專利名稱：：利用免疫調(diào)節(jié)劑化合物治療過敏性疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于治療、預(yù)防、抑制或減輕受試者的過敏性疾病或其影響的治療方法，其包括向受試者施用有效量的式A的免疫調(diào)節(jié)劑化合物R-NH-CH-(CH2)"h——C-XCOOHO(A)在式A中，n是l或2，R是氫、?；?、垸基或肽片段，且X是芳族氨基酸或雜環(huán)氨基酸或其衍生物。優(yōu)選地，X為L-色氨酸或D-色氨酸。圖1為本發(fā)明一個實(shí)施方案的結(jié)果的圖示。圖2為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。圖3為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。圖4為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。圖5為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。圖6為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。圖7為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。5圖8為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。優(yōu)選實(shí)施方案根據(jù)一個實(shí)施方案，本發(fā)明涉及用于治療、預(yù)防、抑制或減輕受試者(優(yōu)選為人患者)過敏性疾病(例如哮喘)及其影響的治療方法。在某些實(shí)施方案中，所治療的是特應(yīng)性支氣管哮喘(atopicbronchialasthma)。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑化合物包含式A的免疫調(diào)節(jié)劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>在式A中，n是l或2，R是氫、?；③螂钠?，且X是芳族氨基酸或雜環(huán)氨基酸或其衍生物。優(yōu)選地，X為L-色氨酸或D-色氨酸。作為"X"的芳族氨基酸或雜環(huán)氨基酸的適當(dāng)衍生物為酰胺、單(d-C6)或雙(CrC6)烷基取代的酰胺、芳基酰胺和(CrC6)烷基酯或芳基酯。作為"R"的適當(dāng)?；蜊鶠閘至約6個碳的支鏈或直鏈烷基基團(tuán)、2至約IO個碳原子的?；鶊F(tuán)，以及封端基團(tuán)，如芐氧羰基和叔丁氧羰基。優(yōu)選地，式A中所示的CH基團(tuán)的碳原子具有立體構(gòu)型，當(dāng)n為2時，其立體構(gòu)型不同于X的立體構(gòu)型。優(yōu)選的實(shí)施方案利用化合物，如y-D-谷氨酰-L-色氨酸、y-L-谷氨酰-L-色氨酸、Y-L-谷氨酰-Nm-甲酰-L-色氨酸、N-甲基-Y-L-谷氨酰-L-色氨酸、N-乙酰-Y-L-谷氨酰-L-色氨酸、Y-L-谷氨酰-D-色氨酸、p-L-天冬氨酰-L-色氨酸和卩-D-天冬氨酰-L-色氨酸。特別優(yōu)選的實(shí)施方案利用Y-D-谷氨酰-L-色氨酸，有時稱為SCV-07。這些化合物、制備這些化合物的方法、這些化合物的藥學(xué)上可接受的鹽和其藥物制劑公開在美國專利第5,916,878號，該專利通過引用并入本文。SCV-07，即Y-D-谷氨酰-L-色氨酸，是具有？谷氨?；蛘咛於滨；囊活惷庖哒{(diào)節(jié)藥物中的一種，其由俄國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并由美國?？她堉扑幑?SciClonePharmaceuticalsInc.)在幾個適應(yīng)癥中檢測了其功效。SCV-07具有多種體內(nèi)和體外免疫調(diào)節(jié)活性。SCV-07提高了Con-A誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖，增加了Con-A誘導(dǎo)的白介素-2(IL-2)生產(chǎn)和脾臟淋巴細(xì)胞的IL-2受體表達(dá)，并刺激骨髓細(xì)胞上的Thy-1.2表達(dá)。在體內(nèi)，SCV-07對受5-FU免疫抑制的動物和用綿羊紅血細(xì)胞免疫的模型具有強(qiáng)免疫刺激作用。式A的化合物可以以任何有效劑量施用，如約0.001-lOmg范圍內(nèi)的劑量?？梢悦啃瞧谝淮位蚨啻蔚厥┯脛┝浚缫蕴鞛榛A(chǔ)，劑量每天施用一次或多次?？梢酝ㄟ^任何合適的方法施藥，包括通過口服、鼻部、透皮、舌下施藥，通過注射、定期輸注、連續(xù)輸注等施用。可通過肌肉注射施用所述劑量，當(dāng)然也可以使用其它形式的注射和輸注，可以應(yīng)用其它的施藥形式，如經(jīng)口部或鼻部吸入或口服。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以以約0.001-10mg范圍內(nèi)的劑量，更優(yōu)選約0.01-lmg范圍內(nèi)的劑量，最優(yōu)選約O.lmg的劑量施用式A的化合物。劑量還可以以微克/千克計(jì)算，所述劑量在約0.00001-100mg/kg的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約0.0001-lmg/kg的范圍內(nèi)，更優(yōu)選約0.001-0.01mg/kg。SCV-07含有通過化學(xué)合成獲得并通過高效液相色譜純化為均一性的活性成分二肽fD-Glu-L-Trp("D-谷氨酰-L-色氨酸)(RU2091389,1997;RU2120298，1998)。所述制劑之前用于傳染病中以及外科手術(shù)后免疫力的恢復(fù)。所述制劑在0.00001mg/kg體重-0.01mg/kg體重的低劑量時具有免疫刺激作用，即其在極低濃度時發(fā)揮其作用。為了治療過敏性疾病，以藥典許可的劑量施用所述制劑。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)向個體施用的形式以及疾病的特征，所述制劑的日劑量為0.1mg-1.5mg。也可能以較低劑量使用所述制劑，但會降低治療效果，而從經(jīng)濟(jì)上來說，以大于1.5mg的劑量使用所述制劑也不適宜。所述制劑的劑量在超出應(yīng)用劑量至少100,000倍時并沒有毒性。當(dāng)通過腸胃外使用(肌內(nèi)或腹膜內(nèi))時，在某些實(shí)施方案中以溶解有活性成分(Y-D-Glu-L-Trp:100嗎)和賦形劑(D-甘露醇9.0mg，氯化鈉l.Omg)的體積為lml的等滲氯化鈉溶液的形式使用所述制劑。在某些實(shí)施方案中，所述單劑量為0.1mg(0.001mg/kg)。在某些實(shí)施方案中以5-10次注射為一療程的形式利用所述制劑進(jìn)行治療。當(dāng)經(jīng)口使用時，在某些實(shí)施方案中以包含0.35mg或1.5mg活性成分的片劑的形式使用所述制劑。在某些實(shí)施方案中所述制劑每天使用一次或兩次，并持續(xù)l-2周。具有取代、缺失、延長、替換或其它修飾部分并且具有與SCV-07基本相似的生物活性的生物活性類似物也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如與SCV-07具有足夠同源性而使其以與SCV-07具有基本相同的方式發(fā)揮基本相同活性的SCV-07衍生肽。根據(jù)一個實(shí)施方案，可以給患者施用式A的化合物從而使該患者的循環(huán)系統(tǒng)在治療或預(yù)防期間基本持續(xù)地保持有效量的式A的化合物。本發(fā)明的實(shí)施方案包括使受試者的循環(huán)系統(tǒng)在至少約6、10、12小時或更長的治療期內(nèi)基本持續(xù)地保持有效量的式A化合物，當(dāng)然更長的治療期也在本發(fā)明的預(yù)期之中。在其它實(shí)施方案中，治療期至少為約l天，甚至多天，如一星期或更長。