專利名稱：家蠶絲腺細(xì)胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器、后部絲腺生物反應(yīng)器、以及絲腺生物反應(yīng)器三種生物反應(yīng)器，使家蠶中部、后部、或中后兩部分絲腺細(xì)胞能夠合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法。
背景技術(shù)：
狂犬病是當(dāng)今世界公共衛(wèi)生中有嚴(yán)重威脅的傳染病之一。狂犬病是由狂犬病病毒感染恒溫動物或人引起，導(dǎo)致動物或者人急性致死性腦脊髓炎，臨床特征主要表現(xiàn)為狂燥不安、行為反常、攻擊性、進(jìn)行性麻痹和最終死亡，是一種人獸共患傳染病。其特點(diǎn)是潛伏期長，致死率高，幾乎100%死亡?？袢〔《緦儆趶棤畈《究茝棤畈《緦?，是單鏈不分節(jié)負(fù)鏈RNA病毒，病毒外形呈彈狀，一端純圓，一端平凹，有囊膜，內(nèi)含衣殼呈螺旋對稱，表面具有包膜，內(nèi)含有單鏈 RNA。狂犬病病毒的基因組全長約12kb，基因組的3’端至5’端排列著N、P、M、G、L 5個結(jié)構(gòu)基因，各基因序列的長度分別為1424、991、805、1675和6475bp，它們分別編碼核蛋白 (N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L或RNA依賴的RNA轉(zhuǎn)錄酶蛋白)?？袢〔《居袃煞N主要抗原一種是病毒外膜上的糖蛋白抗原，它能與乙酰膽堿受體結(jié)合，表現(xiàn)出神經(jīng)毒性，能使體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體及血凝抑制抗體；另一種為內(nèi)層的核蛋白抗原，它使體內(nèi)產(chǎn)生補(bǔ)體結(jié)合抗體和沉淀素。G蛋白是狂犬病病毒表面蛋白，可介導(dǎo)病毒的入侵，決定病毒的致病性和組織嗜性。G蛋白識別的宿主細(xì)胞表面受體包括煙堿型乙酰膽堿受體、神經(jīng)細(xì)胞黏附因子和p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體等。無G基因的狂犬病病毒不能經(jīng)過突觸傳播。G蛋白分布到宿主細(xì)胞的表面可能導(dǎo)致離子通道紊亂，進(jìn)而影響神經(jīng)的生理功能，導(dǎo)致神經(jīng)功能性損傷，是病毒引起機(jī)體病理變化的基礎(chǔ)。G蛋白由524個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為67Da，分為信號肽、膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)。G蛋白基因轉(zhuǎn)錄翻譯后，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行糖基化修飾，并切去 N端19個氨基酸殘基信號肽后成為成熟的G蛋白，成熟后的糖蛋白具有505個氨基酸殘基， 分為3個區(qū)域膜外區(qū)即抗原區(qū)(第1-439位)，位于病毒顆粒包膜的表面；穿膜區(qū)即跨膜區(qū)(第440-461位)，功能為把糖蛋白固定在病毒雙脂膜上；膜內(nèi)區(qū)(第462-505位)，位于病毒包膜內(nèi)表面，提供M蛋白和N蛋白相互作用的位點(diǎn)。糖基化對于G蛋白正確的空間折疊、穩(wěn)定性、加工運(yùn)輸、抗原性、免疫原性、致病性和毒力都有極其重要影響。不同毒株糖基化的數(shù)目、效率和位點(diǎn)不同，第319位Asn糖基化位點(diǎn)廣泛存在于所有已知的多種狂犬病病毒，而第247位Asn的N糖苷能加強(qiáng)第319位Asn的糖基化，產(chǎn)生更多的寡甘露糖或高甘露糖型糖鏈，提高糖基化程度，提高了病毒對細(xì)胞的識別能力，進(jìn)而影響到病毒的致病力。轉(zhuǎn)基因家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器、后部絲腺生物反應(yīng)器是在家蠶中部絲腺、后部絲腺中特異表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)系統(tǒng)。家蠶生長周期短，50天左右可完成一個世代，每個雌蛾可產(chǎn)卵約400粒；家蠶經(jīng)過長達(dá)四千多年的人工馴養(yǎng)、選育，性情溫順，已完CN 102286529 A
說明書
2/7頁
成喪失飛翔逃逸能力，而在絲蛋白合成、分泌方面具有非常強(qiáng)的能力；合成的蛋白可以隨蠶絲蛋白一起分泌到體外，蠶絲蛋白主要由3種絲素蛋白和3種絲膠蛋白構(gòu)成，成分簡單。所以，轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應(yīng)器構(gòu)建容易，運(yùn)行安全，表達(dá)外源蛋白效率高，外源蛋白多具有生物活性，蛋白純化方便，只需要通過飼養(yǎng)轉(zhuǎn)基因家蠶，就可以非常方便地維持表達(dá)系統(tǒng)的延續(xù)，是一種非常有價值的表達(dá)系統(tǒng)，具有廣闊的實(shí)用前景。