国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333位氨基酸突變株的制作方法

      文檔序號:576645閱讀:835來源:國知局
      專利名稱:狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333位氨基酸突變株的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬于重組病毒疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒 疫苗株,其表達的狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣?氨酰胺Q。更具體地,本發(fā)明涉及狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸突變株 rLEP333Q。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述突變株的方法,以及所述突變株的應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      狂犬病即瘋狗癥,又名恐水癥,是由狂犬病病毒引起的、侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性 病毒性人獸共患性傳染病。幾乎所有的溫血動物都對狂犬病病毒易感。犬類動物在傳播人 狂犬病過程中起主要作用,是本病的主要宿主之一。此外,貓、浣熊、狐貍和蝙蝠等也會患病 并傳播病毒??袢鞑ネ緩街饕峭ㄟ^動物咬傷后,唾液中的狂犬病病毒經(jīng)破損皮膚侵 入機體。此外,還可通過消化道、呼吸道以及動物密切接觸等途徑傳播??袢∈瞧駷橹?人類病死率最高的急性傳染病,一旦發(fā)病,病死率可高達100%??袢∈且环N很重要的人 畜共患病,在世界范圍內(nèi)每年約有60,000余人死于狂犬病[1],引起嚴重的公共健康問題, 主要分布在亞洲、非洲和拉丁美洲等發(fā)展中國家。中國也是受狂犬病危害最為嚴重的國家 之一??袢〉念A(yù)防主要通過疫苗免疫的方式進行??袢∫呙绶N類繁多,效果不一。 自從1940年,Koprowski等人從病死女孩腦內(nèi)分離到狂犬病病毒Flury株,經(jīng)1日齡雛雞 腦內(nèi)、雞胚卵黃囊傳代后,再經(jīng)雞胚傳代178代以上,無論神經(jīng)內(nèi)、外接種都對動物喪失致 病力,但對于新生乳鼠和猴在腦內(nèi)接種時仍具有殘留毒力。在雞胚傳代68代以前的稱為 “LEP” (雞胚低代株),高于136代的稱為“HEP” (雞胚高代株)。Flury-LEP株具有優(yōu)良的 免疫原性,被廣泛用作人或動物的狂犬病滅活疫苗種毒株,還被包括中國在內(nèi)的許多國家 用作預(yù)防犬狂犬病的弱毒疫苗??蒲泄ぷ髡咭恢辈婚g斷地對狂犬病疫苗進行改進和創(chuàng)新, 取得了豐碩的成果,但仍然存在很多不足。我國目前生產(chǎn)ERA株和Flury株活疫苗??袢?病弱毒疫苗在體內(nèi)的增殖過程與病原感染機體的過程相似,能誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞免疫和體液免 疫,且產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較強,持續(xù)時間較長,在我國狂犬病防治工作中曾起到一定的積極作 用。但有的疫苗毒株本身對乳鼠致病,對懷孕動物、免疫機能不全的動物和幼小動物使用不 安全,而且存在毒力回升、返祖的潛在危險。因此,存在獲得更加安全的減毒活病毒疫苗株 的需要??袢〔《緦儆趶棤畈《究?、狂犬病毒屬,為不分節(jié)段單股負鏈RNA病毒,其基因 組長約12kb,共編碼5個結(jié)構(gòu)蛋白核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、囊膜糖蛋白(G) 和RNA聚合酶(L)。囊膜糖蛋白G(簡稱糖蛋白或G蛋白)是狂犬病病毒最主要的致病因 子[2’3]。G蛋白主要功能包括,與細胞表面受體相互作用以介導(dǎo)病毒快速侵入細胞[4’5’6],與 RNA-NP-M復(fù)合物相互作用使病毒出芽[7]。G蛋白的表達水平必須控制在一定的水平以防止 對感染神經(jīng)細胞的功能性破壞[3]。多項研究表明G蛋白第333位為影響病毒毒力的關(guān)鍵位
      占[2,8,9,10] W、O
      Flury-LEP雖然已高度致弱,對狗沒有致病性,但是腦內(nèi)接種小鼠仍致死,且G蛋 白第333位仍是R。本研究采用負鏈RNA病毒反向遺傳(reverse genetics)操作技術(shù),對 Flury-LEP G蛋白第333位R進行人工突變,預(yù)期獲得進一步致弱的狂犬病弱毒疫苗株。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明屬于重組病毒疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒 疫苗株,具體地,所述突變?nèi)醵疽呙缰瓯磉_的狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨 基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨0稱。更具體地,本發(fā)明涉及狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白 (G)第333位氨基酸突變株rLEP333Q,其中所述狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位 氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨0稱。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述突變株的方法,以及所述突變 株的應(yīng)用。在第一方面中,本發(fā)明構(gòu)建了 Flury-LEP全長基因組cDNA (SEQ IDN0:1)克隆 pCI-LEP 和 cDNA 片段克隆 pCI_F2,pCI_F3,pCI_F31,pBlue-Fl,pBlue_F2 和 pBlue_F3,以 及轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒系統(tǒng)pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG_L,所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒分別包括編碼狂犬病 病毒Flury-LEP核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因的開放閱讀框架(ORF)的 cDNA序列。在第二方面中,本發(fā)明利用第一方面構(gòu)建的Flury-LEP全長基因組cDNA片段克隆 pBlue-F2和pCI-F31,設(shè)計帶有糖蛋白(G)第333氨基酸位點突變(R333Q)的PCR引物,成 功構(gòu)建了 Flury-LEP G333突變?nèi)L基因組cDNA重組載體pCI_LEP333Q。在所述重組載體 PCI-LEP333Q中,編碼狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)的核苷酸包含堿基突變,使得糖蛋白 (G)第333位氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨0稱。然而,本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解,用于構(gòu)建狂犬病病毒Flury-LEP全長基因組 cDNA重組載體以及構(gòu)建Flury-LEP G333突變?nèi)L基因組cDNA重組載體的質(zhì)粒包括,但不 限于,PCI,只要攜帶CMV啟動子的質(zhì)粒都可以用于本發(fā)明,例如,pCAGG等。利用攜帶CMV 啟動子的質(zhì)粒的優(yōu)點在于,攜帶CMV啟動子的質(zhì)粒利用細胞內(nèi)的RNA聚合酶II進行轉(zhuǎn)錄, 而無需傳統(tǒng)的T7聚合酶系統(tǒng),因此理論上可以在任何真核細胞系中拯救病毒。另外,本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解,本發(fā)明第一方面和第二方面所述的構(gòu)建狂犬 病病毒Flury-LEP全長基因組cDNA突變重組載體的策略可以適用于構(gòu)建在Flury-LEP全 長基因組cDNA中引入任何突變的重組載體。在第三方面中,本發(fā)明利用構(gòu)建的Flury-LEP G333突變?nèi)L基因組cDNA重組載 體PCI-LEP333Q,和輔助質(zhì)粒系統(tǒng)pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG_L,在293T細胞中拯救了突變的 重組病毒株rLEP333Q。在第四方面中,本發(fā)明鑒定了突變株rLEP333Q的生物學(xué)活性。本發(fā)明人檢測了野 生株LEP(WtLEP)和突變株rLEP333Q在神經(jīng)元細胞NA和非神經(jīng)元細胞BHK-21上的生長動 力學(xué)曲線,如圖3所示,rLEP333Q在兩種細胞上的生長性能與wtLEP沒有顯著差異,這表明糖 蛋白(G)第333位的精氨酸R突變?yōu)楣劝滨0稱后并不影響其生長特性。此外,本發(fā)明人 還檢測了 wtLEP、突變株rLEP333Q和無毒株HEP的嗜神經(jīng)指數(shù),結(jié)果顯示在表4中,wtLEP的 嗜神經(jīng)指數(shù)為0. 8,而rLEP333Q的嗜神經(jīng)指數(shù)已下降與無毒株Flury-HEP —樣接近于零。最 后,本發(fā)明人還檢測了 wtLEP、rLEP333Q以及HEP對小鼠的致病性,測定了 wtLEP和rLEP333Q的LD5tl,分別為8. 8個FFU和80個FFU。結(jié)果表明,rLEP333Q突變病毒株腦內(nèi)接種小鼠感染 仍致死,但與wtLEP相比,喪失了體外嗜神經(jīng)性,致病性略微下降。這表明本發(fā)明的狂犬病 病毒突變株rLEP333Q作為更安全的活毒疫苗應(yīng)用的潛力。