專利名稱：使用固相血小板結(jié)合劑產(chǎn)生血管閉塞的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過使用血小板激活作為起始事件產(chǎn)生血管閉塞來產(chǎn)生治療益處的 組合物和方法。本發(fā)明的組合物和方法涉及將固相血小板-結(jié)合劑遞送到靶部位，使血小 板結(jié)合和激活從而形成局部血栓。在本發(fā)明的一些實施方案中，血栓可進(jìn)一步被結(jié)締組織 替代。通過局部血栓閉塞靶組織的脈管系統(tǒng)典型地導(dǎo)致必需的氧和營養(yǎng)的喪失，再導(dǎo)致組 織退化和最終組織死亡。相關(guān)技術(shù)描述血小板在體內(nèi)起在血管損傷事件中限制失血的作用。通常，血小板與血液的其它 細(xì)胞組分一起遍及身體內(nèi)循環(huán)，浸浴在各種血漿蛋白質(zhì)的混合物中，所述血漿蛋白質(zhì)中許 多在凝固過程中起關(guān)鍵作用。在血管內(nèi)皮下膜暴露以后，發(fā)生一系列復(fù)雜事件來限制血液 從損傷的脈管喪失。與暴露的內(nèi)皮下膜的組分接觸的循環(huán)的血小板1)結(jié)合和粘附，2)擴 散越過暴露的表面，幻激活，如由顆粒狀內(nèi)容物的釋放證明，4)聚集并從血流中募集其它 循環(huán)血小板，和幻形成有效的栓塞，凝塊，和/或血栓，其堵塞來自血管的血流。與凝固級聯(lián)形成對比，凝固級聯(lián)為一個部分由血纖蛋白原至血纖蛋白轉(zhuǎn)化所定義 的過程，血小板在損傷區(qū)域周圍聚結(jié)并由與血小板表面特異受體結(jié)合的橋連分子結(jié)合在一 起。血小板和內(nèi)皮下膜之間的起始橋連依賴于血小板表面的糖蛋白Ib(GPIb)受體和內(nèi)皮 下膜中的馮威勒布蘭特因子(VWF)(即固定的VWF)之間的相互作用。該相互作用本身是獨 特的，因為在血液中循環(huán)的正常血小板經(jīng)常與可溶性VWF接觸，但不被激活，它們也不與可 溶性VWF結(jié)合。體外實驗已經(jīng)證實將可溶性VWF固定到表面促進(jìn)血小板的結(jié)合和激活。經(jīng) 激活血小板后，另一個受體，糖蛋白nb/IIIa(GPIIb/IIIa)被改變，使其能夠結(jié)合幾種血 漿蛋白質(zhì)，由此促進(jìn)血小板/血小板結(jié)合。除血纖蛋白原以外，可溶性VWF與活化的GPIIb/ IIIa受體結(jié)合，再通過GPHd和GPIIb/IIIa變得被固定和能夠結(jié)合其它血小板。在不合適的時間活動過強的血小板可以誘導(dǎo)血栓形成，導(dǎo)致對各種器官和組織的 血液供給減少。主要的實例是由血液流經(jīng)供應(yīng)心臟的狹窄(窄)脈管誘導(dǎo)的血栓形成。向 心肌血流的減少導(dǎo)致梗塞和最終心臟病發(fā)作(心臟細(xì)胞死亡)。當(dāng)栓子或血栓堵塞供給腦 的血管時發(fā)生腦局部缺血(短暫性缺血發(fā)作(TIA)；中風(fēng))。存在由血小板激活導(dǎo)致的其它病變，所述血小板激活是不適當(dāng)?shù)目贵w介導(dǎo)的過程 的結(jié)果。肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HIT)特征是血小板數(shù)量的顯著減少和在預(yù)先存在的病 理部位形成血栓。接受未級分的、作為促進(jìn)血流的抗凝劑的肝素的所有患者中的-5% 產(chǎn)生與肝素結(jié)合的抗體，所述肝素與血小板顆粒蛋白復(fù)合。抗體與血小板表面上的肝素/ 蛋白質(zhì)復(fù)合體的結(jié)合誘導(dǎo)血小板迅速激活和局部血栓形成。這又導(dǎo)致被影響區(qū)域的梗塞。
血栓是被充分描述的癌的后果。關(guān)于高可凝固狀態(tài)是否是癌的預(yù)示存在爭論。已 經(jīng)進(jìn)行許多研究，證明與大部分瘤形成或腫瘤一起的促血栓趨勢。已經(jīng)提示血栓是明顯惡 性病患者最頻繁的并發(fā)癥。開發(fā)成功的抗腫瘤劑的關(guān)鍵是設(shè)計將選擇性殺死腫瘤細(xì)胞，而對正常組織施加相 對很小的，若有的話，副作用的制劑的能力。該目標(biāo)已經(jīng)是難以捉摸的因為在腫瘤和正常組 織之間存在很少的定性差異。因此，這些年來許多研究已經(jīng)集中在鑒定可以作為化學(xué)療法 和診斷的免疫目標(biāo)的腫瘤特異“標(biāo)志物抗原”。已經(jīng)鑒定許多腫瘤特異或準(zhǔn)腫瘤特異(腫瘤 相關(guān))的標(biāo)志物，其是可以被特異性抗體識別的腫瘤細(xì)胞抗原。不幸地，通常情形是腫瘤特異抗體本身和自動將不發(fā)揮足以使它們在癌癥治療中 有效的抗腫瘤作用。與它們在淋巴瘤中的功效形成對比，免疫毒素已經(jīng)證明在實體瘤如癌 的治療中相對無效。關(guān)于這的主要原因是實體瘤對于抗體大小的分子通常是不滲透的每 克腫瘤小于注射劑量的0. 001%的比吸收值在人的研究中是常見的。另外，由于幾個原因進(jìn) 入腫瘤塊的抗體分布不均勻。首先，腫瘤細(xì)胞和纖維狀腫瘤基質(zhì)的緊密堆積產(chǎn)生對于大分 子遞送難以克服的物理屏障，與淋巴引流的缺少結(jié)合在腫瘤中心產(chǎn)生升高的間隙壓力，其 減少外滲和流體對流。第二，大部分腫瘤中的血管分布是無組織的和不均勻的。結(jié)果一些 腫瘤細(xì)胞與毛細(xì)管大距離分開以致外滲的抗體必須在大體積范圍內(nèi)擴散以便到達(dá)和與遙 遠(yuǎn)的腫瘤細(xì)胞結(jié)合。第三，所有進(jìn)入腫瘤的抗體可能變得被最先遇到的腫瘤細(xì)胞吸收在血 管周圍區(qū)域，沒留下任何一個到達(dá)在更遠(yuǎn)部位的腫瘤細(xì)胞。使用抗體克服靶腫瘤的缺點的一種方法是將誘導(dǎo)血栓的試劑靶向腫瘤的脈管系 統(tǒng)而不是腫瘤。本發(fā)明人提出該方法將提供幾個優(yōu)于直接靶向腫瘤細(xì)胞的優(yōu)勢。首先，靶細(xì)胞能 夠直接接近脈管施用的治療劑，允許高百分率的注射劑量的迅速局部化。第二，因為每個毛 細(xì)管為在它周圍腫瘤帶中的數(shù)千細(xì)胞提供氧和營養(yǎng)，即使對腫瘤脈管系統(tǒng)有限的損傷也產(chǎn) 生大量腫瘤細(xì)胞死亡。本發(fā)明還涉及治療異常組織生長，異常出血(在外科手術(shù)期間或之后，產(chǎn)后)，異 βιΜ.^ IifBIlnii (placenta previa), ^ : (placenta accreta)禾口〒胃磯； (uterine fibroids)的組合物和方法。在某些臨床情形下，理想的是通過閉塞它相關(guān)的脈管系統(tǒng)抑制向組織的血流。實 例包括出血性中風(fēng)，在隱靜脈旁路移植外科手術(shù)中隱靜脈側(cè)支的存在，主動脈瘤的治療，血 管畸形的矯正，和實體瘤的治療。已經(jīng)使用包括栓塞治療(embolotherapy)的多種技術(shù)和材料進(jìn)行血管閉塞。栓 塞治療的實例包括由多種材料組成的顆粒，由膠原蛋白組成的物理栓塞(Conston等， US 5，456，693)和線圈(coil) (Mariant, US 5,639, 277)的應(yīng)用，所述材料包括聚乙烯醇 (Boschetti, PCT W00023054)，丙烯酰胺(Boschetti 等，US 5, 635, 215 ；Boschetti 等，US 5，648，100)，聚甲基丙烯酸甲酯(Lemperle, US 5，344，452)。栓塞治療包括通過導(dǎo)管將這 些材料遞送到靶脈管系統(tǒng)。因為在任何給定區(qū)域的脈管系統(tǒng)從較大的動脈開始至小動脈至 后小動脈至毛細(xì)管，每個具有漸小的脈管直徑，遞送的材料(栓塞)繼續(xù)在流動的血液中行 進(jìn)直至它固定在較小的血管中，從而阻礙血液流向依附的組織。本發(fā)明是新穎的和通過使用包被哺乳動物來源的馮威勒布蘭特因子(VWF)的固相材料，如微?；蚓€圈或支架(stent)致力于未滿足的醫(yī)療需要。