本發(fā)明是利用轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)將狂犬病病毒糖蛋白基因?qū)爰倚Q基因組內(nèi)，并在家蠶中部絲腺細(xì)胞、后部絲腺細(xì)胞、或兩部分的絲腺細(xì)胞中特異表達(dá)，開發(fā)出合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的家蠶，為利用狂犬病病毒糖蛋白研制更加安全、高效、經(jīng)濟(jì)和使用方便的人用狂犬病新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建中部絲腺生物反應(yīng)器、后部絲腺生物反應(yīng)器、以及絲腺生物反應(yīng)器三種生物反應(yīng)器，使家蠶中部絲腺細(xì)胞、后部絲腺細(xì)胞或兩部分絲腺細(xì)胞能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法。培育成功的生產(chǎn)狂犬病病毒糖蛋白的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種，可以提高蠶農(nóng)養(yǎng)蠶經(jīng)濟(jì)效益，為利用狂犬病病毒糖蛋白研制更加安全、高效、經(jīng)濟(jì)和使用方便的人用狂犬病新型疫苗奠定基礎(chǔ)。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下
(1)采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建家蠶合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的載體 pBSerlRVGP-A3EGFP 質(zhì)粒和 pBFibLRVGP_A3EGFP 質(zhì)粒。(2)采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBkrlRVGP-A3EGFP質(zhì)?；?pBFibLRVGP-A3EGFP質(zhì)粒與能夠提供轉(zhuǎn)座酶trans的輔助質(zhì)粒一起導(dǎo)入家蠶受精卵內(nèi)，蠶卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代為Gl代，在Gl代轉(zhuǎn)基因家蠶的小蠶期，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對量無損傷測定方法，觀察選擇表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲自交續(xù)代為G2代，G2代以后均采用蛾區(qū)育，成蟲自交續(xù)代，再經(jīng)1-3代選種，每代在小蠶期采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對量無損傷測定方法，以表達(dá)EGFP標(biāo)志基因?yàn)榱舴N篩選標(biāo)志，創(chuàng)制家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器和后部絲腺生物反應(yīng)器，育成中部絲腺細(xì)胞、后部絲腺細(xì)胞能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種。(3)在中部絲腺細(xì)胞能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種的基礎(chǔ)上，采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBFibLRVGP-A3EGFP質(zhì)粒與能夠提供轉(zhuǎn)座酶trans的輔助質(zhì)粒一起導(dǎo)入該家蠶品種受精卵內(nèi)，在后部絲腺細(xì)胞能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種的基礎(chǔ)上，采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBkrlRVGP-A3EGFP質(zhì)粒與能夠提供轉(zhuǎn)座酶trans的輔助質(zhì)粒一起導(dǎo)入該家蠶品種受精卵內(nèi)，受精卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代為GGl代，在GGl代轉(zhuǎn)基因家蠶的小蠶期，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對量無損傷測定方法，觀察選擇表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲自交續(xù)代為GG2代，GG2代以后均采用蛾區(qū)育，成蟲自交續(xù)代，再經(jīng)2代選種，每代在小蠶期采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對量無損傷測定方法，以表達(dá) EGFP標(biāo)志基因?yàn)榱舴N篩選標(biāo)志，創(chuàng)制家蠶絲腺生物反應(yīng)器，育成中部絲腺細(xì)胞、后部絲腺兩部分細(xì)胞都能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種。