在第五方面中,本發(fā)明提供上述生產(chǎn)突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株的方 法,所述方法包括(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒,所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括在其中引入狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白 (G)第333位氨基酸突變的狂犬病病毒Flury-LEP全長基因組cDNA序列;(2)構(gòu)建一個或多個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒,所述輔助質(zhì)粒包括編碼狂犬病病毒 Flury-LEP核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因的開放閱讀框架(ORF)的cDNA 序列;(3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染允許狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗 復(fù)制的宿主細胞,培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細胞;(4)收獲上清液,鑒定突變病毒株。在一個優(yōu)選實施方案中,所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒為pCI-LEP333Q,在所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中,編碼狂 犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)的核苷酸包含堿基突變,使得糖蛋白(G)第333位氨基酸 由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨0稱。所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。所述 宿主細胞是真核細胞。在第六方面中,本發(fā)明提供狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸突 變病毒株rLEP333Q的應(yīng)用,所述突變株rLEP333Q可以用作高安全性的活毒疫苗,其可以單獨 或與其它疫苗一起使用,還可以作為口服疫苗,對野生動物進行投食免疫,也可以在滅活后 進一步用于人免疫,等等。在第七方面中,本發(fā)明提供Flury-LEP G333突變?nèi)L基因組cDNA重組載體的應(yīng) 用,其可以作為狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)進行進一步的應(yīng)用,例 如,其可以對除G蛋白333位氨基酸以外的Flury-LEP株基因組毒力相關(guān)的其它位點進行 定點突變修飾,以研究不同毒力相關(guān)位點間的作用,尋找安全性更好的活毒疫苗;還可以在 所述病毒基因組插入導(dǎo)致病毒減毒或增強免疫反應(yīng)的外源基因,插入額外的G基因以增強 免疫原性,或者從基因組中刪除某個完整的病毒基因,使病毒無法繁殖而失去毒力。因此, 本發(fā)明的狂犬病病毒Flury-LEP G333突變?nèi)L基因組cDNA重組載體還可以用于構(gòu)建表達 犬瘟熱等其它重要病原保護性免疫原的重組病毒,研制出可同時預(yù)防狂犬病及犬瘟熱等其 它疫病的重組二聯(lián)活載體疫苗。


      從下面結(jié)合附圖的詳細描述中,本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯,其中圖1顯示狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株全長基因組cDNA的重組載體pCI_LEP的 構(gòu)建示意圖。圖2顯示向編碼LEP G蛋白的基因中引入點突變,構(gòu)建rLEP333Q。(A)rLEP和 rLEP333Q的基因組圖示;(B)左圖間接免疫熒光檢測拯救病毒rLEP333Q感染BHK-21細胞, 右圖陰性對照,以陰性血清(即,沒有狂犬病病毒抗體的血清)為一抗觀察IFA結(jié)果;(C) 重組病毒基因組RNA經(jīng)RT-PCR擴增,用BECKMAN CEQ 8000自動測序儀進行測序,測序顯示病毒基因組內(nèi)的堿基由GG突變?yōu)锳A,突變部分用邊框表示。圖3顯示野生型LEP (wtLEP)和突變的rLEP333Q在NA細胞(A)和BHK-21細胞⑶ 上的生長動力學(xué)曲線。圖4顯示pCI系列質(zhì)粒(A)、pCAGG質(zhì)粒(B)和pBluescriptSK+質(zhì)粒(C)的圖譜。
      具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解,所述實施例只是舉例說明 的目的,并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。實施例1狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333位氨基酸突變株的構(gòu)建及其生物學(xué) 活性鑒定1 材料1. 1質(zhì)粒、細胞株和病毒質(zhì)粒pCAGG、pCI_RBz購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所,pBluescriptSK (+) 購自 clonetech。BHK-21 細胞(ATCC CC1-10),293T 細胞(CRL-11268)購自 ATCC,培養(yǎng)基均 為含10%胎牛血清的DMEM(購自GIBC0)。小鼠腦神經(jīng)瘤細胞NA細胞來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的MEM(購自GIBC0)??袢〔《綟lury-LEP 和HEP購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心,在BHK-21細胞上擴 增,-70°C凍存?zhèn)溆谩?.2主要試劑和儀器T4 DNA連接酶,限制性內(nèi)切酶Sph I,Mlu I等均購自TaKaRa公司。Phusion 超保真DNA聚合酶。SuperScript III反轉(zhuǎn)錄試劑盒、無血清培養(yǎng)基Opti-MEM,轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000均購自Invitrogen公司。犢牛血清購自Gibco公司。LB培養(yǎng)基成 分均購自O(shè)XOID公司。膠回收試劑盒(Gel Extraction Mini Kit)及質(zhì)粒小量提取試劑盒 (Plasmid Mini Kit)均購自O(shè)MEGA公司。質(zhì)粒中量提取試劑盒QIAfilter Plasmid Midi Kit購自QIAGEN公司。鼠抗狂犬病病毒高免血清由本研究室制備。FITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光 二抗購自Sigma公司。普通顯微鏡,購自O(shè)LYMPUS公司;熒光顯微鏡,購自ZEISS公司。PCR 儀購自Applied Biosystem公司。核酸測序采用BECKMAN CEQ 8000自動測序儀,所用試劑 為BECKMAN公司產(chǎn)品。P2級生物安全柜購LABC0NC0自公司。二氧化碳培養(yǎng)箱購自Thermo Electron公司。不同型號離心機均購自BECKMAN公司。-70°C超低溫冰箱購自NBS公司。 普通冰箱冰柜購自海爾公司。全自動凈水機MILI-Q購自BIOCEL公司。各種規(guī)格細胞培養(yǎng) 瓶及細胞培養(yǎng)板均購自CORNING公司。1.3 引物參照Gene Bank中所提供的Flury-HEP株基因組序列(Gene Bank序列號 AB085828),和 Flury-LEP 基因序列(Gene Bank 序列號 DQ099524,F(xiàn)lury-LEP 全長基因組 cDNA序列見SEQ ID NO 1),將Flury-LEP基因組分為3段(即,F(xiàn)l,F(xiàn)2和F3)分別設(shè)計PCR 引物。其中,片段Fl為Flury-LEP基因序列的1-4063核苷酸序列(SEQ ID N0:2),片段F2 為Flury-LEP基因序列的4013-8254核苷酸序列(SEQ ID NO :3),片段F3為Flury-LEP基 因序列的8187-11925核苷酸序列(SEQ ID NO :4)。構(gòu)建全長基因組cDNA所用引物(表1) 和構(gòu)建輔助質(zhì)粒所用引物(表2)均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)Flury-LEP基因組序列,設(shè)計將G蛋白第333位精氨酸突變?yōu)楣劝滨0返囊?表3),突變堿基用邊框 表示,所述引物也由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。表IRT-PCR和全長基因組cDNA構(gòu)建所用的引物
      引物名稱引物序列
      GTTAA^PrCTGAfdTG 丁CCdfdACJCMUdmCTAT^UdA/^CKMjiffddJW F1-PF .^G7rACGCTTAACAACAAAACCAAAGAA-3'
      Fl-PR 5'- GGCACGCGTACTCCACATAACTTGAGTTTGC -3' F2-PF 5'- AGGCCTGTATAAGTCTTTAAAGGGAGCA -3' F2-PR 5'- ATCGGGGTTCCCGGCCTCTTGACACAAC -3' F3-PF 5'- TATGCTAGCTCTGGTTAAGCTCCCACGAATC -3'
      F3-PR 5'-ATACCC/i CCGCGA GG AGGTGG A GA TGCCA TGCCGA CCCACGCTTAACAAATAAACAATAA AG -3'______注cDNA片斷與圖1相一致。下劃線部分為病毒特異序列,黑體表示酶切位點,錘 頭狀核酶(HamRz)和丁肝病毒核酶(HdvRz)用斜體表示。表2輔助質(zhì)粒構(gòu)建所用的引物
      引物名稱
      L-N- PF L-N - PR L-P 一 PF L-P - PR L-L-PF L-L-PR
      引物序列
      5'- GGCGAATTCGCC/jCCATGGATGCCGACAAGATTGT -3' 5'- CCGGGTACCTC囚TTATGAGTCACTCGAATACG -3' 5'- GGCGAATTCGCC/^CCATGAGCAAGATCTTTGTTAA -3'
      5'- CCGGGTACCTCATTAGCATGATGTGTAGCGATCC -3'
      5'- GGCGAATTCGCC/jCCATGCTGGATCCGGGAGAGGTTTA -3' 5'- CCGGGTACC|TTA|TTACAAACAACTC}TAGTCTA -3' 注下劃線部分為病毒特異序列,黑體表示酶切位點,突變堿基用字符邊框表示, Kozak序列用斜體表示。 表3G333定點突變所用的引物
      引物名稱
      引物序歹Ij
      F2-PF RtoQ-PR
      RtoQ-PF F2-PR
      5·- AGGCCTGTATAAGTCTTTAAAGGGAGCA -3'(丨司表 1 中F2-PF)
      5'-TCAAACACCCTTTTGAGGGGATGATCTCATTCCAGGTfTT|GGACAGACTTG
