專利名稱：Pitman moore狂犬病病毒株對原代雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物的適應(yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，尤其是，涉及將Pitman moore狂犬病病毒株(PM株)適應(yīng)于純化的雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物以用于生產(chǎn)改良且高度純化的疫苗。具體而言，該適應(yīng)的PM狂犬病病毒株產(chǎn)生高病毒效價，并且按照每顆蛋的疫苗劑量計算能夠得到較高產(chǎn)量且具有高度免疫原性。

背景技術(shù)：
狂犬病是一種動物源性病毒疾病，可感染家養(yǎng)和野生動物。一旦出現(xiàn)該疾病癥狀，狂犬病對動物和人均是致死性的。然而，如果在暴露于病毒前或暴露于病毒后用狂犬病疫苗對個體進(jìn)行免疫接種，并用消毒劑與抗狂犬病的抗體徹底清洗創(chuàng)口，該個體通?？傻玫搅己玫谋Ｗo(hù)。人狂犬病疫苗由滅活或減毒的狂犬病疫苗制備，且自巴斯德時期至今已經(jīng)過了成功的改良。由巴斯德研制的最初的狂犬病疫苗是基于神經(jīng)組織的，且病毒通過干燥而滅活，但由于存在神經(jīng)組織或髓磷脂(myelin)，該疫苗具有激活該病毒和發(fā)生過敏性反應(yīng)的風(fēng)險。Fuezalida等人引入了由新生小鼠腦制備的無髓磷脂疫苗(Vaccines第四版，第37章，Plotkin，Rupprecht and Koprowski)。
隨后，研制了用于狂犬病的鴨胚疫苗(DEV)。用于狂犬病的DEV由在胚胎化鴨蛋中繁殖的病毒而制備。其免疫原性比腦組織疫苗要差。因此，對于DEV而言，推薦每天接種14-23次，而且有時在嚴(yán)重暴露后，如此高的劑量也不能保護(hù)個體免受狂犬病侵襲。(Vaccines第四版，第37章，第1018頁，Plotkin，Rupprecht andKoprowski)。另一個與DEV相關(guān)的缺陷是它也含有髓磷脂相關(guān)蛋白，可引起副反應(yīng)，因此后來被WHO禁用。因此，長久以來一直需要免疫原性較高并以低劑量且安全有效地應(yīng)用的，既可用于初次免疫也可用于暴露后治療的狂犬病毒疫苗。這些疫苗還能夠大大降低接種后反應(yīng)的次數(shù)和嚴(yán)重性。
由于組織/細(xì)胞培養(yǎng)疫苗的研制而滿足了這種需求。與前面所說的病毒的腦培養(yǎng)疫苗相比，細(xì)胞培養(yǎng)疫苗由于不存在神經(jīng)組織，因此不僅更加安全而且更加有效。為了獲得較高的免疫原性和安全性，現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了幾種基于細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗，如純化鴨胚疫苗(PDEV)、第一代疫苗如人二倍體細(xì)胞疫苗(Wiktor et al.，1964.J.Immunol.93353-366)and 2nd generation vaccines like Purified ChickEmbryo Cell Vaccine(PCECV)，Purified Vero Cell Rabies Vaccine，Rabies Vaccine Adsorbed(RVA)，and Primary Hamster Kidney CellVaccine(PHKCV)etc.(RefJIACM 2006；7(1)39-46)。
上述疫苗研制成功的技術(shù)進(jìn)展包括使Pitman moore狂犬病病毒株適應(yīng)于連續(xù)細(xì)胞系如Vero細(xì)胞(如，純化的Vero細(xì)胞狂犬病疫苗-AbhayrabTM&VerorabTM)和MRC-5人雙倍體培養(yǎng)細(xì)胞系[如印度的人雙倍體細(xì)胞疫苗(HDCV)-MIRV-HDC][RefJIACM 2006；7(1)39-46]或鴨胚中原位進(jìn)行適應(yīng)(如，純化的鴨胚疫苗-PEDV-Lyssavac N)。(RefLaboratory Techniques in Rabies；FourthEdition，Edi.by F.X.Meslin，M.M.Kaplan&H.Koprowski，WHOGeneva-1996)。
Vero和MRC-5細(xì)胞系都是連續(xù)細(xì)胞系，因此有必要檢測終產(chǎn)品中的細(xì)胞殘留DNA(Ref.歐洲藥典，2004)，因為其可能具有傳遞潛伏病毒和其他物質(zhì)的風(fēng)險。而且，即使采用PM株制備疫苗，通過Vero細(xì)胞得到的產(chǎn)量實際上也比較低。PDEV是一種混懸疫苗，因此該疫苗無法用于皮內(nèi)(ID)應(yīng)用。此外，該技術(shù)獲得的產(chǎn)量較低(每顆蛋1.8-2.2劑量)。處理時間也太長，需要88天。且市售PDEV疫苗采用防腐性硫柳汞，其可能與幼童自閉癥有關(guān)系(Refhttp://www.ncirs.usyd.edu.au/facts/f-thiomersal.html)。另外，生產(chǎn)PDEV的過程長而繁瑣，而且由于其產(chǎn)量低，因此不適于大規(guī)模生產(chǎn)。可以認(rèn)為HDCV是金標(biāo)準(zhǔn)疫苗，但其太過昂貴。因此，需要提供一種改良的高免疫原性狂犬病疫苗，其能提供較高產(chǎn)量，而且利用基于細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)，花費也不會那么昂貴。