(4)將中部絲腺細(xì)胞能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種，與后部絲腺細(xì)胞能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種雜交為Fl代，在Fl代轉(zhuǎn)基因家蠶的小蠶期，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對量無損傷測定方法，觀察選擇表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲自交續(xù)代為F2 代，F(xiàn)2代以后均采用蛾區(qū)育，成蟲自交續(xù)代，再經(jīng)2代選種，每代在小蠶期采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對量無損傷測定方法，以表達(dá)EGFP標(biāo)志基因?yàn)榱舴N篩選標(biāo)志，創(chuàng)制家蠶絲腺生物反應(yīng)器，育成中部絲腺細(xì)胞、后部絲腺兩部分細(xì)胞都能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種。所述的pBSerlRVGP-A3EGFP質(zhì)粒是以piggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒為基礎(chǔ)，質(zhì)粒帶有Amp抗性基因以用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和篩選，包含piggyBac轉(zhuǎn)座子的2個轉(zhuǎn)座臂PBL 和PBR，包含2個功能表達(dá)框，一個是A3啟動子啟動的綠色熒光蛋白基因表達(dá)框A3 Promoter+EGFP+SV40,以用作轉(zhuǎn)基因陽性家蠶的篩選標(biāo)志，另一個是家蠶絲膠蛋白1啟動子、帶有便于提純外源蛋白的His接頭以及狂犬病病毒糖蛋白基因的表達(dá)框Serl Promoter +His+ RVGP +SV40，依靠家蠶絲膠蛋白1啟動子Serl Promoter具有中部絲腺細(xì)胞組織特異性啟動基因表達(dá)的功能，創(chuàng)制家蠶中部絲腺細(xì)胞生物反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)在中部絲腺細(xì)胞表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白。所述的pBFibLRVGP-A3EGFP質(zhì)粒是以pBSerlRVGP_A3EGFP質(zhì)粒為基礎(chǔ)，用家蠶絲素蛋白輕鏈啟動子Fib-L Promoter替換家蠶絲膠蛋白1啟動子Serl Promoter構(gòu)建而成， 依靠家蠶絲素蛋白輕鏈啟動子Fib-L Promoter具有后部絲腺細(xì)胞組織特異性啟動基因表達(dá)的功能，創(chuàng)制家蠶后部絲腺細(xì)胞生物反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)在后部絲腺細(xì)胞表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白。所述的輔助質(zhì)粒包含Amp抗性基因、piggyBac轉(zhuǎn)座子的1個轉(zhuǎn)座臂PBR、A3啟動子啟動的轉(zhuǎn)座酶trans基因表達(dá)框A3 Promoter+ trans，以提供轉(zhuǎn)座酶。本發(fā)明具有的有益效果是
可以借助熒光標(biāo)志基因篩選轉(zhuǎn)基因家蠶，這種轉(zhuǎn)基因家蠶能夠在家蠶中部絲腺細(xì)胞特異地合成分泌狂犬病病毒糖蛋白，為提高狂犬病病毒糖蛋白的生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本、并研制更加安全、高效、經(jīng)濟(jì)和使用方便的人用狂犬病新型疫苗奠定基礎(chǔ)。


圖1是家蠶中部絲腺細(xì)胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的pBSerlRVGP_A3EGFP載體結(jié)構(gòu)圖。圖2是家蠶后部絲腺細(xì)胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的pBFibLRVGP-A3EGFP載體結(jié)構(gòu)圖。圖3是能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1
將pBSerlRVGP-A3EGFP質(zhì)粒(圖1)及能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒(圖3)按1:1比率混合，2種質(zhì)粒的總濃度為0. 5μβ/μ1，質(zhì)粒溶解在0. 5mM、pH7. 0含有5mM氯化鉀的磷酸緩沖液中，然后采用顯微注射方法導(dǎo)入家蠶產(chǎn)卵后8小時以內(nèi)的受精卵內(nèi)，導(dǎo)入總體積為15nl。將顯微注射的蠶卵在25°C、85%濕度、1 光照條件下飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代(Gl代)。在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的Gl代小蠶期，通過熒光顯微鏡(Olympus，SZX12，日本)觀察獲取表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶2蛾，熒光顯微鏡的激發(fā)波長為460nm 490nm，發(fā)射波長為510 nm 550 nm。將蠶飼養(yǎng)至成蟲自交產(chǎn)卵續(xù)代(G2)。