      TAGTGAGCATCAGCCTCCATCAAGGT-3'
      5'-GTCTGTCC|A^CCTGGAATGAGATCATCCCCTCAAAAGGGTGTTTGA-3' 5'- ATCGGGGTTCCCGGCCTCTTGACACAAC -3' (iwj表 1 中F2-PR)
      注突變堿基用字符邊框表示。
      1. 4構(gòu)建Flury-LEP基因組全長cDNA克隆和cDNA片段克隆以及輔助質(zhì)粒系統(tǒng)
      7
      1.4. 1病毒基因組的提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR取Flury-LEP病毒液250 μ L,加入750 μ L Trizol,經(jīng)常規(guī)方法提取基因組RNA。 提取的RNA用SUperSCriptTMIII反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(反轉(zhuǎn)錄引物見表1)按該 試劑盒說明書進行操作,獲得末端部分重疊的3個病毒cDNA片段Fl、F2和F3片段。1. 4. 2RT-PCR 產(chǎn)物的克隆整個基因組分為末端部分重疊的3個片斷進行RT-PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳,使用膠回收試劑盒(購自O(shè)MEGA公司)回收Fl、F2和F3片段,分別克隆至 pBluscript IIKS (+/-) (Clontech)的EcoR ν位點,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5 α,選擇并提取陽 性質(zhì)粒pBlue-Fl,pBlue-F2和pBlue_F3,測序確保克隆的基因組片段與病毒基因組RNA序 列完全一致(具體方法見《分子克隆試驗指南》,J.薩姆布魯克編,2008年第三版,科學(xué)出版 社譯)。1. 4. 3Flury-LEP基因組全長cDNA克隆和cDNA片段克隆的構(gòu)建利用基因組cDNA片段F1、F2和F3相鄰重疊部分存在的限制酶切位點進行連接組 裝(示意圖見圖1)。具體地,首先將F3段cDNA經(jīng)Nhe I和Rsr II位點克隆進pCI-RBz,所得 質(zhì)粒命名為PCI-F3,再將Fl段經(jīng)Nhe I和Mlu I插入到pCI_F3,所得質(zhì)粒命名為pCI_F31。 最后將F2段經(jīng)Sph I和Mlu I克隆進pCI-F31,至此Flury-LEP全基因組cDNA組裝完成, 構(gòu)建成的病毒基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒命名為pCI-LEP。該克隆在CMV啟動子之下、兩個核酶之間的全長cDNA可以在真核細胞RNA聚合酶 的作用下得到轉(zhuǎn)錄,并且由于核酶的自身催化功能,可以保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3'末端與病毒基 因組精確一致。1. 4. 4構(gòu)建轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒系統(tǒng)以pCI-LEP為模板,PCR擴增編碼核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因 的開放閱讀框架(ORF) cDNA序列(核苷酸序列分別為SEQ ID NOs :5_7,引物序列見表2), 分別克隆在PCAGG質(zhì)粒的多克隆位點(MCS)。在起始密碼子前引入Kozak序列(GCCACC),以 增強蛋白表達[3’4];在原有終止密碼子后增加一個終止密碼子,以有效終止輔助質(zhì)粒mRNA 的轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建成的輔助質(zhì)粒分別命名為pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG_L。1. 5 G333突變?nèi)L基因組的構(gòu)建以在1. 4. 2中構(gòu)建好的pBlue-F2為模板,分別以F2-PF和RtoQ-PR、RtoQ-PF和 F2-ra為引物分別進行PCR擴增,將2個PCR產(chǎn)物回收后,再以2個PCR產(chǎn)物為模板,以F2-PF 和F2+R為引物進行PCR擴增出全長的F2’片段(含有G蛋白333位氨基酸突變,由精氨 酸R突變?yōu)楣劝滨0稱)。將PCR產(chǎn)物克隆至pBluscript IIKS(+/_)的多克隆位點,將陽性 克隆質(zhì)粒pBlue-F2’ (G333Q)進行測序,確保突變成功以及克隆的基因組片段與病毒基因組 RNA序列完全一致。最后將G333R突變?yōu)镼的F2’段經(jīng)Sph I和Mlu I克隆進在1. 4. 3中已 構(gòu)建好的PCI-F31,至此Flury-LEP G333突變?nèi)蚪McDNA組裝完成,構(gòu)建成的病毒基因 組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒命名為pCI-LEP333Q。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解,本發(fā)明上述方面所述的構(gòu)建狂犬病病毒Flury-LEP全 長cDNA突變重組載體PCI-LEP333Q的策略可以適用于構(gòu)建在Flury-LEP全長cDNA基因中 引入任何突變的重組載體。1. 6病毒拯救
      在轉(zhuǎn)染前一天,將293T細胞傳到35mm 6孔板上,當(dāng)細胞密度達到80%以上時即 可進行轉(zhuǎn)染。將 pCI-LEP333Q、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L 分別以 4 μ g、2 μ g、1 μ g、1 μ g 的 比例加入到250 μ 1無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM中,混勻;取15 μ 1 Lipofectamine 2000溶于 250 μ 1 OPTI-MEM中,混勻后在室溫靜置5min ;然后將Lipofectamine 2000與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 (即 pCI-LEP333Q、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L 各 4 μ g、2 μ g、1 μ g、1 μ g)混合均勻,室溫孵 育30min。在此期間用OPTI-MEM洗滌293T細胞兩次,然后每孔加入OPTI-MEM 1ml,最后將 Lipofectamine 2000-質(zhì)?;旌弦?00 μ 1加入細胞培養(yǎng)孔中,置于37°C CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)8h后吸棄轉(zhuǎn)染液,加入10% DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。72小時后,仔細吹落培養(yǎng)板上的細胞,將培 養(yǎng)液及細胞混合物全部接種BHK-21細胞。72h后,在BHK-21細胞上用間接免疫熒光(IFA) 檢測病毒滴度,簡言之,即以鼠抗狂犬病病毒高免血清為一抗,相同倍數(shù)稀釋的小鼠陰性血 清為對照,熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma)為二抗,最后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。 收獲上清液,獲救突變病毒株,獲救病毒株命名為rLEP333Q株。1.7種毒的制備及滴定將拯救的病毒在BHK-21細胞上進行擴增,10% DMEM 37°C培養(yǎng)3天。在NA細胞或 BHK-21細胞上培養(yǎng)48h后,以IFA(步驟同1. 6)確定病毒滴度。病毒滴度用病灶形成單位 (focus forming unit) FFU 表不。1. 8病毒生長動力學(xué)曲線的測定為測定病毒生長動力學(xué)曲線,以M.0. I.為0.01分別感染單層NA細胞和BHK-21細 胞。感作Ih后,用無菌PBS洗2次后,分別加含0. 2% FBS的MEM 2ml和2% DMEM 2ml于 37°C培養(yǎng)。分別于接種后24h、72h和120h取細胞培養(yǎng)液上清,在NA細胞和BHK-21細胞上 測定滴度,繪制病毒生長動力學(xué)曲線。1. 9小鼠半數(shù)致死量(LD5tl)的測定將HEP、wtLEP和rLEP333Q用滅菌的PBS作10倍倍比稀釋至10",將1(Γ4 10"各 稀釋度分別取30 μ 1腦內(nèi)接種5只5 6周齡的Balb/c雌性小鼠。連續(xù)觀察21天,記錄每 組小鼠的平均體重變化和死亡情況。利用Reed-Muench法計算小鼠半數(shù)致死量(LD5tl)[11]。2.結(jié)果2. 1從突變的全長cDNA克隆拯救突變病毒rLEP333Q為了從克隆的cDNA中拯救感染性RV,首先以pCI_LEP333Q及表達RVN、P、L蛋白 的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞。3天后收獲細胞液,盲傳一代后IFA檢測呈陽性結(jié)果(圖 2B)。對拯救病毒進行RT-PCR及基因組序列分析結(jié)果顯示,救獲病毒糖蛋白(G)第333位 精氨酸R(CGG)已經(jīng)突變?yōu)楣劝滨0稱(CAA),和預(yù)期完全相符(圖2C)。結(jié)果表明,通過反 向遺傳操作技術(shù),成功拯救出具有感染性的糖蛋白(G)第333位突變?yōu)楣劝滨0返淖哟?毒 rLEP333Q。2. 2拯救的Flury-LEP突變株(rLEP333Q)生物學(xué)特性的鑒定2. 2.1動力學(xué)曲線wtLEP和rLEP333Q在神經(jīng)元細胞NA和非神經(jīng)元細胞BHK-21上的生長動力學(xué)曲線 如圖所示(圖3),可見兩種病毒的生長性能并沒有顯著差異,這表明糖蛋白(G)第333位的 精氨酸突變?yōu)楣劝滨0泛蟛⒉挥绊懫渖L特性。2. 2. 2嗜神經(jīng)指數(shù)
      狂犬病病毒的體外嗜神經(jīng)指數(shù)是指病毒在NA細胞相對于BHK-21細胞上的感染性 比例[12],嗜神經(jīng)指數(shù)為1即表示病毒在神經(jīng)元細胞上感染的能力比在非神經(jīng)細胞上的高10 倍。致病性毒株與弱毒株相比通常具有較高的嗜神經(jīng)指數(shù)。致病性毒株的嗜神經(jīng)指數(shù)一般 大于1,而弱毒株的嗜神經(jīng)指數(shù)通常接近于0[12’13’14]。WtLEP和rLEP333Q的嗜神經(jīng)指數(shù)分別 為0. 8和0 (表4)。與wtLEP相比,rLEP333Q的嗜神經(jīng)指數(shù)已下降與無毒株Flury-HEP —樣 接近于零。表4wt LEP、rLEP333Q和HEP的體外嗜神經(jīng)性