這樣通過將固相血小 板-結(jié)合試劑遞送到靶部位和引發(fā)有效的導(dǎo)致相關(guān)脈管系統(tǒng)閉塞的血栓形成來取得治療 益處。發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用通過局部血小板激活誘導(dǎo)血栓形成的固相劑用于靶向組織和/ 或器官，和相關(guān)脈管系統(tǒng)的治療方法和組合物，所述組織和/或器官，和相關(guān)脈管系統(tǒng)實質(zhì) 上是增生性的或致瘤性的，或具有動靜脈畸形，或正在出血。組合物包含將血小板俘獲在固 相劑如線圈或支架或顆粒上的試劑。在本發(fā)明的一些實施方案中，固相劑不但俘獲而且激 活血小板。該方法利用在固相顆粒上局部化血小板集合和激活血小板來產(chǎn)生隨后的血栓形 成，由此限制向靶區(qū)域的血液供應(yīng)，而未誘導(dǎo)全身性的或系統(tǒng)的前血栓形成狀態(tài)。本發(fā)明提供通過將血小板俘獲在微球上誘導(dǎo)血栓形成，誘導(dǎo)血小板激活，和使血 栓形成的方法。靶脈管系統(tǒng)的血栓形成減少對下游組織的血液供應(yīng)。通過將血小板俘獲在 包含膠原蛋白的微球(例如包被的顆粒)上，本發(fā)明的方法可以用于治療癌，增生，子宮肌 瘤(uterinefibroids),盆腔游血(pelvic congestion),月經(jīng)過多(menorrhagia), AV-畸 形，神經(jīng)檢塞(neuro-embolism)，精索靜脈曲張(varicoceles)，口各血(hemoptysis),內(nèi) 臟動脈動脈瘤(visceral artery aneurysms),動脈動脈瘤(arterial aneurysms),內(nèi)漏 (endoleak)等。有目的地在患者中誘導(dǎo)血栓形成初看起來似乎是反直覺的，因為眾所周知血栓形 成顯著有助于患者的發(fā)病率和死亡率。本發(fā)明固相血小板介導(dǎo)的閉塞是基于利用身體響應(yīng) 固定的馮威勒布蘭特因子(VWF)或其它局部作用的血小板激活劑產(chǎn)生血栓的天然能力而 部位特異性誘導(dǎo)血栓形成。盡管VWF以可溶性形式在血流中循環(huán)，直至該分子作為內(nèi)皮下 膜的一部分被暴露或與暴露的來自內(nèi)皮下膜的膠原蛋白結(jié)合它才能夠俘獲血小板和誘導(dǎo) 血小板激活。固相血小板-結(jié)合劑與來自患者的血液(先體外后體內(nèi))或血流中的血液(體 內(nèi))接觸誘導(dǎo)血小板結(jié)合和局部激活，導(dǎo)致固相劑周圍的血小板增加，其導(dǎo)致血栓形成和 向由閉塞的血管供應(yīng)的組織的血流的中斷。細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞或增生組織，由于局部血流 的喪失而減小或死亡。該方法避免全身的血小板激活和血栓形成；依賴于固定的VWF(但不 是可溶性VWF)與循環(huán)的血小板結(jié)合并將其激活的事實。因此，本發(fā)明的方法和組合物是間 接的治療病理疾病如癌，增生性細(xì)胞，大出血或動靜脈(AV)畸形的方式。本發(fā)明在現(xiàn)有的用于治療實體瘤，增生組織，大出血和AV-畸形和其中血小板(靜 止的和/或活化的)可能起治療作用的其它任何疾病或病癥的方法上改善。以類似于現(xiàn)有病理狀況(即肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥[HIT])的方式，通過將人Fc 片段包括或結(jié)合到固相劑上的Fc-介導(dǎo)的方法，或通過將選擇抗體導(dǎo)向靶區(qū)域可以增強局 部的血小板激活。在HIT綜合癥中的血小板激活導(dǎo)致局部的血栓形成和向受侵襲區(qū)域的血 流的中斷。這導(dǎo)致受累組織的死亡。部位特異性的血栓形成的范圍或程度可以以各種方法控制。通過使用抗血小板試 劑(例如GPIIb/IIIa抑制劑，阿斯匹林，潘生丁等)抑制血小板激活以確定的、可滴定的方 式減小了誘導(dǎo)血栓的趨勢。改變局部血流，血壓和組織溫度還可以作為控制對刺激物的局 部血小板激活的方法。
典型的血管化腫瘤是實體瘤，特別是癌，其需要豐富的脈管血液供應(yīng)。本發(fā)明涉 及的典型實體瘤包括，但不限于肺、乳腺、卵巢、胃、胰、喉、食管、睪丸、肝、腮腺、膽道、結(jié)腸、 直腸、子宮頸、子宮、子宮內(nèi)膜、腎、膀胱、前列腺、甲狀腺、頭頸部的原發(fā)惡性腫瘤，黑素瘤 (melanomas)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤(gliomas)，成神經(jīng)細(xì)胞瘤(neuroblastomas)，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 (neuroendocrine tumors)等。本發(fā)明涉及的其它病癥包括但不限于上述腫瘤類型的繼 發(fā)性(轉(zhuǎn)移)瘤，癌性疼痛，AV-畸形，子宮肌瘤，盆腔淤血，月經(jīng)過多，精索靜脈曲張，咯血 (hemoptysis),動脈瘤(aneurysms),內(nèi)臟動脈動脈瘤(visceral artery aneurysms),假動 脈瘤(pseudoaneurysms)禾口內(nèi)漏(endoleaks)。本發(fā)明優(yōu)選方法包括制備包被重組或哺乳動物來源的VWF的線圈或支架和將 VffF-包被的試劑導(dǎo)入動物如人類患者，動物患者，或試驗動物的血流中；然后將VWF遞送或 匯集在期望的靶部位。線圈或支架可以由任何適當(dāng)?shù)牟牧蠘?gòu)造，該材料能夠?qū)WF保持在 線圈或支架內(nèi)部或在線圈或支架的表面上不定的或變化長度的時間。針對實體瘤無限制生長的問題的解決方案是攻擊腫瘤中的血管。該方法提供幾個 優(yōu)于直接靶向腫瘤細(xì)胞的方法的優(yōu)勢。首先，腫瘤脈管能夠直接接近脈管施用的治療劑，因 此允許高百分率的注射劑量的迅速局部化。第二，因為每個毛細(xì)管為在它周圍腫瘤帶中的 數(shù)千細(xì)胞提供氧和營養(yǎng)，即使對腫瘤脈管系統(tǒng)有限的損傷也可產(chǎn)生大量腫瘤細(xì)胞死亡。最 后，血管在不同腫瘤中是類似的，使開發(fā)治療多種類型的癌的單一試劑是可行的。本發(fā)明的方法高度有效地抑制靶脈管系統(tǒng)中的血流。為患者提供最終的益處，該 方法和組合物還可與其他治療方案，例如，化學(xué)療法聯(lián)合使用。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于將血小板俘獲在預(yù)定部位，激活血小板，和利用血小板的天然功 能來取得有益的治療結(jié)果的組合物和方法。按照本發(fā)明，血小板可以是循環(huán)的血小板或 者可以是從外源獲得的血小板。按照本發(fā)明，可以將血小板濃集特異性部位處或之上，然 后可以利用血小板誘導(dǎo)血栓形成的天然能力來阻止，中斷，或減少該部位的血流。減少 的血流伴隨著減少對疾病或病癥體(condition agent)如腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，因此疾病體 (diseaseagent)的尺寸減小。減小腫瘤大小是明顯的治療益處，這一點是清楚的。在一些 情形中減少對靶區(qū)域的血液供應(yīng)減輕疼痛。本發(fā)明提供了施用具有血小板結(jié)合劑的生物可降解微球，使得微球誘導(dǎo)血栓形 成，并使得血栓被永久的結(jié)締組織替代的方法。本發(fā)明還包括使用能夠結(jié)合和激活血小板的固相劑將血小板靶向能夠被選擇性 靶向的預(yù)定組織，例如增生組織。在本發(fā)明的這些實施方案中，靶向是指包含與預(yù)定部位或 組織特異性結(jié)合的靶向部分例如配體等的固相。在本發(fā)明的其它實施方案中，靶向可以包 括例如通過導(dǎo)管，支架，或線圈將本發(fā)明的組合物遞送到或接近腫瘤部位。在預(yù)選的部位激 活血小板通過減少對組織或部位的營養(yǎng)供應(yīng)導(dǎo)致治療益處。