專利名稱：與針對(duì)葡萄球菌性肺部疾病和病癥進(jìn)行免疫相關(guān)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體而言涉及免疫學(xué)、微生物學(xué)、傳染病學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在一個(gè)更具體的實(shí) 施方案中，它涉及含有外毒素蛋白(如a-溶血素)的用于產(chǎn)生針對(duì)細(xì)菌之免疫應(yīng)答的方 法和組合物。II.
背景技術(shù)：
治療金黃色葡萄球菌(S. aureus)性肺炎的現(xiàn)有方法依賴于抗微生物藥物，生物 有獲得針對(duì)所述藥物之抗性的明顯傾向。葡萄球菌感染的發(fā)病機(jī)制依賴于多種不同的毒力 因子如分泌的外毒素。以前的研究表明，缺失編碼這些因子的單基因未導(dǎo)致缺陷，或者僅導(dǎo) 致輕度的毒力降低。但是，本發(fā)明人在鼠模型系統(tǒng)中進(jìn)行的金黃色葡萄球菌性肺炎研究意 外地將a-溶血素(也稱作a毒素)確定為該疾病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵毒力因子，因?yàn)槿狈?這種外毒素的突變菌株是無(wú)毒的。a“溶血素是由金黃色葡萄球菌所分泌的細(xì)菌細(xì)胞毒素 家族的成員，它能夠插入到大量真核細(xì)胞的細(xì)胞膜中。該蛋白質(zhì)以單體形式分泌，但它在真 核細(xì)胞表面上組裝成七聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)。組裝后的毒素插入宿主細(xì)胞膜，形成由于破壞膜的 完整性而導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡的孔洞。一些生物化學(xué)研究已經(jīng)確定了 a-溶血素單體中促 進(jìn)與宿主細(xì)胞結(jié)合、七聚體形成和宿主細(xì)胞裂解的氨基酸殘基。葡萄球菌侵染策略的多樣性阻礙了葡萄球菌疫苗的開發(fā)。公認(rèn)的是，活的減毒微 生物是高效的疫苗，向受試者的免疫系統(tǒng)呈遞多種抗原。與非復(fù)制型或多組分免疫原產(chǎn)生 的免疫應(yīng)答相比，由這些疫苗引發(fā)的免疫應(yīng)答常常程度更高且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。對(duì)該現(xiàn)象的 一種解釋可能是，活的減毒菌株造成宿主中的局限性感染，模擬天然感染的早期階段，并且 向免疫系統(tǒng)呈遞多種抗原。大量參考文獻(xiàn)描述了在疫苗中包合a-溶血素(Hla)組分，其中一些文獻(xiàn)描述 了化學(xué)減毒或熱減毒的Hla類毒素。參見例如美國(guó)專利4，327，082。另一些參考文獻(xiàn)描 述了用多組分類毒素疫苗免疫人體以及分離Hla中和抗體用于被動(dòng)免疫。參見美國(guó)專利 4，027，010。Adlam等(1977)測(cè)試了純化的Hla對(duì)避免乳房感染的有效性。Adlam等觀察 到乳腺炎的“藍(lán)胸形式”(“blue breast form")減少，但是未觀察到針對(duì)局部慢性潰瘍形 式葡萄球菌病的保護(hù)作用。Adlam等將這一觀察結(jié)果歸因于僅有Hla不足以提供針對(duì)多因 素疾病狀態(tài)(如葡萄球菌感染的局部慢性潰瘍形式)的保護(hù)。Bhakdi等(1994)描述了具有第35位殘基突變之Hla的毒性降低，而且描述了向 兔施用該突變體未導(dǎo)致兔死亡。Menzies和Kernode(1996)描述了相似的Hla突變體H35L 及其用于在兔中產(chǎn)生抗體的用途，該抗體可進(jìn)一步純化用于被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)。Menzies和
5Kernode還描述了使用單一組分的疫苗產(chǎn)生保護(hù)作用的困難和預(yù)期的失敗。他們說(shuō)“金黃 色葡萄球菌作為病原體的巨大多樣性及其產(chǎn)生的多種毒力因子，使得不太可能使單一免疫 靶標(biāo)如a毒素成為有效的候選疫苗?！北景l(fā)明人注意到，這些參考文獻(xiàn)都未指出任何組合 物對(duì)預(yù)防或治療葡萄球菌性肺炎的有效性。本領(lǐng)域的現(xiàn)狀使得本領(lǐng)域技術(shù)人員不會(huì)將單獨(dú)的或基本上單獨(dú)的重組Hla認(rèn)為 是預(yù)防葡萄球菌感染(特別是葡萄球菌呼吸系統(tǒng)感染或葡萄球菌呼吸系統(tǒng)感染的間接效 應(yīng))的有效抗原。因此，在沒(méi)有或者基本沒(méi)有其他葡萄球菌抗原時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員不會(huì) 期望把Hla作為主要疫苗組分施用來(lái)引起足以預(yù)防或治療受試者呼吸道感染或葡萄球菌 相關(guān)肺炎的免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域仍需要另外的組合物和方法來(lái)預(yù)防和/或治療肺部的葡萄球菌感染，以及 減弱或改善這種感染的繼發(fā)效應(yīng)。發(fā)明概述本發(fā)明基于這樣的數(shù)據(jù)，其表明向人葡萄球菌性肺炎的動(dòng)物模型施用來(lái)源于金黃 色葡萄球菌的減毒a-溶血素(Hla)毒素可防止動(dòng)物死亡，減少?gòu)膭?dòng)物肺中回收的細(xì)菌數(shù) 量，而且將病理性損傷局限在感染的病灶部位。此外，本發(fā)明還基于這樣的數(shù)據(jù)，其表明可 對(duì)小鼠施用在兔中產(chǎn)生的針對(duì)a-溶血素(也稱作a毒素)的抗體，以賦予其針對(duì)葡萄球 菌性肺炎的保護(hù)效應(yīng)。因此，本發(fā)明涉及在受試者中使用Hla毒素作為單一治療進(jìn)行針對(duì) 葡萄球菌性肺炎之主動(dòng)免疫的方法和組合物(其中特別排除了其他葡萄球菌蛋白質(zhì)和抗 體)，以及使用a"溶血素特異性抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫的方法和組合物。某些實(shí)施方案包括含有分離多肽的免疫原性組合物，所述多肽含有SEQ ID N0:2 的至少或至多 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 個(gè)或更 多個(gè)氨基酸，包括其間的所有值和范圍。在某些方面中，分離多肽包含SEQ ID N0:2的至 少、至多或約1-50位氨基酸。在另一方面中，分離多肽為融合蛋白。所述組合物可含有佐 劑。在某些方面中，分離多肽為融合蛋白和/或脂肽。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，有對(duì)患者提供針對(duì)葡萄球菌性肺部疾病或病癥(例 如與葡萄球菌存在相關(guān)的疾病或病癥，包括由葡萄球菌感染導(dǎo)致的疾病，或者葡萄球菌感 染是之前疾病或病癥的后遺癥)之保護(hù)的方法，該方法包括對(duì)患者施用有效量的含有重組 和減毒的葡萄球菌a-溶血素(Hla)毒素的組合物，其中所述組合物包含不多于污染量的 其他任何葡萄球菌蛋白質(zhì)。污染量是指，除了含有Hla全部或片段的肽以外的蛋白質(zhì)、多肽 或肽的重量百分比低于10、5、1、0. 1,0. 05或更低。本發(fā)明上下文中的短語(yǔ)“保護(hù)患者”是指預(yù)防、治療、改善人類患者的葡萄球菌性 肺部疾病或病癥和/或降低其嚴(yán)重程度。除非另有說(shuō)明，它還指防止或延遲由疾病或病癥 導(dǎo)致的死亡，減少?gòu)姆尾炕厥盏钠咸亚蚓鷶?shù)量，將病理性損傷局限在病灶部位，縮小疾病或 病癥導(dǎo)致的損傷程度，縮短疾病或病癥的持續(xù)時(shí)間，和/或降低與疾病或病癥相關(guān)的癥狀 的數(shù)量、程度或持續(xù)時(shí)間。對(duì)人患者實(shí)施的本發(fā)明實(shí)施方案也可實(shí)施于任何哺乳動(dòng)物受試 者。在另一些方面中，可引導(dǎo)所述方法來(lái)引發(fā)對(duì)葡萄球菌的免疫應(yīng)答。在另一方面中，患者 患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生與葡萄球菌相關(guān)的肺部疾病。本發(fā)明的另一些實(shí)施方案涉及預(yù)防患者中葡萄球菌性肺部疾病或病癥的方法，該方法包括對(duì)患者施用有效量的含有重組和減毒的葡萄球菌a-溶血素(Hla)毒素的組合 物，其中所述組合物不引發(fā)針對(duì)任何其他葡萄球菌蛋白質(zhì)的可檢測(cè)免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及對(duì)患者提供針對(duì)葡萄球菌性肺部疾病或病癥之保護(hù)的方法，該方法 包括對(duì)患者施用有效量的基本由重組和減毒的葡萄球菌a-溶血素(Hla)毒素組成的組合
物。術(shù)語(yǔ)“基本由......組成”意思是所述組合物不含有可實(shí)質(zhì)性影響本發(fā)明基本特性和
新特性(即在組合物中使用重組減毒Hla毒素作為葡萄球菌抗原以在患者中引發(fā)針對(duì)葡萄 球菌之免疫應(yīng)答)的其他成分。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，有對(duì)患者提供針對(duì)葡萄球菌性肺部疾病或病癥之 保護(hù)的方法，該方法包括對(duì)患者施用有效量的含有對(duì)金黃色葡萄球菌a-溶血素(Hla)有 免疫反應(yīng)性之人源化抗體的組合物。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指經(jīng)遺傳工程改造而使移植到人類抗體中的非人抗體量盡 可能小的抗體。含有非人序列的抗體部分通常為抗體的可變部分，而非可變部分是人序列。 通常地，人源化抗體具有90-95%的人序列和5-10%的非人序列。術(shù)語(yǔ)“有免疫反應(yīng)性”意 思是所述抗體特異性識(shí)別特定抗原并產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)“葡萄球菌性肺部疾病或病癥”是指葡萄球菌感染引發(fā)、促成、加重和/或幫 助持續(xù)的肺部疾病或病癥。在一些具體實(shí)施方案中，葡萄球菌性肺部疾病或病癥為肺炎。本發(fā)明的方法包括以有效實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的(如本發(fā)明所指出的)的量來(lái)提供抗原、 表位或抗體。更具體地，在一些實(shí)施方案中，有效量是指有效刺激或引發(fā)免疫應(yīng)答、或提供 對(duì)感染的抗性或改善感染的活性成分的量。在更具體的方面中，有效量預(yù)防、減輕或改善疾 病或感染的癥狀，或延長(zhǎng)被治療受試者的存活期。有效量的測(cè)定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的 能力之內(nèi)，特別是借助于本文提供的已詳細(xì)公開的內(nèi)容。對(duì)本發(fā)明方法中使用的任何制備 物，有效量或劑量均可以首先從體外、細(xì)胞培養(yǎng)物、和/或動(dòng)物模型測(cè)定中估算。例如，可以 在動(dòng)物模型中得出獲得期望的免疫應(yīng)答或循環(huán)抗體濃度或效價(jià)的劑量。這些信息可以用于 更為準(zhǔn)確地確定人體中的有用劑量。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中涉及的患者被認(rèn)為有罹患葡萄球菌性肺部疾病 或病癥的風(fēng)險(xiǎn)。這些患者包括但不僅限于已住院或?qū)⒆≡旱幕颊?、已進(jìn)入或?qū)⑦M(jìn)入重癥監(jiān) 護(hù)室的患者、將進(jìn)行手術(shù)的患者、將被麻醉或處于全身麻醉中的患者、年齡超過(guò)65歲的患 者，免疫系統(tǒng)受損的患者、兒童患者、佩戴或可能佩戴呼吸機(jī)或其他機(jī)械通氣機(jī)的患者、即 將或已經(jīng)植入氣管內(nèi)導(dǎo)管的患者、已經(jīng)或即將無(wú)法移動(dòng)的患者，即將、正在或已經(jīng)進(jìn)行化學(xué) 治療或清髓治療的患者，以及即將、正在或已經(jīng)服用一種或多種免疫抑制劑特別是持續(xù)很 長(zhǎng)時(shí)間(長(zhǎng)于一個(gè)月)的患者。此外，本發(fā)明涉及的是，所述患者還可表現(xiàn)為健康個(gè)體，或 者可從本發(fā)明方法和組合物中獲益的病人可以無(wú)已知或明顯的肺炎風(fēng)險(xiǎn)因子。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，方法還可包括鑒定具有罹患葡萄球菌性肺部疾病 或病癥之風(fēng)險(xiǎn)的患者。此外，方法還可包括評(píng)估患者罹患葡萄球菌性肺部疾病或病癥的風(fēng) 險(xiǎn)因子，評(píng)估患者的葡萄球菌性肺部疾病或病癥的癥狀，或診斷患者的葡萄球菌性肺部疾 病或病癥。在某些實(shí)施方案中，方法可包括所述葡萄球菌性肺部疾病或病癥為肺炎的實(shí)施 步驟。在本發(fā)明的一些方面中，a-溶血素(Hla)毒素是減毒的，意思是通過(guò)改造使所 述毒素比未改造毒素功能更弱或毒力更低。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變產(chǎn)生Hla突變體，從而對(duì)所述毒素進(jìn)行減毒。氨基酸改變可以是缺失、插入和 / 或替換 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、 159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、 178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、 197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、 235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、 254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、 273、274、275、276、277、278、279、280、281、282和283個(gè)氨基酸或其中可得出的任何范圍。 在一些實(shí)施方案中，所述改變涉及SEQID N0:1或SEQ ID NO :2。在具體實(shí)施方案中，所述改 變位于SEQ ID而2的第24、35、66、70、110和/或152位。在具體實(shí)施方案中，所述改變?yōu)?D24C、H35C、H35K、R66C、E70C或K110C，或其任何組合(使用單字母代碼指代氨基酸)。此 外，在具體實(shí)施方案中，減毒的Hla毒素為H35L (文獻(xiàn)中使用的名字)，它是指在多肽35位 具有代替組氨酸之亮氨酸的毒素。可預(yù)期的是，35位可替換成位于該位置的其他任何氨基 酸，包括其他19種天然氨基酸中的任一種。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，減毒的Hla 毒素是重組的，意思是使用通過(guò)重組工程改造的DNA來(lái)產(chǎn)生所述毒素。在某些實(shí)施方案中，Hla毒素具有與SEQ ID NOs :1或2相同或相似的序列。在某些 方面中，Hla毒素是成熟的Hla毒素(SEQ ID NO :2)，其中去除了 SEQ ID NO :1的前26個(gè)氨 基酸。在具體實(shí)施方案中，Hla毒素具有來(lái)源于金黃色葡萄球菌Hla毒素的蛋白質(zhì)序列。相 似性或同一性(優(yōu)選同一性)為本領(lǐng)域所知，可使用許多不同程序來(lái)確定蛋白質(zhì)(或核酸) 是否具有相對(duì)于已知序列的序列同一性或相似性。序列同一性和/或相似性可使用本領(lǐng)域 的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定，包括但不僅限于Smith和Waterman (1981)的局部序列同一性算法，通 過(guò)Needleman和Wunsch(1970)的序列同一性比對(duì)算法，通過(guò)Pearson和Lipman(1988)的 相似性檢索方法，通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)工具(Wisconsin Genetics Software Package, GeneticsComputer Group, 575 Science Drive,Madison, Wis.中的 GAP、BESTFIT、FASTA 禾口 TFASTA)，Devereux等(1984)描述的Best Fit序列程序，優(yōu)選使用默認(rèn)設(shè)置，或者通過(guò)觀 察。優(yōu)選地，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或可獲得的比對(duì)工具來(lái)計(jì)算同一性百分比。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，減毒Hla毒素在膜結(jié)合、細(xì)胞裂解(可具體為紅細(xì)胞 的細(xì)胞裂解或溶血作用或抗原呈遞細(xì)胞的裂解)和/或七聚體形成方面的活性降低或消 失。在對(duì)這些活性的測(cè)定中(如以引用方式并入本文的Walker和Bailey (1995)等所描 述的方法和本文的方法)，任一或所有這些活性相對(duì)于未減毒Hla毒素可降低約、至少約或 至多約 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、100%。在某些實(shí)施方案中，減毒的Hla毒素缺少可檢測(cè)的溶血活性
8或致死活性。此外，本發(fā)明涉及的是，在一些實(shí)施方案中Hla毒素是變性或未變性的，如通過(guò)化 學(xué)變性(如使用甲酰胺和甲醛)或熱變性。術(shù)語(yǔ)“基本未變性”是指在毒素中可能檢測(cè)到 一定的變性，但免疫活性或者與構(gòu)象特異性結(jié)合物(與多肽的三級(jí)或二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān))的結(jié) 合能力也是可檢測(cè)的。在具體實(shí)施方案中，Hla毒素是純化的，可采用或不采用輕度變性來(lái) 獲得。在本發(fā)明的一些方面中，Hla毒素是有活性的，意思是毒素保留一定的可檢測(cè)水平的 功能或活性，如前面所描述的那些，包括結(jié)合能力。本發(fā)明涉及的是，可將Hla毒素純化到 約、至少約或至多約 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%, 98%、99%、100%的純度或均一性(相對(duì)于其他蛋白質(zhì)分子和/或細(xì)胞大分子)，或其中可 得出的任何范圍。在另一些實(shí)施方案中，重組Hla毒素可以是分離的。術(shù)語(yǔ)“分離的”可 指核酸或多肽，其基本不含其所來(lái)源的細(xì)胞材料、細(xì)菌材料、病毒材料或培養(yǎng)基(當(dāng)用重組 DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí))或者化學(xué)前體或其他化學(xué)品(當(dāng)化學(xué)合成時(shí))。此外，分離的化合物是指 能夠以分離化合物的形式施用于受試者的化合物；也就是說(shuō)，如果化合物被吸附于柱中或 包埋于瓊脂糖凝膠中，則不可簡(jiǎn)單地認(rèn)為它是“分離的”。此外，“分離的核酸片段”或“分離 的肽”是不以片段形式天然存在和/或通常不處于功能狀態(tài)的核酸或蛋白質(zhì)片段。本發(fā)明的方法包括對(duì)患者施用Hla毒素來(lái)刺激患者中針對(duì)Hla的免疫應(yīng)答。在某 些實(shí)施方案中，方法包括對(duì)患者檢測(cè)針對(duì)Hla毒素的抗體。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 熟知，它們包括但不僅限于以下分析方法Western印跡、ELISA、斑點(diǎn)印跡、夾心測(cè)定、免疫 組織化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)如FACS。本發(fā)明涉及的是，可單次或多次施用本發(fā)明組合物。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，將 組合物施用1、2、3、4、5、6或更多次或其中可得出的任何范圍。本發(fā)明涉及的是，預(yù)防或治 療方案可包含在1、2、3、4、5、6和/或7天或者1、2、3、4或5周和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11和/或12個(gè)月或其中可得出的任何范圍中多次施用。此外，任何這種方案均可在經(jīng) 過(guò)一定長(zhǎng)度的時(shí)間之后、或當(dāng)受試者重新表現(xiàn)出罹患葡萄球菌性疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)或罹患 疾病或病癥時(shí)重復(fù)實(shí)施。可通過(guò)用于將疫苗或抗體引入患者的任何途徑對(duì)患者施用本發(fā)明組合物。這些途 徑包括但不局限于粘膜或肌內(nèi)遞送。在具體實(shí)施方案中，通過(guò)鼻內(nèi)或吸入對(duì)患者施用組合 物。在另一些實(shí)施方案中，通過(guò)靜脈或靜脈注射施用組合物。在另外的實(shí)施方案中，組合物 的施用方式包括但不局限于口服、腸胃外、皮下、肌肉、靜脈施用，或它們的多種組合。可將所述組合物配制成藥學(xué)上可接受的組合物。在本發(fā)明的某些方面中，所述葡 萄球菌是金黃色葡萄球菌。此外，在本發(fā)明實(shí)施方案中，方法可包括含有約、至少約或至多約0. 1,0. 2,0. 3、 0. 4、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、 9. 5、10. 0、10. 5、11. 0、11. 5,12. 0,12. 5,13. 0,13. 5,14. 0,14. 5,15. 0,15. 5,16. 0,16. 5、 17.0,17.5,18.0,18.5,19.0,19. 5,20. 0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、 170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、 540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、 730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、 920、930、940、950、960、970、980、990或lOOOii g或mg蛋白質(zhì)(或其中可引出的任何范圍)