      滴度(ffU/mla) 體外嗜神經(jīng)指 _4]母NA細胞_BHK-21 數(shù)匕_
      wtLEP 3.7X IO85.3 XIO7 0.8
      rLEP333Q 3.0X IO73.3 XIO7 0^£
      HEP 5. QX IQ6_5. OXlO6 0_a同一種毒在NA細胞和BHK-21細胞上的滴度b體外嗜神經(jīng)指數(shù)=log (NA上的滴度)-log (BHK-21上的滴度)2. 2. 3對小鼠的致病性為了確定wtLEP、rLEP333Q以及HEP對小鼠的致病性,每只小鼠腦內(nèi)接種病毒 105FFU/30y L· HEP感染的小鼠只表現(xiàn)出輕微的癥狀如毛微亂、體重略減;而感染wt LEP和 rLEP333Q的小鼠則表現(xiàn)出麻痹、興奮,體重減輕等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床癥狀(數(shù)據(jù)未顯 示)。所有的老鼠在11天內(nèi)全部死亡。此外,我們測定了 wtLEP和rLEP333Q的LD5tl,分別為 8. 8個FFU和80個FFU。結(jié)果表明,rLEP333Q毒株腦內(nèi)接種小鼠感染仍致死,但與wtLEP相 比,致病性下降。3 討論狂犬病病毒的G蛋白是很重要的致病因子,與細胞粘附、誘導(dǎo)細胞凋亡和免疫 應(yīng)答等有關(guān)。G蛋白的第333位氨基酸位點對小鼠的致病性至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)將 Flury-LEP糖蛋白(G)第333位的R突變?yōu)镼后,雖然小鼠腦內(nèi)接種仍能致死,但病毒喪失 了體外嗜神經(jīng)性,對小鼠的致病性有所下降。目前已報道的狂犬病病毒的細胞受體有煙堿乙酰膽堿受體 (nicotinicacetylcholine receptor) [15]> 神經(jīng)細胞粘附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)[16]和低親和力神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(low-affinity neurotrophinreceptor, p75NTR)[17]。G 蛋白結(jié)合 p75NTR 的能力依靠于第 330 位的 lysine 或是333位的R。因此,P75NTR可能與LEP獲得在CNS中傳播和擴增有關(guān)系。表4顯示LEP 和LEP333Q體外的嗜神經(jīng)指數(shù)有顯著差異,表明333位上的R改變了病毒結(jié)合細胞種屬的特 性。狂犬病病毒在細胞間的傳遞有兩種假設(shè)模式一是神經(jīng)細胞內(nèi)的病毒直接侵入到 毗鄰的細胞神經(jīng)細胞,二是自由的病毒粒子侵入到神經(jīng)細胞內(nèi)[18]。病毒在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的傳 播以前者為主,333位的R對細胞間的傳遞極為重要。將LEP333位R突變后,其嗜神經(jīng)性降 低與無致病性毒株Flury-HEP —致。因此,本發(fā)明人認為, 毒神經(jīng)嗜性的減弱能極大地提高其作為活毒疫苗使用時的安全性。所以,本發(fā)明的突變株rLEP333Q可以用作一種更加安 全的疫苗,同時還可以作為口服疫苗,對野生動物進行投食免疫,也可用于人免疫等。實施例2突變重組病毒rLEP333Q對比格犬的免疫試驗為了評價突變重組病毒rLEP333Q對比格犬的免疫效果,將3月齡12只比格犬隨 機分成兩組,6條后腿肌肉注射IO6FFU的rLEP333Q,6條注射IO6FFU的wtLEP。免疫后3周 采血、分離血清,用于中和抗體滴度檢測。中和試驗血清樣品首先56°C水浴處理30min滅活,隨后連續(xù)20倍至1280倍倍比稀釋,同 時設(shè)陰性、標(biāo)準血清對照。攻擊病毒采用標(biāo)準固定毒CVS株,將稀釋好的血清與含10000個 FFU的病毒等體積混合,37°C孵育lh,然后取100 μ 1加到過夜生長的24孔ΒΗΚ-21細胞上。 每個樣品作3個重復(fù)。感染后48h進行IFA檢測。被檢血清的中和抗體滴度為使熒光灶抑 制等于50%的血清最高倍數(shù)。標(biāo)準血清的起始稀釋效價為2IU/ml,待測抗體單位(IU/ml) =待測血清中和滴度/標(biāo)準血清中和滴度X2。突變重組病毒rLEP333Q對比格犬的免疫保護性根據(jù)0. I. E標(biāo)準測定rLEP333Q和WtLEP誘導(dǎo)比格犬中和抗體水平實驗結(jié)果顯 示rLEP333Q免疫比格犬誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體達18. 7士6. 5IU/ml,wtLEP免疫比格犬誘 導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度為20士9. 7IU/ml,兩組數(shù)據(jù)并無顯著性差異??梢?,突變重組病毒 rLEP333Q可誘導(dǎo)與wtLEP相當(dāng)?shù)闹泻涂贵w水平,且安全性較wtLEP更好,因此該病毒作為活 疫苗更具有優(yōu)勢。應(yīng)該理解,盡管參考其示例性的實施方案,已經(jīng)對本發(fā)明進行具體地顯示和描述, 但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解,可以在其中進行各種形式和細節(jié)的變化,而不背離 由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍。參考文獻[l]Martinez L. Global infectious disease surveillance. Int J Infect Dis, 2000,4(4) :222-8.[2]Dietzschold B, Wunner WH, Wiktor TJ, et al.Characterization of anantigenie determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity ofrabies virus. Proc Natl Acad Sci USA,1983,80(1) :70-4.[3]Morimoto K, Hooper DC, Spitsin S, et al. Pathogenicity of different rabiesvirus variants inversely correlates with apoptosis and rabies virus glycoproteinexpression in infected primary neuron cultures. J Virol,1999,73(1) 510-8.[4]Dietzschold B, Wiktor TJ, Trojanowski JQ, et al.Differences in cell-to-cellspread of pathogenic and apathogenic rabies virus in vivo and in vitro. J Virol. 1985,56(1) :12-8.[5] Faber M, Pulmanausahakul R, Nagao K, et al. Identification of viralgenomic elements responsible for rabies virus neuroinvasiveness. Proc NatlAcad Sci USA,2004,101(46) :16328_32.[6]Lentz TL, Burrage TG, Smith AL, et al. Is the acetylcholine receptor
      11arables virus receptor ? Science,1982,215 (4529) 182-4.[7]Mebatsion T,Weiland F,Conzelmann KK. Matrix protein of rabies virus isresponsible for the assembly and budding of bullet-shaped particles andinteracts with the transmembrane spike glycoprotein G.J Virol,1999,73(1) 242-50.[8]McGettigan JP, Pomerantz RJ, Siler CA, et al. Second-generation rabiesvirus-based vaccine vectors expressing human immunodeficiency virus type Igag have greatly reduced pathogenicity but are highly immunogenic. J Virol, 2003,77(1) :237-44.[9] Mebats ion T. Extensive attenuation of rabies virus by simultaneouslymodifying the dynein light chain binding site in the P protein and replacingArg333 in the G protein. J Virol,2001,75(23) 11496-502.[10] Inoue K,Shoji Y,Kurane I,et al. An improved method for recoveringrabies virus from cloned cDNA. J Virol Methods,2003,107(2) :229_36.[11] Reed, LJ, Muench,H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg,1938,27 :493_497.[12]Morimoto K,Hooper DC,Carbaugh H,et al. Rabies virus quasispecies implications for pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA,1998,95 (6) :3152_6.[13]Morimoto K, Foley HD, McGettigan JP, et al. Reinvestigation of the roleof the rabies virus glycoprotein in viral pathogenesis using a reverse geneticsapproach. J Neurovirol,2000,6(5) :373_8L[14] Ito N,Takayama M,Yamada K,et al. Rescue of rabies virus from clonedcDNA and identification of the pathogenicity-related gene :glycoprotein geneis associated with virulence for adult mice. J Virol,2001,75 (19) :9121_8.