US 4115195(Rudolph Barth et al.)描述了生產(chǎn)狂犬病疫苗的過程。其中教導(dǎo)了雞胚成纖維細(xì)胞以及其他培養(yǎng)的細(xì)胞株均可用來利用多種病毒來制備狂犬病疫苗，如VP11株、Pasteur株、PM株病毒或者包含F(xiàn)lury LEP株(低代株(low egg passage))或Flury HEP株(高代株(high egg passage))病毒的均質(zhì)化雞胚物質(zhì)。該專利還具體提供了利用狂犬病病毒固定株VP11、Flury HEP和Flury LEP感染雞胚成纖維細(xì)胞的實例。然而，該文獻(xiàn)未提及使Pitman moore株(Wistar株P(guān)M-HDCS、1503-3M)適應(yīng)于原代鴨胚成纖維細(xì)胞或原代雞胚成纖維細(xì)胞。而且，該專利發(fā)明中應(yīng)用的培養(yǎng)基是一種在US4115195中未闡明的獨特的組合培養(yǎng)基，其專為PM狂犬病病毒感染原代雞胚成纖維細(xì)胞而設(shè)計。
本發(fā)明已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)Pitman moore株能夠適應(yīng)于原代雞成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物。這種適應(yīng)提供了一種大量制備狂犬病疫苗的方法，其產(chǎn)量高且生產(chǎn)時間短，易于成規(guī)模。因為該疫苗不是混懸液，因此除了肌內(nèi)應(yīng)用(IM)，所生產(chǎn)的疫苗還將適合于皮內(nèi)應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，通過使Pitman moore適應(yīng)于原代雞成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物而制備的狂犬病疫苗比基于多種其他連續(xù)細(xì)胞系的狂犬病疫苗更加有利，且更加易于成規(guī)模以進(jìn)行大規(guī)模商業(yè)化疫苗生產(chǎn)。通過本發(fā)明所述方法生產(chǎn)的疫苗具有極高的產(chǎn)量、效力、安全性，而且當(dāng)優(yōu)選地利用PET TC轉(zhuǎn)瓶實施該方法時，該方法比已知用于制備狂犬病疫苗的多種其他方法更加經(jīng)濟(jì)有效。
本發(fā)明者已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，在合適的處理條件，如下文將詳細(xì)描述的，利用PET TC轉(zhuǎn)瓶，Pitman moore病毒可以在具有如其他文獻(xiàn)所述的獨特組合培養(yǎng)物的原代雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中嚴(yán)重感染。這些優(yōu)選實施方式提供了具有高產(chǎn)量、較高效價和免疫原性的疫苗，這使得該疫苗相對而言比較經(jīng)濟(jì)有效。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是使Pitman moore狂犬病毒株適應(yīng)于雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基以獲得狂犬病疫苗。
在本發(fā)明的一種實施方式中，提供了一種利用用于抗狂犬病活性免疫的Pitman moore株來生產(chǎn)具免疫原性且高度純化的雞胚細(xì)胞疫苗PM(下文稱為PCECVPM)的方法。
本發(fā)明的另一種實施方式是開發(fā)一種利用較簡單的方法獲得高產(chǎn)量疫苗的獨特方法。
在本發(fā)明的另外一種實施方式中，提供了一種適合的培養(yǎng)基組合物，以獲得Pitman moore株狂犬病病毒進(jìn)入雞胚成纖維細(xì)胞的高感染性。
本發(fā)明提供了一種將Pitman moore狂犬病病毒株適應(yīng)于雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。首先通過一次腦內(nèi)傳代使原始Pitmanmoore狂犬病病毒株(Wistar株P(guān)M-HDCS，1503-3M)適應(yīng)于小鼠，然后在鴨蛋中反復(fù)傳代，本發(fā)明人通過連續(xù)傳代進(jìn)一步使其適應(yīng)于鴨胚成纖維細(xì)胞，隨后通過利用適合的培養(yǎng)基以及其他適合的培養(yǎng)條件在原代雞胚成纖維細(xì)胞中進(jìn)一步連續(xù)傳代以獲得狂犬病疫苗。
本發(fā)明的另一個方面提供了一種獨特的組合培養(yǎng)基，以實現(xiàn)使得Pitman moore狂犬病病毒株較高且較嚴(yán)重感染地進(jìn)入純化雞胚成纖維細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個方面中，提供了一種利用PM狂犬病病毒株的滅活的純化雞胚細(xì)胞狂犬病疫苗，具有較高純度和免疫原性。