的組合物。所述蛋白質(zhì)可以在約、至少約或至多約0 1、0. 2、0. 3、0..4、0. 5、0. 6、0.7,0.8、0. 9,1.0、1 1,1.2,1.3,1.4,1. 5,1.6、1. 7、1. 8、1. 9、2.0、2. 1、2. 2、2.3 > 2 4 > 2. 5 > 2.6,2. 7、2. 8、2.9、3,.0、3.1,3.2,3.3 > 3 4 > 3 5、3. 6、3. 7、3. 8、3.9,4. 0,4. 1,4.2,4. 3,4. 4,4.5,4. 6、4. 7,4.8、4, 9 > 5 0,5.1,5.2 > 5. 3 > 5.4、5. 5、5. 6、5. 7、5.8、5. 9、6. 0、6.1、6. 2、6. 3、6.4,6. 5、6. 6、6.7,6, 8、6.9,7.0,7.1,7. 2,7.3,7. 4,7. 5,7. 6,7.7,7. 8、7. 9、8.0、8.1、8.2、8.3,8. 4、8. 5、8..6、8.7,8.,8、8, 9、9 0、10、11、12、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、,24、25、26,27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、
51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、 110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、 300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、 480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、 670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、 860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990 或 1000 ii 1 或 ml (或其中 可引出的任何范圍)中。在某些方面中，可按照每kg體重0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、1.0、1.5、 2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、9. 5、10. 0、10. 5、 11. 0,11. 5,12. 0,12. 5,13. 0,13. 5,14. 0,14. 5,15. 0,15. 5,16. 0,16. 5,17. 0,17. 5,18. 0、 18.5,19.0,19.5,20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、 210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、 400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、 580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、 770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、 960、970、980、990或lOOOmg的劑量施用一種或多種抗Hla抗體。在一些實(shí)施方案中，還給予患者一種或多種用于治療金黃色葡萄球菌肺部感染的 抗生素。所述抗生素可以被包括或不包括在含Hla毒素或Hla毒素特異性抗體的組合物之 內(nèi)。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，組合物含有一種或多種佐劑。佐劑可共價(jià)地或非 共價(jià)地連接到本發(fā)明多肽或肽上。在某些方面中，所述佐劑以化學(xué)方法綴合到蛋白質(zhì)、多肽 或肽上本發(fā)明的部分(如抗原或免疫原)可共價(jià)地或非共價(jià)地綴合或連接至其他部分如 佐劑、蛋白質(zhì)、肽、支持物、熒光部分或標(biāo)記。術(shù)語(yǔ)“綴合”或“免疫綴合”用于寬泛地定義一 部分與另一制劑的有效聯(lián)合，而非意圖單指任一類型的有效聯(lián)合，特別是不局限于化學(xué)“綴合”。重組的融合蛋白是特別涉及的?；谄渌廴疚锏牧?，核酸或多肽組合物可至少具有 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%^； 100% 的純度。在另一些實(shí)施方案中，組合物含有編碼Hla毒素的重組核酸分子。重組核酸分子 通常包含異源的啟動(dòng)子。在某些方面中，本發(fā)明的重組核酸分子是載體，在另一些方面中， 所述載體為質(zhì)粒。在某些實(shí)施方案中，所述載體為病毒載體。通常向人受試者施用組合物， 但也涉及向能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的其他動(dòng)物施用，特別是牛、馬、山羊、綿羊和其他馴養(yǎng)的動(dòng) 物。在另一些方面中，所述葡萄球菌為金黃色葡萄球菌。在另一些實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng) 答為保護(hù)性免疫應(yīng)答。在另一些方面中，本發(fā)明的方法和組合物可用于預(yù)防、減輕、降低或 治療肺部感染，特別是肺炎和其他肺部感染。其他方法包括但不局限于，預(yù)防性降低未表現(xiàn) 出感染跡象之受試者體內(nèi)的細(xì)菌含量，特別是疑似有目標(biāo)細(xì)菌定殖的受試者或具有此風(fēng)險(xiǎn) 的受試者，例如在住院、治療和/或恢復(fù)期間有或會(huì)有感染風(fēng)險(xiǎn)和易受感染的患者。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”是能夠與抗體或T細(xì)胞受體結(jié)合的分子?？乖€能夠誘 導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致B和/或T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。引起生物學(xué)應(yīng)答的 抗原結(jié)構(gòu)方面在本文中被稱作“抗原決定簇”。B淋巴細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生抗體來(lái)應(yīng)答外來(lái)抗原決 定簇，而T淋巴細(xì)胞則是細(xì)胞免疫的介導(dǎo)者。除了作為細(xì)胞免疫的介導(dǎo)者，T淋巴細(xì)胞還可 通過(guò)進(jìn)一步刺激B淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的應(yīng)答來(lái)促進(jìn)抗體產(chǎn)生。因此，抗原決定簇或表位是為 抗體或T細(xì)胞受體(在MHC的情況下)所識(shí)別的抗原部分。抗原決定簇不需要是蛋白質(zhì)的 連續(xù)序列或片段，而是可包含不相互鄰近的多個(gè)序列。在本申請(qǐng)全文中還討論了本發(fā)明的其他實(shí)施方案。與本發(fā)明某一方面相關(guān)的任一 實(shí)施方案均適用于本發(fā)明的其他方面，反之亦然。在實(shí)施例章節(jié)中的實(shí)施方案應(yīng)理解為適 用于本發(fā)明所有方面的本發(fā)明實(shí)施方案。本發(fā)明特別涉及的是可在要保護(hù)的發(fā)明中具體納入或排除列表中的各個(gè)成分或要素。當(dāng)在權(quán)利要求和/或說(shuō)明書中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“抑制”、“降低”或“預(yù)防”或這些術(shù)語(yǔ) 的任何變異詞包括用于實(shí)現(xiàn)期望結(jié)果的任何可測(cè)量的降低或完全抑制。當(dāng)在權(quán)利要求和/或說(shuō)明書中與術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”等聯(lián)合使用時(shí)，無(wú)數(shù)量詞修 飾的詞語(yǔ)可指“一個(gè)”，但也可與“一個(gè)或多個(gè)”、“至少一個(gè)”和“一個(gè)或多于一個(gè)”的意思一致。本發(fā)明涉及的是，本文中所討論的任一實(shí)施方案均可應(yīng)用于本發(fā)明的任何方法或 組合物，反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物和試劑盒可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。在本申請(qǐng)全文中，使用術(shù)語(yǔ)“約”來(lái)指示數(shù)值，所述數(shù)值包含測(cè)定該值所用儀器或 方法的標(biāo)準(zhǔn)誤差。權(quán)利要求中的術(shù)語(yǔ)“或”用于表示“和/或”，除非明確指出僅表示選擇，或者選擇 之間是互斥的，但本公開內(nèi)容支持僅表示選擇和“和/或”的定義。本說(shuō)明書和權(quán)利要求中所使用的詞語(yǔ)“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包容性 的或開放式的，而不排斥另外的未提及的要素或方法步驟。通過(guò)下文的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)將是很明顯的。但是，應(yīng)當(dāng) 理解的是，僅僅通過(guò)舉例說(shuō)明的方式給出了詳細(xì)描述和具體實(shí)例(即本發(fā)明的具體實(shí)施方 案)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)這一詳細(xì)描述，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的許多改變和修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是很明顯。


以下附圖是本說(shuō)明書的一部分，并用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的某些方面。通過(guò)參考 一個(gè)或多個(gè)圖并結(jié)合本文給出的具體實(shí)施方案的詳述，可以更好地理解本發(fā)明。圖1A-1C a-溶血素(Hla)是CA-MRSA(社區(qū)型耐甲氧西林金黃色葡萄球菌， community associated-methicillin resistant S. aureus)肺部感染的毒力因子。(圖 1A) CA-MRSA菌株金黃色葡萄球菌LAC(野生型)與同基因型hla: :erm突變體在鼠肺部感染模 型中的毒力比較，通過(guò)測(cè)定感染后24、48和72小時(shí)的動(dòng)物死亡率而得到。每組感染10只 動(dòng)物(P < 0. 0007)。(圖 1B)在 CA-MRSA 菌株 LAC 或 MW2 中缺失編碼 Panton-Valentine 殺白細(xì)胞素(Panton-Valentine leukocidin, PVL)毒素的 lukS-PV 和 lukF-PV 基因，不影 響在葡萄球菌性肺炎鼠模型中的毒力。用2X108CFU的金黃色葡萄球菌LAC野生型(wt)或 同基因型lukS-PV和lukF-PV缺失突變體(Apvl) (p = 0. 22)和3_4X108CFU的金黃色葡 萄球菌麗2(wt)及其同基因型pvl缺失突變體(Apvl) (p = 0.41)來(lái)感染小鼠。在感染后 24,48和72小時(shí)測(cè)定每種菌株15只動(dòng)物一組的死亡率。(圖1C)通過(guò)蘇木精-伊紅染色， 切片肺組織的組織病理學(xué)分析顯示相似的肺部損傷模式，與PVL在LAC和MW2分離群中的 表達(dá)無(wú)關(guān)。圖2A-2B a -溶血素(Hla)是CA-MRSA (社區(qū)型耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)肺 部感染的毒力因子。(圖2A)用2X108CFU的金黃色葡萄球菌LAC野生型(wt)或同基因 型lukS-PV和lukF-PV缺失突變體(A pvl) (p = 0. 22)和3-4X 108CFU的金黃色葡萄球菌 麗2(wt)及其同基因型pvl缺失突變體(Apvl) (p = 0. 41)來(lái)感染小鼠。被葡萄球菌感染 24小時(shí)后之動(dòng)物右肺的細(xì)菌回收顯示，缺失lukS-PV和lukF-PV不影響葡萄球菌在肺部組 織中的復(fù)制(每種菌株10只動(dòng)物一組)。采用Student’ s t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到，與 LAC菌株比較為p = 0. 46, MW2菌株為p = 0. 23。(圖2B)用針對(duì)LukS-PV和LukF-PV之 抗體進(jìn)行的免疫印跡證實(shí)，pvl突變體菌株中無(wú)相應(yīng)毒素分泌，而a-溶血素(Hla)的分泌 不受同基因型pvl缺失的影響。用星號(hào)D標(biāo)記的交叉反應(yīng)種類遷移略快于LukF-PV。圖3A-3F表達(dá)Panton-Valentine殺白細(xì)胞素(PVL)的小Sa2mw噬菌體的溶原性 不影響金黃色葡萄球菌Newman在葡萄球菌性肺炎鼠模型中的毒力。(圖3A)圖示金黃色 葡萄球菌Newman的基因組、其復(fù)制起點(diǎn)(ori)和終點(diǎn)(ter)、以及四個(gè)原噬菌體插入位點(diǎn) (小NM1、小匪2、小匪3、小匪4)。標(biāo)出了小Sa2mw在金黃色葡萄球菌Newman中的插入位點(diǎn)。 (圖3B)菌株Newman的$ Sa2mw溶原性引起lukS-PV和lukF-PV的表達(dá)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)培養(yǎng)物 上清液樣品中用兔抗血清進(jìn)行的免疫印跡分析可檢測(cè)到這兩種PVL毒素組分(LukS-PV和 LukF-PV)。用星號(hào)(*)標(biāo)記的交叉反應(yīng)種類遷移略快于LukF-PV。(圖3C)用3-4X108 集落形成單位(CFU)的金黃色葡萄球菌Newman (wt)或由 Sa2mw溶原化的同基因型變體 (Newman (t Sa2mw)鼻內(nèi)接種24小時(shí)后之小鼠右肺的細(xì)菌回收，未顯示葡萄球菌復(fù)制存在 顯著差異(Student t檢驗(yàn)p = 0.74，每組15只動(dòng)物)。細(xì)菌回收的平均值用橫線指示。 (圖3D)通過(guò)鼻內(nèi)接種用金黃色葡萄球菌Newman (wt)或用小Sa2mw溶原化的同基因型突 變體(Newman Sa2mw)感染的動(dòng)物在觀察24、48或72小時(shí)之后表現(xiàn)出相似的致死性(p = 0.58)。(圖3E)將hla::erm等位基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入金黃色葡萄球菌Newmanc^Sdmw消除了在鼠
12肺部感染模型中的毒力(P < 0. 00004)。圖4A-4B表達(dá)Panton-Valentine殺白細(xì)胞素(PVL)的小Sa2mw噬菌體的溶原性 不影響金黃色葡萄球菌Newman在葡萄球菌性肺炎鼠模型中的毒力。(圖4A)經(jīng)由鼻內(nèi)途 徑用3-4X 108CFU帶有空載體或ppvl的金黃色葡萄球菌Newman感染的動(dòng)物表明，質(zhì)粒介 導(dǎo)的PVL過(guò)表達(dá)不影響動(dòng)物死亡率(p = 0. 27)。a-溶血素缺陷型菌株(hla: :erm)在肺 部感染中無(wú)毒力，并分析了用空載體、ppvl或phla轉(zhuǎn)化的hla: :erm突變體在鼠肺部感染 模型中毒力特征。每種菌株檢測(cè)10到15只動(dòng)物，記錄感染后24、48和72小時(shí)的死亡率。 用金黃色葡萄球菌hla突變體(phla)感染的動(dòng)物的死亡率明顯高于用帶有空載體或ppvl 的金黃色葡萄球菌hla突變體(phla)感染的動(dòng)物的死亡率(p = 0. 00004)。(圖4B)來(lái)源 于用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的金黃色葡萄球菌Newman及其同基因型hla: :erm突變體的18小時(shí)培養(yǎng)物 上清液的免疫印跡分析，所述質(zhì)粒促進(jìn)PVL(ppvl、lukS-PV和lukF-PV)、a -溶血素(phla) 或空載體表達(dá)。特異性抗體指示LukS-PV、LukF-PV、a -溶血素(Hla)和核酸酶的存在和/ 或缺乏。用星號(hào)D標(biāo)記的交叉反應(yīng)種類遷移略快于LukF-PV。圖5A-5E用突變a -溶血素進(jìn)行免疫提供了針對(duì)葡萄球菌性肺炎的保護(hù)。(圖5A) 將C57BL/6J小鼠用PBS或20y g HlaH3a (具有阻止毒素活性和孔洞形成之單氨基酸替換的 突變a-溶血素)進(jìn)行免疫，然后用金黃色葡萄球菌Newman攻擊。記錄感染后24、48和72 小時(shí)的死亡率(P < 0. 001)。(圖5B)用HlaH3a免疫小鼠減少了感染的鼠肺部組織中金黃 色葡萄球菌Newman的生長(zhǎng)。(圖5C)來(lái)自用PBS或HlaH3a免疫之小鼠的金黃色葡萄球菌 Newman感染肺部組織的總體病理學(xué)。(圖5D)來(lái)自用PBS或HlaH3a免疫之小鼠的金黃色 葡萄球菌Newman感染肺部組織的組織病理學(xué)。(圖5E)將C57BL/6J小鼠用PBS或20 y g HlaH35L進(jìn)行免疫，然后用金黃色葡萄球菌CA-MRSA菌株LAC或MW2攻擊。記錄感染后24、48 和72小時(shí)的死亡率。用金黃色葡萄球菌菌株LAC(p = 0.00001)或麗2 (p = 0.018)攻擊 時(shí)，HlaH3a免疫動(dòng)物的死亡率明顯低于假(PBS)免疫動(dòng)物的死亡率。圖6A-6C a -溶血素介導(dǎo)葡萄球菌性人肺泡細(xì)胞損傷。(圖6A)用金黃色葡萄球 菌(菌株LAC、麗2或Newman)感染人A549肺泡細(xì)胞。在37°C共培養(yǎng)4小時(shí)后，對(duì)每個(gè)孔 進(jìn)行裂解細(xì)胞的乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenas^LDH)釋放測(cè)定。一式三份進(jìn)行感染， 用Student t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。(圖6B)未感染的或者用帶有質(zhì)粒載體或phla之 a -溶血素突變體金黃色葡萄球菌菌株(hla: :erm)感染的A549細(xì)胞的相差顯微圖像。感 染3小時(shí)后采集圖像。(圖6C)通過(guò)用抗Hla兔血清處理或與純化的HlaH35L預(yù)孵育，降低了 a-溶血素介導(dǎo)的葡萄球菌性人肺細(xì)胞損傷，而無(wú)反應(yīng)性的兔血清(non-reactive rabbit serum, NRS)沒(méi)有效果。圖7A-7F用抗Hla血清進(jìn)行的小鼠被動(dòng)免疫產(chǎn)生了針對(duì)葡萄球菌性肺部感染的保 護(hù)作用。(圖7A)通過(guò)腹膜內(nèi)注射用無(wú)反應(yīng)性(NRS)、或帶有抗Hla抗體的兔血清對(duì)小鼠進(jìn) 行被動(dòng)免疫，然后用金黃色葡萄球菌Newman攻擊(p < 0. 0007)。記錄感染后24、48和72 小時(shí)的死亡率。(圖7B)用抗Hla進(jìn)行的小鼠被動(dòng)免疫降低了金黃色葡萄球菌Newman在鼠 肺部組織中生長(zhǎng)的能力(圖7C)，還降低了感染后的總體病理學(xué)(圖7D)和組織病理學(xué)損 傷。(圖7E)抗Hla抗血清還在通過(guò)鼻內(nèi)接種用金黃色葡萄球菌菌株LAC(p < 0. 025)或 MW2 (p < 0. 009)攻擊時(shí)保護(hù)動(dòng)物。(圖7F)根據(jù)感染后24、48和72小時(shí)的記錄，抗PVL免 疫球蛋白不能提供針對(duì)金黃色葡萄球菌LAC感染的保護(hù)作用(p = 0. 55)。
圖8用針對(duì)a-溶血素之抗體進(jìn)行的被動(dòng)免疫影響了葡萄球菌性肺部感染期間的 細(xì)胞因子應(yīng)答。將無(wú)反應(yīng)性或帶有抗Hla抗體的兔血清注射入小鼠的腹腔內(nèi)。通過(guò)檢測(cè) IL-10 和 IFN-Y 濃度的多元珠細(xì)胞因子測(cè)定(multiplex bead-based cytokine assay) 來(lái)測(cè)定血清細(xì)胞因子水平。用Student t檢驗(yàn)(每組9只動(dòng)物)計(jì)算細(xì)胞因子水平差異的 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，并記錄下來(lái)。圖9針對(duì)a -溶血素之小鼠單克隆抗體對(duì)A549細(xì)胞提供針對(duì)金黃色葡萄球菌所 誘導(dǎo)裂解的保護(hù)。在無(wú)反應(yīng)性(NRS)或帶有抗Hla的兔血清存在下，將A549細(xì)胞與活的金 黃色葡萄球菌共培養(yǎng)。將另外的A549細(xì)胞孔與活的金黃色葡萄球菌以及兩種獨(dú)立的抗Hla 單克隆抗體(7B8. 35和1A9)或其同種型匹配的對(duì)照抗體(分別是IgG2a和IgG2b)共培養(yǎng)， 證實(shí)多克隆兔抗血清和小鼠單克隆抗體都能對(duì)A549細(xì)胞提供針對(duì)Hla所誘導(dǎo)損傷的保護(hù)。圖10在A549細(xì)胞LDH釋放測(cè)定中的小鼠單克隆抗體滴定。在金黃色葡萄球 菌Newman存在下，將同種型對(duì)照抗體(IgG2a或IgG2b)或抗a-溶血素的單克隆抗體 7B8. 35/1A9. 4F9加入A549細(xì)胞共培養(yǎng)物中。按照以下濃度在測(cè)定中滴定單克隆抗體從左 至右為 2. 5mg/ml、2mg/ml、l. 5mg/ml、lmg/ml、0. 5mg/ml、0. lmg/ml、0. Olmg/ml 禾口 0. OOlmg/ ml。在共培養(yǎng)4小時(shí)之后測(cè)定LDH釋放。圖11A-11B抗a -溶血素的單克隆抗體7B8. 35和1A9. 4F9對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供針對(duì) 金黃色葡萄球菌性肺炎相關(guān)死亡的保護(hù)。用金黃色葡萄球菌Newman感染之前24小時(shí)， 15只小鼠一組接受同種型對(duì)照抗體(IgG2a，圖A或IgG2b，圖B)或相應(yīng)抗Hla單克隆抗體 (7B8. 35，圖A或1A9.4F9，圖B)的腹膜內(nèi)注射。每種抗體以5mg/kg的劑量遞送。經(jīng)由鼻內(nèi) 途徑的金黃色葡萄球菌感染后，觀察動(dòng)物的急性致死疾病，表現(xiàn)出由任一單克隆抗體處理 所提供的顯著保護(hù)作用。 圖12抗Hla的單克隆抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供針對(duì)USA300/LAC所致肺炎的保護(hù)。動(dòng) 物接受同種型對(duì)照抗體(IgG2a或IgG2b)或相應(yīng)抗Hla單克隆抗體(7B8. 35或1A9. 4F9) 的腹膜內(nèi)給藥。每種抗體以5mg/kg的劑量施用。經(jīng)由鼻內(nèi)途徑的金黃色葡萄球菌菌株 USA300/LAC感染后，觀察動(dòng)物的急性致死疾病，表現(xiàn)出由任一單克隆抗體處理所提供的顯 著保護(hù)作用。圖13 HlaH35L截短產(chǎn)物的圖示。全長(zhǎng)HlaH35L和示于全長(zhǎng)蛋白質(zhì)下方的7個(gè)截