[15]Lentz TL, Burrage TG, Smith AL,et al. Is the acetylcholine receptor arables virus receptor ? Science,1982,215 (4529) 182-4.[16] Thoulouze MI,Lafage M,Schachner M,et al. The neural cell adhesionmolecule is a receptor for rabies virus. J Virol,1998,72 (9) :7181_90.[17] Tuf fereau C,Bene jean J,Blondel D, et al. Low-aff inity nerve-growthfactor receptor(P75NTR)can serve as a receptor for rabies virus. EMBO J,1998,17(24) :7250_9.[18] Dietzschold B,Wiktor TJ, Trojanowski JQ, et al.Differences incell-to-cell spread of pathogenic and apathogenic rabies virus in vivo and invitro. J Virol,1985,56(1) :12_8.序列表〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333位氨基酸突變株<130>IB092064<160>7
      12
      <170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>11925<212>DNA<213>狂犬病病毒<400>1acgcttaacaSLCSLSLSLSLCCSLSLagaagaagcagacagcgtcagttgcaaagcaaaaatgtaa60
      cacccctacaatggatgccgacaagattgtgttcaaagtcaataatcaggtggtctcttt120
      gaagcccgagattatcgtggatcaatatgagtacaagtaccctgctatcaaagatttgaa180
      aaagccttgtataaccctagggaaagcccccgatttaaacaaagcttacaaatcagtttt240
      atcaggcatgaatgccgccaaacttgatcctgatgatgtatgctcctacttggcagcagc300
      aatgcagttctttgaggggacatgtccggaagactggaccagctatggaatcctgattgc360
      acgaaaaggagacaagatcaccccagactctctagtggagataaagcgtactgatgtaga420
      agggaattgggctctgacaggaggcatggaactgacaagggaccccactgtctccgaaca480
      tgcatctttagtcggtcttctcctgagtctgtacagattgagcaaaatatcaggacaaaa540
      cactggtaactataagacaaacattgcggatagaatagagcagattttcgagacagcccc600
      ttttgttaagatcgtggaacaccataccctgatgacaactcacaagatgtgtgctaattg660
      gagtactataccgaacttcagatttttggccggaacctacgacatgtttttctcacggat720
      cgagcatctgtattcggcaatcagagtgggcacagttgtcaccgcttatgaagactgctc780
      aggactggtatcgtttacagggttcataaagcagatcaatctcaccgcaagagaagcaat840
      actatatttcttccacaagaactttgaagaagagataaggagaatgtttgagccagggca900
      agagacagctgttcctcactcttatttcattcacttccgttcactaggcttgagtgggaa960gtctccttattcatcaaatg ccgtcggtcatgtgttcaatctcattcactttgttggatg1020
      ctatatgggtcaagtcagat ctctaaatgcaacggttattgctgcatgtgcccctcatga1080
      gatgtctgttctagggggct atttgggagaggagttcttcggaaaagggacatttgaaag1140
      aaggttcttcagagacgaga aagaacttcaagaatatgaggcggctgaactgacaaagac1200
      cgacgtggcactggcagatg acggaaccgtcaactccgatgacgaggactacttctccgg1260
      tgaaaccagaagtccagaag ctgtctatactcgaatcatgatgaatggaggtcgactgaa1320
      gagatcacatatacggagat atgtctcagtcagttccaatcatcaagcccgtccaaactc1380
      attcgccgaatttttaaaca aaacgtattcgagtgactcataaggagttgaatgacaggg1440
      tgccagaaatccatagattg tgtatatccatcatgaaaaaaactaacactcctcctttcg1500
      aaccatcccaagtatgagca agatctttgttaatccgagtgcaatcagagCCggtCtggC1560
      cgatcttgagatggccgaag agactgttgatctgatcaacagaaacatagaagacaatca1620
      ggctcatctccagggagaac ccatagaagtggacaatctccctgaggacatgaggcaatt1680
      tcacctgggcgatgaaaaat tgtccaaccttggtgagatggttagggtgggcgaaggcaa1740
      gtatcgagaggactttcaga tggatgagggagaggaccccaacctcctgttccaatcgta1800
      cctggacaatgttggagtcc aaatagtcagacaaatgaggtcaggagagagattcctcaa1860
      gatatggtcacagaccgtag aggaaattatatcctatgtcacggtcaactttcctaaccc1920
      tccaggaaggtcttcggagg ataaatcaacccaaactactggccgggagctcaagaagga1980
      13
      gacaacatccactctttctcagagagaaagccaaccttcaaaagccggaatggtggctca2040
      agttgcctctggccctccatcccttgaatggtctgccaccaatgaagaggatgatctatc2100
      agtagaggctgagatcgctcatcagattgctgaaagcttttccaagaagtacaagtttcc2160
      ctctcgatcttcaggaatattcttgtataattttgagcaactggagatgaaccttgatga2220
      catagttaaagaggcaaaaaatgtaccgggcgtgacccgtctggcccatgatggatccaa2280
      aatccccctaagatgtgtactgggatgggtcgctttggccaactccaagaaattccaatt2340
      gatagtcgaggccgacaagctaagcaaaatcatgcaagatgacttggatcgctacacatc2400
      atgctaaccgagtcttcgaattcattccctctagataatgaaaactgagatgtcatggag2460
      tcgacatgaaaaaaacaggcaacaccactaataaaatgaactttctatgtaagatagtga2520
      aaaactgtagggatgaggacacccaaaagccctctcctgtgtcagcccctccggatggcg2580
      atgacctgtggcttccacctccagaatatgtcccgctgaaagaactcacaagcaagaaga2640
      acatgaggaacttttgtatcaacggggaggttaaagtgtgtagcccgaacggttactcat2700
      tcaggatcctgcggcatattctgagatcattcgacgagatatactctgggaatcatagga2760
      tgattgggttagtcaaagttgttattggactagctttatcaggagctccagttcctgagg2820
      gcatgaactgggtatacaaattgaggagaacccttattttccagtgggctgattccaggg2880
      gccctcttgaaggggaggagttggaacactctcaagagatcacttgggacgatgatactg2940
      aattcgtcggattgcaaatgagagtgagcgcaagacaatgtcatattcaaggcaggatct3000
      ggtgtatcaacatgaactcgagggcatgtcaactatggtctgacatgtctcttcagacac3060
      aaaggtctgaagaggacaaagactcttctctgcttctagaataatcagattatatcccgc3120
      aagtttatcacttgtttacctctggaggagagaacatacgggcttaactccaatccttgg3180
      gagcaataga3.C3.3.3.3.3.3.3.Cacgccatggtgccattaaaccgctgcattttatcaaagtc3240
      aagttaattacctttacattttgagcctcttggatgtgaaaaaaactattaacatccctc3300
      aaaagacttaaggaaagatggttcctcaggttcttttgtttgtacccctcCtgggttttt3360
      cattgtgtttcgggaagttccccatttacacgataccagacaaacttggtccctggagcc3420
      ctattgacatacaccatctcagctgtccaaataacctggttgtggaggacgaaggatgta3480