然而，可以預(yù)期，使患者循環(huán)系統(tǒng)在治療期間基本持續(xù)地保持有效量的式A化合物的上述治療可以被持續(xù)時間相似或不同的非治療期隔開。根據(jù)一個實(shí)施方案，在治療期間可以通過例如靜脈內(nèi)輸注給患者連續(xù)輸注式A化合物，從而在該患者的循環(huán)系統(tǒng)中基本持續(xù)地保持有效量的式A化合物。所述輸注可以以任何合適的方式進(jìn)行，如通過微量泵。或者，也可以維持式A化合物的注射方案，從而在該患者的循環(huán)系統(tǒng)中基本持續(xù)地保持有效量的式A化合物。合適的注射方案可以包括每1、2、4、6等小時注射一次，從而使該患者的循環(huán)系統(tǒng)在治療期間基本持續(xù)地保持有效劑量的免疫調(diào)節(jié)劑化合物肽。根據(jù)一個實(shí)施方案，在至少約1小時的治療期中連續(xù)輸注式A化合物，當(dāng)然可以預(yù)期在連續(xù)輸注式A化合物中，給藥可以持續(xù)長得多的時間。更優(yōu)選地，連續(xù)輸注進(jìn)行更長時間，如至少大約6、8、10、12小時或更長的時間。在其它實(shí)施方案中，連續(xù)輸注至少大約l天，甚至數(shù)天，如一周或更長。在某些實(shí)施方案中，式A的化合物存在于藥學(xué)上可接受的液體載體例如注射用水、生理濃度的鹽水或類似物中?？梢酝ㄟ^常規(guī)的劑量滴定試驗(yàn)確定式A化合物的有效量。式A化合物還可以與其它治療哮喘的藥物一起施用。通過以下非限制性實(shí)施例來說明本發(fā)明。實(shí)施例l:特應(yīng)性支氣管哮喘的治療SCV-07是對免疫系統(tǒng)具有廣譜活性并且尤其能夠增強(qiáng)IL-2和干擾素-Y產(chǎn)生的合成免疫調(diào)節(jié)劑。這種活性明顯來自T輔助細(xì)胞的平衡在所述制劑影響下向I型T輔助細(xì)胞方向的移動。本發(fā)明的目的是研究SCV-07對小鼠實(shí)驗(yàn)性過敏性哮喘的作用。為此目的，本發(fā)明人使用了吸入施用過敏原的卵白蛋白致敏哮喘模型。在對動物用過敏原進(jìn)行初次全身免疫從而模擬預(yù)敏化生物體狀態(tài)后，給所述動物施用SCV-07。材料和方法構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性過敏性哮喘的模型將雌性無病原Balb/C系小鼠("Pushchtino"laboratoryanimalbreeders)在恒溫、12小時晝/夜循環(huán)的SPF-動物房條件下飼養(yǎng)，并提供無菌飼料和水，供其隨意取食。兩套試驗(yàn)中分別使用在試驗(yàn)開始時為6-8周齡和18-20周齡的小鼠。以每只小鼠8的劑量使用基于硫酸銨的佐劑中的卵白蛋白溶液(Sigma)對動物免疫兩次，其間的間隔為5天。初次免疫后第6天至第11天，每天一次經(jīng)腹膜內(nèi)施用劑量為0.1呢/kg或1.0嗎/kgSCV-07的200(il體積的PBS溶液。在同日向?qū)φ战M施用生理鹽水。每組包含6-10只動物。在初次免疫后第12、16和20天，將動物置于密封箱內(nèi)，利用超聲霧化器LD-207U(LittleDoctor)在該密封箱內(nèi)產(chǎn)生含1%卵白蛋白(OvA)的PBS溶液氣霧劑，并與空氣連續(xù)混合，持續(xù)1分鐘。動物接觸所述氣霧劑的時間為15分鐘。在最后一次接觸氣霧劑24小時后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性過敏性哮喘的嚴(yán)重度分析。根據(jù)支氣管肺泡灌洗液的細(xì)胞組成、組織學(xué)研究和抗原特異性IgE抗體的滴度測定，對實(shí)驗(yàn)性過敏性哮喘在使用SCV-07期間的嚴(yán)重度變化進(jìn)行分析。通過在腹膜內(nèi)施用致死量的巴比妥鈉處死小鼠。利用lmLPBS溶液經(jīng)氣管清洗肺部，獲得支氣管肺泡灌洗液(BAL)。通過離心沉淀BAL9細(xì)胞，重懸沉淀，在Goryaev小室中計(jì)算細(xì)胞濃度，并制備涂片。將涂片干燥、固定，并用Romanovskii染料染色。在光學(xué)顯微鏡下利用油浸法(目鏡:x16，物鏡x100)對支氣管肺泡灌洗液的細(xì)胞組成進(jìn)行分析。觀察不少于5個視野，計(jì)數(shù)每200個細(xì)胞中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量。將每種細(xì)胞群的細(xì)胞相對數(shù)量表示為占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。在采集支氣管肺泡灌洗液后，將肺部在4%的多聚甲醛中固定3-7天，通過醇(2%celluidine-蓖麻油)和氯仿逐漸增加的Peterfi溶液，并傾入石蠟中。制備厚度為5pm的切片。用蘇木精-曙紅對所述切片進(jìn)行染色以評價(jià)細(xì)胞浸潤的強(qiáng)度，并用Schiff-碘酸進(jìn)行染色以計(jì)算杯狀細(xì)胞的數(shù)量。利用ScionImage程序包通過形態(tài)度量的方式對支氣管周圍浸潤和血管周圍浸潤進(jìn)行定量評價(jià)。在每只動物的肺切片上分析三條支氣管和三條血管。計(jì)算含支氣管或血管的組織和其周圍浸潤的面積與血管或支氣管本身的面積之間的差異，作為浸潤面積。計(jì)算浸潤面積與血管或支氣管面積的比例，作為浸潤的指標(biāo)。在分析中，實(shí)驗(yàn)組包括的支氣管和血管面積方面相當(dāng)(組間差異不顯著，p>0.6)。對于每只動物的肺切片，在不少于5個視野中計(jì)算支氣管切片上杯狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞的數(shù)量，并將其表示為占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。在分析中，實(shí)驗(yàn)組包括的支氣管度量方面相當(dāng)(支氣管中細(xì)胞數(shù)量的組間差異不顯著，p>0.5)。從眼后窩竇(retro-orbitalsinus)采集外周血。根據(jù)以下方案，利用固相IFA測定血清和支氣管肺泡灌洗液中的抗-OvAIgE滴度。按照生產(chǎn)商推薦的稀釋度向用于IFA的96-孔平板(CorningCostar)中加入生物素標(biāo)記的抗小鼠IgE的大鼠抗體(Caltag)(100pL/L)，在室溫下孵育1小時，并清洗。然后加入連續(xù)稀釋的血清樣品或BAL，在室溫下孵育l小時，并清洗。隨后加入用辣根過氧化物酶標(biāo)記的OvA，在振蕩器上于室溫下孵育1小時，清洗，加入過氧化物酶的底物(OPD，Sigma)并孵育15分鐘。加入1MH2S04終止反應(yīng)，并使用Victor2分光光度計(jì)(Wallac)在450nm的波長對平板進(jìn)行分析。為了定量比較減去背景后抗原特異性IgE的滴度，發(fā)明人計(jì)算了動物對照組樣品在每個稀釋度的平均光密度，并將試驗(yàn)中來自所有動物樣品在相應(yīng)稀釋度的光密度表示為占上述所得數(shù)值的百分?jǐn)?shù)。利用Windowsv.13的MicrosoftExcel和SPSS程序?qū)Y(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。利用Kholmogorov-Smimov標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算正態(tài)分布。為了評價(jià)正態(tài)分布值的組間差異顯著性，發(fā)明人使用具有不同偏差的雙側(cè)Student檢驗(yàn)，對于非正態(tài)分布的差異，使用Mann-Whitney檢驗(yàn)。當(dāng)p〈0.05時，認(rèn)為差異顯著。除非另有說明，將數(shù)據(jù)用平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式表示。根據(jù)所獲得的結(jié)果，在對年幼動物(試驗(yàn)開始時為6-8周齡)的試驗(yàn)中，BAL細(xì)胞組成的分析沒有顯示出SCV-07的顯著作用。