短產(chǎn)物。圖14抗Hla單克隆抗體與成熟毒素的單個(gè)N端區(qū)域結(jié)合。用單克隆抗體7B8. 35 和1A9. 4F9進(jìn)行的HlaH35L截短產(chǎn)物的點(diǎn)印跡分析證實(shí)，為兩種單克隆抗體所識(shí)別的表位 位于所述蛋白質(zhì)的前50個(gè)氨基酸之內(nèi)。發(fā)明詳述鼠模型系統(tǒng)中金黃色葡萄球菌性肺炎的研究將a _溶血素(Hla)確定為疾病致病 過(guò)程的關(guān)鍵毒力因子，因?yàn)槿鄙龠@一外毒素的突變菌株是無(wú)毒力的。Hla是由金黃色葡萄 球菌所分泌的細(xì)菌外毒素家族的成員，能夠插入多種真核細(xì)胞的細(xì)胞膜。該蛋白質(zhì)以單體 的形式分泌，在真核細(xì)胞表面組裝成七聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)。組裝后的外毒素插入宿主細(xì)胞膜，形 成通過(guò)破壞膜完整性而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡的孔洞。一些生物化學(xué)研究確定了 Hla單體中 促進(jìn)與宿主細(xì)胞結(jié)合、七聚體形成和宿主細(xì)胞裂解的氨基酸殘基。已知成熟毒素中35位的 組氨酸殘基是有效的七聚體形成和細(xì)胞裂解所需要的，但是對(duì)結(jié)合真核細(xì)胞靶標(biāo)不是必要的。本發(fā)明人考慮到，能夠中和Hla的疫苗接種策略應(yīng)該提供針對(duì)金黃色葡萄球菌性肺炎 的免疫保護(hù)。為此，本發(fā)明人制備了以將35位組氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼岬腍la突變體或變體形 式(HlaH35L)為代表的重組的減毒或毒力降低的Hla，因而阻止了該外毒素的有效組裝。用上述突變毒素免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供了針對(duì)金黃色葡萄球菌攻擊后肺炎的保護(hù)作 用。該保護(hù)作用表現(xiàn)為死亡率降低、從肺部回收的細(xì)菌更少以及將病理?yè)p傷局限在病灶區(qū) 域中。相似地，使用以重組HlaH35L免疫的兔血清進(jìn)行的被動(dòng)免疫對(duì)小鼠提供針對(duì)金黃色 葡萄球菌性肺炎的保護(hù)，證實(shí)了與主動(dòng)免疫后所見相同的益處。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于緩解或免除感染和/或預(yù)防或治療葡萄球菌性肺炎 的免疫原性蛋白質(zhì)、多肽和肽(例如Hla和HlaH35L)及其片段?？乖缘鞍踪|(zhì)、多肽或肽 包括但不局限于來(lái)自葡萄球菌特別是金黃色葡萄球菌的Hla蛋白的全部或部分。這些菌株 的非限制性實(shí)例包括屬于Lindsay等(2006)鑒定的10個(gè)克隆類群(CC1、CC5、CC8、CC12、 CC15、CC22、CC25、CC30、CC45和CC51)中之一的那些。更具體地，抗原性蛋白質(zhì)、多肽或肽包 括但不局限于來(lái)自金黃色葡萄球菌MRSA菌株以及與醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染相關(guān)的分化體 (clade)(包括但不局限于金黃色葡萄球菌菌株8325、Barnum、Berlin、Brazilian Iberian、 COL、EMRSA-15、EMRSA-16、Hanover、LAC、N315, MRSA 252、MW2、Mu50、Pediatric NY、Japan 和歸類于 CDC 分化體 USA 100、USA 200、USA 300、USA 500、USA 600 和 USA 800 中的金黃 色葡萄球菌菌株)的Hla蛋白的全部或部分。I.葡萄球菌HLA葡萄球菌a-溶血素(Hla或a毒素)是細(xì)菌成孔桶毒素家族的基本成 員(Bhakdi和Tranum-Jensen, 1991 ；Song等，1996)。它的結(jié)構(gòu)基因hla位于所有被檢測(cè) 到分泌293個(gè)殘基水溶性單體的金黃色葡萄球菌菌株的染色體上(0' Reilly等，1990 ； 0' Reilly等，1986)。Hla被認(rèn)為與敏感性宿主細(xì)胞的表面受體結(jié)合，從而促進(jìn)其自身聚 合成七聚體孔洞前體、并將具有2nm孔徑的桶結(jié)構(gòu)插入質(zhì)膜(Gouaux等，1997)。Hla孔 洞形成于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、肺內(nèi)皮細(xì)胞和紅細(xì)胞中，但是粒細(xì)胞和成纖 維細(xì)胞看來(lái)對(duì)裂解有抗性(Bhakdi和Tranum-Jensen，1991 ；McElroy等，1999)。向兔或大 鼠肺組織中滴注純化的Hla，引發(fā)了血管滲漏和肺動(dòng)脈高血壓，其原因在于釋放了幾種信號(hào) 分子，如磷脂酰肌醇、一氧化氮、前列腺素類(P 2、PGI2)和血栓烷A2 (McElroy等，1999 ； Seeger 等，1984 ；Seeger 等，1990 ；Rose 等，2002 ；Suttorp 和 Habben，1988)。與 Hla 的生物 化學(xué)特性一致，消除金黃色葡萄球菌Newman中Hla表達(dá)的突變體嚴(yán)重減弱了在鼠肺炎模型 中的毒力(Bubeck-Wardenburg等，2007)。本文中本發(fā)明人以Hla作為靶標(biāo)，用于開發(fā)針對(duì) 金黃色葡萄球菌肺部感染之疫苗或免疫治療的策略。本發(fā)明的某些方面包括涉及Hla蛋白之蛋白質(zhì)組合物(包含多肽、肽或編碼它們 的核酸)的方法和組合物?？梢酝ㄟ^(guò)缺失、插入和/或替換來(lái)修飾這些蛋白質(zhì)。在具體實(shí) 施方案中，這些蛋白質(zhì)的修飾能夠在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答。 Hla多肽包含來(lái)自葡萄球菌屬中細(xì)菌的Hla蛋白質(zhì)的氨基酸序列。Hla序列可以 來(lái)自特定葡萄球菌物種如金黃色葡萄球菌，也可以來(lái)自特定菌株如Newman。在某些實(shí)施方 案中，Hla序列可包含這樣的序列，該序列具有金黃色葡萄球菌共有前體序列MKTRIVSSVTTTLLLGSILMNPVANAADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKS
GLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAA(E/D)NFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKff (I/T) DRSSERYKIDWEKEEMTN (以 SEQ ID NO 1 表示)和成熟金黃色葡萄球菌共有序列ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNK
KLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAA(E/D)NFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKff(I/T)DRSSERYKIDWEKEEMTN(以 SEQ ID NO 2 表示)在某些方面中，Hla序列基本如Genbank登記號(hào)AAA26498 (gi 152953)、 Mu50(NP_371687. 1) (gi 15924153)、COL (YP_186036. 1) (gi57650272)、N315 (NP_374279. 1) (gi15926746) 、 JH9(YP_001246598. 1) (gi148267655)、 JH1 (YP_001316387. 1) (gi150393712)、 USA300 (YP_493756. 1) (gi87160380)、 NCTC8325 (YP_499665. 1) (gi88194865)、Newman(YP_001332107. 1)(gi151221285)、MW2 (NP_645861. 1)(gi21282773) 和MSSA476 (YP_043222. 1) (gi49486001)(在本申請(qǐng)的最早優(yōu)先日期時(shí)通過(guò)引用并入本文) 所示，或者為其變體。在另一些實(shí)施方案中，可以使用其他Hla多肽，其序列可由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用 數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)可訪問(wèn)資源來(lái)確定。本文所用的“蛋白質(zhì)”或“多肽”是指含有至少十個(gè)氨基酸殘基的分子。在一些實(shí) 施方案中使用蛋白質(zhì)或多肽的野生型形式，但是在本發(fā)明的許多實(shí)施方案中，使用修飾的 蛋白質(zhì)或多肽來(lái)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。上述術(shù)語(yǔ)可在本文中互換使用。“修飾的蛋白質(zhì)”或“修飾 的多肽”是指其化學(xué)結(jié)構(gòu)特別是氨基酸序列與野生型蛋白質(zhì)或多肽相比發(fā)生變化的蛋白質(zhì) 或多肽。在一些實(shí)施方案中，修飾的蛋白質(zhì)或多肽具有至少一種改變的活性或功能(認(rèn)為 蛋白質(zhì)或多肽可能具有多種活性或功能)。本發(fā)明特別涉及的是，可針對(duì)某一活性或功能來(lái) 改變修飾的蛋白質(zhì)或多肽，而在其他方面保留野生型活性或功能，如免疫原性。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或多肽(野生型或修飾的)的大小可以包括但不局限 于 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、 140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、 235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、300、325、350、375、400、425、450、 475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、 950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500 個(gè)氨基分子或更多、以 及其中可得出的任何范圍，或其衍生物。本發(fā)明還涉及的是，可通過(guò)截短(使其短于相應(yīng)的
16野生型形式)來(lái)突變多肽，也可通過(guò)融合或綴合具有特定功能(例如用于靶向或定位、用于 增強(qiáng)免疫原性、用于純化目的等等)的異源蛋白質(zhì)序列來(lái)改變多肽。在此“氨基分子”是指本領(lǐng)域所知的任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模擬物。 在某些實(shí)施方案中，蛋白性分子的殘基是連續(xù)的，沒(méi)有任何非氨基分子中斷氨基酸殘基的 序列。在另一些實(shí)施方案中，所述序列可包含一個(gè)或多個(gè)非氨基分子部分。在具體實(shí)施方 案中，蛋白性分子的殘基序列可以為一個(gè)或多個(gè)非氨基分子部分所中斷。因此，術(shù)語(yǔ)“蛋白性組合物”包括氨基分子序列，所述序列含有至少一種天然合成 蛋白質(zhì)中的20種常見氨基酸或者至少一種修飾的或非常見氨基酸?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何技術(shù)來(lái)制造蛋白性組合物，所述技術(shù)包括(i) 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽或肽，(ii)從天然或重組來(lái)源(例如大腸桿菌、 昆蟲細(xì)胞、酵母等)中分離蛋白性化合物，或(iii)化學(xué)合成蛋白性材料。以前已經(jīng)公開了 多種基因的核苷酸及蛋白質(zhì)、多肽和肽的序列，還可以在公認(rèn)的計(jì)算機(jī)管理數(shù)據(jù)庫(kù)中找到 上述序列。其中一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)是國(guó)立生物技術(shù)信息中心的Genbank和GenP印t數(shù)據(jù)庫(kù)(萬(wàn)維 網(wǎng)網(wǎng)址為ncbi.nlm.nih. gov/)。可以用本文公開的或?yàn)楸绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的技術(shù)來(lái) 擴(kuò)增和/或表達(dá)這些基因的編碼區(qū)?？紤]了 Hla的氨基酸序列變體，所述變體可以為替換、插入、或缺失的變體。與野 生型相比，對(duì)本發(fā)明多肽的修飾可影響多肽中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、 111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、 149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、 168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、 187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、 206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、 225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、235、 236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、 255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、 274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、 293個(gè)或更多個(gè)非連續(xù)的或連續(xù)的氨基酸。來(lái)源于任何葡萄球菌物種和菌株的Hla多肽均 考慮用于本發(fā)明的方法中。變體通常缺少天然或野生型蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)殘基?？梢匀笔蝹€(gè)殘基，或 者可以缺失許多連續(xù)的氨基酸。可將終止密碼子(通過(guò)替換或插入)引入編碼的核酸序列 中，以產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。插入突變通常包括在多肽非末端位點(diǎn)處加入材料。這可包括插 入一個(gè)或多個(gè)殘基。還可產(chǎn)生末端添加，稱作融合蛋白。替換變體通常包含在蛋白質(zhì)一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處將一個(gè)氨基酸替換為另一個(gè)，并可 被設(shè)計(jì)成調(diào)節(jié)多肽的一個(gè)或多個(gè)特性，同時(shí)丟失或不丟失其他功能或特性。替換可以是保守的，即將一個(gè)氨基酸替換成形狀和電荷相似的氨基酸。保守性替換為本領(lǐng)域所熟知，包括 如以下改變丙氨酸變?yōu)榻z氨酸；精氨酸變?yōu)橘嚢彼?；天冬酰胺變?yōu)楣劝滨０坊蚪M氨酸；天 冬氨酸變?yōu)楣劝彼?；半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸；谷氨酰胺變?yōu)樘於０?；谷氨酸變?yōu)樘於彼幔?甘氨酸變?yōu)楦彼?；組氨酸變?yōu)樘於０坊蚬弱０罚划惲涟彼嶙優(yōu)榱涟彼峄蚶i氨酸；亮氨 酸變?yōu)槔i氨酸或異亮氨酸；賴氨酸變?yōu)榫彼?；甲硫氨酸變?yōu)榱涟彼峄虍惲涟彼?；苯丙?酸變?yōu)槔野彼?、亮氨酸或甲硫氨酸；絲氨酸變?yōu)樘K氨酸；蘇氨酸變?yōu)榻z氨酸；色氨酸變?yōu)槔?氨酸；酪氨酸變?yōu)樯彼峄虮奖彼?；纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼峄蛄涟彼帷；蛘?，替換可以是非 保守的，從而影響多肽的功能或活性。非保守性變化通常包括將殘基替換成化學(xué)不相似的， 如極性或帶電氨基酸代替非極性或不帶電氨基酸，反之亦然。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是重組的或體外合成的。或者，可以從細(xì)菌中分離非重組或 重組的蛋白質(zhì)。還考慮可將含有上述變體的細(xì)菌應(yīng)用于本發(fā)明的組合物和方法中。因此， 不需要分離蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“功能等價(jià)密碼子”在本文中用于指代編碼相同氨基酸的密碼子(如精氨酸 或絲氨酸的六個(gè)密碼子)，也指編碼生物學(xué)上等價(jià)的氨基酸的密碼子(見下面的表1)。表1密碼子表
氨基酸密碼子丙氨酸AlaAGCAGCCGCGGCU半胱氨酸CysCUGCUGU天冬氨酸AspDGACGAU谷氨酸GluEGAAGAG苯丙氨酸PheFuucuuu甘氨酸GlyGGGAGGCGGGGGU組氨酸HisHCACCAU異亮氨酸lieIAUAAUCAUU賴氨酸LysKAAAAAG亮氨酸LeuLUUAUUGCUACUCCUGCUU甲硫氨酸MetMAUG天冬酰胺AsnNAACAAU脯氨酸ProPCCAcccCCGCCU谷氨酰胺GinQCAACAG精氨酸ArgRAGAAGGCGACGCCGGCGU絲氨酸SerSAGCAGUUCAUCCUCGUCU蘇氨酸ThrTACAACCACGACU纈氨酸ValVGUAGUCGUGGUU色氨酸TrpffUGG酪氨酸TyrYUACUAU
還應(yīng)當(dāng)理解的是，氨基酸和核酸序列可包含額外的殘基，如分別為額外的N端或C 端氨基酸、或5'或3'序列，但仍然基本如本文公開的序列所示，只要該序列滿足上文設(shè) 定的標(biāo)準(zhǔn)(包括保持與蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)生物活性)。末端序列的添加特別適用于 核酸序列(例如可包含位于編碼區(qū)5'或3'部分之側(cè)翼的多種非編碼序列)。下文是基于改變蛋白質(zhì)的氨基酸來(lái)產(chǎn)生等價(jià)或改進(jìn)的第二代分子的討論。例如， 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可以替換為其他氨基酸，而沒(méi)有相互結(jié)合能力(同例如抗體的 抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點(diǎn)之結(jié)構(gòu)結(jié)合)的可感知損失。由于蛋白質(zhì)的相互作用 能力和性質(zhì)決定了蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能活性，因此可在氨基酸序列(及其背后的DNA編碼 序列)中進(jìn)行某些氨基酸替換，而仍產(chǎn)生具有相似特性的蛋白質(zhì)。因而，本發(fā)明人考慮可在 基因或核酸的DNA序列中進(jìn)行多種變化，而不導(dǎo)致其生物學(xué)應(yīng)用和活性的可感知缺失。進(jìn)行這種變化時(shí)，應(yīng)考慮氨基酸的親水性指數(shù)。氨基酸親水性指數(shù)在賦予蛋白質(zhì) 以相互作用生物學(xué)功能中的重要性為本領(lǐng)域所廣泛了解(Kyte和Doolittle、1982)。為人 們所接受的是，氨基酸的相對(duì)親水性決定了產(chǎn)物蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)而決定 了該蛋白質(zhì)與其它分子(例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等)的相互作用。還為本領(lǐng)域所了解的是，可以根據(jù)親水性有效地進(jìn)行相似氨基酸的替換。通過(guò)引 用并入本文的美國(guó)專利4，554，101陳述了蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性(由其鄰近氨基酸 親水性決定)與蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性相關(guān)。應(yīng)理解的是，氨基酸可以被替換為具有相似親 水值的其他氨基酸，而仍產(chǎn)生生物學(xué)等價(jià)或免疫學(xué)等價(jià)的蛋白質(zhì)。如上所述，氨基酸替換一般是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如它們的 疏水性、親水性、電荷、大小等。將多種前述性質(zhì)考慮在內(nèi)的示例性替換是眾所周知的，包 括精氨酸和賴氨酸，谷酰胺和天冬酰胺，絲氨酸和蘇氨酸，谷氨酸和天冬氨酸，以及纈氨 酸、亮氨酸和異亮氨酸。本發(fā)明涉及的是，在每ml本發(fā)明組合物中有約O.OOlmg到約10mg的總蛋白質(zhì)。因 此，組合物中的蛋白質(zhì)濃度可以是約、至少約或至多約0. 001,0. 010,0. 050,0. 1,0. 2,0. 3、 0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、 7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、9. 5、10. Oiig/ml、mg/ml或者更多(或其中可得出的任何范圍)。在這當(dāng) 中，約、至少約或至多約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99、100%可為 Hla 蛋白。本發(fā)明涉及施用Hla多肽或肽來(lái)改變針對(duì)與葡萄球菌病原菌感染相關(guān)的疾病或 病癥(在特定方面為肺炎)發(fā)展之預(yù)防性療法。本發(fā)明還涉及施用針對(duì)Hla多肽或肽而 產(chǎn)生的抗體，用來(lái)預(yù)防或治療與葡萄球菌病原菌感染相關(guān)的疾病或病癥(在特定方面為肺 炎)。此外，通過(guò)引用并入本文的美國(guó)專利4，554，lOl(Hopp)教導(dǎo)根據(jù)親水性從一級(jí)氨 基酸序列中鑒定和制備表位。通過(guò)在Hopp中公開的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定來(lái)自 氨基酸序列中的可能表位，并確認(rèn)它們的免疫原性。大量科學(xué)文獻(xiàn)也致力于從氨基酸序列 分析中預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)和鑒定表位(Chou和Fasman，1974a，b、1978a，b、1979)。如果需要，可