      ccaacctgtccgagttctcttacatggaacttaaagtgggatacatctcagccataaaag3540
      tgaacgggttcacttgcacaggtgttgtgacagaggcagaaacctacaccaactttgttg3600
      gttatgtcacaaccacattcaagagaaagcatttccgccccaccccagacgcatgtagag3660
      ccgcgtataactggaagatggccggtgaccccagatatgaagagtctctacacaatccgt3720
      accccgactaccattggcttcgaactgtaa3.3.3.CC3.CC3.3.agagtctctcgttatcatat3780
      ccccaagtgtgacagatttggacccatatgacaaatcccttcactcaagggtcttccctg3840
      gcggaaattgctcaggaataacggtgtcctcgacctactgctcaactaatcatgattaca3900
      ccatttggatgcctgagaatctgagactagggacatcttgtgacatttttaccaatagca3960
      gagggaagagggcatccaaaggaggcaagacttgcggctttgtggatgaaagaggcctgt4020
      ataagtctctaaagggagcatgcaaactcaagttatgtggagttctcggacttagactta4080
      tggatggaacatgggtcgcgatgcaaacatcagatgagaccaaatggtgccctccaggtc4140
      agttggtgaatttgcacgactttcgctcagacgagattgagcatctcgttgtggaagagt4200
      tagtcaagaaaagagaggagtgtctggatgcactagagtccatcatgaccaccaagtcag4260
      tgagtttcagacgtctcagtcacttgagaaaacttgtccctgggtttggaaaagcatata4320
      caagtactccaagtggtatctagattcgagattccttgccctagaccaccccttggctcc6720
      ttatatcaagacccaaacatggccacccaaacatatagtagacttggtgggggacacatg6780
      gcacaagctcccgatcacgcagatctttgagattcctgaatcaatggacccgtcagagat6840
      actggatgataaatcacattctttcaccagaacaagactagcttcttggctgtccgagaa6900
      ccgaggggggcctgttcctagcgagaaggtcattatcacggccctgtctaagccacctgt6960
      caatccccgagagtttttgaaatctatcgacctcggaggattgccagatgatgacttgat7020
      aattggcctcagaccaaaggaacgggagttgaagattgagggccgattcttcgctctaat7080
      gtcatggaatctaagattatattttgtcatcaccgagaagctcttggccaactacatttt7140
      gccactttttgacgcactgactatgacagacaacctgaacaaggtatttaaaaagttgat7200
      cgacagggtcaccgggcaagggcttttggactattcgagggtcacatacgcatttcacct7260
      ggactatgagaaatggaacaatcatcaaagattggagtcaacggaggatgtattttctgt7320
      cctagatcaggtgtttggattgaagagggtgttttctagaacacacgagttttttcagaa7380
      gtcctggatctattattcagacagatcagacctcattgggttacgggaggatcagatata7440
      ttgcttggatatgtccaatggtccaacctgctggaatggccaagacggcgggctagaggg7500
      cttacggcagaagggctggagtctagtcagcttattgatgatagatagag7560
      caggaacacaagaaccaagatactagctcaaggagacaaccaggttctgtgtccgacata7620
      catgttgtcaccgggattgtctcaagaggggcttctctatgagttagagagcatatcgag7680
      gaatgcactctcaatataccgagctatcgaggaaggagcatctaaactggggctgatcat7740
      caagaaagaagagaccatgtgtagttatgactttctcatatatgggaagacccccttatt7800
      tcgaggcaacatattagtacctgaatccaaaagatgggcccgagtctcttgcatctctaa7860
      cgaccaaatagtcaacctcgccaatataatgtctacagtatccaccaatgcgctgacagt7920
      ggcacaacactctcaatctctgatcaaacctatgagggattttctgctcatgtcagtaca7980
      ggcagttttccactacctgctgtttagcccaatcttaaaaggcagggtttataagattct8040
      gagtgctgaaggggagagctttctcctagccatgtcgcggataatctacctagatccttc8100
      tttgggaggggtgtctggaatgtctctcgggaggttccatatacgtcagttctcagaccc8160
      tgtctctgaagggttgtcattctggagagagatctggttaagctcccatgaatcctggat8220
      tcacgcgttgtgtcaagaggccgggaaccccgatcttggagagagaacactagagagctt8280
      cactcgccttttagaagatcctactaccttaaatatcaaaggaggggccagtcctaccat8340
      tctactcaaggatgctatcagaaaggctctgtacgacgaggtggacaaggtggaaaattc8400
      agagtttcgagaggcaatcctgttgtccaagacccatagagataactttatactcttttt8460
      aaaatctgttgagcctctgttccctcgatttctcagtgaactcttcagttcgtccttctt8520
      gggaataccagagtcaattattggactgatacaaaactccaggacaataagaaggcagtt8580
      tagaaagagtctctcaagaactttagaagagtccttctacaactcagagatccacgggat8640
      taatcggatgacccagacacctcaaagggtcgggagagtgtggccttgctcttcagagag8700
      ggcagatctacttagggagatctcttggggaaggaaagtggtaggcacgacagttcctca8760
      cccttccgagatgttggggctgcttccaaaatcctctatttcctgcacttgtggagcaac8820
      agggggaggcaatcctagagtttctgtatcagtactcccgtccttcgatcagtcattttt8880
      ttcacgaggtcccctaaagggatacttgggctcgtccacctccatgtcaacccagctatt8940
      ccatgcatgggaaaaagtcactaatgttcatgtggtgaaaagggctatatcgttaaaaga9000
      16
      tcagttgatcagacatggtcgtgtagattctcataacacgggagatcttctagcagtttc
      agtgaccaacggtgctttcattctccaggaactgataccaaaggttgtggacaagccaag
      gggtgcttcggattactctgtgcttgggcacagaaagaggtcgtagtttgccccttgata
      gcagattcaacatgaattaactaagaaaggcgatctgcctcccatgaaggacataagcaa
      tagttcacaatcatcttgcatctcagtgaagtgtacataactataaagggctgggtcatc
      taagcatttcagtcgagaaaaaaactgtagaccaaaagaaC 3.3. C 3.3. C 3.3.cacttctcat
      cccgagacccatatcaagatgctggatccgggagaggtttatgatgaccctattgatcca
      attgagtcagaggctgaacccagaggaacccccactgtccccaacatcttgaggaactct
      gactacaatct caactctcctttgatagaggactctgccaaactaatgttagaatggttg
      aaaacaggga acagaccttatcggatgactttgacagacaattgctccaggtcttacaaa
      gttttgaaagattatttcaagaaagtagatttgggttctctcaaagtgggaggaactgct
      gcacaatcaa tgatttctctctggttgtatggagcccactctgagtcaaacaggagccgg
      60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740
      agatgtataaccgacttggcccatttctattccaagtcatcccccatagagaagctgttg1800
      aattgtacgttaggaaacagaggcctgagaatcccaccagagggggtgttaagttgcctt1860
      gagagggtcgattatgataaggcatttgggaggtatctggccaacacgtattcctcttat1920
      ctgtttttccatgtaattaccttatacatgaatgccctagactgggaagaggaaaaaacc1980