圖1示出了第5天時，03PM/鴨/S.Pas.07在鴨培養(yǎng)物中的狂犬病特異性熒光。
圖2示出了第5天時，04PM/雞/S.Pas.09在雞胚培養(yǎng)物(CEC)中的狂犬病特異性熒光。
圖3示出了第3天時，04PM/雞/S.Pas.10在雞胚培養(yǎng)物(CEC)中的狂犬病特異性熒光。
圖4示出了第3天時，04PM/雞/S.Pas.11在雞胚培養(yǎng)物(CEC)中的狂犬病特異性熒光。
圖5示出了第3天時，04PM/雞/S.Pas.12在雞胚培養(yǎng)物(CEC)中的狂犬病特異性熒光。
圖6本發(fā)明的實驗疫苗與多種市售狂犬病疫苗的比較。

具體實施例方式 本發(fā)明涉及在原代雞/鴨成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中適應(yīng)Pitmanmoore狂犬病病毒。所采用的蛋是SPF級雞蛋。SPF雞蛋和Pitmanmoore狂犬病病毒株是WHO批準(zhǔn)用于制造用于人狂犬病疫苗的底物和病毒株。在一種優(yōu)選實施方式中，利用PET TC轉(zhuǎn)瓶使PM狂犬病病毒株適應(yīng)于轉(zhuǎn)動培養(yǎng)物中的雞成纖維細(xì)胞，與其他幾種技術(shù)相比，其可得到較高的產(chǎn)量。
首先通過一次腦內(nèi)傳代使原始的Pitman moore株(Wistar株P(guān)M-HDCS，1503-3M)適應(yīng)于小鼠，隨后通過反復(fù)傳代而適應(yīng)于鴨蛋中。接下來，本發(fā)明人試圖開發(fā)一種使PM狂犬病病毒株適應(yīng)于原代鴨胚成纖維細(xì)胞的方法，發(fā)現(xiàn)僅有部分細(xì)胞被感染(圖1)。經(jīng)過幾次傳代，感染性未能增加至令人滿意的程度。
在例如US 4115195中已知足夠高的病毒效價是有效狂犬病疫苗的一個必要條件。因此，本發(fā)明人改變了其關(guān)注點，使病毒傳代在雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行。在幾次感染性和適應(yīng)性試驗后，在雞胚細(xì)胞中獲得了滿意的病毒效價結(jié)果(圖2至圖5)。
下文將適應(yīng)于鴨胚的原始“Wistar株P(guān)M-HDCS，1503-3M”稱為“主種子DE42/74Pas.12.12.11.1974”，其是用于生產(chǎn)PDEV疫苗的主種子。根據(jù)本發(fā)明所述，該“主種子DE42/74Pas.12.12.11.1974”狂犬病疫苗最初在鴨胚細(xì)胞中然后在原代雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中適應(yīng)和繁殖，以生產(chǎn)用于狂犬病的細(xì)胞培養(yǎng)PCEC疫苗(PCECVPM)。
最初，本發(fā)明人試圖通過反復(fù)傳代將“主種子DE42/74Pas.12.12.11.1974”適應(yīng)于原代鴨胚成纖維細(xì)胞。但是，因為原代鴨胚成纖維細(xì)胞不是PM狂犬病病毒的“天然”宿主，因此最初的實驗中本發(fā)明人不能得到任何感染，而且隨后的實驗中進(jìn)一步優(yōu)化也僅得到極少量感染。因此，對該方法進(jìn)行了明顯的改進(jìn)，將在原代鴨胚成纖維細(xì)胞中傳代改成了在適合的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下在原代雞胚成纖維細(xì)胞中傳代。PM狂犬病病毒株傳代入原代雞胚成纖維細(xì)胞中是一種獨特而非常規(guī)的情形，在本領(lǐng)域中尚未見報道，因為這些細(xì)胞不是PM狂犬病病毒株的“天然”宿主，本領(lǐng)域中技術(shù)人員也不能將其延伸視為常規(guī)技術(shù)。
在本發(fā)明中，將所述“主種子DE42/74Pas.12.12.11.1974”適應(yīng)于原代鴨胚成纖維細(xì)胞然后如下所述通過反復(fù)傳代適應(yīng)于雞胚成纖維細(xì)胞
傳代過程中獲得的多株病毒按照下列通用格式進(jìn)行命名“制備年份(例如“04”表示2004年)/Pitman moore株(PM)/在其中進(jìn)行傳代的底物(鴨或雞)/連續(xù)傳代次數(shù)/培養(yǎng)日期”。
用作主種子或工作種子的已適應(yīng)Pitman moore株通過用PM病毒(DE42/74Pas.12.12.11.1974)感染原代鴨胚成纖維細(xì)胞而得到，并于33-36℃進(jìn)行7次傳代以使該病毒株適應(yīng)于原代鴨胚成纖維細(xì)胞，從而得到“03PM/鴨/S.Pas.07；18.12.03”。對該“03PM/鴨/S.Pas.07；18.12.03”株進(jìn)一步通過至少4次傳代而感染進(jìn)入原代雞胚成纖維細(xì)胞中，得到主種子“04PM/雞/S.Pas.11；04.08.04”。人們可從主種子進(jìn)行1-5次傳代來制備用于商業(yè)化疫苗生產(chǎn)的工作種子。按照上述方法制備的工作種子批號的一個實例命名為“04PM/雞/S.Pas.12；25.12.04”。
從主種子“04PM/雞/S.Pas.11；04.08.04”得到的病毒具有至少106.5TCID50％/ml的峰效價。