所有組中BAL的總體細(xì)胞性質(zhì)基本相同(對照組為2.00±0.34百萬個細(xì)胞，接受0.1pg/kg制劑的組為1.96±0.99百萬個細(xì)胞，接受1pg/kg制劑的組為2.21±1.16百萬個細(xì)胞)。通過比較BAL中各白細(xì)胞群的相對百分?jǐn)?shù)，發(fā)明人注意到接受l嗎/kgSCV-07的組中，嗜酸性粒細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)顯著低于對照組動物，而巨噬細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)則顯著高于對照組動物(見表1)。BAL中各個細(xì)胞群的絕對細(xì)胞數(shù)量在組間沒有顯著差異。表l.BAL細(xì)胞的百分組成(6-8周齡動物)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*與對照組相比，p<0.05在18-20周齡動物的試驗(yàn)中，接受SCV-07的組中BAL細(xì)胞組成的變化各不相同。發(fā)明人注意到，接受O.lpg/kg所述制劑的組，其灌洗液中細(xì)胞總數(shù)顯著減少(1.12士0.15百萬，其與對照組2.03士0.78百萬相比，p<0.05)，而在接受1|ig/kgSCV-07的組中，該指標(biāo)具有降低的明顯趨勢(1.32±0.23百萬)。盡管白細(xì)胞各個亞群的百分含量沒有顯著差異，但分析絕對值發(fā)現(xiàn)，接受O.lpg/kgSCV-07組的嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，而接受l.Olag/kg所述制劑的組中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)li胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量也顯著減少(見表2，圖1，其中SCV-07表示為SCV-07)。表2BAL細(xì)胞的亞群組成(18-20周齡動物)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*與對照組相比，p<0.05在6-8月齡動物[sic]的血清和支氣管肺泡灌洗液中，模型中使用的IgE抗原的特異滴度的測量值顯示，與對照組相比，接受0.1pg/kgSCV-07的組的血清滴度顯著降低。在接受1pg/kgSCV-07的小鼠中，血清和支氣管肺泡液中抗-OvAIgE的滴度均顯著降低(見表3，圖2，其中SCV-07表示SCV-07)。表3.抗-OvAIgE的滴度(6-8周齡動物)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*與對照組相比，p<0.05在使用18-20周齡小鼠的試驗(yàn)中，發(fā)明人還觀察到，在使用SCV-07后IgE特異性滴度的下降趨勢，但該指標(biāo)在所有組中的變化性非常高，且差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著(見表4)。表4.抗-OvAIgE的滴度(18-20周齡動物)動物組指標(biāo)對照SCV-070.1pg/kgSCV-071嗎/kg血清中IgE的滴度，稀釋度1:400，占對照組平均值的百分?jǐn)?shù)100±4492±4479±46BAL中IgE的滴度，稀釋度1:32，占對照組平均值的百分?jǐn)?shù)100±9185±70101±51小鼠切片的形態(tài)分析表明，在接受0.1pg/kgSCV-07的動物的支氣管上皮中，杯狀細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)降低2倍以上，與對照組相比差異顯著(見表5)。目前尚未完成支氣管周圍浸潤和血管周圍浸潤強(qiáng)度的形態(tài)度量評價(jià)。表5.支氣管上皮中杯狀細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(6-8周齡動物)動物組指標(biāo)對照SCV-070.1嗎/kgSCV-071昭/kg杯狀細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)(中間值，最小值-最大值)39.3(3-85)15.2*(4陽卯)36.5(3-92)*與對照組相比，p<0.05支氣管周圍和血管周圍浸潤強(qiáng)度的形態(tài)度量評價(jià)可以使接受SCV-07的兩個組的支氣管周圍浸潤的降低獲得可信的證明。在接受SCV-07的組中，血管周圍浸潤強(qiáng)度也具有降低的明顯趨勢，然而由于癥狀的高變化性，與對照組的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不可信(見表6)。表6.肺組織的浸潤強(qiáng)度動物組指標(biāo)對照SCV-070,1嗎/kgSCV-071嗎/kg支氣管周圍浸潤指標(biāo)，常規(guī)單位0.52±0.230.39±0.19*0.35±0.14**血管周圍浸潤指標(biāo)，常規(guī)單位2.46±2.221.67±1.081,48±1.02*與對照組相比，p<0.05**與對照組相比，p<0.0113結(jié)論所得結(jié)果表明，在使用SCV-07的過程中，觀察到過敏性哮喘模型的試驗(yàn)進(jìn)程(experimentalprocess)嚴(yán)重度降低，特別是支氣管腔內(nèi)白細(xì)胞的出現(xiàn)以及支氣管周圍浸潤減少，支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞減少，血清和灌洗液中抗原特異性IgE的數(shù)量下降，和支氣管上皮中形成粘膜的杯狀細(xì)胞的數(shù)量也下降。實(shí)施例2.SCV-07對Thl和Th2克隆的細(xì)胞因子生產(chǎn)的作用以每天5次腹膜內(nèi)注射的形式將0.1|ig/kg體重和1.0)ig/kg體重劑量的SCV-07施用于完整的野生型小鼠。此后，分離脾細(xì)胞，通過用5pg/mL劑量的伴刀豆球蛋白A刺激細(xì)胞從而在培養(yǎng)基中誘導(dǎo)細(xì)胞因子合成。通過免疫酶定量分析測定合成細(xì)胞因子的水平。試驗(yàn)結(jié)果示于圖l中，其顯示在腹膜內(nèi)施用SCV-07后，有絲分裂原誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生白介素-4和干擾素-Y。從圖1可以明顯看出，ConA誘導(dǎo)產(chǎn)生的其它兩種細(xì)胞因子[sic]-IFN-Y和IL-4的變化本質(zhì)上成倒數(shù)關(guān)系。觀察到，在SCV-07(1嗎/kg)影響下，由脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4減少2倍，而產(chǎn)生的IFN-y增加幾乎5倍。這些數(shù)據(jù)表明，SCV-07不僅刺激脾T細(xì)胞的功能應(yīng)答，強(qiáng)化IL-2的產(chǎn)生，同時還主要通過激活I(lǐng)型T輔助細(xì)胞來影響T輔助細(xì)胞的極化。實(shí)施例3.用SCV-07治療支氣管哮喘患者B-skii，生于1952年，報(bào)告主述每天出現(xiàn)呼吸困難6-7次，咳嗽并伴有難以咳出的痰、呼吸短促和鼻塞。從其病史可以得知，B-skii于1985年患上支氣管哮喘，曾經(jīng)通過緊急醫(yī)療服務(wù)在過敏科(AllergologicalDepartment)接受數(shù)次住院治療，同時伴有疾病的惡化。自1997年起，他一直接受全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素(脫氫皮質(zhì)醇，每天2片-維持劑量)。他還服用BeklazomLD250(高達(dá)1000(ig/天)、Flixotide250(達(dá)1000(ag/天)、長效支氣管治療齊U(prolongedbroncholytics)(Serevent25jag/單位，50|ag/s)、Teotard200(2k/天，400mg/天)。在疾病發(fā)作時，使用沙丁胺醇(Ventolin)進(jìn)行治療。