本發(fā)明提供通過將血小板俘獲在固相劑上誘導(dǎo)血栓形成，誘導(dǎo)血小板激活，和使 血栓形成的組合物和方法。靶脈管系統(tǒng)的血栓形成減少對下游組織的血液供應(yīng)。通過將血 小板俘獲在包含VWF的固相(例如包被的顆粒)上，本發(fā)明的組合物和方法可以用于治療 癌，增生，子宮肌瘤，盆腔淤血，月經(jīng)過多，AV-畸形，神經(jīng)栓塞，精索靜脈曲張，咯血，內(nèi)臟動 脈動脈瘤，動脈動脈瘤，內(nèi)漏等。此外，本發(fā)明的組合物和方法為組合物的受者提供治療益處。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，VWF是哺乳動物來源。在本發(fā)明最優(yōu)選實施方案中， VffF是人源的。在本發(fā)明另一最優(yōu)選實施方案中，VWF是豬源的。VffF可以是天然的，合成的，重組的，或符合VWF生物活性部分的肽序列。在本發(fā)明 的另一最優(yōu)選實施方案中，VWF是重組來源的。本發(fā)明還提供將血小板結(jié)合劑(例如VWF)與固相直接或通過間隔物間接結(jié)合的 組合物，只要血小板結(jié)合劑結(jié)合血小板的能力不受損害。間隔物在本文中是指在物理上將 血小板結(jié)合劑從固相劑的表面分開的一組惰性或活性分子。例舉的間隔物在下面描述。直 接結(jié)合可以共價或非共價地發(fā)生。間接結(jié)合可以通過間隔物發(fā)生，所述間隔物包括但不限 于肽間隔臂，抗體間隔物，抗體片段間隔物，融合蛋白間隔物或糖間隔物。這些間隔物通常 只作為顆粒和VWF之間的橋；然而，間隔物還可以用于改變血小板激活的程度。例如，F(xiàn)c組 分可以用作間隔物，由此在固相劑上和周圍實現(xiàn)增強的血小板激活。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的方法可以發(fā)生VWF與固相劑的偶聯(lián)。偶聯(lián)劑的實例包括但不限于戊二醛和碳二亞 胺。在本發(fā)明的實施方案中，血小板結(jié)合劑可包括膠原蛋白。在本發(fā)明進(jìn)一步的實施方案中，膠原蛋白是哺乳動物來源的。在本發(fā)明最優(yōu)選的 實施方案中，膠原蛋白是人來源的。在本發(fā)明進(jìn)一步最優(yōu)選的實施方案中，膠原蛋白是牛、 羊、或豬來源的。在本發(fā)明進(jìn)一步最優(yōu)選的實施方案中，膠原蛋白是重組來源的。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，不含活性靶向試劑的組合物在哺乳動物脈管系統(tǒng)中 的定位將通過在經(jīng)高度選擇性微導(dǎo)管遞送后定向引導(dǎo)的血流選擇。按照本發(fā)明的組合物還可以包括能夠與靶抗原或在脈管內(nèi)皮或靶組織上的部位 結(jié)合的靶向試劑或部分，由此使固相劑能夠定位在所選部位。例舉的靶向試劑或部分對于 本領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的，包括但不限于抗體，配體，受體，激素，植物血凝素，和鈣 粘著蛋白，或其部分或片段。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，靶向試劑將包括具有生物素，生物素模擬物 (mimetic)和/或肽組分的抗體或抗體樣分子。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，抗體或抗體 樣分子將指向生長因子/受體復(fù)合體。按照本發(fā)明的組合物還可以包括下列的一種或多種一種或多種血小板結(jié)合調(diào)節(jié) 劑(例如抑制劑或增強劑)，一種或多種血栓形成控制劑或調(diào)節(jié)劑或一種或多種補體級聯(lián) 組分。按照本發(fā)明的方法還可以包括施用能夠在預(yù)定部位結(jié)合血小板的固相劑；還可包 括誘導(dǎo)俘獲的血小板的激活；施用具有抗原決定簇和血小板結(jié)合位點的雙功能性結(jié)合劑； 通過改變本發(fā)明一種或多種組合物的溫度，或通過改變預(yù)選部位處的溫度控制血栓生成。按照本發(fā)明的方法可以另外包括以下的一項或多項施用一種或多種血小板結(jié)合 調(diào)節(jié)劑，施用一種或多種血栓形成調(diào)節(jié)劑；施用一種或多種補體級聯(lián)組分；施用一種或多 種配體和/或抗-配體，其用于將固相結(jié)合到預(yù)定部位，和/或用于將血小板結(jié)合部分或組 分與固相結(jié)合。本發(fā)明還包括試劑盒，其可以包含但不限于任何或所有的以下組分，組分包括用 于將血小板靶向內(nèi)皮膜元件的固相劑用于結(jié)合血小板的結(jié)合劑；用于結(jié)合內(nèi)皮膜元件的配體；配體偶聯(lián)物；用于結(jié)合配體或配體偶聯(lián)物的抗配體；血小板結(jié)合調(diào)節(jié)劑(增強劑和/ 或抑制劑)；血栓形成調(diào)節(jié)劑；補體級聯(lián)組分；補體級聯(lián)組分誘導(dǎo)物；和包括抗配體的用于 結(jié)合血小板的結(jié)合劑。試劑盒可以包括雙功能結(jié)合劑，和/或結(jié)合劑-配體偶聯(lián)物，和/或 血小板結(jié)合劑-抗配體偶聯(lián)物。本發(fā)明的組合物和方法包括將組合物遞送到預(yù)選部位的任何機理，所述遞送包括 但不限于全身地，局部地(locally)，口服地，或表面地(topically)。按照本發(fā)明的一些實施方案，將結(jié)合劑用于在預(yù)定部位俘獲血小板。定義在本文中，固相劑是指適合用于結(jié)合，包含，或保留血小板結(jié)合劑的任何固體材 料。血小板結(jié)合劑可以被附著到固相劑以使血小板結(jié)合活性被保留，例如在靶部位或在靶 部位內(nèi)部。固相劑可以是線圈，支架，或顆粒，例如珠或類似物，所有這些對于本領(lǐng)域技術(shù)人 員是眾所周知的。在本文中，顆粒是指能夠包含或保留血小板結(jié)合劑的固相材料的分離部分或一部 分。本發(fā)明的優(yōu)選方法包括制備包被重組或哺乳動物來源的VWF的顆粒和將包被VWF的顆 粒導(dǎo)入動物如人類患者，動物患者，或試驗動物的血流中。在本文中，術(shù)語“顆?！笔侵改軌?直接或間接(例如通過配體)結(jié)合血小板的任何固相材料。關(guān)于尺寸，顆粒可以是均勻或不 均勻的。具體地，顆?？梢允乔蛐?包括橢圓形)或不規(guī)則形?？梢杂萌魏芜m當(dāng)?shù)牟牧蠘?gòu) 建顆粒，該材料能夠?qū)WF保留在顆粒內(nèi)部或顆粒表面上不確定的或變化長度的時間。例 舉的材料包括聚乙烯醇(PVA)，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚丙交酯，聚乙交酯，丙交酯-乙交酯 共聚物，聚己酸內(nèi)酯，丙交酯-己內(nèi)酯共聚物，聚羥基丁酸酯，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚酐， 聚原酸酯，白蛋白，膠原蛋白，明膠，多糖，葡聚糖，淀粉，甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸，丙烯 酸羥烷基酯，甲基丙烯酸羥烷基酯，亞甲基二醇二甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，基 于纖維素的聚合物，乙二醇聚合物和共聚物，氧化乙烯和氧化丙烯聚合物，聚乙酸乙烯酯， 聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯吡啶，磁性顆粒，熒光顆粒，動物細(xì)胞，植物細(xì)胞，大顆粒聚集白蛋 白和小顆粒聚集白蛋白(micro-aggregated albumin)，變性蛋白聚集體和脂質(zhì)體，單獨或 結(jié)合使用。適用于本發(fā)明的固相材料對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的，應(yīng)當(dāng)不限于上述 列舉的那些例證性材料。