在雞胚細(xì)胞中進(jìn)行連續(xù)傳代時，病毒效價成對數(shù)增加，表明該病毒具有穩(wěn)定的表型特征。
在每次傳代時，均通過標(biāo)記FITC的Ab結(jié)合物將培養(yǎng)物染色，并利用熒光顯微鏡檢測其感染性。得到用于感染性和培養(yǎng)的最佳和可重復(fù)性條件后，如在各種藥典中所描述的，最初通過熒光顯微鏡確認(rèn)該結(jié)果，然后通過幾次體外以及體內(nèi)檢測加以確認(rèn)。
所述病毒的適應(yīng)優(yōu)選利用PET TC轉(zhuǎn)瓶或多層TC瓶來實施。
為了進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪m應(yīng)，采用了幾種培養(yǎng)基及其成分的組合，下文借助實施例1進(jìn)行描述。本發(fā)明進(jìn)一步通過下列非限制性實施例進(jìn)行闡釋，所述實施例均代表實施本發(fā)明的優(yōu)選模式之一。應(yīng)該理解，可以在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員掌握的范圍內(nèi)進(jìn)行若干非創(chuàng)造性的改進(jìn)，并認(rèn)為這些改進(jìn)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例1選擇用于病毒適應(yīng)和處理優(yōu)化的培養(yǎng)基 選擇下列培養(yǎng)基進(jìn)行病毒適應(yīng)和處理條件的優(yōu)化。
●生產(chǎn)培養(yǎng)基1(PCM1) ●生產(chǎn)培養(yǎng)基2(PCM2) ●生產(chǎn)培養(yǎng)基(PCM) 上文提到的培養(yǎng)基包含以下成分

上述培養(yǎng)基進(jìn)一步以適當(dāng)濃度補(bǔ)充人血清白蛋白、水解明膠、碳酸氫鈉和抗生素溶液。
利用不同培養(yǎng)基進(jìn)行實驗后，比較其形成細(xì)胞單層和病毒感染程度的有效性。
取9-11天的胚胎，并用胰蛋白酶依次處理10-10-20分鐘。將細(xì)胞離心除去胰蛋白酶并同樣地重懸浮于PCM1、PCM2和PCM中。在不同實驗中，將3種培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)量均調(diào)整為約1.7×106個細(xì)胞/ml。所有實驗中均采用1∶1200稀釋的“03PM/鴨/S.Pas.07”病毒。每次實驗的吸附時間均為90分鐘。將已感染細(xì)胞接種于Greiner TC瓶和PET轉(zhuǎn)瓶中。并將來自TC瓶/轉(zhuǎn)瓶的代表性感染細(xì)胞接種在24孔TC板內(nèi)。將該TC瓶和轉(zhuǎn)瓶于34℃±1℃孵育5天。所述24孔板在3％CO2環(huán)境中于34℃±1℃孵育，并在第3天時用FITC結(jié)合物染色，檢測病毒感染程度，根據(jù)狂犬病特異性熒光分級為好(+)、很好(++)、極好(+++)或超好(++++)。
第4天或第5天，從每一組實驗收集細(xì)胞上清液作為第一次收獲物，并分別補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育后，自第一次收集的第2天、第3天或第4天，從每一組采取第二次收獲物。檢測第一次收獲物和第二次收獲物的病毒效價和無菌度。
結(jié)果發(fā)現(xiàn) ●通過狂犬病特異性免疫熒光評估，在24孔板中，在PCM1和PCM2中接種的細(xì)胞表現(xiàn)為差至好的感染，而在PCM中接種的細(xì)胞則表現(xiàn)為極好至超好的感染。
●與僅接種于PCM1和PCM2相比，用PCM接種的TC瓶/轉(zhuǎn)瓶表現(xiàn)出的效價為好。PCM1、PCM2和“PCM”中的效價值分別為105.6、105.8和107.7TCID50％。
根據(jù)上述不同實驗中的結(jié)果，選擇PCM培養(yǎng)基用于在原代雞胚成纖維細(xì)胞中進(jìn)行適應(yīng)，隨后的疫苗制備通過不同的處理條件并進(jìn)一步選擇適合的TC轉(zhuǎn)瓶而進(jìn)一步優(yōu)化，所述處理條件在本領(lǐng)域技術(shù)人員的掌握范圍內(nèi)。
用于制備主種子、工作種子和狂犬病疫苗生產(chǎn)的一般細(xì)胞培養(yǎng)步驟 用70-90％RH將雞蛋于35℃-37℃孵育8-11天。孵育后，透光檢查雞蛋以選擇存活且健康的胚胎。透光檢查后，在無菌條件下從每一個雞蛋取出胚胎，然后通過提拉法將頭和身體分離。隨后立即將頭丟棄，而將胚胎的身體部分投入瓶中，用無菌PBS清洗3至4次，并在35℃±2℃用預(yù)熱的胰蛋白酶處理10-40分鐘。
將胰蛋白酶處理過的細(xì)胞混懸液通過尼龍布進(jìn)行過濾，隨后以1000至1500rpm的速度在低溫離心機(jī)中離心10至15分鐘。將細(xì)胞沉淀混懸于新鮮的生長培養(yǎng)基中，使細(xì)胞充分混合，并以相同的方式再次離心該細(xì)胞混懸液。將該細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移到含上文所述培養(yǎng)基的無菌玻璃瓶中，并于35℃±2℃攪拌5-10分鐘。在20L的玻璃瓶中，利用培養(yǎng)基將最終的細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為1.4-2.2×106/ml的范圍。