他曾在1994年到當(dāng)?shù)剡^敏反應(yīng)局(MunicipalAllergyO伍ce)接受了變態(tài)反應(yīng)的檢查，并找到了家居過敏原(家居灰塵、家居塵螨)；考慮到疾病的嚴(yán)重時期，沒有進(jìn)行灰塵ASIT。最近一次惡化是在2周前，當(dāng)時在基礎(chǔ)治療的背景下發(fā)生呼吸困難，并用P-2激動劑(短期)難以進(jìn)行治療，支氣管痙攣和呼吸短促增加。他在第二GUZ醫(yī)院(GUZHospitalNo.2)的過敏科進(jìn)行住院治療，并且對門診治療的沒有響應(yīng)。按材料目錄追蹤過敏癥病理學(xué)的遺傳性。過敏史藥物-陰性；食物-蜂蜜、柑橘、西瓜、甜瓜(鼻塞、呼吸困難發(fā)作、咳嗽)；家居(家居灰塵)-呼吸困難發(fā)作、咳嗽、鼻塞、鼻液溢(rhinorrhea);表皮-陰性；灰塵-鼻炎的季節(jié)性惡化、結(jié)膜炎、連續(xù)10年在夏-秋季(7月-IO月)發(fā)生呼吸困難的頻率增加；昆蟲-陰性；檢査表示處于平均的嚴(yán)重度狀態(tài)。導(dǎo)致性患者姿勢(坐姿)。皮膚表面干凈、蒼白、干燥。皮下淋巴結(jié)沒有增大。沒有觸及甲狀腺。鼻部呼吸嚴(yán)重受阻，從鼻腔分離出少量粘液；不能察覺氣味。結(jié)膜-粉色。鼻粘膜(在鼻鏡檢查過程中)-蒼白、浮腫?？谇徽衬?粉色。呼氣特征的呼吸困難。呼吸頻率=24次/分鐘。形成桶狀胸腔。叩診-肺部聲音的鼓性叩響(capsularresonance)。聽診-大量干性喂音，在整個肺野中傳播。心音有節(jié)律。HR=P5=78/分鐘。BP=130/85mmHg。舌上覆有白色舌苔。腹部柔軟、無痛。肝部沿肋弓邊緣。腎的區(qū)域沒有變化，兩側(cè)均為Pasternak綜合征陰性。入院時進(jìn)行以下檢査常規(guī)血液分析紅細(xì)胞-5.07'1012/L，血紅蛋白二167g/L，白細(xì)胞=11.6'109/L，ESR=5mm/h，B=1%，E=3%，桿狀核細(xì)胞=10%，分節(jié)核細(xì)胞=70%，淋巴細(xì)胞=11%，MON=5%。常規(guī)的唾液分析顏色-灰色，特性-粘液狀，狀態(tài)-粘液狀，扁平上皮細(xì)胞-10-12x，肺泡上皮細(xì)胞-3-5x，L-10-12x，紅細(xì)胞-無，杯狀細(xì)胞-沒有發(fā)現(xiàn)。/L，ALT-0.24，AST-0.16mmol/h/L，尿素-5.12mmol/L，肌酸酐-0.108mmol/L，L-淀粉酶-7.0mmol/L。激素狀態(tài)血清皮質(zhì)醇-39.8nmol/L免疫狀態(tài)的評價(jià)TSIK-40相對單位NST-94/158/1.7CD3+-53%IgG匿8.74CD4+-34%IgA-0.67CD8+-15%IgM-1.39CD16+-12%IgE畫l130.6CD20+-18%CD25+-1.3%EKG:竇性心律。HR^76次搏動/分鐘視覺無病變FVD:FVC=66%，F(xiàn)EV=52%，F(xiàn)EV/FVC=61%，MOC75=37%，MOC50=34%，MOC25=51%。PTM:L/exp-2.0L/sL/exp-1.0Us。胸部X-射線肺野氣腫，肺硬化在下級肺泡(lowercompartments)擴(kuò)散。ENT會診診斷持續(xù)過敏性鼻炎。慢性咽炎。對該患者的診斷如下DS:支氣管哮喘，持久性、嚴(yán)重期、激素依賴、惡化。并發(fā)癥DN2。肺氣腫、肺硬化。并發(fā)癥持續(xù)過敏性鼻炎?；ǚ蹮?，沒有惡化。給所述患者開具以下治療1.在呼吸困難發(fā)作期間通過噴霧器施用Ventolin,持續(xù)2天，然后在呼吸困難期間施用Astalin(DAI)，每天不多于3-4次；2.靜脈內(nèi)滴注1.含脫氫皮質(zhì)醇90nu-60nu-30nu的200.0mL生理鹽水；2.氨茶石咸2.40/0-10.0-5.OmL。3.肝素5000單位。4.Be露ort200(800嗎/天)。5.脫氫皮質(zhì)醇4t/day(8'.0Q，12:00)166.通過噴霧器施用Lazolvan，然后是Ambrohexal1t/3次/天。在急性癥狀減弱期間(入院治療的第8天)，處方每天一次肌內(nèi)注射[sic]含O.lmgSCV-07的l.OmL生理鹽水的量，共5天。在療程結(jié)束后(5次肌內(nèi)注射)，觀察到患者自我感覺顯著改善、心情良好，沒有觀察到副作用。所述制劑耐受性良好，體溫在正常值范圍內(nèi)。在動態(tài)條件下對患者進(jìn)行另一次檢査(第5次肌內(nèi)注射SCV-07后24小時)全血液分析紅細(xì)胞-5.12.1012/1^，HB-159g/L，白細(xì)胞匿9.7-109/L，ESR-6mm/h，b-，e-2%，桿狀核細(xì)胞-5%，分節(jié)核細(xì)胞-67%，淋巴細(xì)胞-20%，M-6%。血液生物化學(xué)糖-5.7;總膽紅素-8.9，ALT■0.12，AST-0.13，尿素-5.12，肌酸酐-0.073常規(guī)的唾液分析特性-粘液似的、顏色為灰色、粘度均勻，視野中扁平上皮細(xì)胞7-8，肺泡上皮細(xì)胞-無，白細(xì)胞-1-2x激素狀態(tài)皮質(zhì)醇-72.4免疫狀態(tài)的評價(jià)CD4+-36IgG-11.5CD3+-52IgA-1.11CD8+-15IgM-0.9CD16+-7IgE-672.1NST-100/163CD20+-11k-1.6CD25+-1.3TSIK-77在患者中觀察到疾病的積極動態(tài)呼吸困難發(fā)作、咳嗽、鼻炎消除，呼吸短促減少(至16次/分鐘)、鼻塞消失，患者開始感覺到氣味。在第15天，患者以良好的狀態(tài)出院，同時皮質(zhì)類固醇治療減至維持劑量(每天2片脫氫皮質(zhì)醇)，并建議進(jìn)行基礎(chǔ)治療且在1月內(nèi)復(fù)査。實(shí)施例4.使用SCV-07以增強(qiáng)花粉熱的特異免疫治療的有效性?；颊逷-naM.N.,45歲，首次會診的日期2004年10月。診斷經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確證為對樹花粉敏感的花粉熱，鼻結(jié)膜型，非發(fā)病季節(jié)時緩解。實(shí)驗(yàn)室初步檢査的結(jié)果中度嗜酸性粒細(xì)胞增多(7%)，中度高IgE免疫球蛋白血癥(165ME/mL)，白樺花粉和榛樹花粉過敏原特異性IgE的血清水平高(MAST-class3)，免疫調(diào)控指標(biāo)降低(0.88)。從2004年11月末至2005年3月中旬，根據(jù)以下方案利用類變應(yīng)原("Puretal-tree")對花粉熱患者進(jìn)行特異性免疫治療(SIT):最初，每周一次皮下施用單劑量0.025mL的類變應(yīng)原，在治療過程中逐步提高后續(xù)劑量，直至達(dá)到0.5mL(0.025mL-0.05mL，-0.1mL-0.2mL-0.3mL-0.4mL-0.5mL)的單劑量，后續(xù)劑量維持該劑量。此后花粉熱的季節(jié)性惡化周期(2005年4月-6月)的性質(zhì)表明SIT的有效性極低嚴(yán)重的鼻結(jié)膜癥狀仍然需要使用基本劑量方案的全身經(jīng)口抗組胺劑(Erius)和局部類固醇治療(Nasonex)?？紤]到以上狀況，在2005年10月，為了提高SIT的臨床有效性，在初發(fā)或預(yù)期條件下，按照以下療程經(jīng)口施用免疫刺激制劑"SCV-07":1.5mg，每天一次，連續(xù)施用10天。"SCV-07"療程完成后，花粉熱患者從2005年11月中旬至2006年3月中旬按照之前的方案接受利用類變應(yīng)原"Puretal-tree"的另一個SIT療程。針對"SCV-07"療程和SIT療程開端之間的時間間隔為15天。此后花粉熱季節(jié)性惡化周期(2006年4月-6月)的性質(zhì)證明所實(shí)施的SIT的有效性顯著提高季節(jié)性鼻結(jié)膜癥狀近乎消失，在樹授粉的季節(jié)中，對患者既沒有使用抗組胺制劑也沒有使用局部類固醇。所得結(jié)果表明使用"SCV-07"預(yù)防和治療過敏性疾病的有效性。針對該目標(biāo)，所述制劑的無害性和其相對低的成本使其有望作為獨(dú)立治療劑和在綜合治療中廣泛使用。