在優(yōu)選的實施方案中，聚合物顆?？砂ǚ巧锞酆衔铩Ｔ谝恍嵤┓桨钢?，聚 合物顆粒選自聚丙交酯，聚乙交酯，和聚乳酸乙醇酸共聚物(polydactic-co-glycolic acid)(PLGA)。在本發(fā)明的實施方案中，血小板結(jié)合劑可包括膠原蛋白。在本發(fā)明進(jìn)一步的實施方案中，膠原蛋白是哺乳動物來源的。在本發(fā)明最優(yōu)選的 實施方案中，膠原蛋白是人來源的。在本發(fā)明進(jìn)一步最優(yōu)選的實施方案中，膠原蛋白是牛來 源的或豬來源的。在本發(fā)明進(jìn)一步最優(yōu)選的實施方案中，膠原蛋白是重組來源的。形成支架或線圈的例舉材料包括但不限于聚乙烯醇(PVA)，聚苯乙烯，聚碳酸 酯，聚丙交酯，聚乙交酯，丙交酯-乙交酯共聚物，聚己酸內(nèi)酯，丙交酯-己內(nèi)酯共聚物，聚羥 基丁酸酯，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚酐，聚原酸酯，多糖，葡聚糖，淀粉，甲基丙烯酸甲酯，甲 基丙烯酸，丙烯酸羥烷基酯，甲基丙烯酸羥烷基酯，亞甲基二醇二甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺， 雙丙烯酰胺，基于纖維素的聚合物，乙二醇聚合物和共聚物，氧化乙烯和氧化丙烯聚合物，聚乙酸乙烯酯，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯吡啶；磁性材料，熒光材料；金，鉬，鈀，錸，銠，釕， 不銹鋼，鎢，鈦，鎳及其合金；單獨或結(jié)合使用。固相材料的優(yōu)選尺寸取決于所用材料的類型。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到如 果固相是支架或線圈，大小優(yōu)選為在血管如動脈范圍內(nèi)的直徑。典型地直徑可達(dá)約15mm或 更大。如果固相是顆粒，如珠，直徑可達(dá)約7mm，優(yōu)選約1 μ m至約5mm，甚至更優(yōu)選約20 μ m 至約300 μ m。適用于本發(fā)明的固相材料的尺寸對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的，并應(yīng) 當(dāng)不限于以上列舉的例證性大小。在本文中，結(jié)合劑或靶向部分是指用于將一種物質(zhì)與另一種結(jié)合的一種或多種固 相化學(xué)或生物分子或構(gòu)件。具體地，結(jié)合劑，或固相劑與在限定細(xì)胞群體，典型地增生組織 和/或相關(guān)脈管系統(tǒng)，或癌細(xì)胞和/或相關(guān)脈管系統(tǒng)上的配體，受體或配體/受體復(fù)合體結(jié) 合。分子作為結(jié)合劑的功能不應(yīng)當(dāng)受限于附著的結(jié)構(gòu)機理。例如，結(jié)合劑可以結(jié)合受體， 抗原決定簇或表位，酶底物，或?qū)⒔Y(jié)合劑與靶細(xì)胞或細(xì)胞群體連接的其它生物構(gòu)件。結(jié)合 劑可以是偶聯(lián)物，包括但不限于免疫偶聯(lián)物，化學(xué)偶聯(lián)物(共價或非共價)，融合蛋白等。 示例性的靶向劑或靶向部分是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且包括但不限于抗體、配體、受 體、激素、凝集素和鈣粘附蛋白，或其部分或其片段；和USP 6，960，532 ；6, 887，474 ；和USSN 11/205，047(于2005年8月17日申請)，每一個均通過引用合并于此。在本文中，配體結(jié)合劑是指顯示彼此特異性結(jié)合的互補的一組分子。配體/抗配 體對通常以相對高的親和力結(jié)合，為此，對于本發(fā)明的應(yīng)用可能是高度理想的。非常著名的 配體/抗配體對是生物素和抗生物素蛋白。在本文中，抗生物素蛋白是指抗生物素蛋白，鏈 霉抗生物素蛋白，中性抗生物素蛋白(neutravidin)，其衍生物和類似物，及其功能等價物。 抗生物素蛋白可以以多價或單價方式與生物素結(jié)合。其它例舉的配體/抗配體對包括但不 限于同源肽，異源肽，“亮氨酸拉鏈”，鋅指蛋白/雙鏈DNA片段，酶/酶抑制劑，半抗原/抗 體，配體/配體受體，和生長因子/生長因子受體。在本文中，所選部位，預(yù)定部位，靶向，和預(yù)先靶向全都指其中在固相劑周圍的血 小板累積將提供治療有益的結(jié)果的部位。典型地，這涉及靶向部分的靶部位定位。該部位 包括但不限于實體瘤的脈管系統(tǒng)，良性瘤的脈管系統(tǒng)，增生組織的脈管系統(tǒng)，AV畸形，脈管 動脈瘤和內(nèi)漏。在本文中，使用導(dǎo)管，微導(dǎo)管或通過針和注射器可以發(fā)生包含血小板結(jié)合劑的固 相劑的遞送。最經(jīng)常通過動脈循環(huán)進(jìn)入來實現(xiàn)通過導(dǎo)管或微導(dǎo)管的遞送，然而通過靜脈循 環(huán)遞送固相劑也是理想的。例如，利用動脈或靜脈循環(huán)通過對靶部位的導(dǎo)管可以遞送顆粒， 線圈或支架形式的固相劑。利用動脈循環(huán)的固相劑的遞送是有利的，因為在靶組織中施用 試劑下游的毛細(xì)血管床作為俘獲試劑的工具，由此防止試劑進(jìn)入體循環(huán)。還可以使用與固 相劑有關(guān)的靶向試劑將固相劑定位在動脈循環(huán)內(nèi)部。利用靜脈系統(tǒng)的固相劑的遞送也是理 想的。可以通過使用與固相劑有關(guān)的靶向試劑將固相劑與靶部位結(jié)合來完成固相劑在靜脈 系統(tǒng)中的定位遞送。還可以在外科手術(shù)過程中將固相劑遞送到靶部位。例如，通過注射器 和針可以將顆粒形式的固相劑遞送到靶部位。作為另一實施例，在外科手術(shù)過程中可以手 工地將線圈或支架形式的固相劑放置在靶部位。在本文中，血栓是指陷于血纖蛋白中的血細(xì)胞的任何半固體聚集體和來源于血小 板與固相劑活性結(jié)合的血小板的凝塊。按照本發(fā)明，作為活化的血小板在預(yù)定位置累積的直接結(jié)果形成血栓。血栓形成是指血栓的形成，典型地在血管中。形成血栓的是指易于導(dǎo) 致血塞形成，或血栓形成的物質(zhì)。在本文中，栓塞物是指血管內(nèi)的團(tuán)塊，其通過血流，和通過大小約束最終固定在血 管或毛細(xì)管中，遠(yuǎn)離血管內(nèi)團(tuán)塊的起始部位。栓塞形成不意味著主動過程，而是指被動過 程，由此通過血管內(nèi)團(tuán)塊穿過血流，在那它們固定在小血管和毛細(xì)管中而發(fā)生血管閉塞。相反，本發(fā)明涉及固相材料至靶脈管系統(tǒng)的遞送，因此通過使用血小板結(jié)合劑將 血小板活性募集在固相表面。與包括在此作為參考的引用的專利中所述的栓塞材料形成對 比，由于血小板在固相材料周圍的迅速累積，必須將本發(fā)明的試劑遞送到接近靶脈管系統(tǒng)。例如，由Draximage (Kirkland, Quebec, Canada)提供的大分子聚集白蛋白 (macro-aggregated albumin) (MAA)，例如被用作檢塞顯象劑。MAA 由大小為 10 μ m_70 μ m, 最大尺寸為150 μ m的顆粒組成，所述顆粒用高锝酸鈉Tc 99m放射性標(biāo)記以使閃爍照相術(shù) 成像。將MAA顆粒靜脈內(nèi)注射，并作為栓塞穿過血流，其中它們被俘獲在肺的肺泡毛細(xì)血管 床中。使用本發(fā)明的方法，將VWF固定在MAA上，隨后將顆粒注射到血管系統(tǒng)中導(dǎo)致血小板 與顆粒立即結(jié)合和接近注射位置的脈管系統(tǒng)的閉塞。本發(fā)明在現(xiàn)有的產(chǎn)生血管閉合的方法上改善，通過使用血小板結(jié)合劑將血小板固 定在固相材料的表面，由此增加固相材料的有效尺寸。例如，被注射到血流中的包被或含有 VWF的顆粒將在它的表面上迅速累積血小板，在接近注射位置有效產(chǎn)生分層的，活化的血小 板的“洋蔥-效應(yīng)”。