      atcctagcattatggaaagatctaacctcagtggataccgggaaggacttggtcaaattc2040
      aaagatcaaatatggggactgctggttgtgacaaaggactttgtttactctcagagttct2100
      aactgtctttttgacagaaactatacactgatgctaaaggatcttttcttgtctcgattc2160
      aactccttgatgattttgctttctccccctgagccccgatactcagatgacttaatatct2220
      cagctgtgccagctatacatcgctggggatcaagtcttgtCCttgtgtgggaactccggc2280
      tatgaagtcatcaaaatattggagccatatgtcgtgaacagtttggtccagagggcagag2340
      aagtttaggcctctcatccactccttgggagactttcctatgtttataaaagacaaggtg2400
      aatcaacttgaagggactttcggtcccagtgcaaaaaggttttttagggttctagatcaa2460
      ttcgacaacatacatgatctagtatttgtgtatggctgttacagacattgggggcacccc2520
      tatatagattatcggaagggtctgtcgaaactatatgatcaagttcacattaagaaagta2580
      atagataagtcctaccaggagtgtttagcaagtgacttggctagaaggatcctcagatgg2640
      ggatttgacaagtactccaagtggtatctagattcgagattccttgccctagaccacccc2700
      ttggctccttatatcaagacccaaacatggccacccaaacatatagtagaCttggtgggg2760
      gacacatggcacaagctcccgatcacgcagatctttgagattcctgaatcaatggacccg2820
      tcagagatactggatgataaatcacattctttcaccagaacaagactagcttcttggctg2880
      tccgagaaccgaggggggcctgttcctagcgagaaggtcattatcacggccctgtctaag2940
      ccacctgtcaatccccgagagtttttgaaatctatcgacctcggaggattgccagatgat3000
      gatttgataattggcctcagaccaaaggaacgggagttgaagattgagggccgattcttc3060
      gctctaatgtcatggaatctaagattatattttgtcatcaccgagaagctcttggccaac3120
      tacattttgccactttttgacgcactgactatgacagacaacctgaacaaggtatttaaa3180
      aagttgatcgacagggtcaccgggcaagggcttttggactattcgagggtcacatacgca3240
      tttcacctggactatgagaaatggaacaatcatcaaagattggagtcaacggaggatgta3300
      ttttctgtcctagatcaggtgtttggattgaagagggtgttttctagaacacacgagttt3360
      tttcagaagtcctggatctattattcagacagatcagacctcattgggttacgggaggat3420
      cagatatattgcttggatatgtccaatggtccaacctgctggaatggccaagacggcggg3480
      ctagagggcttacggcagaagggctggagtctagtcagcttattgatgatagatagagaa3540
      tctcaaaccaggaacacaagaaccaagatactagctcaaggagacaaccaggttctgtgt3600
      ccgacatacatgttgtcaccgggattgtctcaagaggggcttctctatgagttagagagc3660
      atatcgaggaatgcactctcaatataccgagctatcgaggaaggagcatctaaactgggg3720
      ctgatcatcaagaaagaagagaccatgtgtagttatgactttctcatatatgggaagacc3780
      cccttatttcgaggcaacatattagtacctgaatccaaaagatgggcccgagtctcttgc3840
      atctctaacgaccaaatagtcaacctcgccaatataatgtctacagtatccaccaatgcg3900
      ctgacagtggcacaacactctcaatctctgatcaaacctatgagggattttctgctcatg3960
      tcagtacaggcagttttccactacctgctgtttagcccaatcttaaaaggcagggtttat4020
      aagattctgagtgctgaaggggagagctttctcctagccatgtcgcggataatctaccta4080
      gtgtttggattgaagagggtgttttctagaacacacgagttttttcagaagtcctggatc1980
      tattattcagacagatcagacctcattgggttacgggaggatcagatatattgcttggat2040
      atgtccaatggtccaacctgctggaatggccaagacggcgggctagagggcttacggcag2100
      aagggctggagtctagtcagcttattgatgatagatagagaatctcaaaccaggaacaca2160
      agaaccaagatactagctcaaggagacaaccaggttctgtgtccgacatacatgttgtca2220
      ccgggattgtctcaagaggggcttctctatgagttagagagcatatcgaggaatgcactc2280
      tcaatataccgagctatcgaggaaggagcatctaaactggggctgatcatcaagaaagaa2340
      gagaccatgtgtagttatgactttctcatatatgggaagacccccttatttcgaggcaac2400
      atattagtacctgaatccaaaagatgggcccgagtctcttgcatctctaacgaccaaata2460
      gtcaacctcgccaatataatgtctacagtatccaccaatgcgctgacagtggcacaacac2520
      tctcaatctctgatcaaacctatgagggattttctgctcatgtcagtacaggcagttttc2580
      cactacctgctgtttagccc3-3- C3.3.3.3.ggcagggtttataagattctgagtgctgaa2640
      ggggagagctttctcctagccatgtcgcggataatctacctagatccttctttgggaggg2700
      gtgtctggaatgtctctcgggaggttccatatacgtcagttctcagaccctgtctctgaa2760
      gggttgtcattctggagagagatctggttaagctcccatgaatcctggattcacgcgttg2820
      tgtcaagaggccgggaaccccgatcttggagagagaacactagagagcttcactcgcctt2880
      ttagaagatcctactaccttaaatatcaaaggaggggccagtcctaccattctactcaag2940
      gatgctatcagaaaggctctgtacgacgaggtggacaaggtggaaaattcagagtttcga3000
      gaggcaatcctgttgtccaagacccatagagataactttatactctttttaaaatctgtt3060
      gagcctctgttccctcgatttctcagtgaactcttcagttcgtccttcttgggaatacca3120
      gagtcaattattggactgat3-C 3.3.3.3.C t C Caggacaataagaaggcagtttagaaagagt3180
      ctctcaagaactttagaagagtccttctacaactcagagatccacgggattaatcggatg3240
      acccagacacctcaaagggtcgggagagtgtggccttgctcttcagagagggcagatcta3300
      cttagggagatctcttggggaaggaaagtggtaggcacgacagttcctcacccttccgag3360
      atgttggggctgcttccaaaatcctctatttcctgcacttgtggagcaacagggggaggc3420
      aatcctagagtttctgtatcagtactcccgtccttcgatcagtcatttttttcacgaggt3480
      cccctaaagggatacttgggctcgtccacctccatgtcaacccagctattccatgcatgg3540
      gaaaaagtcactaatgttcatgtggtgaaaagggctatatcgttaaaagaatctataaac3600
      tggttcatcaatagaaattccaatttggctcaaactctaattagaaacatcatgtctctg3660
      acaggccctgatttccctctagaagaggctcctgttttcaaacggacagggtcagccttg3720
      cataggttcaagtctgccagatacagcgaaggagggtattcttctgtttgtcctaacctt3780
      ctctctcatatctctgtcagtacagacactatgtctgatttgacccaagacgggaagaac3840
      tatgatttcatgtttcagccattgatgctttatgcgcaaacatggacatcagagctggta3900
      cagagagacacaagactgagagactccacgtttcactggcaccttcgatgcaacagatgt3960
      gtaaggcccattgaggatataacactggaaacttctcagatcttcgagttcccggatgtg4020