實(shí)施例5:SCV-07在過敏性疾病的豚鼠模型中的有效性概述哮喘為肺部疾病，特征為支氣管收縮、炎性細(xì)胞(尤其是嗜酸性粒細(xì)胞)向肺部浸潤、氣道高反應(yīng)性以及粘液分泌增加。可以在豚鼠中構(gòu)建過敏性哮喘模型，其具有針對過敏原的明顯且快速的支氣管收縮反應(yīng)以及炎性細(xì)胞浸潤，并在接觸過敏原后24小時出現(xiàn)肺損傷。本研究的目的是測定在過敏原激發(fā)后，SCV-07是否能夠減少炎性細(xì)胞向肺部的浸潤。通過腹膜內(nèi)注射卵白蛋白使豚鼠致敏化。在第17-21天，用PBS載體、1ug/kgSCV-07或10ug/kgSCV-07經(jīng)腹膜內(nèi)處理所述豚鼠。在第21天，用抗組胺劑對所有動物進(jìn)行預(yù)處理，以降低可能致死的快速支氣管收縮反應(yīng)。隨后，使動物接觸氣霧化卵白蛋白以引發(fā)過敏反應(yīng)。對照動物用卵白蛋白使致敏化并用鹽水氣霧劑作為對照進(jìn)行激發(fā)。SCV-07治療降低動物在快速過敏反應(yīng)過程中的咳嗽、呼吸困難和整體疼痛；肺組織中的固有嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞減少；過敏性肺損傷降低，表現(xiàn)為滲漏到支氣管肺泡灌洗液中的紅細(xì)胞顯著減少；并沒有明顯抑制炎性細(xì)胞向過敏肺的浸潤或卵白蛋白特異性抗體的產(chǎn)生。結(jié)論顯示SCV-07有望降低急性過敏反應(yīng)和隨后的肺損傷，但在抑制炎性細(xì)胞向過敏肺的浸潤方面無效。將來的研究應(yīng)當(dāng)檢測SCV-07抑制過敏原誘導(dǎo)的支氣管收縮的能力。此外，基于SCV-07預(yù)防紅細(xì)胞滲漏的作用，應(yīng)當(dāng)評價(jià)其預(yù)防過敏原誘導(dǎo)的微血管滲透性改變和肥大細(xì)胞調(diào)節(jié)因子釋放的能力?？s寫EPO嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶MPO髓過氧化物酶WBC白細(xì)胞RBC紅細(xì)胞BAL支氣管肺泡灌洗液NSS生理鹽水溶液PBS磷酸鹽緩沖液OVA卵白蛋白ip腹膜內(nèi)背景軼事證據(jù)表明患有慢性哮喘的人由于其它適應(yīng)癥而接受SCV-07時，能夠減少其哮喘用救急藥的使用。假設(shè)患者對口2激動劑的使用減少表明，SCV-07削弱了氣道高反應(yīng)性和/或過敏原誘導(dǎo)的早期和晚期支氣管收縮。對小鼠哮喘模型的研究還表明，在過敏原激發(fā)后細(xì)胞浸潤可略有減少(SciClonecommunication)。目的測定SCV-07是否緩解豚鼠哮喘模型的哮喘癥狀。具體目標(biāo)測定在致敏后但在過敏原激發(fā)前對豚鼠哮喘模型施用SCV-07是否減少細(xì)胞浸潤。材料和方法動物雌性Dunkin畫Hartley豚鼠(200-350g)購自CharlesRiver,Kingston,NewYorkfacility,BarrierK81。將動物運(yùn)送至明尼蘇達(dá)州德盧斯市(Duluth，Minnesota),并在試驗(yàn)開始前將其在本發(fā)明人的動物房中飼養(yǎng)5-7天。試驗(yàn)處理組列于表7中。表7:試驗(yàn)處理組<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在約6個月的時間內(nèi)進(jìn)行5次獨(dú)立試驗(yàn)，每次試驗(yàn)8-10只動物。第一次試驗(yàn)由4只PBSNSS動物和4只PBSOVA動物構(gòu)成，以保證試驗(yàn)系統(tǒng)正常運(yùn)作和OVA激發(fā)動物發(fā)展出明顯的嗜酸性粒細(xì)胞增多癥狀。隨后的4次試驗(yàn)包含來自所述6個處理組中每組的大概1-3只動物，并且每個處理組的最終N為7-8只動物，如表7中所示。試驗(yàn)過程在第0天用50mg/kgOVA經(jīng)腹膜內(nèi)致敏化動物。在第17、18、19和20天，在上午8點(diǎn)至10點(diǎn)之間通過腹膜內(nèi)注射向動物施用PBS、1ug/kgSCV-07或10ug/kgSCV-07(肽處理)。在第21天的上午8點(diǎn)-10點(diǎn)之間，在用OVA或鹽水(NSS)氣霧劑激發(fā)前2小時向動物施用肽。在用OVA或NSS氣霧劑激發(fā)前30分鐘，通過腹膜內(nèi)注射向每只動物施用抗組胺劑(6.1mg/kg馬來酸吡納明)以預(yù)防由于伴隨氣霧劑OVA激發(fā)的過敏性反應(yīng)而導(dǎo)致的死亡。利用DeVilbissModel35B超聲噴霧器，使在樹脂玻璃室(22X22X29cm)中的成對動物接觸1%OVA溶液噴霧劑或NSS噴霧劑5分鐘。在總共5分鐘氣霧化過程中觀察動物，并記錄下評論。在激發(fā)后的22-24小時內(nèi)，處死動物。通過心臟穿刺采血，灌洗，并摘取肺葉以測量細(xì)胞浸潤。在OVA或NSS激發(fā)和安樂死時，動物體重變化范圍在約350-550g，平均重量約420g。該試驗(yàn)方法與之前公開的研究中使用的方法相似(RegalandFraser,1996;Regaletal.,2000)。細(xì)胞浸潤的測定利用戊巴比妥(100-200mg/kg)使動物安樂死，通過心臟穿刺采血，并利用室溫的PBS灌洗。實(shí)施氣管插管，并向氣管插管中引入4體積的PBS，并將其溫和取出，以獲得支氣管肺泡灌洗液(BAL)。總灌洗液體積為60ml/kg。將BAL離心以沉淀細(xì)胞，將BAL細(xì)胞沉淀重懸在1.0mlPBS中，以測定每只動物BAL中回收的白細(xì)胞(WBC)總數(shù)。將BAL上清液在-70。C冷凍以利用Lowryetal.(1951)的方法測定BAL上清液中回收的總蛋白。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，利用Turk's溶液在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中對BAL中總白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。由使用改良Wrights'染料(DiffQuik,AmericanScientificProducts,McGrawPark,IL)染色的BAL細(xì)胞(3X1()4細(xì)胞)的細(xì)胞離心涂片(cytospinpreparation)獲得分類計(jì)數(shù)(differentialcount)。計(jì)數(shù)400個細(xì)胞，經(jīng)鑒別為嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞。利用BAL細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算從每只動物BAL回收的各細(xì)胞類型的總數(shù)。為了估測肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量，分別對左肺葉進(jìn)行處理以測定嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶(EPO)的活性，對右肺葉進(jìn)行處理以測定髓過氧化物酶(MPO)的活性(Fraseretal.，1995)。剩余的肺在8(TC干燥3-5天，以測定干重(g)。灌洗后勻質(zhì)化左肺尾葉的EPO活性表示為總OD/分鐘。灌洗后均質(zhì)化右肺尾葉的MPO活性表示為酶活性的總單位數(shù)。1ug/mlSCV-07沒有抑制EPO或MPO試驗(yàn)。如前所述(Fraseretal.,1995)，通過測定裂解RBC后重懸的BAL細(xì)胞沉淀的OD412，對BAL中RBC的數(shù)量進(jìn)行定量。同時測定BAL上清液的OD412，以估測在灌洗過程中以及在重懸細(xì)胞以進(jìn)行計(jì)數(shù)之前被裂解RBC的數(shù)量。0.3ug/mlSCV-07不影響體外OD412的測量。OVA特異性IgG1按照之前的闡述(Fraseretal.，1998;Regaletal.,2000)，通過ELISA測定血清中的OVA特異性IgG1。