因此本發(fā)明能夠?qū)⒆钌倭康男☆w粒遞送到血流中，因此顆粒由與顆粒 上或內(nèi)部的血小板結(jié)合劑活性結(jié)合的血小板的增加而在尺寸上迅速增加。此外，顆粒結(jié)合 的血小板將彼此相互作用，由此形成增加尺寸的聚集體，其產(chǎn)生緊密的基質(zhì)和引起靶脈管 系統(tǒng)的閉塞。本發(fā)明另外在現(xiàn)有的產(chǎn)生血管閉塞的方法上改善，通過血小板結(jié)合劑將血小板固 定在固相材料的表面。本發(fā)明的試劑因此將具有下列體內(nèi)效應(yīng)a)模塑它滯留的血管或毛 細(xì)管的輪廓，b)產(chǎn)生固體、不通透的三維基質(zhì)；這又在脈管中產(chǎn)生緊密的，不通透的密封， 由此最大地抑制血液向下游血管和組織的遞送。例如，將血小板結(jié)合顆粒導(dǎo)入血流將進(jìn)行經(jīng)過下列順序的事件a)在顆粒表面上 將形成單層血小板，由此形成(i)增加直徑的顆粒和(ii)包被活化血小板的顆粒，其有 結(jié)合和激活懸浮液中附近的血小板的傾向，此處定義為‘單層的表面活化的血小板’顆粒 (S-SAP顆粒)，(b)在血流中流動的血小板將與結(jié)合形成‘洋蔥樣’層的S-SAP顆粒的血小 板相互作用，此處定義為‘多層的表面活化的血小板顆粒(M-SAP顆粒)，c)M-SAP將通過形 成較大聚集體的血小板/血小板相互作用而彼此相互作用，此處定義為‘M-SAP基質(zhì)’。作為另一個實例，通過下述順序的事件進(jìn)行將包含或具有表面結(jié)合的血小板結(jié)合 劑(如VWF)的無定形血小板結(jié)合顆粒(如MAA)引入到血流中；a)單一的(single)血小 板將結(jié)合到顆粒的基質(zhì)上或內(nèi)部，從而形成(i)具有增加的直徑和剛性的顆粒，(ii)包被 以并包含活化的血小板的顆粒，所述血小板具有結(jié)合和活化懸浮液中附近血小板的傾向； b)在血流中流動的血小板將與結(jié)合到和/或結(jié)合入顆粒的血小板相互作用，從而在顆粒內(nèi) 部和/或顆粒上形成聚集體，c)包含和/或具有表面結(jié)合的血小板的顆粒將彼此相互作用 以形成大的顆粒聚集體。在本文中，提供治療益處等等的治療有益的是指受體動物的生理的理想變化。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，變化是可以檢測的。按照本發(fā)明，可以使用或利用涉及活化血小板 或血小板調(diào)節(jié)的任何生物機理來取得有益的治療結(jié)果。按照本發(fā)明產(chǎn)生的例舉的治療益處 包括但不限于形成血栓，形成血小板介導(dǎo)的閉塞，消除增生組織或細(xì)胞，消除腫瘤和/或腫 瘤細(xì)胞，減小增生組織的尺寸，減小腫瘤的尺寸，使增生組織或腫瘤變得對另外的治療如化 學(xué)療法和/或放射療法等等敏感，缺乏或減少對增生組織或癌的營養(yǎng)供應(yīng)，修復(fù)AV-畸形， 減少或防止血液從內(nèi)漏中損失和修復(fù)脈管動脈瘤。在本文中，“施用”是指導(dǎo)致包含固相劑的組合物遞送到預(yù)定細(xì)胞，多種細(xì)胞，或組 織，典型地哺乳動物的任何行為。施用可以體內(nèi)，體外，或先體外后體內(nèi)進(jìn)行。例如，可以通 過注射或通過內(nèi)鏡或?qū)Ч苁┯媒M合物。施用還可以包括直接將按照本發(fā)明的組合物施用到 細(xì)胞。例如，在外科手術(shù)期間，腫瘤或增生組織的脈管系統(tǒng)可能被暴露。按照本發(fā)明的實施 方案，例如通過洗滌或沖洗外科手術(shù)部位，脈管系統(tǒng)，和/或細(xì)胞可以將暴露的細(xì)胞或脈管 系統(tǒng)直接暴露于本發(fā)明的組合物。使用結(jié)合或靶向試劑可以將固相血小板結(jié)合劑定位在特定的靶部位。例舉的結(jié)合 或靶向試劑包括但不限于單克隆抗體；多克隆抗體；嵌合單克隆抗體；人源化抗體；遺傳工 程抗體；抗體片段，其選自 F(ab)2，F(xiàn)(ab，)2, Fab, F(ab，)，Dab，F(xiàn)v, sFv, scFv, Fe，和最小 識別單位組成的組；表示單克隆抗體活性部分的單鏈(SC-Mab)；腫瘤結(jié)合肽；蛋白質(zhì)，包括 受體蛋白質(zhì)；肽；多肽；糖蛋白；脂蛋白等等，例如生長因子；淋巴因子和細(xì)胞因子；酶，免 疫調(diào)節(jié)劑；激素，例如促生長素抑制素；配體(與它的互補抗配體配對)；寡核苷酸；與介導(dǎo) 效應(yīng)子功能的分子結(jié)合的上述任何一種；和上述任何一種的模擬物或片段。保持與確定靶 細(xì)胞群體結(jié)合能力的以上所列靶向部分的類似物也可以用于所要求的本發(fā)明中。另外，可 以設(shè)計合成的靶向部分。用于本發(fā)明的實施中的單克隆抗體包括完整的抗體及其片段。該單克隆抗體和片 段可以按照常規(guī)技術(shù)，如雜交瘤合成，重組DNA技術(shù)和蛋白質(zhì)合成來生產(chǎn)。有效的單克隆 抗體和片段可以衍生于任何物種(包括人類)或可以作為利用來自多于1種物種的序列 的嵌合蛋白形成。通常參見 Kohler 和 Milstein，Nature (自然)，256 :495_97，1975 ;Eur. J. Immunol.(歐洲免疫學(xué)雜志)，6 =511-19,1976。優(yōu)選的能夠?qū)⒐滔鄤┒ㄎ辉诎胁课坏慕Y(jié) 合和/或靶向試劑是抗體或抗體樣分子，優(yōu)選單克隆抗體。更優(yōu)選的結(jié)合劑是結(jié)合配體/受 體復(fù)合體的抗體，所述配體/受體復(fù)合體在增生組織或細(xì)胞(例如腫瘤)或與增生組織或 細(xì)胞有關(guān)的脈管系統(tǒng)上。最優(yōu)選的結(jié)合劑是抗體或抗體樣分子，其與腫瘤塊如腫瘤脈管系 統(tǒng)上或附近的生長因子/生長因子受體復(fù)合體結(jié)合。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，結(jié)合劑 (即抗體或抗體樣分子)將與VEGF/VEGF受體復(fù)合體結(jié)合。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中， 抗體或抗體樣分子結(jié)合將識別由于配體/受體(即生長因子/生長因子受體)相互作用形 成的新表位(隱蔽的或先前不可用的表位)。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，抗體或抗體樣 分子與生長因子/生長因子受體復(fù)合體的結(jié)合將不影響生長因子或生長因子受體的功能。在本發(fā)明的實施中寡核苷酸，例如與靶細(xì)胞核酸(DNA或RNA)的部分互補的反義 寡核苷酸也有效用作靶向部分。與細(xì)胞表面結(jié)合的寡核苷酸也有效。上述分子的功能等價物也有效用作本發(fā)明的靶向部分。一種靶向部分功能等價物 是“模擬”化合物，一種設(shè)計來模擬用于靶向部分-靶細(xì)胞結(jié)合的適當(dāng)構(gòu)象和/或定向的有 機化學(xué)構(gòu)建體。另一靶向部分功能等價物是稱為“最小”多肽，使用計算機輔助分子模型和具有改變的結(jié)合親和力的突變體構(gòu)建的短多肽，該最小多肽顯示靶向部分的結(jié)合親和力。免疫球蛋白的Fv片段對于定向腫瘤治療來說具有許多優(yōu)于完整免疫球蛋白的顯 著的優(yōu)勢，包括在實體瘤組織上更好的損傷穿透和更迅速的血液清除，以及可能更低的Fc 介導(dǎo)的免疫原性。典型的單鏈Fv(SCFV)結(jié)合劑可以從分離自識別配體/受體復(fù)合體的抗 體的可變區(qū)的基因來設(shè)計。本發(fā)明的實施方案涉及與正常非腫瘤相關(guān)脈管系統(tǒng)相比，具有對標(biāo)志物的結(jié)合親 和力的靶向試劑，該標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，表達(dá)，易于結(jié)合，或另外定位在腫瘤相關(guān)脈管內(nèi)皮細(xì)胞 的細(xì)胞表面上。