該細(xì)胞混懸液以預(yù)定的最佳主種子或工作種子病毒稀釋度進(jìn)行接種，并于35±2℃緩慢攪拌下孵育90-120分鐘，以使病毒吸附于細(xì)胞。在吸附結(jié)束時，將感染的病毒混懸液分裝于PET TC轉(zhuǎn)瓶(300±50ml/TC轉(zhuǎn)瓶)或多層TC瓶如細(xì)胞工廠或細(xì)胞培養(yǎng)室(3000±500ml)或二者的組合。隨后于34.5℃±0.5℃孵育4-6天。在第4天或第5天，收集細(xì)胞上清液作為第一次收獲物，在第7或第8天實施第二次收集。各種病毒收獲物儲存于2℃-8℃。由于多次收集能得到更多具有良好效價的收獲物，因此使得本發(fā)明更加經(jīng)濟(jì)有效。
混合的病毒收獲物通過在蔗糖密度梯度區(qū)帶離心機(jī)中以35000rpm超速離心而純化和濃縮。蔗糖濃度在約35-40％之間時，狂犬病病毒的結(jié)合最好，含有活性活狂犬病病毒的蔗糖梯度/區(qū)帶作為產(chǎn)品組分而收集。將來自不同混合收獲物的產(chǎn)品組分病毒濃縮物于-60℃以下儲存直至實施各種測試，如體外Ag分析、無菌度檢測和細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的結(jié)果已經(jīng)比較清楚。
本發(fā)明還提供了一種滅活PM病毒以破壞其感染性而保留其抗原性的方法。將所述濃縮物于37℃解凍并于4±2℃冷卻。用疫苗穩(wěn)定劑稀釋該濃縮物以獲得適當(dāng)?shù)目乖?.5IU/ml，樣品回收用于體外Ag分析，如ABT、ELISA和SRD檢測。測量該混合物的pH并用10％w/v已事先滅菌的NaOH溶液的pH調(diào)至8.0±1。然后，將有效量的用PBS 1∶100稀釋的β-丙內(nèi)酯緩慢加入該混合物中，以達(dá)到1∶4000(0.025％)的終濃度，將容器中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到另一個已事先滅菌的滅活容器中。在持續(xù)攪拌下，于2-6℃與β-丙內(nèi)酯一起孵育。需要至少48小時以充分滅活病毒感染性而不喪失病毒抗原性。為了大規(guī)模培養(yǎng)時使工藝簡化，優(yōu)選于2-6℃進(jìn)行PM病毒的滅活過程。
最后將滅活的混合物儲存于5℃±3℃直至在持續(xù)攪拌下進(jìn)行進(jìn)一步處理。用適合的穩(wěn)定劑溶液稀釋該滅活的混合物，以將抗原值調(diào)為至少5IU/ml?；旌线^程中，將該混合物保持于5℃±3℃進(jìn)行攪拌。裝瓶之前，攪拌該混合疫苗30分鐘。按照本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行冷凍干燥。所采用的疫苗穩(wěn)定劑包含蔗糖、脫水明膠、人白蛋白和鈉鹽。疫苗制備成冷凍干燥型制劑，可用無菌注射用水進(jìn)行重建。
利用雞成纖維細(xì)胞制備的疫苗的效價和免疫原性與已利用多種動物安全性、效力和血清轉(zhuǎn)化性研究進(jìn)行評估的國際參考疫苗(International Reference Vaccine)(WHO 5th IRM)相同。此外，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證和比較最終產(chǎn)品的純度，類似于其他市售產(chǎn)品(圖6)。并且當(dāng)儲存于2℃-8℃時該產(chǎn)品非常穩(wěn)定。按照ICH的生物技術(shù)和生物學(xué)材料穩(wěn)定性指南，在加速和應(yīng)激溫度下其也能保持效力和其他關(guān)鍵參數(shù)。
實施例2將Pitman moore狂犬病病毒株適應(yīng)于原代鴨胚成纖維細(xì)胞以及將從中獲得的病毒連續(xù)適應(yīng)于原代雞胚成纖維細(xì)胞。
(A)首先通過1次腦內(nèi)傳代將原始Pitman moore狂犬病病毒株(Wistar株P(guān)M-HDCS，1503-3M)在瑞士白化體小鼠(Swiss AlbinoMice)體內(nèi)進(jìn)行適應(yīng)，隨后通過12次傳代在胚胎化鴨蛋中適應(yīng)，將得到的病毒命名為DE 42/74 Pas.1212.11.1974。本發(fā)明利用該病毒進(jìn)一步適應(yīng)于原代鴨胚成纖維細(xì)胞以及隨后的雞胚成纖維細(xì)胞。
實驗利用11-12天的SPF鴨蛋而實施。按照已知的技術(shù)，將細(xì)胞數(shù)量設(shè)定為1.8×106個細(xì)胞/ml，利用補(bǔ)充1.5％人白蛋白的生產(chǎn)培養(yǎng)基1(PCM 1，如上文所述)制備細(xì)胞混懸液。將一份5ml上述命名為“DE 42/74Pas.1212.11.1974”的冷凍病毒在37℃解凍，并稀釋于細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定劑中，用于感染鴨胚細(xì)胞混懸液。將感染的細(xì)胞混懸液裝入TC PET轉(zhuǎn)瓶中并于34℃孵育。感染后的第5天，從轉(zhuǎn)瓶采集收獲物并測試小鼠體內(nèi)的病毒效價以及是否存在諸如細(xì)菌和真菌等的污染物。所收獲的這些病毒命名為“02PM/鴨/S Pas.01”。