      tcaaaaaggatatccaggatggtttctggagccgtccctcactttcagaagcttcctgat4080
      atccgtctaagaccaggtgattttgaatctctaagtggtagagaaaagtctcgccacata4140
      gggtcagctcaggggctcttatactcaatcttagtagcaattcacgattcaggatacaat4200
      gatgggaccatcttccctgtcaacatatacggcaaagtttcccctagagactatttgaga4260[0661gggctcgcaagagggatcttgataggatcctcgatttgcttcttgacacgaatgacaaat4320[06623. 3.3. 3. 3.aaagacctcttgaattgatctcaggggtaatttcctatattctcctgagg4380[0663ctggataatcatccctctctgtatataatgcttagagaaccgtctcttagaggagagata4440[0664ttctctatccctcagaaaatccccgccgcttacccaaccactatgaaagaaggcaacaga4500[0665tcgatcttgtgttacctccaacacgtgctacgctatgagcgagaagtaatcacggcgtcc4560[0666ccggagaatgactggctgtggatcttctcagacttcagaagtgcgaaaatgacgtacttg4620[0667accctcattacctaccagtctcacctcctactccagagggttgagcgaaacttgtctaag4680[0668agtatgagagctactctgcgacaaatgggttccttaatgaggcaagtgctgggtgggcac4740[0669ggagaagacaccttggagtcagacgacgacattcaacgattactaaaagactctttgcga4800[0670aggacaaggtgggtagatcaagaggtgcgccatgcagctagaaccatgagtggagattac4860[0671agccccaacaagagagtatcccgcaaggcaggatgttcagaatgggtctgctctgctcaa4920[0672caggttgccgtctccacctcagccaacccggcccctgtctcagagcttgacattagggcc4980[0673ctatctaagaggtttcaaaaccccttgatctcgggcctaagagtggttcagtgggcaacc5040[0674ggcgcccattataagcttaagcctattctagatgatctaaatgttttcccatctctctgt5100[0675cttgttgttggagacgggtcagggggaatatcaagggcagttctcaacatgtttccagat5160[0676tctaagcttgtgttcaacagcctattggaggtgaatgatctgatggcttccggaacacat5220[0677ccactgcctccttcagcaatcatgagtggaggagatgatatcatctccagagtgatagac5280[0678tttgactcaatctgggaaaaaccatccgacctgaggaacttggccacctggagatacttc5340[0679cagtcagttcaaaagcaggtcaacatgtcgtatgacctcattgtttgtgatgcagaagtt5400[0680actgatattgcatctatcaaccggataactctgttgatgtctgatttcgcattgtctata5460[0681gatggaccactttatctggtcttcaaaacttacgggactatgctagtgaacccagactat5520[0682aaagctatccaacatctgtcaagagcgttcccttcggtcacagggtttataacccaagta5580[0683acttcgtccttttcttctgagctatacctccggttctccaaacgagggaagttttttagg5640[0684gatgctgagtacttgacctcttccacccttcgggagatgagccttgtgttattcaattgt5700[0685agcagccccaaaagtgagatgcagagagctcgttccttaaactatcaagatcttgtaagg5760[0686ggatttcctgaagagatcatatcaaatccttacaatgaaatgatcataactctgattgac5820[0687agtgatgtagagtccttcctggtccacaagatggtggatgatcttgagttacagagggga5880[0688actctgtctaaagtggctatcattatatccatcatgattgttttttccaatagagtcttc5940[0689aacatttccaaacctttgactgaccccttgttctatcccccatctgatcctaaaatcctg6000[0690aggcacttcaacatatgttgcagtactatgatgtatctatctaccgctttaggcgacgtc6060[0691cctagcttcgcaagacttcatgacctatataatagacctataacttattacttcagaaag6120[0692caagttattcgagggaatatttatctatcttggagctggtccgatgacaccccagtgttc6180[0693aagagggtagcctgtaattctagcttgagtctgtcatctcactggatcaggttgatttac6240[0694aagatagtgaagactaccagactcgttggcagcatagaagatctatcaggagaggtagaa6300[0695cgacacctgcatgggtacaacagatggatcaccctcgaggatatccgatctagatcatcc6360[0696ctactagact acagttgttt gtaa638權(quán)利要求
      一種突變狂犬病病毒Flury LEP弱毒疫苗株,其表達的狂犬病病毒Flury LEP糖蛋白第333位氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨0稱。
      2.生產(chǎn)權(quán)利要求1的突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株的方法,所述方法包括(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒,所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括在其中引入狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333 位氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨0稱的狂犬病病毒Flury-LEP全長基因組cDNA序列;(2)構(gòu)建一個或多個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒,所述輔助質(zhì)粒包括編碼狂犬病病毒Flury-LEP核 蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L基因的開放閱讀框架的cDNA序列;(3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染允許狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株復(fù) 制的宿主細胞,培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細胞;(4)收獲上清液,獲救突變病毒株。
      3.權(quán)利要求2的方法,其中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒為pCI-LEP333Q。
      4.權(quán)利要求2的方法,其中所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG_L。
      5.權(quán)利要求2-4中任一項的方法,其中所述宿主細胞是真核細胞。
      6.權(quán)利要求1的突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株的應(yīng)用,其用作高安全性的活 毒疫苗,單獨或與其它疫苗一起使用。
      7.狂犬病病毒Flury-LEPG333突變?nèi)L基因組cDNA重組載體,其表達的狂犬病病毒 Flury-LEP糖蛋白第333位氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨0稱。
      8.權(quán)利要求7的狂犬病病毒Flury-LEPG333突變?nèi)L基因組cDNA重組載體的應(yīng)用, 其與分別編碼LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L的轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒一起用于拯救狂 犬病病毒弱毒疫苗株的一種反向遺傳操作系統(tǒng)。
      9.權(quán)利要求7的狂犬病病毒Flury-LEPG333突變?nèi)L基因組cDNA重組載體的應(yīng)用, 其用于構(gòu)建預(yù)防狂犬病和其它疫病的重組二聯(lián)活載體疫苗。
      10.權(quán)利要求8或9的應(yīng)用,其中所述狂犬病病毒Flury-LEPG333突變基因組cDNA重 組載體是 PCI-LEP333Qt全文摘要
      本發(fā)明屬于重組病毒疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株,其表達的狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨0稱。更具體地,本發(fā)明涉及狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸突變株rLEP333Q。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述突變株的方法,以及所述突變株的應(yīng)用。
      文檔編號C12N15/85GK101942418SQ20091024450
      公開日2011年1月12日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
      發(fā)明者步志高, 王喜軍, 葛金英, 陶麗紅 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
      1