另外，靶向試劑具有結(jié)合親和力的某些標(biāo)志物可以與腫瘤相關(guān)脈管系統(tǒng)的 組分有關(guān)而不是在腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞本身上。例如，該標(biāo)志物可以位于基底膜或腫瘤相關(guān) 結(jié)締組織上?？赡苄枰苽浜褪褂萌缤ㄟ^組織切片的免疫染色評估具有對腫瘤脈管系統(tǒng)相對 高程度的選擇性，和與正常內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞表面的很小或無反應(yīng)性的抗體或其它結(jié)合劑或 部分。還可能需要制備和使用能夠結(jié)合所有脈管系統(tǒng)共有的表位的抗體或其它結(jié)合劑或部 分。可以使用按照本發(fā)明的含有或不含靶向試劑的包括固相血小板-結(jié)合劑的任何 組合物來引發(fā)體內(nèi)治療益處，血栓形成，和/或細(xì)胞致死或退化。組合物可以包括一種或多 種佐劑，一種或多種載體，一種或多種賦形劑，一種或多種穩(wěn)定劑，一種或多種滲透劑(例 如，調(diào)節(jié)穿過細(xì)胞膜運動的試劑)，一種或多種顯像劑，一種或多種效應(yīng)物；和/或生理可接 受的鹽水和緩沖劑。通常，佐劑是與免疫原混合以便引發(fā)更顯著免疫應(yīng)答的物質(zhì)。組合物 還可以包括藥用載體。藥用載體包括但不限于鹽水，無菌水，磷酸鹽緩沖鹽水等。在本發(fā)明 的組合物中可以包括適于遞送給患者的其它緩沖劑，分散劑，和惰性非毒性物質(zhì)。組合物可 以是適于給藥的溶液，典型地是無菌的，非熱源性的和不含不希望有的顆粒物質(zhì)。通過常規(guī) 滅菌技術(shù)可以將組合物滅菌。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，適當(dāng)?shù)慕M合物包括與配體/受體復(fù)合體結(jié)合的結(jié)合 劑或靶向試劑。按照本發(fā)明用作靶子的示例性抗原包括但不限于癌相關(guān)抗原，所述癌包括 肺，結(jié)腸，直腸，乳腺，卵巢，前列腺，頭，頸，骨，免疫系統(tǒng)，血液，或其它任何解剖位置。示例 性抗原和/或預(yù)定部位包括但不限于VEGF/VEGF受體復(fù)合體，F(xiàn)GF/FGF受體復(fù)合體，或TGF. β/TGF. β受體復(fù)合體，ρ-選擇素，唾液酸-路易斯X(Sialyl-leWiS X)，內(nèi)皮縮血管肽，內(nèi) 皮縮血管肽受體，內(nèi)皮縮血管肽/內(nèi)皮縮血管肽受體復(fù)合體，甲胎蛋白，血小板-內(nèi)皮細(xì)胞 粘附分子(PECAM)，CD31,CD34, CD36，糖蛋白Ib(GPIb)，endoglin，凝血調(diào)節(jié)蛋白，內(nèi)皮白細(xì) 胞粘附分子(ELAM)，胞間粘附分子I(ICAM-I)，MHC-I，和MHC-II。受試者可以是人或動物 受試者。如上所述，本發(fā)明的組合物或方法包括血小板結(jié)合劑或組分。示例性血小板結(jié)合 劑或組分包括但不限于馮威勒布蘭特因子(VWF)，骨橋蛋白，血纖蛋白原，血纖蛋白，纖連蛋 白，玻連蛋白，膠原蛋白，血小板反應(yīng)蛋白，層粘連蛋白，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸軟骨素， 磷脂酶A2(PLA2)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，凝血酶，玻璃，唾液酸-路易斯X，fibulin-1, 血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(PECAM)，胞間粘附分子1 (ICAM-I)，胞間粘附分子2 (ICAM-2)， CD lib/CD 18 (MAC-I)，CDlla/CD18 (LFA-1)，ρ-選擇蛋白糖蛋白配體 1 (PSGL-1)，單獨地或組
口 O
如上所述，本發(fā)明的組合物或方法可以包括血小板介導(dǎo)的閉塞增強劑。血小板介 導(dǎo)的閉塞增強劑可以是形成以上所述雙功能分子一部分的部分，可以是按照本發(fā)明的組合 物中的成分，和/或可以與按照本發(fā)明的組合物分開施用。示例性的血小板-介導(dǎo)的閉塞增強劑包括但不限于瑞斯托菌素(ristocetin)， 凝血酶，肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HIT)抗體或其部分，抗磷脂抗體(APA)或其部分，通 過Fc-介導(dǎo)機理的全抗體分子，抗LIBS抗體，抗CD9抗體，腎上腺素，凝血酶受體激活肽 (TRAP)，蛋白酶(proteinase)活化的受體(也稱為蛋白酶(protease)活化的受體，PAR)拮 抗劑，組織蛋白酶G，彈性蛋白酶，花生四烯酸酯，血小板活化因子(PAF)，血栓烷A2 (TxA2)， TxA2模擬物，磷脂酶A2(PU^)，蛋白激酶CO5KC)的激活劑，腺苷二磷酸(ADP)，環(huán)加氧酶 1 (C0X-1)的誘導(dǎo)物，環(huán)加氧酶2(C0X-2)的誘導(dǎo)物，膠原蛋白，馮威勒布蘭特因子(VWF)，基 質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸軟骨素，離子載體，補體級聯(lián)組分(例如 C5b-9)血小板微粒，血小板膜級分。如上所述，本發(fā)明的組合物或方法可以包括血小板介導(dǎo)的閉塞阻滯劑等。血小板 介導(dǎo)的閉塞阻滯劑可以是形成如上所述的雙功能分子一部分的部分，可以是按照本發(fā)明的 組合物中的成分，和/或可以與按照本發(fā)明的組合物分開施用。示例性的血小板介導(dǎo)的閉塞阻滯劑包括但不限于阿斯匹林(aspirin)，布 洛芬(ibuprofen)，對乙酰氨基酚(acetaminophen)，酮洛芬(ketoprofen)，噻氯匹 定(ticlopidine)，氯吡格雷(clopidogrel)，吲哚美辛(indomethacin)，雙嘧達(dá)莫 (dipyridamole), ω-3 月旨肪酸(omega-3 fatty acids),前列環(huán)素(prostacyclin)，氧 化氮(nitric oxide)，氧化氮的誘導(dǎo)物，氧化氮合成酶的誘導(dǎo)物，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 (MMPIs，TIMPs)，抗 GPIIb/IIIa 試劑，抗 α ν β 3 試劑，抗 α 2 β 1 試劑，抗 CD36 試劑，抗 GPVI 試劑，金精三羧酸(aurintricarboxylicacid)，凝血酶受體拮抗物，血栓烷受體拮抗物，鏈 激酶，尿激酶，組織纖溶酶原激活物(tPA)。另外，已知已經(jīng)被冷卻至低于它們膜相變溫度(即< 15°C )的血小板變得不可逆 地活化。盡管如果灌輸?shù)交颊咧械难“逭Ｆ鹱饔?，血小板也被迅速清除出身體(即，在 約24小時內(nèi)，和7-10天的正常循環(huán)血小板的壽命形成對比)。盡管這些血小板被迅速清 除，它們以高親力合與固定的VWF結(jié)合。因此，冷卻的血小板的灌輸提供另外的增強在靶部 位血栓形成的方法。因此，本發(fā)明的一個實施方案包括通過施用如上所述冷卻的血小板控 制血小板介導(dǎo)的閉塞。如上所述，靶向部分可以是，或可以結(jié)合至結(jié)合對的一個成員。按照本發(fā)明的方法 可能要求足夠的時期來在固定部位累積靶向部分，對非目標(biāo)累積的最佳靶向，累積和結(jié)合 結(jié)合對的第二個成員，和/或清除未結(jié)合的物質(zhì)。按照本發(fā)明，可能使用兩步，三步或更多靶向或定位步驟。這些方案中許多在本領(lǐng) 域是眾所周知的(參見，例如，使用生物素/抗生物素蛋白方案的美國專利5，578，觀7)。示 例性的多步方案包括但不限于施用結(jié)合劑-配體，施用抗-配體以清除未結(jié)合的結(jié)合劑和 局部化結(jié)合的結(jié)合劑-配體，和施用活化劑-配體。