同樣的，進(jìn)一步在鴨胚細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行6次這樣的傳代，且每一次傳代后，均收集約7.0升的收獲物。每一次傳代后，均采集收獲物并測試小鼠體內(nèi)的病毒效價以及是否存在諸如細(xì)菌和真菌等的污染物。將每一次傳代的收獲物均進(jìn)一步分裝成5ml的等份，并如下命名。
在上述實驗過程中，初次傳代后，發(fā)現(xiàn)僅少量細(xì)胞感染且表現(xiàn)出狂犬病特異性熒光。從第4次傳代開始，病毒感染性逐漸并顯著增強(qiáng)。這可在下列圖表中示出
第7次傳代后，感染性幾乎恒定不變。嘗試了幾種備選方案但均未成功。出人意料的是，將病毒“03PM/鴨/S.Pas.0718.02.03”感染入雞胚成纖維細(xì)胞時，感染性顯著增強(qiáng)。根據(jù)該發(fā)現(xiàn)，如下文所述將該病毒株在雞胚成纖維細(xì)胞中進(jìn)一步傳代以獲得所需的感染性和病毒效價。
(B)約9-11天(180個胚胎)的已受精SPF雞蛋用于該過程，并將頭部與身體部分分離，僅處理身體部分而將頭部丟棄。用磷酸緩沖鹽反復(fù)沖洗所收集的身體部分，隨后利用胰蛋白酶溶液消化處理胚胎。在PCM中制備細(xì)胞混懸液，并將細(xì)胞數(shù)量設(shè)定為1.6×106個細(xì)胞/ml。將一等份5ml的“03PM/鴨/S.Pas.07”在37℃解凍，并稀釋于穩(wěn)定劑中。其用于感染該雞胚細(xì)胞混懸液。在緩慢攪拌下將該感染細(xì)胞混懸液于37℃孵育1.5小時。將該感染細(xì)胞分裝入轉(zhuǎn)瓶中以及多層TC瓶中，并于34℃孵育。在感染的第5天，從轉(zhuǎn)瓶和多層TC瓶采集約7升的收獲物，并以適當(dāng)?shù)确葸M(jìn)行分裝，將這些分裝的等份中的若干個5ml等份用于檢測小鼠體內(nèi)的病毒效價以及是否存在諸如細(xì)菌和真菌等的污染物。
將這些病毒收獲物命名為“04PM/雞/S.pas.08”。
隨后，在雞成纖維細(xì)胞中再進(jìn)行3次病毒的連續(xù)傳代，每一次均采集部分收獲物，并以5ml的等份分裝，如上所述進(jìn)行命名。對所有的代數(shù)均測試病毒效價以及是否存在細(xì)菌和真菌。
根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)，將第4次傳代后得到的病毒命名為“04PM/雞/S Pas.1104.08.04”，具有107.7LD50％病毒效價/ml，本發(fā)明認(rèn)為其可作為主種子病毒。該病毒再經(jīng)過一次傳代得到工作種子病毒“04PM/雞/S Pas.1225.12.04”。
實施例3從工作種子制備疫苗 通過一個類似于上文步驟1(b)中所述的過程，在雞成纖維細(xì)胞中感染該種子病毒“04PM/雞/S Pas.1225.12.04”，在第4天或之后得到第一次收獲物，第一次收集之后的2-3天獲得第二次收獲物。混合的病毒收獲物通過在蔗糖密度梯度區(qū)帶離心機(jī)中以35000rpm超速離心而純化和濃縮。在蔗糖濃度為約35-40％之間時進(jìn)行狂犬病病毒的結(jié)合，收集有活性的活狂犬病病毒作為產(chǎn)品組分。將來自不同混合收獲物的病毒濃縮物儲存于-60℃以下直至多個測試，如體外Ag分析、無菌度檢測和細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的結(jié)果已經(jīng)比較清楚。
將所述濃縮物于37℃解凍并于4℃±2℃冷卻。用疫苗穩(wěn)定劑稀釋該濃縮物以獲得適當(dāng)?shù)目乖?.5IU/ml，回收樣品用于體外Ag分析，如ABT、ELISA和SRD檢測。測量該混合物的pH并用10％w/v已事先滅菌的NaOH溶液將pH調(diào)至8.0±1。隨后利用已知技術(shù)加入適當(dāng)濃度的B-丙內(nèi)酯來滅活該混合物。
最后將滅活的混合物儲存于5℃±3℃同時持續(xù)攪拌，并用適合的穩(wěn)定劑溶液稀釋，以將抗原值調(diào)為至≥5IU/ml，并將該混合物保持于5℃±3℃攪拌30分鐘。將該混合物裝入瓶中，并利用包含蔗糖、脫水明膠、人白蛋白和鈉鹽的疫苗穩(wěn)定劑使其穩(wěn)定化。疫苗制成可用的冷凍干燥型制劑，可用無菌注射用水進(jìn)行重建。
該疫苗的免疫原性和效價如下進(jìn)行檢測 實施例4小鼠體內(nèi)的NIH效價檢測 小鼠體內(nèi)的NIH效價檢測按照狂犬病實驗室技術(shù)(LaboratoryTechniques in Rabies，WHO’1996)第四版以及印度藥典來實施。
通過比較保護(hù)小鼠免受致死量腦內(nèi)狂犬病毒侵襲所需的實驗疫苗劑量與給與相同保護(hù)所需的相應(yīng)參考疫苗(WHO 5thIRM，16.0IU/安瓿)劑量來確定狂犬病疫苗的效價。
采用體重約12-15g的瑞士白化體小鼠。

將一種劑量的國際參考疫苗重建于2.0ml注射用水中，將其中的0.5ml與12ml磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底混勻得到25倍稀釋液。
將來自至少每一批次(shelf)的本發(fā)明所述冷凍干燥的實驗疫苗中的一種劑量分別重建于1.0ml注射用水中，然后混合到一起。取出0.5ml與12ml PBS徹底混勻，以得到25倍稀釋液。