數(shù)據(jù)表示為樣品中OVA特異性IgG1的濃度除以標(biāo)準(zhǔn)品中OVA特異性IgG1的濃度(將該濃度定義為1)。通過使OVA致敏化豚鼠的血清混合物通過蛋白A瓊脂糖凝膠柱來制備IgG標(biāo)準(zhǔn)品。用NSS透析回收的IgGl，并將其等分以作為試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)品使用。試劑SCV-07由SciClone將200mgSCV-07運(yùn)送至德盧斯市并保存于-70。C。在實(shí)驗(yàn)室避光稱量所述化合物并避光保存。制備含20ug/ml和2ug/mlSCV-07的PBS儲備液，并于以1ml的體積等分保存在-7(TC冰箱中的聚丙烯試管(Sarstedttubes;Ref72.694.105)中。同樣將用于制備SCV-07溶液的PBS等分，并進(jìn)行冷凍以作為對照PBS注射劑(PBS目錄號Gibco10010，無鈣或鎂，經(jīng)測定內(nèi)毒素小于0.03EU/ml)。在使用的當(dāng)天解凍等分試樣，并在襯箔包裹的試管中避光放置在冰上。如果當(dāng)天沒有完全使用，將其避光儲存在冰箱中并于次日用完，否則將其丟棄。給動物施用0.5ml/kgPBS和2ug/mlSCV-07或20ug/mlSCV-07,從而獲得SCV1(1ug/kg)或SCV10(10ug/kg)的遞送劑用于致敏化的OVA制備100ml含25mg/ml卵白蛋白(A5503，Sigma)的鹽水(Baxter,無菌，無熱源)溶液。將含4ml等分試樣的Nunc低溫保存管(Cat337516)在-70"C冷凍。利用21g針通過腹膜內(nèi)向動物施用2ml/kg該OVA溶液，從而獲得50mg/kg的最終遞送劑量。利用OVA對該試驗(yàn)中的所有動物進(jìn)行致敏化。用于氣霧劑激發(fā)的OVA在氣霧劑激發(fā)當(dāng)天制備含1%OVA的室溫NSS(Baxter,無菌，無熱源)溶液。統(tǒng)計(jì)分析對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，以均衡變量并允許構(gòu)建正態(tài)參數(shù)模型。對于OVA特異性IgG1的數(shù)值，在統(tǒng)計(jì)分析前，將所有的數(shù)值加0.01的常數(shù)以使極小數(shù)值對對數(shù)分度中變量的影響最小化。所有圖中的數(shù)值表示為7-8個數(shù)值的幾何平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。利用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用JMP軟件(SASInstituteInc.,Cary，N.C，USA)進(jìn)行對比檢驗(yàn)。將在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性定義為p<0.05。結(jié)果SCV-07對OVA氣霧劑產(chǎn)生的快速反應(yīng)的影響在OVA氣霧化的過程中觀察動物，并將所記錄的評論總結(jié)于表8中。試驗(yàn)者沒有對處理進(jìn)行盲測。如表8左欄所示，用NSS氣霧劑激發(fā)的動物表現(xiàn)正常且沒有記錄到呼吸譜或運(yùn)動的變化。一般而言，用OVA致敏化和激發(fā)動物，用抗組胺劑預(yù)處理的動物將不死于過敏原激發(fā)，但將出現(xiàn)呼吸困難，并時常地咳嗽和喘息。PBSOVA處理組的所有7只動物都出現(xiàn)預(yù)期的可見反應(yīng)。值得注意的發(fā)現(xiàn)是，SCV1OVA和SCV10OVA處理組中沒有對OVA氣霧劑作出明顯反應(yīng)的動物數(shù)。這些數(shù)據(jù)表明，1ug/kg或10ug/kg的SCV-07預(yù)處理對過敏原敏化和激發(fā)的快速過敏影響具有保護(hù)作用。明顯的推論是SCV-07削弱了由過敏原激發(fā)引起的快速支氣管收縮。該觀測結(jié)果明確地預(yù)示了隨后的試驗(yàn)。表8在豚鼠(46只動物)的氣霧化過程中記錄的評論<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>SCV-07對OVA-誘導(dǎo)的細(xì)胞向肺浸潤的影響利用OVA使所有動物致敏化，并測定SCV-07對用NSS氣霧劑激發(fā)的動物(陰性對照，無過敏反應(yīng))的影響和對用OVA氣霧劑激發(fā)的動物的影響。通過測量勻質(zhì)化肺中嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶，對肺組織中的嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行估測，并且通過測量髓過氧化物酶對肺組織中的嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行估測(圖4)。本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室和其他實(shí)驗(yàn)室之前的研究已證實(shí)這些測量值可用于估測組織中的炎性細(xì)胞。此外，本發(fā)明人測定了氣道中存在的白細(xì)胞的數(shù)量和類型，即BAL細(xì)胞(圖5-6)。SCV-07對肺中固有細(xì)胞的影響首先采用ANOVA的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與僅用NSS氣霧劑激發(fā)的對照動物(n=24)對比，以確定SCV-07是否對肺組織或氣道中的固有嗜酸性粒細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞具有顯著影響。如圖4所示，1ug/kgSCV-07顯著降低了用NSS氣霧劑激發(fā)的動物的MPO，10ug/kgSCV-07顯著降低了EPO(*與PBSNSS對照相比，p<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，SCV-07處理顯著降低了肺組織中固有嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量(圖4)。然而，在用NSS激發(fā)的對照動物的BAL中，SCV-07沒有對細(xì)胞組成造成顯著影響(圖5，NSS)。SCV-07對OVA-誘導(dǎo)的細(xì)胞浸潤的影響如圖4和5所示，ANOVA分析表明OVA對肺EPO和所有BAL細(xì)胞類型具有顯著的整體效果。利用OVA激發(fā)，肺MPO沒有顯著增加，這與本發(fā)明人之前的結(jié)果一致。由于利用SV-07處理改變了固有嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，本發(fā)明人進(jìn)行ANOVA對比檢驗(yàn)(從PBSNSS到PBSOVA的變化)vs(從SCV1NSS到SCV1OVA的變化)(從PBSNSS到PBSOVA的變化)vs(從SCV10NSS到SCV10OVA的變化)如圖4所示，利用10ug/kgSCV-07處理后肺EPO的變化大于用PBS處理后的變化(#)。肺MPO的變化沒有隨SCV-07處理而改變。就BAL細(xì)胞而言，BAL嗜中性粒細(xì)胞的變化隨SCV-07處理而改變。這些區(qū)別在某種程度上是由于SCV-07處理后固有嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的減少造成的。用百分?jǐn)?shù)表示的細(xì)胞分類也示于圖6A-6C中，以與在小鼠哮喘模型(SciClonedoc43-10718)中的SCV-07研究進(jìn)行比較。在用OVA氣霧劑激發(fā)的SCV-07處理的動物中，BAL中嗜酸性粒細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)有減少的趨勢(圖6A)。然而，BAL中嗜酸性粒細(xì)胞的總數(shù)沒有改變(圖5B)。SCV-07對OVA-誘導(dǎo)的肺損傷和/或微血管滲透性變化的影響已知過敏原激發(fā)引起肺中微血管滲透性的增加并可引起紅細(xì)胞向氣道中滲漏的肺損傷。