在本文中，活化劑是指任何活性或變成 活性和導(dǎo)致治療益處的治療劑。按照本發(fā)明的方法，結(jié)合劑必須能夠結(jié)合配體/受體復(fù)合體，并可以通過任何在 免疫學(xué)上適當(dāng)?shù)穆肪€施用于患者。例如，可以通過靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，皮下，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，膀胱內(nèi)，真皮內(nèi)，肌內(nèi)，或淋巴管內(nèi)(intralymphatic)途徑將結(jié)合劑導(dǎo)入患者。組合物可以是固 體，溶液，片劑，氣溶膠，或多相制劑形式。脂質(zhì)體，長期循環(huán)脂質(zhì)體，免疫脂質(zhì)體，生物可降 解微球體，微團(tuán)等也可以用作載體，賦形劑，或遞送系統(tǒng)。另外，使用本領(lǐng)域眾所周知的先體 外后體內(nèi)方法，可以將血液，血漿或血清從患者中取出；任選地，純化患者血液中的抗原可 能是理想的；血液或血清然后可以與組合物混合，所述組合物包括按照本發(fā)明的結(jié)合劑或 固相劑；將處理過的血液或血清返回至患者。臨床醫(yī)師可以比較與這些不同的途徑相關(guān)應(yīng) 答來確定最有效的給藥途徑。本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)限制于任何具體的將結(jié)合劑導(dǎo)入患者的方法。施用可以是一次，多次，或持續(xù)延長的時期。因為本發(fā)明的組合物可以用于處 于嚴(yán)重疾病狀態(tài)，即生命危險或可能生命危險的患者，如果需要可以施用過量的固相劑。 用于施用藥物組合物的實際方法和方案，包括注射本發(fā)明組合物的稀釋技術(shù)，是眾所周 知的或?qū)Ρ绢I(lǐng)域的技術(shù)人員將是明顯的。這些方法和方案中的一些在雷明頓制藥科學(xué) (Remington，sPharmaceutical Science)，馬克出版公司(Mack Publishing Co.) (1982)中 描述。固相劑可以與其它結(jié)合劑結(jié)合給藥，或可以結(jié)合其它治療方案或試劑，例如化學(xué) 治療劑，栓塞劑如明膠海綿(Gelfoam)或聚乙烯醇(PVA)顆粒等給藥。如在本領(lǐng)域眾所周知，與體內(nèi)施用治療劑或治療劑偶聯(lián)物相關(guān)的缺點包括非目標(biāo) 或不希望有的目標(biāo)結(jié)合。因此最小化非目標(biāo)結(jié)合，最小化非目標(biāo)暴露于治療劑或活性劑，和 /或最大化清除未結(jié)合的結(jié)合劑，配體，或活化劑是任何施用的組合物的理想屬性。此外，最 優(yōu)化這些屬性典型地允許施用更高劑量的活性劑，治療劑，或激活先前未激活試劑的方法 的成分。本領(lǐng)域的技術(shù)人員精通于選擇施用最高可能的劑量而安全地保持在毒性閾值以下 的最佳參數(shù)。因此，按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，未活化的血小板通過與固相劑結(jié)合累積或被 誘導(dǎo)累積在預(yù)定部位，然后適當(dāng)固定的血小板被選擇性地激活。按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，激活的血小板通過與固相劑結(jié)合或通過與固相劑結(jié) 合的血小板累積或被誘導(dǎo)累積在預(yù)定部位。本發(fā)明的有效性可以通過測定血栓形成，血栓形成的形態(tài)測量研究，腫瘤壞死，腫 瘤大小，腫瘤形態(tài)學(xué)，和/或?qū)е履[瘤壞死的血栓形成，血流研究(例如血管造影術(shù)，多普勒 超聲，放射顯影，CT掃描，MRI)，或疼痛癥狀的減輕的常規(guī)試驗來監(jiān)測。本領(lǐng)域的技術(shù)人員 將認(rèn)識到可以進(jìn)行其它試驗來評估或監(jiān)測治療益處。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到對于某些先天性和病理學(xué)狀況，其中一些所列如下， 理想的是改進(jìn)本發(fā)明的組合物或方法來補償患者過度出血或形成血栓的體質(zhì)。在這些情形 下，可以利用增強或抑制本發(fā)明的方法或組合物的改良劑的應(yīng)用。這些改良劑的應(yīng)用預(yù)計 使出血或凝血事件最小化。此外，改良劑的應(yīng)用能夠在正常情形(即正常止血)下控制給 藥按照本發(fā)明的組合物。可以許可使用控制劑(controller)，阻滯劑，或減弱本發(fā)明的方法或組合物的 試劑的示例性的促血栓形成或促凝結(jié)癥狀包括但不限于，因子A^idm缺乏，抗磷脂綜合 癥(APS)，蛋白C和/或蛋白S和/或抗凝血酶III缺乏，深靜脈血栓形成(DVT)，假von Willebrands病，IIb類von Willebrands病，周圍性血管疾病(PVD)，和高血壓，這只是其 中之一。示例性的包括出血風(fēng)險、可以許可使用增強劑或增加本發(fā)明方法或組合物的試劑的癥狀包括但不限于任何包括出血風(fēng)險的癥狀，其包括但不限于凝固因子缺乏，血友病 (hemophilia)，血小板減少癥(thrombocytopenia)，和抗凝治療，這只是其中之一?？刂蒲?栓產(chǎn)生包括改變預(yù)定部位溫度，改變預(yù)定部位血流速率，和改變預(yù)定部位血壓中的至少一 種。作為前述的實例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到在血管閉塞過程開始后，相關(guān)促血 栓形成癥狀的逆轉(zhuǎn)或抑制可能是必需的。在該情形中，降低血小板反應(yīng)性的試劑的給藥將 又減小對血管閉塞引發(fā)劑的應(yīng)答。該試劑容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員知道和包括但不限于阿 斯匹林或類阿斯匹林化合物，布洛芬，對乙酰氨基酚，酮洛芬，噻氯匹定，氯吡格雷，吲哚美 辛，ω-3脂肪酸，前列環(huán)素，氧化氮，氧化氮的誘導(dǎo)物，氧化氮合成酶的誘導(dǎo)物，基質(zhì)金屬蛋 白酶抑制劑(MMPIs, TIMPs)，抗GPIb試劑，抗GPIIb/IIIa試劑，抗α νβ 3試劑，抗α 2β 1 試劑，抗CD36試劑，金精三羧酸，凝血酶受體拮抗物，血栓烷受體拮抗物，鏈激酶，尿激酶， 組織纖溶酶原激活物(tPA)。其中增強或增加血小板閉塞過程是理想的示例性過程包括血小板減少(低血小 板量)患者。這些個體將受益于伴隨或預(yù)先給藥(灌輸)血小板產(chǎn)品以提供足夠來源的血 小板來實現(xiàn)血小板閉塞。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到在該情形下可以使用所有可灌輸?shù)哪?擬或近似正常血小板功能的產(chǎn)品。該試劑包括但不限于隨機供體血小板，單采血液成分術(shù) 血小板，自身血小板，洗滌的血小板，血小板膜級分，冷卻的血小板，冷凍血小板，包含或表 達(dá)血小板膜組分的顆粒，血小板代用品和全血。作為另外的實例，一旦靶向治療部位可以使用特定的血小板功能增強劑來提高或 增強初始的血小板反應(yīng)性。已經(jīng)證明本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的試劑增強現(xiàn)有的血小板反應(yīng) 性和/或降低限制充分血小板反應(yīng)性的閾值以促進(jìn)在現(xiàn)有血栓周圍的不可逆血小板附著 和/或血小板脫粒和/或血小板/血小板結(jié)合和/或血小板增加。