接下來，在PBS(pH 7.4)中制備國際標(biāo)準(zhǔn)和實驗疫苗的3-5倍稀釋液。如此選擇稀釋范圍是為了獲得包含足夠的中間稀釋度以保護(hù)50％研究用小鼠的疫苗，病毒的激發(fā)劑量為10-50LD50。稀釋度范圍1∶25、1∶125、1∶625、1∶3125對于兩種疫苗即標(biāo)準(zhǔn)以及實驗疫苗均能發(fā)揮有效作用。
首次免疫接種的過程中，通過腹膜內(nèi)途徑對16只小鼠(8只雄性+8只雌性)注射0.5ml的每一種稀釋液，首次免疫接種7天后，進(jìn)行第二次免疫接種，重復(fù)第一次免疫接種的步驟。
對已免疫小鼠的病毒激發(fā)(感染) 第一次免疫接后14天，所有小鼠均感染激發(fā)病毒標(biāo)準(zhǔn)(Challenge Virus Standard，CVS)的腦懸液；將劑量調(diào)整為10-50LD50。
實驗動物的觀察 觀察感染小鼠14天。注意到感染5天后出現(xiàn)小鼠死亡。
效價的計算 通過REED和MUENCH法進(jìn)行計算效價。發(fā)現(xiàn) ●所述測試和標(biāo)準(zhǔn)疫苗的ED50值均在給予實驗動物的最高與最低劑量之間。
●所述激發(fā)混懸液的效價表現(xiàn)為0.03ml包含10-50LD50，接受該強(qiáng)度混懸液的所有動物均應(yīng)出現(xiàn)死亡。
顯著性水平(p＝0.95)的置信區(qū)間不低于所計算的效價的25％且不超過400％。
最終結(jié)果列表如下
從上述實驗可以得知，實驗疫苗的平均效價是5.43IU/劑。每一次檢測的95％置信區(qū)間均為所計算效價的25-400％。每一次檢測中應(yīng)用的激發(fā)病毒劑量(CVD)均在10-50LD50之間。每一次檢測中應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)和測試疫苗的ED50均處于最高和最低稀釋度之間。因此，可得出結(jié)論認(rèn)為，該疫苗具有免疫保護(hù)性，且NIH效價值遠(yuǎn)高于所需要的最小劑量2.5IU/劑。
實施例5兔體內(nèi)的血清轉(zhuǎn)化和激發(fā)研究 根據(jù)小鼠體內(nèi)血清轉(zhuǎn)化/激發(fā)研究的陽性結(jié)果，設(shè)計了一種組合研究來確定兔體內(nèi)的血清轉(zhuǎn)化和保護(hù)。采用體重約1.5-2.5kg的新西蘭白兔，每組包括5只雄兔和5只雌兔。
根據(jù)WHO 5th IRM，于2ml無菌注射用水中重建得到8IU/ml的濃度，作為參考疫苗。將本發(fā)明所述實驗疫苗重建于1ml無菌注射用水中。
第0天和第7天，對每一組中的所有兔子均肌內(nèi)注射0.5ml每一種疫苗，觀察14天。第14天時，從每一只兔的耳緣靜脈無菌抽取2ml血液，并37℃孵育1小時使其凝血。將血液樣品以1500rpm離心10分鐘分離血清，并將血清無菌收集于事先滅菌的試管/冷凍管中。將樣品于56℃熱滅活30分鐘，并儲存于-60℃以用于進(jìn)行進(jìn)一步的效價測定。
通過RFFIT和MNT測定每一個樣品的抗體效價。接下來，全部兔均在靜脈麻醉(硫噴妥納)的情況下用30MLD50/0.3ml激發(fā)病毒標(biāo)準(zhǔn)(CVS-27)進(jìn)行腦內(nèi)激發(fā)，觀察兔14天，看是否出現(xiàn)狂犬病特異性癥狀和死亡情況。直至第5天的死亡可認(rèn)為是非特異性死亡。
觀察 我們觀察到，任何一組中的兔均未表現(xiàn)出狂犬病特異性癥狀，也均未死亡。從表格可以推斷，測試疫苗的免疫原性類似于參考疫苗。
兔體內(nèi)的血清轉(zhuǎn)化 組I參考狂犬病疫苗(WHO 5th IRM)
組II實驗測試疫苗(PCEC狂犬病疫苗)
推論 根據(jù)實驗測試疫苗(RFFIT和MNT分別測得的平均值為8.2和10.87)和參考疫苗(RFFIT和MNT分別測得的平均值為8.51和10.06)得到的抗體效價，可以推斷本發(fā)明所述實驗疫苗與參考疫苗的免疫原性相同。
因此，我們可以從激發(fā)后獲得的結(jié)果得到結(jié)論就免疫原性和效價而言，根據(jù)本發(fā)明所述方法制備的PCEC疫苗(實驗疫苗)與參考標(biāo)準(zhǔn)具有同等保護(hù)性。
實施例6本發(fā)明所述實驗疫苗與各種市售狂犬病疫苗的比較 利用已知標(biāo)記物，實施SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析來檢測并比較實驗性狂犬病疫苗的蛋白結(jié)合與其他市售產(chǎn)品的蛋白結(jié)合。
從該研究觀察到(圖6)，當(dāng)如同其他市售狂犬病疫苗一樣配制時，本發(fā)明所述病毒濃縮物表現(xiàn)出同樣的蛋白條帶。
在圖6中， 泳道1低分子量標(biāo)記物； 泳道2本發(fā)明的API； 泳道3如其他市售PCEC狂犬病疫苗一樣配制的本發(fā)明API； 泳道4市售PCEC狂犬病疫苗； 泳道5基于Vero細(xì)胞系的市售狂犬病疫苗； 泳道6如其他市售Vero狂犬病疫苗一樣配制的本發(fā)明API。
權(quán)利要求
1.Pitman moore狂犬病病毒株對用于狂犬病疫苗的生產(chǎn)的原代雞成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適應(yīng)方法，其中，所述方法包括以下步驟