19以使用這些當(dāng)中的任一個(gè)來(lái)補(bǔ)充美國(guó)專利4，554，101中Hopp的教導(dǎo)。本發(fā)明描述了用于本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案的多肽、肽和蛋白質(zhì)。例如，對(duì)特定多肽測(cè) 定了其引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。在具體實(shí)施方案中，也可根據(jù)常規(guī)技術(shù)在溶液中或在固體支 持物上合成本發(fā)明蛋白質(zhì)的全部或一部分。多種自動(dòng)合成儀是可買到的，且可以根據(jù)已知 的方案加以使用。參見例如 Stewart 和 Young (1984)、Tam 等(1983)、Merrifield (1986)、 Barany和Merrif ield (1979)，均通過(guò)引用并入本文?；蛘撸墒褂弥亟MDNA技術(shù)，其中將編 碼本發(fā)明肽的核苷酸序列插入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞并在適于表達(dá)的條 件下培養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括利用轉(zhuǎn)移至細(xì)胞(包括微生物)中的基因來(lái)產(chǎn)生和/ 或呈遞蛋白質(zhì)?？蓪⒛康牡鞍踪|(zhì)的基因轉(zhuǎn)移到合適的宿主細(xì)胞中，接著在合適條件下培養(yǎng) 細(xì)胞?；旧暇幋a任何本文所述多肽的核酸均可使用。本文討論了重組表達(dá)載體的產(chǎn)生及 其包含的元件。或者，要生產(chǎn)的蛋白質(zhì)可以是由用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞所正常合成的內(nèi)源 蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案使用了自體B淋巴細(xì)胞細(xì)胞系，所述細(xì)胞系轉(zhuǎn)染有表達(dá)免 疫原產(chǎn)物(更具體地為具有免疫原活性的蛋白質(zhì))的病毒載體。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的其 他實(shí)例包括但不局限于Vero和Hela細(xì)胞、其他B和T細(xì)胞系(如CEM、721. 221、H9、Jurkat、 Raji)、以及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢、W138、BHK、C0S_7、293、H印G2、3T3、RIN和MDCK細(xì)胞的細(xì)胞系。 此外，可選擇調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)的或以需要方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。蛋白 質(zhì)產(chǎn)物的這種修飾(例如糖基化)和加工(例如剪切)可能對(duì)蛋白質(zhì)的功能是重要的。不 同宿主細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯后加工和修飾具有特征性的和特定的機(jī)制?？蛇x擇合適的細(xì)胞 系或宿主系統(tǒng)來(lái)保證所表達(dá)外源蛋白質(zhì)的正確修飾和加工?？墒褂枚喾N選擇系統(tǒng)，包括但不局限于分別位于tk、hgprt或aprt細(xì)胞中的HSV 胸苷激酶、次黃嘌呤_鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因。此外，還可使 用抗代謝物抗性作為選擇基礎(chǔ)dhfr，賦予對(duì)甲氧芐氨嘧啶和氨甲蝶呤的抗性；gpt，賦予 對(duì)霉酚酸的抗性；neo，賦予對(duì)氨基糖苷G418的抗性；hygro，賦予對(duì)潮霉素的抗性?？梢詢煞N方式在體外繁殖動(dòng)物細(xì)胞在整個(gè)培養(yǎng)物體積中懸浮生長(zhǎng)的非錨著依 賴性細(xì)胞，或者需要附著在固體基底上進(jìn)行生長(zhǎng)的錨著依賴性細(xì)胞(即單層類型的細(xì)胞生 長(zhǎng))。來(lái)源于連續(xù)的已建立細(xì)胞系的非錨著依賴性或懸浮培養(yǎng)物是大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞和 細(xì)胞產(chǎn)物的最常用方法。但是，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞具有局限性，例如致癌潛力和低于附著細(xì)胞 的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。A.宿主細(xì)胞本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用。所有這些術(shù)語(yǔ) 還包括其任何或所有后續(xù)世代的后代。應(yīng)當(dāng)了解的是，由于故意的或偶然的突變，所有后代 未必相同。在表達(dá)異源核酸序列的語(yǔ)境中，“宿主細(xì)胞”是指原核或真核細(xì)胞，它包括任何能 夠復(fù)制載體或表達(dá)由載體編碼之異源基因的可轉(zhuǎn)化生物。宿主細(xì)胞可以(并已經(jīng))用作載 體或病毒的接受者。宿主細(xì)胞可以被“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”，這是指將外源核酸(如重組蛋白編 碼序列)轉(zhuǎn)到或引入宿主細(xì)胞的過(guò)程。轉(zhuǎn)化細(xì)胞包括原代受體細(xì)胞及其后代。宿主細(xì)胞可來(lái)源于原核生物或真核生物，包括用于復(fù)制載體或表達(dá)部分或全部核酸序列的細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳細(xì)胞。許多細(xì)胞系和培養(yǎng)物可用作宿主細(xì)胞，它 們可以通過(guò)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)獲得， ATCC是作為活培養(yǎng)物和遺傳材料的存檔中心的組織(www, atcc. org)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員 可根據(jù)載體骨架和期望的結(jié)果來(lái)確定合適的宿主。例如，可將質(zhì)粒或粘粒引入原核宿主細(xì) 胞，以復(fù)制許多載體或表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)。用作宿主細(xì)胞(用于載體復(fù)制和/或表達(dá))的 細(xì)菌細(xì)胞包括葡萄球菌菌株、DH5 a、JM109和KC8，以及許多可買到的細(xì)菌宿主如SURE 感受態(tài)細(xì)胞和 S0L0PACKTMGold 細(xì)胞(STRATAGENE 、La Jolla、CA)?；蛘?，細(xì)菌 細(xì)胞如大腸桿菌LE392可以用作噬菌體病毒的宿主細(xì)胞。合適的酵母細(xì)胞包括釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)禾口畢赤酵母(Pichia pastoris)。用于載體或多肽復(fù)制和/或表達(dá)的真核宿主細(xì)胞的實(shí)例包括HeLa、NIH3T3、 Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。來(lái)自多種細(xì)胞類型和生物的許多宿主細(xì)胞是可用的， 且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。類似地，病毒載體可與真核或者原核宿主細(xì)胞(特別是允許復(fù) 制或表達(dá)該載體的細(xì)胞)結(jié)合使用。一些載體可使用控制序列，所述控制序列能使所述載體同時(shí)在原核和真核細(xì)胞中 復(fù)制和/或表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)了解培養(yǎng)所有上述宿主細(xì)胞以維持它們并允許載體 復(fù)制的條件。能夠大規(guī)模生產(chǎn)載體以及生產(chǎn)由載體編碼的核酸及其相應(yīng)多肽、蛋白質(zhì)或肽 的技術(shù)和條件也是已了解和已知的。B.表達(dá)系統(tǒng)已有許多表達(dá)系統(tǒng)包含至少部分的或全部上述組合物?？蓪⒒谠撕?或真核 的系統(tǒng)與本發(fā)明一起使用，以產(chǎn)生核酸序列或其相應(yīng)多肽、蛋白質(zhì)和肽。許多這樣的系統(tǒng)是 商品化并易于獲得的。昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生異源核酸片段的高水平蛋白表達(dá)，如通過(guò)引 用并入本文的美國(guó)專利5，871，986和4，879，236中所描述，可以購(gòu)買這些系統(tǒng)，例如，
來(lái)自I1VVITROGEN 的名為MAXBAC 2. o和來(lái)自CLONTECH 的名為
BACPACK 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。除了本發(fā)明公開的表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)系統(tǒng)的其他實(shí)例包括STRATTAGENE 的COMPLETE CONTROL 誘導(dǎo)型哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(該系統(tǒng)含有合成的蛻皮激素誘導(dǎo)型 受體)，或其PET表達(dá)系統(tǒng)(一種大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng))。誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的另一實(shí)例是可 購(gòu)自INVITRGG￡N 的使用全長(zhǎng)CMV啟動(dòng)子的誘導(dǎo)型哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，其帶有 T-REX (四環(huán)素調(diào)節(jié)的表達(dá))系統(tǒng)。INVITRGGEN 還提供了稱作畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng) (Pichia methanolica Expression System)的酵母表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)被設(shè)計(jì)用于在甲醇營(yíng) 養(yǎng)酵母畢赤酵母Pichia methanolica中高水平產(chǎn)生重組蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解如 何表達(dá)載體(如表達(dá)構(gòu)建體)來(lái)產(chǎn)生核酸序列或其相應(yīng)多肽、蛋白質(zhì)或肽。II.核酸本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)、多肽、肽的重組多核苷酸。包括野生型Hla或其任 何其他多肽變體的核酸序列，所有序列都通過(guò)引用并入本文。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指重組的或者分離成不含基因組總核酸的核酸分子。包含在術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”中的有寡核苷酸(長(zhǎng)度為100個(gè)或更少殘基的核酸)、重組載 體(包括例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等)。在某些方面中，多核苷酸包括從其天然基因或 蛋白質(zhì)編碼序列中基本分離出來(lái)的調(diào)節(jié)序列。多核苷酸可以是RNA、DNA、它們的類似物或 它們的組合。在這方面，術(shù)語(yǔ)“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用于指編碼蛋白質(zhì)、多肽或肽的核酸 (包括正確轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾或定位所需的任何序列)。應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的是， 這一術(shù)語(yǔ)包含表達(dá)或適于表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽、結(jié)構(gòu)域、肽、融合蛋白或突變體的基因組序列、 表達(dá)盒、cDNA序列和小的工程化核酸片段。編碼全部或一部分多肽的核酸可含有編碼該多 肽全部或一部分的連續(xù)核酸序列，所述核酸序列長(zhǎng)度如下10、20、30、40、50、60、70、80、90、 100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、 290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、 470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、 660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、 850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、 1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、 4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000 個(gè)或更多個(gè)核苷酸、核苷或堿基 對(duì)。還涉及的是，來(lái)自給定物種的特定多肽可以由含有天然變異的核酸所編碼，所述核酸具 有略微不同的核酸序列但是仍編碼相同或基本相似的蛋白質(zhì)(見上文表1)。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及整合了編碼Hla或其任何突變體或片段之核酸序 列的分離核酸片段和重組載體。因此，含有核酸片段的分離核酸片段或載體可編碼例如具 有免疫原性的Hla或Hla(H35L)蛋白?？蓪⑿g(shù)語(yǔ)“重組”與多肽或特定多肽的名稱連起來(lái) 使用，這一般是指由體外操作的核酸分子或該分子的復(fù)制產(chǎn)物所產(chǎn)生的多肽。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及整合了編碼Hla或Hla變體多肽或肽之核酸序 列的分離核酸片段和重組載體，所述多肽或肽可用于在受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在多個(gè)實(shí) 施方案中，本發(fā)明的核酸可用于基因疫苗中。不論編碼序列本身多長(zhǎng)，本發(fā)明中所用的核酸片段均可與其他核酸序列(如啟動(dòng) 子、多腺苷酸化信號(hào)、額外的限制性酶切位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其他編碼片段等)組合，使得它 們的總長(zhǎng)度可能變化非常大。因此，本發(fā)明還涉及的是，可以使用幾乎任何長(zhǎng)度的核酸片 段，其總長(zhǎng)度優(yōu)選受限于預(yù)期使用的重組核酸方法中制備和使用的便利程度。在一些情況 下，核酸序列可編碼具有額外異源編碼序列的多肽序列，例如允許進(jìn)行多肽純化、運(yùn)輸、分 泌、翻譯后修飾，或用于治療益處，如靶向或效力。如上文所討論的，可將標(biāo)簽或其他異源多 肽加到經(jīng)修飾的多肽編碼序列上，其中“異源”是指與所修飾多肽不相同的多肽。本發(fā)明中所用的核酸編碼Hla或任何Hla變體或片段。該序列可以是密碼子冗余 和功能等價(jià)的結(jié)果，密碼子冗余和功能等價(jià)已知在核酸序列及其編碼蛋白質(zhì)中天然存在。 或者，可通過(guò)應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造功能等價(jià)的蛋白質(zhì)或肽，其中可基于所改變氨基酸性 質(zhì)的考慮來(lái)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變?？赏ㄟ^(guò)應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)引入人為設(shè)計(jì)的改變，例如 引入蛋白質(zhì)抗原性的改進(jìn)。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的核酸片段和重組載體，在其序列中包含 來(lái)自SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :2或上述通過(guò)引用并入的其他氨基酸序列的相應(yīng)核酸序列。用于遞送核酸以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明組合物表達(dá)的合適方法被認(rèn)為包括幾乎任何可將核 酸(例如DNA，包括病毒和非病毒載體)引入細(xì)胞、組織或生物體的方法，如本文所述或 為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知。這些方法包括但不局限于直接遞送DNA如通過(guò)注射(美國(guó) 專利 5，994，624,5, 981，274,5, 945，100,5, 780，448,5, 736，524,5, 702，932,5, 656，610、 5，589，466和5，580，859，均通過(guò)引用并入本文)，包括顯微注射(Harland和ffeintraub, 1985;通過(guò)引用并入本文的美國(guó)專利5，789，215)；通過(guò)電穿孔(通過(guò)引用并入本文的美國(guó) 專利 5，384，253)；通過(guò)磷酸鈣沉淀(Graham 和 Van Der Eb, 1973 ；Chen 和 Okayama, 1987 ； Rippe等，1990)；通過(guò)使用DEAE葡聚糖之后用聚乙二醇(Gopal，1985)；通過(guò)直接超聲載 荷(Fechheimer 等，1987)；通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染(Nicolau 和 Sene，1982 ；Fraley 等，1979 ； Nicolau 等，1987 ；Wong 等，1980 ；Kaneda 等，1989 ；Kato 等，1991)；通過(guò)微射彈轟擊(PCT 申請(qǐng)?zhí)?W094/09699 和 95/06128 ；美國(guó)專利 5，610，042,5, 322，783,5, 563，055,5, 550，318、 5，538，877和5，538，880，均通過(guò)引用并入本文)；通過(guò)碳化硅纖維攪拌(Ka印pier等， 1990 ；美國(guó)專利5，302，523和5，464，765，均通過(guò)引用并入本文)；通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(美 國(guó)專利5，591，616和5，563，055，均通過(guò)引用并入本文)；通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 (Omirulleh等，1993 ；美國(guó)專利4，684，611和4，952，500，均通過(guò)引用并入本文)；或通過(guò)干 燥/抑制介導(dǎo)的DNA吸入(Potrykus等，1985)。通過(guò)應(yīng)用諸如此類的技術(shù)，可以穩(wěn)定或暫 時(shí)轉(zhuǎn)化器官、細(xì)胞、組織或生物體。III.免疫應(yīng)答和治療如上文所討論的，本發(fā)明涉及引發(fā)受試者中針對(duì)Hla或其變體或片段之免疫應(yīng) 答。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答可保護(hù)或治療患有、疑似患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生感染或相 關(guān)疾病(特別是那些與葡萄球菌性肺炎相關(guān)的)的受試者。A.保護(hù)性免疫在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，蛋白性組合物賦予受試者保護(hù)性免疫。保護(hù)性免疫 是指身體發(fā)動(dòng)保護(hù)受試者免于發(fā)生特定疾病或病癥的特異性免疫應(yīng)答的能力，所述疾病或 病癥與免疫應(yīng)答所針對(duì)的物質(zhì)相關(guān)。免疫原性有效量能夠賦予受試者保護(hù)性免疫。如本文的說(shuō)明書和后續(xù)的權(quán)利要求書部分中所用的，術(shù)語(yǔ)“多肽”是指通過(guò)肽鍵或 其類似物共價(jià)相連的一段氨基酸。根據(jù)本發(fā)明，不同多肽具有不同的功能。根據(jù)一個(gè)方面， 多肽來(lái)源于設(shè)計(jì)成在受者中誘導(dǎo)主動(dòng)免疫應(yīng)答的免疫原；而根據(jù)本發(fā)明的另一方面，多肽 來(lái)源于在例如動(dòng)物中引發(fā)主動(dòng)免疫應(yīng)答后產(chǎn)生的抗體，所述抗體能在受者中誘導(dǎo)被動(dòng)免疫 應(yīng)答。但在兩種情況下都可由根據(jù)任何可能密碼子使用的多核苷酸編碼所述多肽。本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”或其等價(jià)的“免疫學(xué)應(yīng)答”是指在受試患者中發(fā)生直 接針對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)、肽或多肽的體液應(yīng)答(抗體介導(dǎo)的)、細(xì)胞應(yīng)答(由抗原特異性T細(xì) 胞或其分泌產(chǎn)物介導(dǎo))或者體液及細(xì)胞的應(yīng)答。這種應(yīng)答可以是通過(guò)施用免疫原誘導(dǎo)的主 動(dòng)應(yīng)答，或通過(guò)施用抗體、含抗體的材料或已觸發(fā)T細(xì)胞而誘導(dǎo)的被動(dòng)應(yīng)答。呈遞與I類或 II類MHC分子結(jié)合的多肽表位引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，以活化抗原特異性CD4(+)T輔助細(xì)胞和 /或CD8(+)細(xì)胞毒T細(xì)胞。所述應(yīng)答還可包括活化單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜堿性粒 細(xì)胞、樹突細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或先天免疫的其他組分。本文所用的“主動(dòng)免疫”是指通過(guò)施用抗原而賦予受試者的任何免疫。
