嗎啉基，并且R2被0-3個(gè)烷基取代基取代；
或者R2為
R3為氫、鹵素、烷基、烯基、羥基、芐基氧基或烷氧基；
R4為環(huán)烷基；
R5為氫或烷基；
R6為氫、烷基、烷基SO2-、環(huán)烷基SO2-、鹵代烷基SO2-、(R9)(R10)NSO2-或(R11)SO2-；
R7為氫或烷基；
R8為氫、烷基、環(huán)烷基、(環(huán)烷基)烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、芐基、芐基氧基羰基或吡啶基；
R9為氫或烷基；
R10為氫或烷基；
R11為氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、N-(烷基)哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、高哌啶基或高嗎啉基，并且R11被0-3個(gè)烷基取代基取代；
R12為氫或烷基；
R13為氫或烷基；
R14為氫或烷基；
或者-N(R13)(R14)一起為氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、N-(烷基)哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、高哌啶基或高嗎啉基，并且-N(R13)(R14)被0-3個(gè)烷基取代基取代；
R15為氫、烷基或烷基CO-；
R16為氫或烷基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為-CONR6R7；R6為烷基SO2-、環(huán)烷基SO2-、鹵代烷基SO2-、(R9)(R10)NSO2-或(R11)SO2-；以及R7為氫。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R3為氫。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R3為甲氧基。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中R4為環(huán)己基。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中R6為(R9)(R10)NSO2-或(R11)SO2-。
7.權(quán)利要求1的化合物，其具有如下立體化學(xué)
8.權(quán)利要求1的化合物，其具有如下立體化學(xué)
9.權(quán)利要求1的化合物或其可藥用鹽，所述化合物選自
10.一種組合物，其包含權(quán)利要求1所述的化合物或其可藥用鹽和可藥用載體。
11.權(quán)利要求10所述的組合物，其還包含至少一種額外的對(duì)HCV具有治療益處的化合物，其中所述化合物選自干擾素、環(huán)孢菌素、白細(xì)胞介素、HCV金屬蛋白酶抑制劑、HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑、HCV聚合酶抑制劑、HCV解螺旋酶抑制劑、HCV NS4B蛋白抑制劑、HCV進(jìn)入抑制劑、HCV組裝抑制劑、HCV釋出抑制劑、HCV NS5A蛋白甲制劑、HCV NS5B蛋白抑制劑和HCV復(fù)制子抑制劑。
12.一種治療丙型肝炎感染的方法，所述方法包括向患者給藥治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其還包括給藥至少一種額外的對(duì)HCV具有治療益處的化合物，其中所述化合物選自干擾素、環(huán)孢菌素、白細(xì)胞介素、HCV金屬蛋白酶抑制劑、HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑、HCV聚合酶抑制劑、HCV解螺旋酶抑制劑、HCV NS4B蛋白抑制劑、HCV進(jìn)入抑制劑、HCV組裝抑制劑、HCV釋出甲制劑、HCV NS5A蛋白抑制劑、HCV NS5B蛋白抑制劑和HCV復(fù)制子抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明披露了式I化合物及使用所述化合物的組合物和方法。所述化合物具有抗丙型肝炎病毒(HCV)的活性，并可用于治療被HCV感染的那些患者。
文檔編號(hào)A61P31/12GK101679441SQ200880016128
公開日2010年3月24日 申請(qǐng)日期2008年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月15日
發(fā)明者皮亞塞納·休厄瓦薩姆, 勇 涂 申請(qǐng)人:百時(shí)美施貴寶公司