a)在適合的培養(yǎng)基中，通過合適次數(shù)的傳代使Pitmanmoore狂犬病病毒株適應(yīng)于原代鴨胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物；
b)隨后，在適合的培養(yǎng)基中，通過合適次數(shù)的傳代使所述病毒適應(yīng)于原代雞成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適應(yīng)方法，其中，所述Pitman moore狂犬病病毒株是“DE 42/74 Pas.1212.11.1974”。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的Pitman moore狂犬病病毒株，其是通過將Wistar株P(guān)M-HDCS，1053-3M在鴨蛋中傳代而獲得的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2(a)所述的適應(yīng)方法，其中，所述Pitman moore狂犬病病毒株首先通過至少7次傳代而適應(yīng)于原代鴨胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2(b)所述的適應(yīng)方法，其中，所述Pitman moore狂犬病病毒株通過至少4次傳代而適應(yīng)于原代雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法，其中，所采用的所述培養(yǎng)基是如說明書中所描述的PCM。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含人血清白蛋白、水解明膠、碳酸氫鈉和適合的抗生素溶液。
9.前述權(quán)利要求中任一項所述的適應(yīng)方法，其中，所述細(xì)胞數(shù)量保持在1.4-2.2×106個細(xì)胞/ml的范圍內(nèi)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的適應(yīng)方法，其中，所述適應(yīng)在PET TC轉(zhuǎn)瓶或多層TC瓶中完成。
11.一種原代雞成纖維細(xì)胞，通過權(quán)利要求1中所述的方法用Pitman moore狂犬病病毒進(jìn)行適應(yīng)。
12.通過權(quán)利要求1和2所述的方法由在原代雞胚成纖維細(xì)胞中適應(yīng)的Pitman moore株制備狂犬病疫苗的方法。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，包括以下步驟
-通過權(quán)利要求1和2所述的方法使Pitman moore狂犬病病毒株適應(yīng)于原代雞胚成纖維細(xì)胞，以獲得主種子；
-通過進(jìn)一步將所述主種子在原代雞胚成纖維細(xì)胞中傳代1-5次而制備工作種子；
-在PCEC培養(yǎng)基中，由所述工作種子生產(chǎn)病毒；
-濃縮并純化所述病毒；
-滅活所述病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法制備的狂犬病疫苗，其可進(jìn)一步凍干。
15.一種狂犬病疫苗，包含根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法制備的滅活Pitman moore病毒。
16.一種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法制備的滅活狂犬病疫苗和適合的賦形劑。
17.一種免疫哺乳動物受試者的方法，包括將根據(jù)前述權(quán)利要求制備的疫苗給予所述哺乳動物受試者。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述疫苗在暴露于致病性狂犬病病毒之前給予。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述疫苗在暴露于可引起狂犬病感染的動物咬傷之后給予。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述受試者是人。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述受試者是家養(yǎng)或野生動物。
22.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法制備的疫苗用于治療人和動物中的狂犬病的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及Pitman moore狂犬病病毒株對用于生產(chǎn)狂犬病疫苗的原代雞成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法。
文檔編號A61K39/205GK101730544SQ200880023072
公開日2010年6月9日 申請日期2008年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月3日
發(fā)明者普拉迪普·馬詹拉勒·帕特爾, 潘卡杰·拉曼巴伊·帕特爾 申請人:卡迪拉保健有限公司