這些事件中的任一個都可能由于血漿蛋白或間質(zhì)液向氣道的滲漏而引起B(yǎng)AL中蛋白含量提高。通過測定BAL中RBC(圖7A-7B)和BAL液體中的總蛋白含量(圖7C)評估肺損傷和/或微血管滲透性的變化。通過裂解細(xì)胞沉淀并測定所釋放血紅蛋白的00412來估測BAL中的RBC數(shù)量(圖7A)。此外，還測定了BAL上清液中的OD^以估測在灌洗前或灌洗過程中以及重懸細(xì)胞以進(jìn)行計(jì)數(shù)前被裂解的RBC數(shù)量(圖7B)。從圖7可以看出，用PBS處理的動物的OVA激發(fā)顯著提高了BAL中RBC的數(shù)量以及BAL中的總蛋白量。從NSS到OVA的變化的ANOVA對比表明，1ug/kg或10ug/kgSCV-07都顯著消減BAL中RBC的數(shù)量(#，圖7A)。此外，SCV-07還顯著降低了BAL上清液的OD412，這表明在收集灌洗液的過程中被裂解的RBC顯著減少^，圖7B)。SCV-07處理沒有使BAL液體中的總蛋白受到影響(圖7C)。SCV-07對血清OVA-特異性IgG1抗體的影響參與豚鼠肺過敏反應(yīng)的肥大細(xì)胞致敏抗體包括IgE和IgGl抗體二者。在沒有佐劑存在的情況下用OVA致敏的豚鼠主要產(chǎn)生OVA特異性IgG1抗體。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究已經(jīng)確定，在本研究中用于致敏動物的方法不可能引起OVA特異性IgE的產(chǎn)生(Fraseretal.，1995;RegalandFmser，1996)。為了確保SCV-07處理觀察到的任何影響都不是由于所產(chǎn)生的OVA特異性IgG1抗體的改變而引起的，通過ELISA測定了血清中的濃度(圖8)。由于在本研究中所有動物都用OVA致敏化，在所有組中都可以測到OVA特異性IgG1抗體。SCV-07處理或OVA激發(fā)都沒有對OVA特異性IgG1抗體在血清中的濃度造成顯著影響。一般性結(jié)論和討論哮喘的控制是重要的衛(wèi)生保健問題最近的研究清楚地表明，利用目前的藥物并不能對多數(shù)哮喘癥進(jìn)行很好地控制?，F(xiàn)實(shí)世界哮喘控制和治療的評價(jià)(RealworldEvaluationofAsthmaControlandTreatment,REACT)研究表明，未受控制的哮喘非常普遍。他們的結(jié)果證明，55%使用標(biāo)準(zhǔn)哮喘藥的患者患有未受控制的哮喘。盡管這些患者中的絕大多數(shù)都進(jìn)行了健康護(hù)理，但仍發(fā)生未受控制的哮喘(Petersetal.,2007)。還不清楚這種對哮喘控制的缺乏是否是由于沒有按照最佳方案使用現(xiàn)有藥劑，或者由于現(xiàn)有藥劑在許多哮喘患者中沒有靶向正確的介體和/或事件的事實(shí)。因此，仍需要新型的哮喘療法，不論其靶向?qū)^敏原的快速反應(yīng)還是靶向由接觸過敏原產(chǎn)生的更多慢性炎性作用。當(dāng)然，有證據(jù)表明，在快速過敏反應(yīng)中釋放的介體可以引發(fā)導(dǎo)致炎性疾病的更多慢性作用的事件(Paul，1999)。本研究在豚鼠模型中的主要發(fā)現(xiàn)快速過敏反應(yīng)觀察到對豚鼠的SCV-07治療使見于OVA氣霧劑激發(fā)的快速過敏反應(yīng)過程中的動物咳嗽、呼吸困難和一般疼痛減少。之前關(guān)于小鼠模型的研究并沒有報(bào)道關(guān)于與氣霧劑過敏原激發(fā)過程中的快速過敏反應(yīng)的任何發(fā)現(xiàn)。通常，與豚鼠相比，對過敏原激發(fā)作出應(yīng)答的小鼠的肺功能變化很小，并且小鼠不需要抗組胺劑預(yù)處理來防止快速過敏反應(yīng)過程中的死亡。本發(fā)明人關(guān)于SCV-07對豚鼠模型中快速反應(yīng)的作用的觀察結(jié)果表明，SCV-07對過敏性疾病具有在臨床上非常有用的特性。應(yīng)該進(jìn)一步研究SCV-07治療對皮膚和肺中的快速過敏反應(yīng)的效用。過敏性肺部炎癥豚鼠對過敏原致敏化和激發(fā)做出響應(yīng)，在過敏原激發(fā)后24小時內(nèi)炎性細(xì)胞向肺浸潤。檢測總細(xì)胞數(shù)時發(fā)現(xiàn)，5天的SCV-07預(yù)治療沒有抑制嗜酸性粒細(xì)胞向豚鼠肺部的浸潤的改變(圖5)。SCV-07傾向于降低過敏原激發(fā)后BAL中集聚的嗜酸性粒細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(圖6)。然而，這種降低沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。氣道中細(xì)胞類型的百分?jǐn)?shù)具有臨床重要性還是氣道中細(xì)胞類型的總數(shù)是進(jìn)行評價(jià)的重要變量尚存在爭論。對這二者中的任一個進(jìn)行的評價(jià)都得到相同的結(jié)論(圖5-6)。SCV-07治療并沒有明顯抑制過敏原誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞向豚鼠肺的浸潤。然而，SCV-07治療明顯降低了對照動物的肺總EPO和MPO，這表明所述化合物影響正常狀態(tài)的肺中的固有嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量。在這一發(fā)現(xiàn)之后需要對不同處理組豚鼠的肺進(jìn)行組織病理學(xué)檢查以確定單獨(dú)的SCV-07處理是否改變固有細(xì)胞的數(shù)量。之前用SCV-07在過敏和哮喘模型系統(tǒng)中的研究有限。本發(fā)明人回顧了在小鼠哮喘模型中對SCV-07的研究(SciCloneDoc43-10718)。在所述小鼠研究中，利用OVA對兩組不同年齡的小鼠進(jìn)行致敏化和激發(fā)，并報(bào)道了細(xì)胞浸潤。在兩組不同年齡的小鼠中進(jìn)行研究的基本原理并不清楚。在本發(fā)明利用豚鼠的研究中，僅對一個年齡組進(jìn)行了評價(jià)。本發(fā)明人使用200-350g雌性豚鼠，這是因?yàn)榇饲鞍l(fā)明人在年幼和成年、雄性和雌性豚鼠中的研究表明該性別和年齡的動物恒定地產(chǎn)生強(qiáng)的過敏性肺部炎癥(Regaletal.,2006)。這些動物在研究過程中積極生長，并且該體重范圍內(nèi)的動物通常用于豚鼠過敏性炎癥模型。在所報(bào)道的小鼠研究中，報(bào)道了6-8周小鼠的BAL中嗜酸性粒細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)的降低適度，且總細(xì)胞數(shù)沒有變化。在18-20周齡動物中，利用SCV處理沒有觀察到細(xì)胞類型百分?jǐn)?shù)的變化，但SCV-07使18-20周齡動物BAL中的總嗜酸性粒細(xì)胞減少。在所述小鼠研究中，沒有報(bào)道來自未致敏動物或被致敏但未用氣霧劑OVA激發(fā)的動物的BAL的細(xì)胞分類或細(xì)胞總數(shù)。正常的豚鼠在肺中具有固有的嗜酸性粒細(xì)胞群，然而在正常小鼠肺中嗜酸性粒細(xì)胞并非如此明顯。在本發(fā)明人的研究中，由于SCV-07處理對基線EPO和MPO測量的影響，利用適當(dāng)?shù)膶φ针念A(yù)處理組對NSS和OVA氣霧劑間變量的改變進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是重要的。對于小鼠數(shù)據(jù)無此類比較可獲得。肺損傷或微血管滲透性的變化豚鼠肺中的嚴(yán)重過敏反應(yīng)伴隨著24小時后BAL中紅細(xì)胞數(shù)量的增加。很明顯，SCV-07顯著抑制了該事件(圖7)。根據(jù)本發(fā)明人的研究設(shè)計(jì)不能確定這反映了觀察到的動物快速過敏反應(yīng)的削弱(最初5分鐘)，還是反映了在快速反應(yīng)后且在最初24小時內(nèi)肺中發(fā)生的損傷。然而，SCV-07處理后BAL中RBC數(shù)量的明顯差異表明，所述化合物具有非常明顯的保護(hù)作用。