自第G2代以后的轉(zhuǎn)基因家蠶均采用單蛾育，在小蠶期通過熒光體視顯微鏡觀察，挑選表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲，經(jīng)自交3代選擇留種，在每代的小蠶期，通過熒光體視顯微鏡觀察選留表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶。經(jīng)此創(chuàng)制家蠶中部絲腺細(xì)胞生物反應(yīng)器，育成中部絲腺細(xì)胞能夠合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種，定名為SG2、SG3。 取SG2、SG3品種的基因組DNA為模板，采用hverse PCR擴(kuò)增RVGP基因在家蠶基因組中的插入片段，對擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆、測序和染色體定位分析，結(jié)果顯示如下
狂犬病病毒糖蛋白基因在家蠶基因組中的插入位點(diǎn)鑒定
權(quán)利要求
1.一種家蠶絲腺細(xì)胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法，其特征在于該方法的步驟如下(1)采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建家蠶合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的載體 pBSerlRVGP-A3EGFP 質(zhì)粒和 pBFibLRVGP_A3EGFP 質(zhì)粒；(2)采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBkrlRVGP-A3EGFP質(zhì)?；騪BFibLRVGP_A3EGFP 質(zhì)粒與能夠提供轉(zhuǎn)座酶trans的輔助質(zhì)粒一起導(dǎo)入家蠶受精卵內(nèi)，蠶卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代為Gl代，在Gl代轉(zhuǎn)基因家蠶的小蠶期，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對量無損傷測定方法，觀察選擇表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲自交續(xù)代為G2 代，G2代以后均采用蛾區(qū)育，成蟲自交續(xù)代，再經(jīng)1-3代選種，每代在小蠶期采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對量無損傷測定方法，以表達(dá)EGFP標(biāo)志基因?yàn)榱舴N篩選標(biāo)志，創(chuàng)制家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器和后部絲腺生物反應(yīng)器，育成中部絲腺細(xì)胞、后部絲腺細(xì)胞能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種；(3)在中部絲腺細(xì)胞能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種的基礎(chǔ)上，采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBFibLRVGP-A3EGFP質(zhì)粒與能夠提供轉(zhuǎn)座酶trans的輔助質(zhì)粒一起導(dǎo)入該家蠶品種受精卵內(nèi)，在后部絲腺細(xì)胞能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種的基礎(chǔ)上，采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBkrlRVGP-A3EGFP質(zhì)粒與能夠提供轉(zhuǎn)座酶trans的輔助質(zhì)粒一起導(dǎo)入該家蠶品種受精卵內(nèi)，受精卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代為GGl代，在GGl代轉(zhuǎn)基因家蠶的小蠶期，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對量無損傷測定方法，觀察選擇表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲自交續(xù)代為GG2代，GG2代以后均采用蛾區(qū)育，成蟲自交續(xù)代，再經(jīng)2代選種，每代在小蠶期采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對量無損傷測定方法，以表達(dá)EGFP標(biāo)志基因?yàn)榱舴N篩選標(biāo)志，創(chuàng)制家蠶絲腺生物反應(yīng)器，育成中部絲腺細(xì)胞、后部絲腺兩部分細(xì)胞都能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種；(4)將中部絲腺細(xì)胞能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種，與后部絲腺細(xì)胞能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種雜交為Fl代，在Fl代轉(zhuǎn)基因家蠶的小蠶期，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