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本文所用的“被動(dòng)免疫”是指不向受試者施用抗原而賦予受試者的任何免疫。因 此，“被動(dòng)免疫”包括但不局限于施用已活化的免疫效應(yīng)因子，包括免疫應(yīng)答的細(xì)胞介質(zhì)或 蛋白質(zhì)介質(zhì)(例如單克隆和/或多克隆抗體)。可在被動(dòng)免疫中使用單克隆或多克隆抗體 組合物，來(lái)預(yù)防或治療由帶有該抗體所識(shí)別抗原之生物體所引發(fā)的感染?？贵w組合物可包 含結(jié)合多種抗原的抗體，所述抗原又可與多種生物相關(guān)?？贵w組合物可以是多克隆抗血清。 在某些方面中，抗體是從經(jīng)抗原攻擊的動(dòng)物或第二受試者中親和純化的?；蛘?，可使用抗體 混合物，其為針對(duì)在相同、相關(guān)或不同微生物或生物體(如革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌， 包括但不局限于葡萄球菌)中所存在抗原的單克隆和/或多克隆抗體的混合物?？赏ㄟ^(guò)對(duì)患者施用得自已知有免疫反應(yīng)性之供體或其他非患者來(lái)源的免疫球蛋 白(Ig)和/或其他免疫因子，向患者或受試者傳遞被動(dòng)免疫。在另一些方面中，本發(fā)明的抗 原性組合物可施用于受試者，之后所述受試者可作為應(yīng)答于該組合物攻擊而產(chǎn)生的球蛋白 (“超免疫球蛋白”)的來(lái)源或供體，其包括針對(duì)Hla或其任何變體或片段的抗體。經(jīng)此處 理的受試者可捐獻(xiàn)血漿，其后通過(guò)常規(guī)血漿分級(jí)法從所述血漿中可獲得超免疫球蛋白，并 將其施用于其他受試者，以傳遞對(duì)葡萄球菌感染的抗性或治療葡萄球菌感染。本發(fā)明的超 免疫球蛋白對(duì)免疫力受損的個(gè)體、正經(jīng)受侵入性治療或時(shí)間不允許其產(chǎn)生應(yīng)答于疫苗的自 身抗體的個(gè)體特別有用。與被動(dòng)免疫相關(guān)的示例性方法和組合物參見美國(guó)專利6，936，258、 6，770，278,6, 756，361,5, 548，066,5, 512，282,4, 338，298 和 4，748，018，均通過(guò)引用以其 整體并入本文。對(duì)本說(shuō)明書及所附權(quán)利要求書而言，術(shù)語(yǔ)“表位”和“抗原決定簇”可互換使用，是 指抗原上被B細(xì)胞和/或T細(xì)胞應(yīng)答或識(shí)別的位點(diǎn)。B細(xì)胞表位可由連續(xù)氨基酸形成，或由 通過(guò)蛋白質(zhì)三級(jí)折疊而接近的非連續(xù)氨基酸形成。由連續(xù)氨基酸形成的表位通常在暴露于 變性溶劑后可被保留，而通過(guò)三級(jí)折疊形成的表位用變性溶劑處理時(shí)一般會(huì)丟失。表位通 常包括至少3個(gè)、更通常為至少5或8-10個(gè)處于獨(dú)特空間構(gòu)象的氨基酸。測(cè)定表位空間構(gòu) 象的方法包括例如X射線晶體學(xué)和2維核磁共振。參見例如Epitope Mapping Protocols, 1996。識(shí)別相同表位的抗體可用簡(jiǎn)單的免疫測(cè)定加以鑒定，所述測(cè)定能夠顯示一種抗體阻 礙另一種抗體結(jié)合目標(biāo)抗原的能力。T細(xì)胞識(shí)別含連續(xù)表位，對(duì)CD8細(xì)胞而言約為9個(gè)氨基 酸，對(duì)CD4細(xì)胞而言約為13-15個(gè)氨基酸。識(shí)別表位的T細(xì)胞可通過(guò)測(cè)量抗原依賴性增殖的 體外測(cè)定加以鑒定，這通過(guò)由應(yīng)答表位的已觸發(fā)T細(xì)胞中的3H-胸苷摻入(Burke等1994)、 通過(guò)抗原依賴性殺傷(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞測(cè)定，Tigges等1996)或通過(guò)細(xì)胞因子分泌來(lái)測(cè) 定?？赏ㄟ^(guò)增殖測(cè)定(⑶4(+)T細(xì)胞)或CTL(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞)測(cè)定來(lái)鑒定細(xì)胞介 導(dǎo)的免疫應(yīng)答?？赏ㄟ^(guò)從被免疫的同基因動(dòng)物中分別分離IgG和T細(xì)胞并在另一受試者中 測(cè)量預(yù)防或治療效果，從而區(qū)分體液和細(xì)胞應(yīng)答對(duì)免疫原的預(yù)防或治療效果的相對(duì)貢獻(xiàn)。本文和權(quán)利要求中所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”或“免疫球蛋白，，可互換使用，是指幾類結(jié) 構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)中的任一種，所述蛋白質(zhì)作為動(dòng)物或受試者的免疫應(yīng)答的一部分來(lái)發(fā)揮功 能，所述蛋白包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM和相關(guān)蛋白。本發(fā)明還涉及“人源化”抗體，如帶有人的恒定區(qū)和/或可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的來(lái)自小 鼠、大鼠、兔或其他物種的嵌合抗體、雙特異性抗體、重組和工程化抗體及其片段?！叭嗽?化”技術(shù)通常包括使用重組DNA技術(shù)來(lái)操作編碼抗體分子多肽鏈的DNA序列。使單克隆抗體(MAb)人源化的早期方法包括產(chǎn)生嵌合抗體，在該方法中將含有某一抗體完整可變 結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合位點(diǎn)連接到來(lái)自另一抗體的恒定結(jié)構(gòu)域上。進(jìn)行這種嵌合過(guò)程的方法 描述于 EP0120694(Celltech Limited)、EP0125023 (Genentech Inc.和 City of Hope)、 EP-A-0 171496 (Rev. Dev. Corp. Japan)、EP-A-0 173 494 (Stanford University)禾P WO 86/01533 (CelltechLimited)中，每篇文獻(xiàn)都通過(guò)引用整體并入本文。這些申請(qǐng)一般公開了 制備具有小鼠MAb可變結(jié)構(gòu)域和人免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的抗體分子的方法。替代方法描述于EP-A-0239400 (Winter)，其中通過(guò)使用長(zhǎng)寡核苷酸的定點(diǎn)突變， 將小鼠MAb的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)嫁接到人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)上。這種方法 的實(shí)例參見美國(guó)專利7，262，050，所述專利通過(guò)引用整體并入本文。還可從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中得到人源化抗體。例如，文獻(xiàn)(參見例如Jakobovits等， 1993 Jakobovits等，1993 ；Bruggermann等，1993，至少對(duì)其人類抗體制備的通過(guò)引用并入 本文)中已描述了能應(yīng)答于免疫而產(chǎn)生完整的人類抗體庫(kù)的轉(zhuǎn)基因突變小鼠。特別地，在 這些嵌合的種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(J(H))基因的純合缺失導(dǎo)致對(duì)內(nèi)源抗體產(chǎn)生 的完全抑制，而且向該種系突變小鼠中成功轉(zhuǎn)入人類種系抗體基因陣列導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí) 產(chǎn)生人類抗體。在正常生理?xiàng)l件下，抗體可見于血漿和其他體液中以及某些細(xì)胞的膜上，通常由 稱為B細(xì)胞的淋巴細(xì)胞類型或其功能等價(jià)物產(chǎn)生。IgG類抗體由通過(guò)二硫鍵相連的4條多 肽鏈組成。完整IgG分子的4條鏈?zhǔn)潜环Q為H鏈的兩條相同的重鏈和被稱為L(zhǎng)鏈的兩條相 同的輕鏈。為了產(chǎn)生多克隆抗體，用抗原或抗原片段(一般和佐劑一起，如有必要?jiǎng)t結(jié)合載 體)免疫宿主如兔或山羊。其后從宿主的血清中收集針對(duì)抗原的抗體?？舍槍?duì)抗原親和純 化多克隆抗體，使其具有單一特異性。為了產(chǎn)生單克隆抗體，用抗原對(duì)合適的供體(一般為小鼠)進(jìn)行超免疫。然后分 離產(chǎn)生抗體的脾細(xì)胞。將這些細(xì)胞與有永生特性的細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞)融合，產(chǎn)生能夠 被持續(xù)培養(yǎng)且分泌所需單克隆抗體的融合細(xì)胞雜交物(雜交瘤)。其后大量培養(yǎng)上述細(xì)胞， 并且從細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲單克隆抗體以供使用。按照定義，單克隆抗體對(duì)單個(gè)表位具有特 異性。由于這種原因，針對(duì)相似抗原，單克隆抗體通常具有比多克隆抗體更低的親和常數(shù)。也可通過(guò)使用脾細(xì)胞或來(lái)自脾的細(xì)胞系的原代培養(yǎng)物來(lái)體外產(chǎn)生單克隆抗體 (Anavi，1998)。為了產(chǎn)生重組抗體(一般參見 Huston 等，1991 Johnson 等，1991 ；Mernaugh 等，1995)，將來(lái)自生產(chǎn)抗體的動(dòng)物B淋巴細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞的信使RNA反轉(zhuǎn)錄以獲得互補(bǔ) DNA(cDNA)。擴(kuò)增抗體cDNA(可為全長(zhǎng)的或部分長(zhǎng)度的)，并克隆到噬菌體或質(zhì)粒上。cDNA 可以是分開的或通過(guò)接頭連接的部分長(zhǎng)度的重鏈和輕鏈cDNA。使用合適的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗 體、抗體片段或者抗體的免疫性部分或片段，以獲得重組抗體。還可通過(guò)篩選合適的表達(dá)文 庫(kù)來(lái)獲得抗體cDNA。如上文所討論，本發(fā)明方法中所用的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體或它們 的片段。但是，就某些治療目的而言，將所述抗體人源化，從而使它們不會(huì)引起針對(duì)所施用 抗體的顯著免疫應(yīng)答。還可根據(jù)本發(fā)明使用這種人源化抗體，產(chǎn)生這些抗體的方法為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知(Jones 等，1986 ；Riechmann 等，1988 ；Verhoeyen 等，1988)。如本領(lǐng)域所熟知的，抗體可與固體支持基質(zhì)結(jié)合，或者與可檢測(cè)部分綴合，或者結(jié)
25合并綴合。對(duì)綴合熒光或酶部分的總體討論參見Johnstone等(1982)?？贵w與固體支持底 物的結(jié)合也為本領(lǐng)域所熟知(Harlow等，1988 ；Borrebaeck, 1992)。本文和權(quán)利要求中所用的短語(yǔ)“抗體的免疫性部分”包括抗體Fab片段、抗體Fv片 段、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈與輕鏈的未關(guān)聯(lián)的混合物、抗體重鏈和輕鏈組成的異二 聚體、抗體重鏈的催化結(jié)構(gòu)域、抗體輕鏈的催化結(jié)構(gòu)域、抗體輕鏈的可變片段、抗體重鏈的 可變片段和抗體的單鏈變體(也稱作scFv)。此外，該術(shù)語(yǔ)包括嵌合免疫球蛋白，它是來(lái)源 于不同物種的融合基因的表達(dá)產(chǎn)物，所述物種之一可以是人，在這種情況下稱嵌合免疫球 蛋白為人源化的。任選地，抗體(或優(yōu)選抗體的免疫性部分)可以與其他蛋白質(zhì)化學(xué)綴合，或表達(dá)為 融合蛋白。就本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書而言，所有這些融合蛋白質(zhì)都包含在抗體或抗體 免疫性部分的定義中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性物質(zhì)”或“免疫原”或“抗原”可互換使用，用于描述在 單獨(dú)、與佐劑結(jié)合、或在展示載體上呈遞后施用于受試者時(shí)能夠誘導(dǎo)針對(duì)其自身的免疫應(yīng) 答的分子。單鏈抗體(SCA) —般為遺傳工程化的蛋白質(zhì)，其設(shè)計(jì)用于擴(kuò)展采用單克隆抗體的 可能的治療和診斷應(yīng)用。SCA具有單克隆抗體的結(jié)合特異性和親和力，在天然狀態(tài)下約為單 克隆抗體大小的五分之一到六分之一，一般導(dǎo)致其半衰期很短。與大多數(shù)單克隆抗體相比， SCA提供了一些益處，包括它們能直接與可用于檢測(cè)的多肽(例如螢光素酶或熒光蛋白)融 合。除了這些益處之外，可直接從人SCA文庫(kù)中直接分離全人SCA，而不需要昂貴又費(fèi)時(shí)的 “人源化”過(guò)程。單鏈重組抗體(scFv)由通過(guò)設(shè)計(jì)的柔性肽鏈連接的抗體VL和VH結(jié)構(gòu)域組成 (Atwell等，1999)。與完整IgG相比，在有相當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合親和力時(shí)，scFv具有體積更小和 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，而且它們可以比類似的雙鏈Fab片段更為穩(wěn)定(Colcher等，1998 ；Adams 和 Schier,1999)。來(lái)自重鏈和輕鏈(VH和VL)的可變區(qū)的長(zhǎng)度均為約110個(gè)氨基酸。它們可以通過(guò) 15個(gè)氨基酸的接頭或更長(zhǎng)的序列(例如，具有足夠柔性而使兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組裝成有功能的抗 原結(jié)合口袋的序列)連接。在具體實(shí)施方案中，加入不同的信號(hào)序列能使scFv被靶向到細(xì) 胞內(nèi)部的不同細(xì)胞器或者被分泌。加入輕鏈恒定區(qū)(Ck)允許經(jīng)由二硫鍵發(fā)生二聚化，獲得 提高的穩(wěn)定性和親和力。因此，對(duì)單鏈Fv(SCFv)SCA而言，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由獨(dú) 立的基因編碼，但已經(jīng)證實(shí)可通過(guò)重組方法制造能使他們成為單一蛋白鏈scFv的人工接 頭(Bird等，1988 ；Huston等，1988)。此外，它們由于容易從噬菌體展示文庫(kù)中分離且能夠 識(shí)別保守的抗原而經(jīng)常被使用(綜述參見Adams和Schier，1999)。因此，在本發(fā)明的一些 方面中，抗體可為從噬菌體展示文庫(kù)中分離的SCA，而不是如上所述的更為傳統(tǒng)的生產(chǎn)技術(shù) 所產(chǎn)生的。B.治療和預(yù)防方法本發(fā)明的方法包括治療由葡萄球菌病原體引起的疾病或病癥，以及預(yù)防或減輕感 染，以使病原體的感染程度被組織或盡可能小?？稍诒黄咸亚蚓腥镜摹⒁伤平佑|葡萄球菌 的或有接觸葡萄球菌風(fēng)險(xiǎn)的人中給予本發(fā)明的免疫原性多肽，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，可施 用對(duì)本發(fā)明免疫原性多肽或肽有特異性的抗體，以對(duì)被葡萄球菌感染的、疑似接觸葡萄球菌的或有接觸葡萄球菌風(fēng)險(xiǎn)的人進(jìn)行被動(dòng)免疫?？蓪?duì)葡萄球菌感染檢測(cè)為陽(yáng)性的或由于可 能接觸而被認(rèn)為具有感染風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體使用方法。本發(fā)明涉及的是，可在患者被診斷為患有葡萄球菌性疾病或病癥、被診斷為患有 葡萄球菌感染、被鑒定為有葡萄球菌感染或葡萄球菌性疾病或病癥的癥狀、處于葡萄球菌 感染的風(fēng)險(xiǎn)中、處于葡萄球菌性疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)中、或處于重癥特別護(hù)理和/或住院后 約 1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 分鐘、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小時(shí)、1、2、3、4、5、6、7天、1、2、3、4、5周和/或1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12個(gè)月之內(nèi)施用本發(fā)明組合物。可施用組合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或更多 次，和 / 或每 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 小 時(shí)、或 1、2、3、4、5、6、7 天、或 1、2、3、4、5 周、或 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 個(gè)月或其中的
任何范圍或組合來(lái)施用所述組合物。在一些實(shí)施方案中，在存在佐劑或載體而不存在或基本不存在其他葡萄球菌抗原 和/或蛋白質(zhì)的條件下實(shí)施治療。此外，在一些實(shí)例中，治療包括施用針對(duì)細(xì)菌感染所常用 的其他制劑，如一種或更多抗生素。使用肽進(jìn)行疫苗接種一般需要將肽綴合至免疫原性載體蛋白，如乙肝表面抗原、 匙孔槭血藍(lán)蛋白或牛血清白蛋白。進(jìn)行這種綴合的方法為本領(lǐng)域所熟知。IV.疫苗和藥物組合物A.疫苗本發(fā)明包括預(yù)防或減輕葡萄球菌感染的方法。本發(fā)明的實(shí)施方案包括預(yù)防或減輕 葡萄球菌性肺炎。這樣，本發(fā)明涉及在主動(dòng)和被動(dòng)免疫的實(shí)施方案中使用的疫苗。被認(rèn)為 適合用作疫苗的免疫原性組合物可非常容易地直接從以本文公開的方法制備的Hla肽或 蛋白質(zhì)中制備。優(yōu)選地，將抗原性材料充分透析，以去除不需要的小分子量分子，和/或凍 干以更容易配制成想要的劑型。本發(fā)明包括組合物，所述組合物可用于誘導(dǎo)針對(duì)來(lái)源于Hla 肽或蛋白質(zhì)之多肽或肽的免疫應(yīng)答，從而預(yù)防葡萄球菌引發(fā)的感染及其引起的病癥或疾病 的發(fā)生。在某些方面中，將組合物配制成施用于粘膜表面的劑型，例如氣霧劑劑型?；蛘撸瑢?duì)基于蛋白質(zhì)/肽的疫苗而言其他可行且重要的選項(xiàng)包括引入編碼抗原的 核酸作為DNA疫苗。就這一點(diǎn)而言，近期的報(bào)導(dǎo)描述了構(gòu)建重組痘苗病毒，并成功使用這些 構(gòu)建體免疫小鼠，以引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答，所述重組痘苗病毒表達(dá)10個(gè)連續(xù)最小CTL表位 (Thomson, 1996)或者來(lái)自幾種微生物的B細(xì)胞、CTL和TH表位的組合(An，1997)。因此， 對(duì)成功利用肽、肽脈沖刺激APC和肽編碼構(gòu)建體在體內(nèi)有效引發(fā)保護(hù)性免疫在文獻(xiàn)中有充 分的證據(jù)。美國(guó)專利5，958，895和5，620，896中示范了使用核酸序列作為疫苗。包含多肽或肽序列作為活性成分的疫苗的制備一般為本領(lǐng)域所充分理解，如美國(guó) 專利 4，608，251,4, 601，903,4, 599，231,4, 599，230,4, 596，792 和 4，578，770 所示例，所述 專利都通過(guò)引用并入本文。這種疫苗通常以注射劑如液體溶液或懸浮液的形式制備；還可 制備適于在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式。制劑也可以是乳化的?；钚悦庖咴?成分通常與可藥用并與活性成分相容的賦形劑混合。合適的賦形劑為例如水、鹽溶液、葡聚 糖、甘油、乙醇等，以及它們的組合。此外，如有需要，疫苗可含有一定量的輔助物質(zhì)，如潤(rùn)濕 劑或乳化劑、PH緩沖劑或者增強(qiáng)疫苗效力的佐劑。在具體實(shí)施方案中，用多種物質(zhì)的組合來(lái)配制疫苗，如通過(guò)引用并入本文的美國(guó)專利6，793，923和6，733，754中所描述。疫苗可常規(guī)地腸胃外、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻、通過(guò)吸入和/或注射(例如皮下注射或肌內(nèi) 注射)施用。適用于其他施用方式的附加制劑包括栓劑，在某些情況下為口服制劑。對(duì)于 栓劑，傳統(tǒng)粘合劑和載體可包括例如聚亞烷基二醇(polyalkalene glycol)或甘油三脂； 這些栓劑可由含有活性成分(范圍為約0.5%到約10%，優(yōu)選約到約2%)的混合物形 成。口服制劑包含常用的賦形劑，例如藥品級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖 維素、碳酸鎂等。這些組合物表現(xiàn)為溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放劑或散劑的形 式，包含約10%到約95%的活性成分，優(yōu)選約25%到約70%。多肽和編碼多肽的DNA構(gòu)建體可以中性或鹽形式配制成疫苗。藥學(xué)上可接受的鹽 包括酸加成鹽(由肽的游離氨基形成)和與無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(例如乙 酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等)形成的鹽。由游離羧基形成的鹽也可來(lái)自無(wú)機(jī)堿(例如氫氧 化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)和有機(jī)堿(例如異丙胺、三甲胺、2-乙胺 基乙醇、組氨酸、普魯卡因等)。疫苗一般以與藥劑劑型相匹配的方式、以能夠有效治療和產(chǎn)生免疫的用量來(lái)施 用。施用量取決于受治療的對(duì)象，包括個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力和所需要的保護(hù)程度。 要施用的活性成分的精確劑量取決于醫(yī)生的判斷。但是，合適的劑量范圍為每份疫苗中幾 百微克活性成分的級(jí)別。首次施用和加強(qiáng)注射的合適方案也是可變的，但一般為首次施用 之后再后續(xù)接種或其他施用。應(yīng)用的方式可以是多種多樣的。任何的常規(guī)疫苗施用方法都是可應(yīng)用的。這些方 法應(yīng)包括通過(guò)生理學(xué)可接受的固體基質(zhì)口服應(yīng)用，或者作為生理學(xué)可接受的分散劑以腸胃 外、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻、通過(guò)吸入、通過(guò)注射等施用。疫苗的劑量取決于給藥途徑，且根據(jù)受試者 的體形和健康狀況而變化。在許多實(shí)例中，期望多次施用疫苗，通常不超過(guò)六次疫苗接種，更通常不超過(guò)四次 疫苗接種，優(yōu)選一次或多次，通常至少大概三次疫苗接種。疫苗接種一般間隔2到12周，更 通常為間隔3到5周。間隔1-5年(通常為3年)的定期加強(qiáng)注射可滿足保持保護(hù)性抗體水 平的要求。在免疫接種過(guò)程之后，如例如美國(guó)專利3，791，932,4, 174，384和3，949，064 (通 過(guò)引用并入本文)所述測(cè)定針對(duì)該抗原的抗體。1.載體給定組合物其免疫原性可能不同。因此通常必需增強(qiáng)宿主的免疫系統(tǒng)，這可通過(guò) 將肽或多肽偶聯(lián)到載體上來(lái)實(shí)現(xiàn)。示例性及優(yōu)選的載體為匙孔槭血藍(lán)蛋白(KLH)和牛血清 白蛋白(BSA)。其他白蛋白如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作載體。將 多肽綴合到載體蛋白的方法為本領(lǐng)域所熟知，包括戊二醛、間馬來(lái)酰亞胺苯甲酰-N-羥基 琥珀酰亞胺酯、碳二亞胺和雙重氮聯(lián)苯胺。2.佐齊[J可通過(guò)使用免疫應(yīng)答的非特異性刺激劑(稱為佐劑)來(lái)增強(qiáng)多肽或肽組合物的免 疫原性。合適的佐劑包括所有可接受的免疫刺激化合物，如細(xì)胞因子、毒素或合成組合物。可使用許多佐劑來(lái)增強(qiáng)抗體針對(duì)Hla肽或蛋白的應(yīng)答。佐劑可(1)滯留體內(nèi)的抗 原而引起其緩慢釋放；(2)把涉及免疫應(yīng)答的細(xì)胞吸引到施用部位；(3)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)細(xì)胞 的增殖或活化；或(4)促進(jìn)抗原在受試者整個(gè)身體的傳播。