該保護(hù)作用具有非常重要的臨床意義，應(yīng)該在其后進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)。體液免疫反應(yīng)在利用OVA起始致敏后17天開始SCV-07治療，這樣初次免疫應(yīng)答不可能受到肽處理的影響。過敏原激發(fā)后，在灌洗時測定OVA特異性IgG1的血清濃度。與期望相同，處理組中IgG1的血清水平?jīng)]有顯著差異。這表明，在過敏反應(yīng)中觀察到的任何變化都不可能是由介導(dǎo)該應(yīng)答的親細(xì)胞抗體的可用性差異導(dǎo)致的。這在某種程度上與小鼠研究不同，在小鼠研究中，在用SCV-07處理的小鼠中觀察對OVA-特異性IgE的小但顯著的作用。然而在小鼠模型中SCV-07處理不同，其在第二次致敏注射OVA加氫氧化鋁(alum)后僅一天即開始。研究的優(yōu)勢和局限性豚鼠過敏性肺部炎癥模型是否反映了人哮喘癥一直備受爭議。豚鼠模型的優(yōu)點(diǎn)在于易于發(fā)生嗜酸性粒細(xì)胞向肺部的浸潤。另外，豚鼠易于在沒有佐劑的情況下產(chǎn)生針對OVA的抗體。缺點(diǎn)在于豚鼠不像人那樣易于產(chǎn)生IgE抗體，而是產(chǎn)生親細(xì)胞的IgGl抗體。與人一樣，豚鼠對過敏原激發(fā)產(chǎn)生明顯的快速支氣管收縮反應(yīng)，而該反應(yīng)在小鼠模型中很小且持續(xù)時間短。此外，本發(fā)明人的模型中，必須用抗組胺劑對豚鼠進(jìn)行預(yù)處理，否則在5分鐘氣霧劑處理過程中會有高達(dá)50%的豚鼠死亡。因此，該額外的藥物處理可能使解釋復(fù)雜化。EPO和MPO的測量分別提供了肺葉中總嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的圖譜，但沒有提供關(guān)于這些細(xì)胞位置的信息。隨后的組織病理學(xué)觀察對于檢測炎性細(xì)胞的位置并確認(rèn)所述生化結(jié)果是必要的。在快速反應(yīng)過程中記錄的評論表明，SCV-07保護(hù)動物使其不產(chǎn)生由于接觸過敏原而導(dǎo)致的快速支氣管收縮反應(yīng)。不過，在這一令人感興趣的觀察結(jié)果之后需要進(jìn)行肺功能測量。結(jié)論在該有效的哮喘豚鼠模型中，SCV-07顯示出降低快速過敏反應(yīng)和隨后的肺損傷的功效，但對于阻止炎性細(xì)胞向過敏性肺部的浸潤無效。進(jìn)一步的研究應(yīng)檢測SCV-07抑制過敏原誘導(dǎo)的支氣管收縮的能力。此外，基于SCV-07對肺損傷的保護(hù)作用，應(yīng)當(dāng)評價(jià)其對在皮膚和肺中阻止過敏原誘導(dǎo)的微血管滲透性變化以及肥大細(xì)胞介體釋放變化的能力。參考文獻(xiàn)FraserDG，RegalJF,andArndtML:Trimelliticanhydride-inducedallergicresponseinthelung:Roleofthecomplementsystemincellularchanges.J.PharmacolexpTher273:793-謝，1995.FraserDG，GrazianoFM,LarsenCPandRegalJF:TheroleofIgGIandlgG2intrimelliticanhydride-inducedallergicresponseintheguineapiglung.ToxicologyandAppliedPharmacology150:218-227,1998.LarsenCPandRegalJF:Trimelliticanhydride-inducedcellularinfiltrationintoguineapiglungvarieswithagebutnotgender,lntArch.AllergyImmunol127:63-72，2002.LowryOJ，RosebroughNJ,FairAL，RandallPJ:ProteinmeasurementwiththeFolinphenolreagent.JBiolChem1951;193:265-275.PaulWE:FundamentalImmunology,4thedition,1999.Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia.PetersSP,JonesCA,HaselkomT，MinkDR，ValacerDJ，andWeissST:national^Web-basedsurvey.JAllergyClinImmunol119:1454-1461,2007.RegalJFandFraserDG:Systemiccomplementsystemdepletiondoesnotinhibitcellularaccumulationinantihistaminepretreatedallergicguineapiglung，lntArchAllergyImmunol109:150-160,1996.RegalJF，F(xiàn)raserDG，WeeksCD,GreenbergNA:Dietaryphytoestrogenshaveantiinflammatoryactivityinaguineapigmodelofasthma.PSEBM223:372-378，2000.RegalJF，RegalRR，MeehanJL,MohrmanME:Primarypreventionofasthma:Ageandsexinfluencesensitivitytoallergen-inducedairwayinflammationandcontributetoasthmaheterogeneityinguineapigs,lntArchAllergyImmunol141:241-256,2006.權(quán)利要求1.用于治療、預(yù)防、抑制或減輕受試者的過敏性疾病或其影響的治療方法，其包括向所述受試者施用有效量的式A的免疫調(diào)節(jié)劑化合物，其中，n是1或2，R是氫、?；?、烷基或肽片段，且X是芳族氨基酸或雜環(huán)氨基酸或其衍生物。2.如權(quán)利要求1所述的方法，3.如權(quán)利要求1所述的方法，4.如權(quán)利要求1所述的方法，5.如權(quán)利要求4所述的方法，6.如權(quán)利要求1所述的方法，所述化合物。7.如權(quán)利要求1所述的方法，述化合物。8.如權(quán)利要求1所述的方法，劑量施用所述化合物。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中以約0.001-lmg/kg受試者體重的劑量施用所述化合物。10.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述化合物為SCV-07。11.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述化合物為SCV-07。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中SCV-07的施用是以等滲溶液形式通過腸胃外給予日劑量為約0.01-lmgY-D-谷氨酰-L-色氨酸而實(shí)現(xiàn)。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中以至多約1.5mg的日劑量經(jīng)口施用SCV-07。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在約5-14天的療程中每天一次施用SCV-07。全文摘要本發(fā)明涉及治療、預(yù)防、抑制或減輕受試者的過敏性疾病或其影響的方法，其包括向所述受試者施用有效量的包含芳族氨基酸殘基或雜環(huán)氨基酸殘基或其衍生物的免疫調(diào)節(jié)劑化合物。優(yōu)選地，所述免疫調(diào)節(jié)劑化合物為包含D-色氨酸殘基或L-色氨酸殘基的二肽。文檔編號A61K38/00GK101678069SQ200880016455公開日2010年3月24日申請日期2008年5月13日優(yōu)先權(quán)日2007年5月17日發(fā)明者亞歷山大·A·科洛博夫,安德雷·S·辛比爾采夫申請人:?？她堉扑幑?