對量無損傷測定方法，觀察選擇表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲自交續(xù)代為F2代， F2代以后均采用蛾區(qū)育，成蟲自交續(xù)代，再經(jīng)2代選種，每代在小蠶期采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對量無損傷測定方法，以表達(dá)EGFP標(biāo)志基因?yàn)榱舴N篩選標(biāo)志，創(chuàng)制家蠶絲腺生物反應(yīng)器，育成中部絲腺細(xì)胞、后部絲腺兩部分細(xì)胞都能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種家蠶絲腺細(xì)胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法， 其特征在于所述的pBkr 1RVGP-A3EGFP質(zhì)粒是以ρ i ggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒為基礎(chǔ)，質(zhì)粒帶有Amp抗性基因以用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和篩選，包含PiggyBac轉(zhuǎn)座子的2個轉(zhuǎn)座臂PBL 和PBR，包含2個功能表達(dá)框，一個是A3啟動子啟動的綠色熒光蛋白基因表達(dá)框A3 Promoter+EGFP+SV40,以用作轉(zhuǎn)基因陽性家蠶的篩選標(biāo)志，另一個是家蠶絲膠蛋白1啟動子、帶有便于提純外源蛋白的His接頭以及狂犬病病毒糖蛋白基因的表達(dá)框％1~1 Promoter +His+ RVGP +SV40，依靠家蠶絲膠蛋白1啟動子krl Promoter具有中部絲腺細(xì)胞組織特異性啟動基因表達(dá)的功能，創(chuàng)制家蠶中部絲腺細(xì)胞生物反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)在中部絲腺細(xì)胞表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種家蠶絲腺細(xì)胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法，其特征在于所述的pBFibLRVGP-A3EGFP質(zhì)粒是以pBSerlRVGP_A3EGFP質(zhì)粒為基礎(chǔ)，用家蠶絲素蛋白輕鏈啟動子Fib-L Promoter替換家蠶絲膠蛋白1啟動子Serl Promoter構(gòu)建而成，依靠家蠶絲素蛋白輕鏈啟動子Fib-L Promoter具有后部絲腺細(xì)胞組織特異性啟動基因表達(dá)的功能，創(chuàng)制家蠶后部絲腺細(xì)胞生物反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)在后部絲腺細(xì)胞表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種家蠶絲腺細(xì)胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法，其特征在于所述的輔助質(zhì)粒包含Amp抗性基因、piggyBac轉(zhuǎn)座子的1個轉(zhuǎn)座臂PBR、A3啟動子啟動的轉(zhuǎn)座酶trans基因表達(dá)框A3 Promoter+ trans，以提供轉(zhuǎn)座酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠶絲腺細(xì)胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法。是先構(gòu)建家蠶合成分泌狂犬病病毒糖蛋白RVGP的載體pBSer1RVGP-A3EGFP質(zhì)粒和pBFibLRVGP-A3EGFP質(zhì)粒，再利用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)將這2種質(zhì)粒分別與能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒一起導(dǎo)入到家蠶受精卵內(nèi)，依靠piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座特性，使綠色熒光蛋白基因和狂犬病病毒糖蛋白基因?qū)氲郊倚Q的基因組內(nèi)，并得到穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，從而創(chuàng)制家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器、后部絲腺生物反應(yīng)器、以及絲腺生物反應(yīng)器三種生物反應(yīng)器，育成家蠶中部絲腺細(xì)胞、后部絲腺細(xì)胞或兩部分絲腺細(xì)胞能夠特異性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種。
文檔編號A01K67/04GK102286529SQ20111012358
公開日2011年12月21日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月13日
發(fā)明者危浩, 周繼勇, 莊蘭芳, 鐘伯雄, 阮系真, 顏焰 申請人:浙江大學(xué)