佐劑包括但不局限于水包油乳劑、油包水乳劑、礦物鹽、多核苷酸和天然物質(zhì)?？?使用的具體佐劑包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、y -干擾素、GMCSP、BCG、氫氧化鋁或 其他鋁化合物、MDP化合物(如thur-MDP和nor-MDP)、CGP (MTP-PE)、脂質(zhì)A和單磷酰脂質(zhì) A(MPL)。其他可使用的佐劑包括RIBI，它包含在2%角鯊烯/吐溫80乳劑中的三種從細(xì)菌 中提取的組分，MPL、海藻糖二分枝酸酯(trehalose dimycolate,TDM)和細(xì)胞壁骨架(cell wall skeleton，CWS)。還可使用MHC抗原。其他佐劑或方法示例于美國(guó)專利6，814，971、 5，084，269,6, 656，462，均通過(guò)引用并入本文。對(duì)疫苗實(shí)現(xiàn)佐劑效應(yīng)的多種方法包括使用制劑如氫氧化鋁或磷酸鋁(明礬)，通 常以磷酸鹽緩沖液中約0. 05%到約0. 的溶液使用，與以約0. 25%溶解的人造多聚糖 (Carbopol )混合，分別通過(guò)以約70°C到約ioi°C的溫度熱處理30秒到2分鐘來(lái)聚集 疫苗中的蛋白質(zhì)。還可采用以下方法來(lái)產(chǎn)生佐劑效應(yīng)通過(guò)用胃蛋白酶處理的(Fab)白蛋 白抗體的重激活進(jìn)行聚集；與革蘭氏陰性菌的細(xì)菌細(xì)胞(例如短小棒狀桿菌(C. parvum)), 外毒素或脂多糖成分的混合物；在生理學(xué)可接受的油介質(zhì)(例如二縮甘露醇一油酸 (Aracel A))中的乳劑；或用作為模塊代用品的20%全氟化碳(FlllOSOl-DA )乳劑。例如，通常優(yōu)選的佐劑包括弗氏完全佐劑(包含滅活的結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答 非特異性刺激物)、弗氏不完全佐劑和氫氧化鋁。除了佐劑之外，還可能期望共施用生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(biologicresponse modifier,BRM)來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。BRM已顯示能夠上調(diào)T細(xì)胞免疫或下調(diào)抑制細(xì)胞的活性。 這些BRM包括但不局限于西咪替丁(CIM ； 1200mg/d) (Smith/Kline，PA)、低劑量的環(huán)磷酰胺 (CYP ；300mg/m2) (Johnson/Mead, NJ)和細(xì)胞因子如干擾素、IL-2或IL-12，或編碼涉及 免疫幫助功能的蛋白質(zhì)(如B-7)的基因。B.脂質(zhì)組分和部分在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含一種或多種與核酸或多肽/肽相關(guān)聯(lián)的脂質(zhì) 的組合物。脂質(zhì)是不溶于水而能用有機(jī)溶劑提取的物質(zhì)。除本文具體描述那些以外的化合 物為本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為脂質(zhì)，并包括在本發(fā)明組合物和方法中。脂質(zhì)組分和非脂質(zhì)可 共價(jià)地或者非共價(jià)地互相附著。脂質(zhì)可以是天然脂質(zhì)或人工脂質(zhì)。但是，脂質(zhì)通常為生物物質(zhì)。生物脂質(zhì)為本領(lǐng)域 所熟知，包括例如中性脂肪、磷脂、甘油磷脂、類固醇、萜烯、溶血脂質(zhì)、鞘糖脂、糖脂、硫脂、 含有醚基和酯基連接的脂肪酸的脂質(zhì)和多聚脂質(zhì)，以及它們的組合。與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)的核酸分子或多肽/肽可分散在含有脂質(zhì)的溶液中、用脂質(zhì)溶解、 用脂質(zhì)乳化、與脂質(zhì)混合、與脂質(zhì)組合、與脂質(zhì)共價(jià)鍵合、作為懸液包含于脂質(zhì)中或以其他 方式與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的脂質(zhì)或脂質(zhì)_Hla關(guān)聯(lián)組合物不局限于任何特定結(jié)構(gòu)。例 如，它們還可簡(jiǎn)單地分散于溶液中，可以形成大小或形狀不一的聚集體。在另一實(shí)例中， 它們可以雙層結(jié)構(gòu)存在(如膠束)或具有“塌陷”結(jié)構(gòu)。在另一非限制性實(shí)例中，還涉及 lipofectamine (Gibco BRL) _Superfect (Qiagen) _在某些實(shí)施方案中，組合物可包含約1 %、約2 %、約3 %、約4%約5 %、約6 %、約 7%、約 8%、約 9%、約 10%、約 11%、約 12%、約 13%、約 14%、約 15%、約 16%、約 17%、 約 18 %、約 19 %、約 20 %、約 21 %、約 22 %、約 23 %、約 24 %、約 25 %、約 26 %、約 27 %、 約 28 %、約 29 %、約 30 %、約 31 %、約 32 %、約 33 %、約 34 %、約 35 %、約 36 %、約 37 %、
29約 38 %、約 39 %、約 40 %、約 41 %、約 42 %、約 43 %、約 44 %、約 45 %、約 46 %、約 47 %、 約 48 %、約 49 %、約 50 %、約 51 %、約 52 %、約 53 %、約 54 %、約 55 %、約 56 %、約 57 %、 約 58 %、約 59 %、約 60 %、約 61 %、約 62 %、約 63 %、約 64 %、約 65 %、約 66 %、約 67 %、 約 68 %、約 69 %、約 70 %、約 71 %、約 72 %、約 73 %、約 74 %、約 75 %、約 76 %、約 77 %、 約 78 %、約 79 %、約 80 %、約 81 %、約 82 %、約 83 %、約 84 %、約 85 %、約 86 %、約 87 %、 約 88%、約 89%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%、約99%或其間任何范圍的特定脂質(zhì)、脂質(zhì)類型或非脂質(zhì)成分，如佐劑、抗原、肽、多肽、 糖、核酸或本文所公開的或?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知的其他材料。在非限制性實(shí)例中，組合物 可含有約10%到約20%的中性脂質(zhì)、約33%到約34%的腦苷脂和約的膽固醇。在另一 非限制性實(shí)例中，脂質(zhì)體可包含約4%到約12%的萜烯(其中膠束中約具體為番茄紅 素，脂質(zhì)體的其余約3%到約11%含有其他萜烯)、約10%到約35%的卵磷脂和約的非 脂質(zhì)成分。因此本發(fā)明涉及的是，本發(fā)明組合物可含有以任何組合或百分比范圍的任何脂 質(zhì)、脂質(zhì)類型或其他組分。C.組合療法本發(fā)明的組合物和相關(guān)方法(特別是對(duì)患者/受試者施用Hla蛋白和/或抗Hla 抗體)也可與施用傳統(tǒng)療法組合使用。這些療法包括但不局限于施用抗生素，如鏈霉素、環(huán) 丙沙星、強(qiáng)力霉素、慶大霉素、氯霉素、甲氧芐啶、磺胺甲噁唑、氨芐青霉素、四環(huán)素、苯唑西 林、萬(wàn)古霉素或多種抗生素的組合。此外，對(duì)患者/受試者施用Hla蛋白或抗Hla抗體也可 與施用抗病毒劑(如RIP)組合使用。在一方面，本發(fā)明涉及的是，多肽疫苗和/或療法與抗菌和/或抗病毒治療聯(lián)合使 用?；蛘?，所述療法可在其他制劑治療之前或之后，間隔數(shù)分鐘至數(shù)周。在分別施用其他制 劑和/或蛋白質(zhì)或多核苷酸的實(shí)施方案中，一般應(yīng)確保每次遞送之間的時(shí)間不會(huì)過(guò)長(zhǎng)，以 便本發(fā)明的制劑和組合物仍能對(duì)受試者發(fā)揮有利的組合療效。在這些例子中，本發(fā)明涉及 的是，可在約12-24小時(shí)之內(nèi)(優(yōu)選在約6-12小時(shí)之內(nèi))施用兩種療法。然而，在一些情況 下，期望顯著延長(zhǎng)施用的時(shí)限，這時(shí)在各次施用之間經(jīng)過(guò)幾天(2、3、4、5、6或7)到幾周(1、 2、3、4、5、6、7 或 8)?？刹捎貌煌M合，例如抗生素療法為“A”，分別作為免疫或被動(dòng)免疫療法一部分的 給定免疫原性分子或抗體(如Hla抗體)為“B” A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/BB/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/AB/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A對(duì)患者/或受試者施用本發(fā)明組合物應(yīng)遵從施用這些化合物的一般方案，其中考 慮Hla多肽或抗Hla抗體組合物的毒性(如果有的話)。預(yù)計(jì)可根據(jù)需要重復(fù)治療周期。 還涉及的是，多種標(biāo)準(zhǔn)療法如水療(hydration)可與所述療法組合應(yīng)用。D. 一般藥物組合物在一些實(shí)施方案中，對(duì)受試者施用藥物組合物。本發(fā)明的不同方面包含向受試者 施用有效量的組合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可對(duì)患者施用Hla多肽或肽，來(lái)保護(hù)其 免受一種或多種葡萄球菌病原體的感染。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，可對(duì)患者施用針 對(duì)Hla多肽或肽的特異性抗體，來(lái)治療或預(yù)防一種或多種葡萄球菌病原菌的感染?；蛘撸蓪⒕幋a一種或多種這種多肽或肽的表達(dá)載體給予患者，作為預(yù)防性處理。此外，這些化合物 可與抗生素和/或抗病毒劑組合施用。這些組合物一般可溶解或分散在藥學(xué)上可接受的載 體或含水介質(zhì)中。短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”或“藥物上可接受的”是指，分子實(shí)體和組合物在施用于動(dòng) 物或人時(shí)不產(chǎn)生有害的、過(guò)敏的或其他不想要的反應(yīng)。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體” 包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這些介 質(zhì)和制劑用于藥物活性物質(zhì)的用途為本領(lǐng)域所熟知?？紤]在免疫原性和治療性組合物中使 用任何常規(guī)介質(zhì)或制劑，除非其與活性成分不相容。還可將補(bǔ)充性活性成分(如抗病毒劑 或抗感染劑)摻入組合物中。除了配制成腸胃外施用的化合物(如用于靜脈注射或肌內(nèi)注射的那些)，其他藥 學(xué)上可接受的形式包括例如用于口服施用的片劑或其他固體；緩釋膠囊；以及目前所用的 其他任何形式，包括吸入劑等。可將本發(fā)明的活性化合物配制成用于腸胃外施用，例如配制成用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、 皮下甚至腹膜內(nèi)途徑的注射。根據(jù)本公開內(nèi)容，含有本發(fā)明組合物的水性組合物的制備方 法會(huì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。通?？蓪⑦@些組合物制備成注射劑(液體溶液或懸液)；還 可制備適于在注射前加入液體后制備成溶液或懸液的固體劑型；還可以將制劑乳化。可在與表面活性劑(如羥丙基纖維素)適當(dāng)混合的水中，制備以游離堿或藥學(xué)上 可接受鹽的形式存在的活性化合物的溶液。也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及在 油中制備分散劑。在普通的儲(chǔ)藏和使用條件下，這些制備物含有防止微生物生長(zhǎng)的防腐劑。適于注射使用的藥物劑型包括無(wú)菌水溶液或分散系；包括芝麻油、花生油或水溶 丙二醇的制劑；用于即時(shí)制備無(wú)菌注射溶液或分散系的無(wú)菌散劑。在所有情況下，劑型必須 是無(wú)菌的，而且必須達(dá)到容易被注射的流動(dòng)程度。它還應(yīng)當(dāng)在加工和儲(chǔ)藏條件下是穩(wěn)定的， 而且應(yīng)當(dāng)免受微生物(如細(xì)菌和真菌)的污染作用?？蓪⒌鞍仔越M合物配制成中性或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(由蛋 白質(zhì)的游離氨基形成)和由無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、 扁桃酸等)形成的鹽。由游離羧基形成的鹽也可來(lái)自無(wú)機(jī)堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫 氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)和有機(jī)堿(例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等)。載體也可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇 和液體聚乙二醇等)、它們的合適混合物以及植物油。可通過(guò)例如使用包衣(如卵磷脂)、 通過(guò)維持所需的粒徑(對(duì)于分散系的情況)以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng) 性?？赏ㄟ^(guò)多種抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等來(lái) 實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物作用的預(yù)防。在許多情況下，可優(yōu)選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉?？赏ㄟ^(guò)在 組合物中使用延遲吸收劑例如單硬脂酸鋁和明膠來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)注射組合物的延長(zhǎng)吸收。通過(guò)將所需量的活性化合物摻入具有上面所列舉的多種其他成分的合適溶劑中， 來(lái)制備無(wú)菌注射液，其后根據(jù)需要進(jìn)行過(guò)濾除菌。一般地，通過(guò)將多種無(wú)菌活性成分混合入 無(wú)菌載體(含有基本分散介質(zhì)和所需的其他上面所列舉的成分)來(lái)制備分散系。對(duì)用于制 備無(wú)菌注射液的無(wú)菌散劑而言，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，由預(yù)先經(jīng)過(guò) 濾除菌的溶液產(chǎn)生活性成分和所有其他所需成分的散劑。本發(fā)明組合物的施用通?？梢越?jīng)由任何常見的途徑。這包括但不局限于口服、鼻內(nèi)或含服施用?；蛘?，可通過(guò)正位、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、粘膜或靜脈內(nèi)注射來(lái)施 用。在某些實(shí)施方案中，可吸入疫苗組合物(例如美國(guó)專利6，651，655，特別通過(guò)引用并 入)。這些組合物通常作為藥學(xué)上可接受的組合物(含有生理學(xué)上可接受的載體、緩沖劑或 其他賦形劑)施用。藥學(xué)上可接受的材料、組合物或介質(zhì)可包括但不局限于涉及攜帶或運(yùn) 送化學(xué)制劑的液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料。就水溶液的腸胃外施用而言，例如，必要時(shí)可適當(dāng)?shù)鼐彌_溶液，而且液體稀釋劑應(yīng) 首先用足夠的鹽或葡萄糖進(jìn)行等滲處理。這些特殊的水溶液特別適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和 腹膜內(nèi)施用。在這一點(diǎn)上，根據(jù)本公開內(nèi)容，可采用的無(wú)菌水介質(zhì)可為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 知。例如，可將一劑藥物溶于等滲NaCl溶液中，并且加入到皮下輸液中或注射到建議的輸 注位點(diǎn)(參見例如，Remington，s Pharmaceutical Sciences，1990)。根據(jù)受試者的身體 狀況，必然會(huì)導(dǎo)致一些用量改變。無(wú)論如何，負(fù)責(zé)施用的人會(huì)決定個(gè)體受試者的合適劑量。治療或預(yù)防組合物的有效量基于預(yù)期目標(biāo)來(lái)確定。術(shù)語(yǔ)“單位用藥”或“劑量”是 指適于用于受試者的物理分離的單位，每個(gè)單位包含為產(chǎn)生上面所討論的與其施用(即適 當(dāng)途徑和方案)相關(guān)的預(yù)期應(yīng)答而計(jì)算得到的預(yù)定量組合物。所要施用的量(治療次數(shù)和 單位劑量)取決于預(yù)期得到的保護(hù)作用。組合物的精確劑量也取決于醫(yī)生的判斷，且為每個(gè)個(gè)體所特有的。影響用藥的因 素包括受試者的身體和臨床狀態(tài)、施用途徑、治療的預(yù)期目標(biāo)(減輕癥狀還是治愈)以及特 定組合物的效價(jià)、穩(wěn)定性和毒性。制備后，會(huì)以與給藥劑型相匹配的方式、以有效治療或預(yù)防的劑量來(lái)施用溶液?？?容易地以多種劑型(如上文所描述的注射液的類型)來(lái)施用制劑。E.體外、離體或體內(nèi)施用本文所用的術(shù)語(yǔ)體外施用是指對(duì)從動(dòng)物中取出的或在動(dòng)物體外的細(xì)胞(包括但 不局限于培養(yǎng)的細(xì)胞)進(jìn)行操作。術(shù)語(yǔ)離體施用是指將已在體外進(jìn)行了操作的細(xì)胞隨后施 用于活的動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)體內(nèi)施用包括在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的所有操作。在本發(fā)明的某些方面中，可通過(guò)體外、離體或體內(nèi)施用組合物。在某些體外實(shí)施方 案中，通常將自體B淋巴細(xì)胞細(xì)胞系與本發(fā)明的病毒載體孵育24至48小時(shí)，或與Hla多肽 孵育2小時(shí)。轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞接著可用于體外分析，或用于離體施用。通過(guò)引用并入本文的美國(guó)專利4，690，915和5，199，942公開了離體操作血液?jiǎn)魏?細(xì)胞和骨髓細(xì)胞用于治療應(yīng)用的方法。V.實(shí)施例給出以下實(shí)施例來(lái)闡明本發(fā)明的多種實(shí)施方案，并非以任何方式限制本發(fā)明。本 領(lǐng)域技術(shù)人員很容易領(lǐng)會(huì)到，本發(fā)明非常適于完成目標(biāo)并獲得所提及的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，以及 本文固有的那些目標(biāo)、結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本文的實(shí)施例和本文所描述的方法是現(xiàn)有優(yōu)選實(shí)施方 案的代表，是示例性的，并非意圖限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)想到其中的改變以 及權(quán)利要求范圍所定義的本發(fā)明精神所涵蓋的其他用途。實(shí)施例1疫苗介導(dǎo)的針對(duì)金黃餼葡萄球菌的保護(hù)A.方法細(xì)菌菌株和培養(yǎng)物。在胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)或胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基Newman、LAC和麗2。為獲得PVL轉(zhuǎn)化噬菌體，用1 μ g/ml絲 裂霉素C誘導(dǎo)Φ Sa2mw在金黃色葡萄球菌MW2培養(yǎng)物中的裂解性復(fù)制。用0. 22 μ m膜過(guò)濾 溶菌產(chǎn)物，濾液用于在金黃色葡萄球菌RN4220上的噬菌斑形成(Bae等2006)。