這些試劑包括但不限于 瑞斯托菌素(restocetin)，凝血酶，肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HIT)抗體或其部分，抗磷脂 抗體(APA)或其部分，通過Fc-介導(dǎo)機理的全抗體分子，抗配體誘導(dǎo)的結(jié)合部位(抗-LIBS) 抗體或其部分，抗CD9抗體或其部分，腎上腺素，凝血酶受體激活肽(TRAP)，PAR拮抗劑，組 織蛋白酶G，彈性蛋白酶，花生四烯酸酯，血栓烷A2(TxM)模擬物，TxA2，磷脂酶A2(PLA2)， 蛋白激酶C(H(C)的激活劑，腺苷二磷酸(ADP)，膠原蛋白，馮威勒布蘭特因子(VWF)，基質(zhì)金 屬蛋白酶(MMPs)，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸軟骨素，離子載體，血小板微粒，血小板膜級分。一旦導(dǎo)入患有腫瘤，增生組織，AV-畸形，動脈瘤或內(nèi)漏的動物的血流中，固相劑將 定位在靶脈管系統(tǒng)中；結(jié)合或固定血小板，由此固定激活血小板；激活的血小板又結(jié)合和 激活其它血小板直至形成閉塞。血小板激活和結(jié)合促進(jìn)白細(xì)胞與活化的血小板結(jié)合，進(jìn)一 步增強靶脈管系統(tǒng)的閉塞。實施例實施例1-顆粒固定的VWF在豬模型中的急性作用本研究是設(shè)計來評估包被人VWF的顆粒在豬腎的脈管系統(tǒng)中誘導(dǎo)血栓形成的有 效性。在該過程中，使用20-22規(guī)格的血管導(dǎo)管將導(dǎo)管插入腎動脈。通過外科手術(shù)暴露腎 脈管并將多普勒流量探針(Doppler flow probe)附著于腎脈管以監(jiān)測血液流進(jìn)和流出靶 器官。在從腎動脈和靜脈采取的流量讀數(shù)之間未發(fā)現(xiàn)顯著的差異；因此，從腎靜脈進(jìn)一步 采取所有的讀數(shù)以顯示通過靶腎的血流量。通過與戊二醛過夜溫育將人VWF與人MAA共價結(jié)合。改變基于每重量蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上的、與MAA結(jié)合的VWF的量的先前滴定研究已經(jīng)確定 1:5-1: 80 (MAA VffF)的比率提供足夠的固定的VWF以誘導(dǎo)血小板結(jié)合和激活。在這 個基礎(chǔ)上，選擇1 20(MAA VffF)的比率用于體內(nèi)研究。通過相差顯微鏡術(shù)的顆粒分析 證明最終制劑中的顆粒大小為30 μ m-250 μ m(如通過使用測微計/血細(xì)胞計數(shù)器通過光學(xué) 顯微鏡估計)。注射MAA/VWF (500 μ 1 或 lml)接著人 PRP (500 μ 1，包含約 200_400χ106 個血小板) 于豬的腎動脈導(dǎo)致血流量的顯著減少。在檢驗試劑后將人血小板注射至人體內(nèi)盡可能接近 病癥附近。另外，注意到豬血小板與人VWF的結(jié)合非常弱。在注射檢驗試劑的10分鐘內(nèi)， 血流量已經(jīng)降低至小于基線水平的一半。在注射檢驗試劑的15分鐘內(nèi)，血流量已經(jīng)降低至 小于基線值的20%。在90分鐘的監(jiān)視期內(nèi)向器官的血流量未增加。相反，注射于對側(cè)腎的腎動脈之中的對照試劑(僅MAA ；相同蛋白質(zhì)濃度)顯示血 流量瞬時減小。血流量開始減小50%，但迅速恢復(fù)至接近基線水平，即在15分鐘內(nèi)> 80% 的最初血流量和在30分鐘內(nèi)> 90%的最初血流量。靶脈管系統(tǒng)的組織學(xué)檢查顯示在檢驗器官的腎動脈的最接近的分支中的大血栓， 和在對照腎中的腎脈管系統(tǒng)的較小血栓形成。在對照或檢驗動物的肝臟，肺，脾，腦，心臟和 眼中未發(fā)現(xiàn)血栓。實施例2-顆粒固定的VWF在豬模型中的慢性作用以類似于在實施例1中概述的方法的方式，使用20-22規(guī)格的血管導(dǎo)管將導(dǎo)管插 入2頭檢驗和2頭對照豬的腎動脈。將多普勒流量探針通過外科手術(shù)放置在每只動物的腎 靜脈上，在閉合最初的切口后將導(dǎo)線暴露在動物的外皮上。在建立流過受侵襲的腎的血液 的基線后，將lml MAA VWF顆粒(Ilmg總蛋白)接著ImL富含人血小板的血漿(約460χ106 個血小板(血小板量458x107升)注射到檢驗動物的腎動脈中，將等量的MAA注射到對照 動物中。將動物轉(zhuǎn)移至代謝板條箱(crate)并在7天期間在不同時間間隔監(jiān)視。下表表示 來自這些研究的血流量結(jié)果。豬多普勒血流量(毫升每分鐘)
權(quán)利要求
1.一種用于在預(yù)定部位處產(chǎn)生永久性閉塞的方法，包括施用包含血小板結(jié)合劑的生物 可降解材料，使所述材料誘導(dǎo)血栓形成，以及使所述血栓被結(jié)締組織替代。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述材料包括PLGA。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述血小板結(jié)合劑包括膠原蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述膠原蛋白選自由牛、人和羊膠原蛋白組成的組。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述材料是顆粒物并具有均一的尺寸。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述材料是顆粒物并具有均一的形狀。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述材料具有均一的尺寸和形狀。
8.一種用于在體內(nèi)誘導(dǎo)血栓形成的組合物，其包括包含血小板特異性組分的固相劑； 其中在遞送至靶脈管系統(tǒng)時，所述血小板結(jié)合組分將血小板結(jié)合在所述固相劑上，誘導(dǎo)血 小板激活，并使血栓形成。
9.一種用于在預(yù)定部位處產(chǎn)生暫時閉塞的方法，包括施用包含血小板結(jié)合劑的生物可 降解材料，使所述材料誘導(dǎo)血栓形成。
10.包含血小板結(jié)合劑的生物可降解材料在治療纖維瘤中的應(yīng)用，其中用所述生物可 降解材料暫時阻斷含纖維瘤的血管中的血流，并且當(dāng)所述材料降解時所述血管變?yōu)槲醋钄?的。
11.包含血小板結(jié)合劑的生物可降解材料在因具有暫時性植入體而產(chǎn)生有益效果的任 何病癥或疾病中的應(yīng)用。
12.—種治療疾病或病癥的方法，包括施用包含血小板結(jié)合劑的生物可降解材料，使所 述材料誘導(dǎo)血栓形成，使所述材料降解，并且施用所述材料至少一次以上。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述施用包括將所述固相劑定位在哺乳動物的脈 管系統(tǒng)內(nèi)。
14.一種治療疾病或病癥的方法，包括對哺乳動物施用包含包被以膠原蛋白的PLGA的 固相劑，并且隨后在體內(nèi)誘導(dǎo)血栓，其包含通過血小板與固定在所述固相劑上或內(nèi)部的結(jié)合劑的結(jié)合來俘獲血小板，誘導(dǎo)血小板的激活，以及使血栓形成。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及用于靶向和遞送固相血小板依賴性血管閉塞劑的方法和組合物。特別是，將包被血小板結(jié)合劑的顆?；蚓€圈或支架導(dǎo)引至靶脈管系統(tǒng)，如實體瘤塊或AV-畸形或動脈瘤或內(nèi)漏的脈管系統(tǒng)；固相劑然后結(jié)合和激活血小板，其又結(jié)合和激活其它血小板。該過程導(dǎo)致在固相劑周圍迅速形成血小板介導(dǎo)的血栓，致使血管閉塞。
文檔編號A61K38/39GK102089006SQ200880125273
公開日2011年6月8日 申請日期2008年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月26日
發(fā)明者保羅·B·堤格, 安托萬·努杰姆(死亡), 歐文·J·格里菲思, 羅蘭·H·珀森, 邁克爾·W·斯圖爾特 申請人:Im生物技術(shù)有限公司