將噬菌體懸 液與Iml菌株RN4220的對(duì)數(shù)中期培養(yǎng)物(生長(zhǎng)于添加了 5mM CaCl2的心浸液肉湯(HIBCa5) 中)混合，然后通過(guò)37 °C過(guò)夜孵育來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)酚/氯仿提取法從擴(kuò)增的噬菌體顆粒中 純化 DNA。使用弓丨物 cctcctgttgatggaccact(SEQ ID NO 3)禾口 ggcgctgaggtagtcaaaag(SEQ ID NO :4)，通過(guò)IukS-PV DNA的PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)(tSa2mw。將Φ Sa2mw噬菌體溶液與生長(zhǎng) 于HIBCa5中的菌株Newman的對(duì)數(shù)中期培養(yǎng)物混合，37°C振蕩(150rpm)孵育過(guò)夜，然后涂 板在TSA上。在TSA上繁殖菌落以除掉污染的噬菌體顆粒。在5ml TSB中37°C過(guò)夜培養(yǎng) (tSa2mw溶素原，純化染色體DNA，并擴(kuò)增IukS-PV DNA。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)自菌株ΦΝ Ξ 11568的 bursaaurealis 插入突變產(chǎn)生突變體 Newman Φ Sa2mw hla: :erm、Newmanhla: :erm 禾口 LAC hla: : erm,然后通過(guò)PCR和DNA測(cè)序進(jìn)行篩選以確定hla位點(diǎn)的破壞(Bae等2004)。在含 有10 μ g/ml紅霉素的TSA上維持轉(zhuǎn)導(dǎo)子，除了 LAC hla: erm(在100 μ g/ml紅霉素培養(yǎng)基 上繁殖)。為進(jìn)行回補(bǔ)研究，將葡萄球菌用質(zhì)粒POSl (載體)、phla或ppvl進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并在 含有10 μ g/ml氯霉素的TSA上進(jìn)行培養(yǎng)。為了實(shí)現(xiàn)小鼠肺部感染，將細(xì)菌的過(guò)夜培養(yǎng)物以 1 100稀釋到新鮮TSB中，并37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至OD66tl為0.5。將50ml培養(yǎng)物等分試樣中 的葡萄球菌通過(guò)離心進(jìn)行沉淀，用PBS洗滌，并用750 μ 1 PBS重懸以進(jìn)行致死率研究(每 30 μ 1含3-4X IO8CFU)、或用1250 μ 1 PBS重懸(每30 μ 1含2Χ IO8CFU)以進(jìn)行細(xì)菌載荷 和組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)。為進(jìn)行細(xì)胞毒性研究，培養(yǎng)葡萄球菌菌株至OD66tl 0.5。將每份5ml培 養(yǎng)基中的葡萄球菌通過(guò)離心進(jìn)行沉淀，用PBS洗滌，并用10mlF12培養(yǎng)基(Gibco)重懸。質(zhì)粒。用弓丨物 gcgggatcccccctttcttgaattaaca(SEQ ID NO 5)禾口 gcggaattcacat taatttgtcatttcttc (SEQ ID NO 6)，以金黃色葡萄球菌NewmanDNA作為模板對(duì)hla基因和 啟動(dòng)子進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。用引物 gcgggatccgtatatgatgaatcttaggca(SEQ ID NO 7)和 gcgga attctgtttagctcataggatttttttc(SEQ ID NO 8)對(duì) pvl 基因座和啟動(dòng)子進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。將 PCR產(chǎn)物用BamHI和EcoRI消化，并克隆入pOSl的相應(yīng)位點(diǎn)。兔抗血清的制備。使用pOSl-HlaH35L 模板 DNA 和引物 gccggatccgcagattctgatat taatattaaaacc(SEQ ID NO 9)禾口 gcggaattcacattaatttgtcatttcttc (SEQ ID NO 10)產(chǎn) 生編碼成熟Hla1135L的PCR產(chǎn)物。使用USA300基因組模板DNA及引物gccggatccgctcaaca tatcacacctgtaagtgag(SEQ ID NO 11)和 gcggaattctgtttagctcataggatttttttc(SEQ ID NO: 12) (LukF-PV)以及 gccggatccgataacaatattgagaatattggtgat (SEQ ID NO 13)禾口 gccg aattctcaattatgtcctttcactttaatttc(SEQ ID NO 14) (LukS-PV)產(chǎn)生編碼成熟 LukS-PV 禾口 LukF-PV 的 PCR 產(chǎn)物。將 PCR 產(chǎn)物用 BamHI 和 EcoRI 消化，并克隆入 pGEX_6P_l (Amersham Biosciences)的相應(yīng)位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。通過(guò)親和層析純化GST-HlaH35L、GST-LukF-PV 和GST-LukS-PV融合蛋白。將純化的蛋白質(zhì)(0.5mg)用弗氏完全佐劑(CFA)或者弗氏不完 全佐劑(IFA)乳化，并肩胛下(subscapularly)注射入雌性新西蘭白兔進(jìn)行初次免疫，接下 來(lái)進(jìn)行兩次間隔為21天的加強(qiáng)免疫。主動(dòng)和被動(dòng)免疫研究。對(duì)主動(dòng)免疫，根據(jù)廠商說(shuō)明書(AmershamBiosciences)對(duì) GST-Hla1135L融合蛋白進(jìn)行Precission蛋白酶切割。在通過(guò)Triton X-114提取去除了污 染的內(nèi)毒素之后，將HlaH35L蛋白在CFA或IFA中乳化。4周大的C57B1/6J小鼠(Jackson
33Laboratories)在第0天接受20 μ g在CFA中的Hlama蛋白，之后在第10天用20 μ g在IFA 中的Hla113a蛋白進(jìn)行加強(qiáng)。然后在第21天用金黃色葡萄球菌對(duì)動(dòng)物進(jìn)行攻擊。從在第0 天免疫前和在第20天的動(dòng)物中獲得血清以評(píng)估特異性血清抗體的產(chǎn)生。對(duì)被動(dòng)免疫研究，在用金黃色葡萄球菌攻擊之前24小時(shí)，7周大的C57B1/6J小鼠 通過(guò)腹膜下(IP)注射接受100 μ 1正常兔血清(NRS，Sigma)或抗Hla兔抗血清。用LukF-PV 和LukS-PV被動(dòng)免疫的動(dòng)物接受在總IP注射體積200 μ 1中1 1混合的每種特異性抗血 清100 μ 1。用于LukF/S-PV免疫研究的對(duì)照組動(dòng)物接受200 μ 1 NRS。在在進(jìn)行攻擊時(shí)收 集血清以評(píng)估特異性兔抗體效價(jià)。小鼠感染模型。感染前在芝加哥大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)六周大的雌性C57B1/6J小鼠 (Jackson Laboratories) 一周。用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉動(dòng)物。證實(shí)已正確麻醉后，向左 鼻孔中接種30 μ 1葡萄球菌懸液。將動(dòng)物接種后直立一分鐘，然后以仰臥位放入籠中以利 于恢復(fù)。向所有動(dòng)物提供自由采食的食物和水，并繼續(xù)觀察72小時(shí)。一小部分動(dòng)物常規(guī)性 地死于接種后六小時(shí)內(nèi)，很可能由于呼吸和麻醉的共同作用。這些動(dòng)物不納入后續(xù)分析中。細(xì)菌載荷和組織病理學(xué)。按照芝加哥大學(xué)動(dòng)物關(guān)懷和使用協(xié)會(huì)(University of Chicago Institute of Animal Care和Use Committee)指導(dǎo)方針，通過(guò)強(qiáng)制性二氧化碳吸 入處死感染的動(dòng)物，然后摘除雙側(cè)肺。將右肺置于Iml無(wú)菌PBS中并勻漿，之后在瓊脂糖平 板上進(jìn)行連續(xù)稀釋和菌落形成。為進(jìn)行組織病理學(xué)研究，將左肺解剖并置于的甲醛中。 將甲醛固定的組織進(jìn)行包埋和切片，之后用蘇木精和伊紅染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察。ELISA。使用包被有 1 μ g/ml 重組 HlaH35L、LukF-PV 或 LukS-PV 的 Nunc MaxiSorp Immuno平板進(jìn)行小鼠血清抗體效價(jià)的分析。將血清稀釋液在相應(yīng)平板中孵育，并用HRP綴 合的二抗和Opti-EIA(BDBiosciences)在Tecan GENios分光光度計(jì)上顯色。蛋白質(zhì)分析。將在TSB中培養(yǎng)的葡萄球菌培養(yǎng)物調(diào)整到相等的光密度，將培養(yǎng)物 上清液中的蛋白質(zhì)用三氯乙酸沉淀，用丙酮洗滌并溶解在上樣緩沖液中。通過(guò)采用特異性 抗血清(α -LukS-PV、α -LukF-PV或α -核酸酶)和具有加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的HRP綴合山 羊抗兔二抗的免疫印記，來(lái)分析在15% SDS-PAGE上分離的蛋白質(zhì)。從ToxinTechnology公 司(Sarasota，F(xiàn)L)購(gòu)買辣根過(guò)氧化物酶綴合的抗Hla抗體。細(xì)胞毒性測(cè)定。在添加了 10%胎牛血清和normocin(100y g/ml，InvivoGen, SanDiego, CA)的F12培養(yǎng)基中維持A549細(xì)胞。洗滌A549細(xì)胞，并在96孔板上將其以每 孔1. 5 X IO4個(gè)細(xì)胞的密度置于F12完全培養(yǎng)基中。用無(wú)添加物的F12培養(yǎng)基洗滌A549細(xì) 胞一遍，之后每孔加入100 μ 1葡萄球菌懸液。在加濕的37°C溫箱中孵育4小時(shí)后，一式三 份測(cè)定LDH活性(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)。為進(jìn)行細(xì)胞損傷的顯微 鏡評(píng)價(jià)，使用Nikon Eclipse TE2000U顯微鏡獲取感染后3個(gè)小時(shí)的細(xì)胞圖像。細(xì)胞因子測(cè)定。將感染24小時(shí)后從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物收集的血清以1 4的比例稀釋，并 使用Bioplex Mouse 8-Plex A assay (Bio-Rad)測(cè)定細(xì)胞因子的含量。在帶有Bio-Plex 管理軟件的Bio-Plex工作站上定量細(xì)胞因子的濃度。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行死亡率研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析。使用 雙尾Student t檢驗(yàn)計(jì)算細(xì)菌回收研究和A549 LDH釋放的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。B.結(jié)果葡萄球菌α-溶血素(Hla或α毒素)是細(xì)菌成孔β-桶毒素(Bhakdi和Tranum-Jensen, 1991 ；Song等，1996)的初始成員。它的結(jié)構(gòu)基因hla位于所有被檢測(cè) 到分泌293個(gè)殘基的水溶單體的金黃色葡萄球菌菌株的染色體上(0' Reilly等，1990 ； 0' Reilly等，1986)。Hla被認(rèn)為與敏感性宿主細(xì)胞的表面載體結(jié)合，從而促進(jìn)其自身寡 聚成七聚體孔洞前體，并將具有2nm孔徑的β-桶結(jié)構(gòu)插入質(zhì)膜(Gouaux等，1997)。Hla 孔洞形成于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、肺內(nèi)皮細(xì)胞和紅細(xì)胞，但是粒細(xì)胞和成纖 維細(xì)胞表現(xiàn)出裂解抗性(Bhakdi和Tranum-Jensen，1991 ；McElroy等，1999)。向兔或大鼠 肺部組織中滴入純化的Hla引發(fā)了血管滲漏和肺動(dòng)脈高血壓，其原因在于釋放了幾種信號(hào) 分子，如磷脂酰肌醇、一氧化氮、前列腺素類(PGE2、PGI2)和血栓烷Α2 (McElroy等，1999 ； Seeger 等，1984 ；Seeger 等，1990 ；Rose 等，2002 ；Suttorp 和 Habben，1988)。與 Hla 的生物 化學(xué)特性一致，消除金黃色葡萄球菌Newman中Hla表達(dá)的突變嚴(yán)重減弱了在鼠肺炎模型中 的毒力(Bubeck-Wardenburg等，2007)。本文中，本發(fā)明人研究了以α-溶血素作為靶標(biāo)開 發(fā)針對(duì)金黃色葡萄球菌肺部感染之疫苗或免疫治療的策略。為檢測(cè)在近期臨床金黃色葡萄球菌分離群中hla是否作為一個(gè)毒力因子發(fā)揮功 能，本發(fā)明人選擇了社區(qū)型 MRSA 菌株 LAC(Los AngelesClone, CDC clade USA300) (Voyich 等，2006 ；Miller等，2005)。用hla: erm等位基因取代hla，完全消除了金黃色葡萄球 菌LAC引起肺部感染的能力(圖1A)。近期報(bào)道描述了分泌編碼Panton-Valentine殺 白細(xì)胞素(PVL)之噬菌體的金黃色葡萄球菌分離群的出現(xiàn)(Miller等，2005 Chambers， 2005 ;Vandenesch 等，2003 ;Fridkin 等，2005)。PVL 是另一七聚體 β-桶毒素，該毒素 由兩個(gè)插入選擇性靶細(xì)胞膜的亞基(LukS-PV和LukF-PV)組成(Panton和Valentine， 1932 ；Menestrina等，2001)。利用實(shí)驗(yàn)室菌株金黃色葡萄球菌RN6390及其PVL+衍生物， Labandeira-Rey和同事指出，PVL可能作為鼠肺炎發(fā)病過(guò)程中必要的毒力因子而發(fā)揮功能 (Labandeira-Rey等，2007)。當(dāng)在菌株RN6390中從多拷貝質(zhì)粒上表達(dá)PVL時(shí)，觀察到肺炎 的顯著動(dòng)物致死率和組織病理學(xué)跡象(Labandeira-Rey等，2007)。與之相反，使用敗血癥 和皮膚感染的鼠科動(dòng)物模型，Voyich等發(fā)現(xiàn)PVL在葡萄球菌毒力中沒(méi)有直接作用(Voyich 等，2006)。在美國(guó)流行的CA-MRSA分離群的同基因IukS-PV和IukF-PV突變衍生物、菌株 LAC(USA300)和MW2(USA400)，同樣未顯示PVL在嗜中性粒細(xì)胞裂解、潰瘍形成、表皮壞死或 敗血病誘導(dǎo)死亡中發(fā)揮作用(Voyich等，2006)。PVL及其對(duì)肺部感染發(fā)病機(jī)制的貢獻(xiàn)。為測(cè)試在目前臨床分離群中表達(dá)的PVL是 否對(duì)肺部感染的發(fā)病機(jī)制有所貢獻(xiàn)，在鼠肺炎模型中分析了金黃色葡萄球菌菌株LAC和 MW2及其缺少PVL基因的同基因突變株。在對(duì)由野生型和同基因Δρν 突變體菌株引發(fā)的 感染進(jìn)行配對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，兩者之間在患有金黃色葡萄球菌性肺炎的動(dòng)物總體死亡率上無(wú) 顯著差異(圖1Β)。在兩種CA-MRSA菌株的任一種中缺失lukS/F-PV(Apvl)均不影響細(xì)菌 在小鼠肺中的生長(zhǎng)。來(lái)自感染動(dòng)物的蘇木精-伊紅染色的切片樣品顯示了肺炎的病理學(xué)證 據(jù)，其表現(xiàn)為免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡結(jié)構(gòu)缺失以及肺實(shí)質(zhì)固結(jié)和細(xì)菌滲入；這些特征在用分泌 或不分泌PVL的菌株感染的動(dòng)物中無(wú)法區(qū)分(圖1C)。發(fā)明者考慮到，PVL對(duì)葡萄球菌性肺炎的貢獻(xiàn)是否被在肺部感染發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮 重要作用的α-溶血素所掩蓋。用噬菌體ctSdmw (從金黃色葡萄球菌MW2中分離)來(lái)產(chǎn) 生金黃色葡萄球菌Newman的lukS/F-PV溶素原(Baba等，2002)(圖3A)。將Φ Sa2mw插入 到金黃色葡萄球菌Newman染色體的1565379位核苷酸處，導(dǎo)致LukS-PV和LukF-PV的分泌(Kaneko等，1998)(圖3B)。對(duì)C57B1/6J小鼠進(jìn)行攻擊之后，Φ Sa2mw溶素原以相同效率在 肺部組織中復(fù)制，這通過(guò)右肺勻漿組織中的菌落形成單位(CFU)來(lái)判斷(圖3C)?；加山?黃色葡萄球菌Newman野生型或Newman Φ Sa2mw誘導(dǎo)的肺炎的小鼠的整體死亡率未觀察到 顯著差異(圖3D)，表明通過(guò)噬菌體溶原性而分泌的PVL未增加金黃色葡萄球菌在鼠肺部 感染過(guò)程中的毒力。盡管存在PVL噬菌體，但hla的插入破壞導(dǎo)致金黃色葡萄球菌Newman cj5Sa2mw(hla: :erm)對(duì)鼠肺部感染失去毒力(圖3E) ·用編碼lukS/F-PV(ppvl)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化金黃色葡萄球菌Newman，促進(jìn)了高水平的 PVL表達(dá)(圖4B)。然而，在用帶有空載體或ppvl的金黃色葡萄球菌Newman進(jìn)行的感染 中，沒(méi)有觀察到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺炎相關(guān)死亡率的改變(圖4A)。相似地，PVL表達(dá)未改變感染 動(dòng)物肺部的金黃色葡萄球菌回收或者疾病的組織病理學(xué)跡象(數(shù)據(jù)未顯示)。如以前所報(bào) 道，金黃色葡萄球菌Newman (hla: :erm)中hla表達(dá)的缺失使金黃色葡萄球菌在肺部感染模 型中的毒力和致死性完全喪失(Bubeck-Wardenburg等，2007)，該缺陷不能為ppvl轉(zhuǎn)化所 回復(fù)。與之相反，使用促進(jìn)Hla表達(dá)的質(zhì)粒phla進(jìn)行的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致毒力表型的完全和過(guò)度恢 復(fù)，100%的動(dòng)物在24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)時(shí)死于肺炎(圖4A)。免疫印跡分析提供了在每一這些 菌株中LukS-PV、LukF-PV和α -溶血素的存在水平，同時(shí)證明所示的遺傳缺陷導(dǎo)致相應(yīng)目 的蛋白的缺失(圖4Β)。因此，Hla是在小鼠中建立葡萄球菌性肺部疾病的關(guān)鍵毒力因子， 而非PVL。Hla特異性免疫應(yīng)答。為測(cè)試Hla特異性免疫應(yīng)答是否影響葡萄球菌性肺炎的發(fā) 病機(jī)制，通過(guò)使用磷酸鹽緩沖液(PBS)或20yg純化Hlaroa的肌內(nèi)注射來(lái)免疫小鼠，所述 HIbh35l為具有單個(gè)氨基酸替換的α -溶血素變體，可阻止孔洞而不影響毒素結(jié)合宿主靶細(xì) 胞(Gouaux等，1997)。通過(guò)免疫獲得平均Hlama特異性抗體效價(jià)為1 5601 (士 2789)。在 金黃色葡萄球菌Nesman攻擊后，在經(jīng)Hla113a免疫的動(dòng)物中觀察到動(dòng)物死亡率的顯著下降 (圖5Α)。這種下降與感染24小時(shí)后從肺部回收的金黃色葡萄球菌菌落形成單位減少相關(guān) (圖5Β)。被感染肺部組織的總體病理學(xué)分析顯示，在經(jīng)Hla113a免疫的動(dòng)物中只有局灶性區(qū) 域固結(jié)，與在模擬免疫的動(dòng)物中的彌散性固結(jié)相反(圖5C)。在α _溶血素免疫的動(dòng)物中疾 病的局灶性質(zhì)在感染肺部組織的組織病理學(xué)切片中也很明顯。在Hlaroa免疫的動(dòng)物中病變 是不連續(xù)的，更重要的是，為肺部的正常區(qū)域所包圍(圖5D)。相反地，在模擬免疫的動(dòng)物 中肺泡腔的大部分被栓塞。為檢驗(yàn)接種α-溶血素疫苗在由臨床相關(guān)金黃色葡萄球菌分離 群所致肺部感染發(fā)病機(jī)制中的作用，用金黃色葡萄球菌LAC或金黃色葡萄球菌MW2感染經(jīng) Hlaroa免疫的動(dòng)物。盡管由這些菌株引起的絕對(duì)死亡率各不相同，但是用Hlaroa免疫的所 有組別的動(dòng)物都獲得了顯著的死亡保護(hù)(圖5Ε)。本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到鼠肺部葡萄球菌感染與人不同的可能性。事實(shí)上，兩種金黃色葡 萄球菌噬菌體編碼的蛋白質(zhì)CHIPS和SCIN看來(lái)以物種特異性的方式調(diào)節(jié)人類免疫系統(tǒng) (Rooijakkers等，2005 ；Rooijakkers等，2006)。為闡明PVL在人類肺部組織損傷中的可能 作用，本發(fā)明人分析了金黃色葡萄球菌臨床分離群對(duì)人A549肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)， 所述A549細(xì)胞以前曾被用來(lái)檢測(cè)純化的葡萄球菌α-溶血素或B族鏈球菌β -溶血素對(duì) 人肺部上皮的作用(Rooijakkers等，2005 ；Rooijakkers等，2006)(圖6)。用金黃色葡萄 球菌LAC和MW2感染后，Α549細(xì)胞的損傷可容易地通過(guò)乳酸脫氫酶的釋放來(lái)進(jìn)行檢測(cè)(圖 6Α)。破壞pvl位點(diǎn)并未減弱任一這些 離群中金黃色葡萄球菌的細(xì)胞毒效應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)與
36已報(bào)導(dǎo)的PVL對(duì)于粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的特異性相一致(Woodin，1970 ；Meunier等，1995)。 與之相反，缺乏α “溶血素的金黃色葡萄球菌Newman變體不能破壞A549細(xì)胞，該缺陷能通 過(guò)Phla進(jìn)行回補(bǔ)，并可容易地通過(guò)感染細(xì)胞的顯微鏡檢查來(lái)觀察(圖6B)。α-溶血素在 直接肺泡細(xì)胞損傷中的重要作用提示，中和該毒素能阻止細(xì)胞損傷。向同時(shí)被金黃色葡萄 球菌感染的Α549細(xì)胞中加入Hla抗血清提供了防止毒素?fù)p傷的保護(hù)作用(圖6C)，而對(duì)照 組血清沒(méi)有效果(圖6C)。用純化的Hla1135L處理也能保護(hù)Α549細(xì)胞，這與Hla1135L占據(jù)肺細(xì) 胞表面的α “溶血素結(jié)合位點(diǎn)的假說(shuō)一致(圖6C)。感染后4小時(shí)通過(guò)熒光顯微術(shù)采集人 Α549細(xì)胞的活動(dòng)/靜止影像，評(píng)估未感染或與金黃色葡萄球菌Newman在培養(yǎng)基中共培養(yǎng) 的A549細(xì)胞，所述培養(yǎng)基用磷酸鹽緩沖液(PBS，1 1000)、正常兔血清(NRS，1 1000)、 抗Hla兔血清(a-Hla，l 1000)或純化的HlaH35L(10g/ml)進(jìn)行了處理。還用轉(zhuǎn)化有含有 hla基因的載體或質(zhì)粒(phla)的Newman同基因hla插入突變體hla: erm進(jìn)行了感染。結(jié) 果表明α-溶血素拮抗作用能夠減少金黃色葡萄球菌對(duì)人肺泡表皮細(xì)胞的損傷。α -溶血素特異性抗體可提供針對(duì)葡萄球菌性肺部疾病的保護(hù)。為了測(cè)試α _溶 血素特異性抗體是否能夠提供針對(duì)葡萄球菌性肺部疾病的保護(hù)，在用金黃色葡萄球菌 Newman攻擊前24小時(shí)，通過(guò)腹膜內(nèi)注射用正常兔血清或抗Hla血清被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[平 均Hla113a特異性抗體效價(jià)1 480(士179)](圖7)。肺炎引發(fā)的死亡率檢測(cè)顯示了用抗Hla 血清被動(dòng)免疫的保護(hù)作用，對(duì)照血清則不然(圖7A)。該保護(hù)作用與疾病的總體(圖7C)和 組織病理學(xué)(圖7D)特征的改善相關(guān)。此外，觀察到從抗Hla免疫的動(dòng)物肺部回收的菌落 形成單位顯著減少(圖7B)。不僅在用金黃色葡萄球菌Newman攻擊的動(dòng)物中，而且在用金 黃色葡萄球菌LAC或MW2感染的動(dòng)物中被動(dòng)免疫保護(hù)都是有效的(圖7E)。與之相反，用抗 PVL 血清[特異性抗體平均效價(jià) LukS-PV = 1 894 (士 80)和 LukF-PV = 1 3689 (士 186)] 進(jìn)行的被動(dòng)免疫對(duì)葡萄球菌性肺炎的結(jié)局沒(méi)有影響(圖7F)。多種感染性或非感染性刺激誘發(fā)的肺炎會(huì)導(dǎo)致IL-I β分泌的增加，這不僅促進(jìn) 免疫細(xì)胞募集至感染位點(diǎn)，而且參與全身性炎性應(yīng)答和急性肺損傷(Goodman等，2003)。在 過(guò)量發(fā)生時(shí)，IL-I β分泌必定對(duì)宿主是有害的(Goodman等，2003)。肺部感染葡萄球菌的 動(dòng)物血清中的細(xì)胞因子譜揭示，使用抗Hla被動(dòng)免疫導(dǎo)致血清IL-I β的顯著減少(圖8)。 此外，經(jīng)抗Hla免疫的動(dòng)物釋放促進(jìn)先天免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞)吞噬并 殺死葡萄球菌的細(xì)胞因子IFN- Y (圖8) (Zhao等，1998)。針對(duì)金黃色葡萄球菌α -溶血素產(chǎn)生的抗體能夠?qū)ε囵B(yǎng)的人肺泡表皮細(xì)胞提供 針對(duì)細(xì)胞裂解損傷的保護(hù)，并在鼠模型系統(tǒng)中提供對(duì)侵襲性疾病的保護(hù)能力，這提示，針對(duì) 這種毒素的單克隆抗體可以是有效的治療手段。為促成對(duì)該系列的研究，本發(fā)明人用重組 Hlaroa蛋白免疫小鼠，產(chǎn)生了一系列分泌抗Hla的骨髓瘤細(xì)胞。在基于ELISA的篩選中，有 6個(gè)應(yīng)答于Hlaroa免疫而產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系檢測(cè)為陽(yáng)性；將其中兩個(gè)擴(kuò)大培養(yǎng)，并經(jīng)證實(shí) 能夠功能性阻斷Hla的活性(圖9)。與之前的觀察一致，在未免疫兔血清(NRS)存在下金 黃色葡萄球菌與Α549細(xì)胞的共培養(yǎng)并未產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)；與之相反，用兔抗Hla的共培養(yǎng)能 提供針對(duì)裂解的保護(hù)。相似地，從克隆7Β8. 35和1Α9. 4F9中純化的單克隆抗體提供了統(tǒng)計(jì) 學(xué)顯著程度的針對(duì)Hla誘導(dǎo)Α549損傷的保護(hù)作用。與之相反，同種型對(duì)照小鼠抗體未提供 保護(hù)。還通過(guò)Α549細(xì)胞的LIVE-DEAD染色的顯示出了這些結(jié)果，所述Α549細(xì)胞是未感染 的，或者用抗Hla單克隆抗體或其同種型匹配對(duì)照進(jìn)行了處理。為檢測(cè)這兩種單克隆抗體所提供的相對(duì)保護(hù)，在LDH釋放測(cè)定中對(duì)從2. 5mg/ml到0. 001mg/ml的一系列抗體濃度進(jìn) 行了保護(hù)A549細(xì)胞(與金黃色葡萄球菌Newman共培養(yǎng))能力的評(píng)估(圖10)。單克隆抗 體1A9. 4F9明顯地提供了針對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)，但該抗體產(chǎn)生的保護(hù)作用不如7B8. 35單克 隆抗體所提供的顯著，可能提示這些單克隆抗體所識(shí)別的表位或其對(duì)α-溶血素的親和能 力不同。這些體外保護(hù)研究的結(jié)果表明，Hla特異性單克隆抗體可在金黃色葡萄球菌性肺 炎的病程中在體內(nèi)提供對(duì)Hla溶胞效應(yīng)的保護(hù)。為對(duì)此進(jìn)行研究，本發(fā)明人檢測(cè)了這些純化的小鼠單克隆抗體對(duì)小鼠提供針對(duì)金 黃色葡萄球菌性肺炎之保護(hù)的能力。每組15只小鼠在感染前24小時(shí)通過(guò)腹膜內(nèi)途徑接 受總體積100 μ 1中5mg/kg劑量的純化單克隆抗體7B8. 35 (圖11A)或1A9. 4F9 (圖11B)。 假處理小鼠接受ΙΟΟμΙ PBS。根據(jù)上文實(shí)驗(yàn)中所用的方案，用金黃色葡萄球菌Newman感 染動(dòng)物，并記錄感染后72小時(shí)的死亡率。在該測(cè)定中，用每種單克隆抗體進(jìn)行的被動(dòng)免 疫均提供了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著程度的死亡保護(hù)，這與感染后動(dòng)物的總體臨床表現(xiàn)改善相關(guān)。相 似地，7B8. 35和1A9. 4F9都能對(duì)動(dòng)物提供針對(duì)USA300/LAC所引發(fā)的肺炎相關(guān)性死亡的保 護(hù)，USA300/LAC是目前美國(guó)最流行的甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌分離群(圖12)。與 本發(fā)明人在A549測(cè)定中觀察到的結(jié)果相一致，單克隆抗體7B8. 35在保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方面比 1A9. 4F9更為有效，因?yàn)楹笳邇H提供在感染后第24小時(shí)提供統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著程度的保護(hù)作用。 以前的研究已經(jīng)證明，USA300/LAC分離群在動(dòng)物模型中有很高的毒力，它比Newman分離群 分泌多得多的Hla，因此導(dǎo)致比用金黃色葡萄球菌Newman感染表現(xiàn)出更高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡 率。結(jié)合上述體外和體內(nèi)的數(shù)據(jù)，這兩種小鼠單克隆抗體以Hla功能為靶標(biāo)，來(lái)拮抗該毒素 從而提供針對(duì)該疾病的保護(hù)。由于單克隆抗體在體外肺部損傷細(xì)胞培養(yǎng)模型中表現(xiàn)出保護(hù)作用，并對(duì)動(dòng)物提供 針對(duì)金黃色葡萄球菌性肺炎的保護(hù)，因此本發(fā)明人有志于確定Hla分子中被抗體靶向的區(qū) 域。本發(fā)明人考慮到，對(duì)這些表位的了解可有助于從結(jié)構(gòu)角度理解可如何抑制該毒素，還可 有益于未來(lái)對(duì)治療性化合物、其他單克隆抗體的設(shè)計(jì)，還可為該毒素中可摻入主動(dòng)免疫方 法所用疫苗制劑的獨(dú)立區(qū)域提供啟示。單克隆抗體在體內(nèi)阻斷Hla活性可能有許多機(jī)制。 第一，抗體可結(jié)合到蛋白質(zhì)上遮掩真核受體結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域(這個(gè)目前尚不清楚)，因此阻 止單體與宿主細(xì)胞的功能性相互作用。第二，抗體可通過(guò)削弱分子間相互作用的發(fā)生來(lái)阻 止已結(jié)合單體在細(xì)胞表面裝配成七聚體形式。第三，抗體可使裝配的七聚體不能發(fā)生為將 莖干插入真核脂雙分子層并形成穩(wěn)定孔洞所必需的構(gòu)象變化。對(duì)Hla細(xì)致的生化和結(jié)構(gòu)分 析已提供了對(duì)宿主細(xì)胞結(jié)合、七聚體形成和細(xì)胞裂解有貢獻(xiàn)之氨基酸殘基的認(rèn)識(shí)。因此，確 定每種單克隆抗體的精確結(jié)合位點(diǎn)很可能會(huì)加深對(duì)拮抗毒素之機(jī)制的理解。此外，這種定 位可最終指導(dǎo)將單克隆抗體的有效組合(其中每種抗體結(jié)合不同的表位)組裝成被動(dòng)免疫 治療劑。為了能夠快速確定每種人源化單克隆抗體對(duì)Hla片段的表位特異性，制備了一系 列七種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白，其中每一個(gè)代表毒素中約50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的 重疊片段。每種截短蛋白與前一個(gè)和后一個(gè)蛋白片段都有10個(gè)氨基酸重疊(圖13)。用點(diǎn) 印跡分析技術(shù)檢測(cè)這些融合蛋白與7B8和1A9單克隆抗體的反應(yīng)性。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將1 μ g每 種融合蛋白點(diǎn)至硝酸纖維素膜上并晾干。為兩種單克隆抗體分別準(zhǔn)備一張膜。其后將膜封 閉，并按照標(biāo)準(zhǔn)方案使用濃度0. 2 μ g/ml的每種單克隆抗體分別進(jìn)行Western印跡。洗滌
38印跡，并將其與二抗孵育，通過(guò)化學(xué)熒光顯色技術(shù)檢測(cè)與融合蛋白結(jié)合的單克隆抗體。有趣 的是，7B8和1A9均不僅結(jié)合全長(zhǎng)融合蛋白(Hla1135J，而且專門結(jié)合含有充分加工后之毒素 中1-50位氨基酸的融合蛋白(HlaAl-K50)(圖14)。7B8和1A9的同種型匹配對(duì)照抗體(分 別為IgG2a和IgG2b)未表現(xiàn)出與任一融合蛋白結(jié)合，而針對(duì)毒素(α-Hla)所產(chǎn)生的多克 隆兔血清識(shí)別所述蛋白質(zhì)的每個(gè)片段以及單獨(dú)的GST(兔抗血清針對(duì)全長(zhǎng)GST-HlaH35L融 合蛋白產(chǎn)生)。兩個(gè)獨(dú)立產(chǎn)生的保護(hù)性抗Hla單克隆抗體識(shí)別包含在成熟的已加工毒素的 前50個(gè)氨基酸中的表位，這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈提示，這些抗體可具有通過(guò)阻止穩(wěn)定七聚體孔洞的 裝配來(lái)破壞毒素功能的能力?？傊?，采用Hlaroa疫苗進(jìn)行的主動(dòng)免疫以及采用Hla特異抗體進(jìn)行的被動(dòng)免疫都 在相關(guān)動(dòng)物模型中產(chǎn)生了針對(duì)葡萄球菌肺部感染的顯著保護(hù)。因此，針對(duì)α-溶血素(所 有金黃色葡萄球菌菌株分泌的毒力因子)的抗體應(yīng)該在人中也能夠提供針對(duì)葡萄球菌性 肺部疾病的保護(hù)作用。參考文獻(xiàn)下面的文獻(xiàn)明確地以引用方式并入本文，其程度為它們提供作為本文所述方法之 補(bǔ)充的示例性方法或其他細(xì)節(jié)。美國(guó)專利3791932
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4權(quán)利要求
為患者提供針對(duì)葡萄球菌性肺部疾病或病癥之保護(hù)和/或在患者中引發(fā)針對(duì)葡萄球菌之免疫應(yīng)答的方法，其包括對(duì)患者施用有效量的含有純化的重組和減毒的葡萄球菌α 溶血素(Hla)毒素的組合物，其中所述組合物包含不多于污染量的任何其他葡萄球菌蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述患者已住院或即將住院。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述患者將進(jìn)行手術(shù)和/或?qū)⒈宦樽怼?br> 5.權(quán)利要求1的方法，還包括鑒定有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病癥之風(fēng)險(xiǎn)的患者。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述減毒Hla毒素缺乏可檢測(cè)的溶血活性。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述減毒Hla毒素缺乏可檢測(cè)的致死活性。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述Hla毒素在35位氨基酸處具有用于替代組氨酸的亮氨酸。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述Hla毒素基本未變性。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述Hla毒素是純化的或分離的。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述Hla毒素包含成熟Hla毒素中的不多于1_50位氨基酸。
12.權(quán)利要求1的方法，還包括對(duì)所述患者測(cè)試針對(duì)Hla毒素的抗體。
13.權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)所述患者多次施用所述組合物。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物還包含至少一種佐劑。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述佐劑與所述Hla毒素綴合。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物經(jīng)粘膜或肌內(nèi)施用。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物經(jīng)鼻內(nèi)施用或被吸入。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述葡萄球菌性肺部疾病或病癥為肺炎。
19.在患者中預(yù)防葡萄球菌性肺部疾病或病癥的方法，其包括對(duì)該患者施用有效量 的含有重組和減毒的葡萄球菌α-溶血素(Hla)毒素的組合物，其中所述組合物不引發(fā)針 對(duì)任何其他葡萄球菌蛋白的可檢測(cè)免疫應(yīng)答。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述患者有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述患者已住院或即將住院。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述患者將進(jìn)行手術(shù)和/或?qū)⒈宦樽怼?br> 23.權(quán)利要求19的方法，還包括鑒定有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病癥之風(fēng)險(xiǎn)的患者ο
24.權(quán)利要求19的方法，其中所述減毒Hla毒素缺乏可檢測(cè)的溶血活性。
25.權(quán)利要求19的方法，其中所述減毒Hla毒素缺乏可檢測(cè)的致死活性。
26.權(quán)利要求19的方法，其中所述Hla毒素在35位氨基酸處具有用于替代組氨酸的亮氨酸。
27.權(quán)利要求19的方法，其中所述Hla毒素包含成熟Hla毒素中的不多于1_50位氨基酸。
28.權(quán)利要求19的方法，其中所述Hla毒素基本未變性。
29.權(quán)利要求19的方法，其中所述Hla毒素是純化的或分離的。
30.權(quán)利要求19的方法，其中對(duì)所述患者多次施用所述組合物。
31.權(quán)利要求19的方法，其中所述組合物還包含至少一種佐劑。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述佐劑與所述Hla毒素綴合。
33.權(quán)利要求19的方法，還包括對(duì)所述患者檢測(cè)針對(duì)Hla毒素的抗體。
34.權(quán)利要求19的方法，其中所述組合物經(jīng)粘膜或肌內(nèi)施用。
35.權(quán)利要求19的方法，其中所述組合物經(jīng)鼻內(nèi)施用或被吸入。
36.權(quán)利要求19的方法，其中所述葡萄球菌性肺部疾病或病癥為肺炎。
37.為患者提供針對(duì)葡萄球菌性肺部疾病或病癥之保護(hù)的方法，其包括對(duì)患者施用有 效量的基本由重組和減毒的葡萄球菌α-溶血素(Hla)毒素組成的組合物。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述患者有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述患者已住院或即將住院。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述患者將進(jìn)行手術(shù)和/或?qū)⒈宦樽怼?br> 41.權(quán)利要求37的方法，還包括鑒定具有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病癥之風(fēng)險(xiǎn)的患者ο
42.權(quán)利要求37的方法，其中所述減毒Hla毒素缺乏可檢測(cè)的溶血活性。
43.權(quán)利要求37的方法，其中所述減毒Hla毒素缺乏可檢測(cè)的致死活性。
44.權(quán)利要求37的方法，其中所述Hla毒素在35位氨基酸處具有用于替代組氨酸的亮氨酸。
45.權(quán)利要求37的方法，其中所述Hla毒素包含成熟Hla毒素中的不多于1_50位氨基酸。
46.權(quán)利要求37的方法，其中所述Hla毒素是基本未變性。
47.權(quán)利要求37的方法，其中所述Hla毒素為純化的或分離的。
48.權(quán)利要求37的方法，還包括對(duì)所述患者檢測(cè)針對(duì)Hla毒素的抗體。
49.權(quán)利要求37的方法，其中對(duì)所述患者多次施用所述組合物。
50.權(quán)利要求37的方法，其中所述組合物還包含至少一種佐劑。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述佐劑與所述Hla毒素綴合。
52.權(quán)利要求37的方法，其中所述組合物經(jīng)粘膜或肌內(nèi)施用。
53.權(quán)利要求37的方法，其中所述組合物經(jīng)鼻內(nèi)施用或被吸入。
54.權(quán)利要求37的方法，其中所述葡萄球菌性肺部疾病或病癥為肺炎。
55.為患者提供針對(duì)葡萄球菌性肺部疾病或病癥之保護(hù)的方法，其包括對(duì)患者施用有 效量的包含對(duì)金黃色葡萄球菌α-溶血素(Hla)有免疫反應(yīng)性之抗體的組合物。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述抗體為人源化抗體。
57.權(quán)利要求55的方法，其中所述抗體為人抗體。
58.權(quán)利要求55的方法，其中所述抗體為單克隆抗體或?yàn)榭贵w的免疫性部分。
59.權(quán)利要求55的方法，其中所述患者有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述患者已住院或即將住院。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述患者將進(jìn)行手術(shù)和/或?qū)⒈宦樽怼?br> 62.權(quán)利要求55的方法，其中所述患者有葡萄球菌性肺部疾病或病癥的癥狀，或已被 診斷為患有葡萄球菌性肺部疾病或病癥。
63.權(quán)利要求62的方法，還包括對(duì)患者施用用于治療金黃色葡萄球菌肺部感染的抗生
64.權(quán)利要求55的方法，還包括鑒定有罹患葡萄球菌性肺部疾病或病癥之風(fēng)險(xiǎn)的患者ο
65.權(quán)利要求55的方法，其中所述組合物經(jīng)靜脈內(nèi)施用。
66.權(quán)利要求55的方法，其中對(duì)所述患者多次施用所述組合物。
67.權(quán)利要求55的方法，其中所述葡萄球菌性肺部疾病或病癥為肺炎。
68.特異性結(jié)合成熟Hla毒素中1-50位氨基酸的抗體。
69.權(quán)利要求68的抗體，其中所述成熟Hla毒素具有SEQID NO 2的氨基酸序列。
70.含有分離多肽的免疫原性組合物，所述分離多肽包含SEQIDNO :2的1-50位氨基酸。
71.權(quán)利要求70的組合物，其中所述分離多肽包含SEQID NO 2的不多于1_50位氨基酸。
72.權(quán)利要求71的組合物，其中所述分離多肽為融合蛋白。
73.權(quán)利要求70的組合物，還含有佐劑。
74.權(quán)利要求70的組合物，其中所述分離多肽為融合蛋白。
75.權(quán)利要求70的組合物，其中所述分離多肽為脂多肽。
76.權(quán)利要求70的組合物，其中所述組合物包含于藥學(xué)上可接受的制劑中，特別是氣 霧劑制劑。
全文摘要
本發(fā)明的實(shí)施方案包括可用于疫苗接種策略的方法和組合物，所述疫苗接種策略能夠中和Hla以提供針對(duì)金黃色葡萄球菌性肺炎的免疫保護(hù)。在某些方面中，本發(fā)明包括以重組突變體形式Hla(HlaH35L，其中35位組氨酸變?yōu)榱涟彼?為代表的毒性降低的Hla，其可用于阻止該毒素的生產(chǎn)性組裝并為受試者提供針對(duì)葡萄球菌性肺炎的保護(hù)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101951948SQ200880113312
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月31日
發(fā)明者奧拉夫·施內(nèi)溫德, 布魯克·拉格萊, 朱利安娜·布貝克-沃登伯格 申請(qǐng)人:芝加哥大學(xué)