專利名稱：抗血管新生融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體說地涉及抑制血管新生的重組DNA序列、該 DNA序列表達(dá)的融合蛋白及其在病理性血管新生疾病治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在正常情況下，成人體內(nèi)的血管絕大多數(shù)處于靜止?fàn)顟B(tài)，血管新生只見于少數(shù)病 理或生理狀態(tài)。生理狀態(tài)僅發(fā)生于創(chuàng)傷修復(fù)，組織再生和婦女的生理周期。病理情況發(fā)生 于腫瘤，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病性視網(wǎng)膜病和干癬，年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)。腫瘤血管 新生是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的“命脈”。(Hanahanand Folkman，Cell，1996，86 :353_364)。近年 來，抗血管新生治療成為腫瘤等疾病治療的熱點(diǎn)和最有前途的領(lǐng)域。血管生成由多個血管生成促進(jìn)因子和抑制因子組成的復(fù)雜系統(tǒng)調(diào)節(jié)，成人的血 管生成嚴(yán)格受此促進(jìn)和抑制平衡調(diào)節(jié)。VEGF對血管內(nèi)皮細(xì)胞基膜的水解、遷移和血管 構(gòu)建的調(diào)節(jié)作用強(qiáng)，特異性高，是目前發(fā)現(xiàn)的主要特異促血管生成因子。(Folkman J, et al.Sciencel987 ；235 442 ；Giampietro G, etal. Cancer Metastassis Rev 1994 ；Ferrara. Endocrine Reviews2004, 25 (4) :581_611)因此，針對VEGF信號通路的抗血管新生治療成 為抗腫瘤和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的重要治療靶點(diǎn)。VEGF受體有 3種，flt-l(fms-like tyrosine kinase, VEGFR-1) ,Flk-l/KDR(fetal liver kinase 1-murine homologue/Kinase insert Domain containingReceptor-human homologue, VEGFR-2)和 flt_4 (VEGFR-3)。VEGFR-1，2，主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面， VEGFR-3主要分布于淋巴內(nèi)皮。他們由含7個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外區(qū)、膜區(qū)及酪氨酸 激酶區(qū)組成。該酪氨酸激酶的活性通過受體和配體結(jié)合而激活，由受體磷酸化而引起細(xì)胞 內(nèi)許多酶和其他反應(yīng)。其中Flk-l(KDR)在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成起決定作用。通過抗VEGF抗體和可溶性VEGF受體片斷可以阻斷VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞上VEGF 受體(flt-1，KDR等)之間的相互作用，從而阻止由VEGF介導(dǎo)的信息傳導(dǎo)，抑制由VEGF 高表達(dá)而引起的病理性新生血管的生長。這類VEGF抑制劑包括Avastir^bevacizumab)， Lucentis, VEGF-Trap等，用于治療血管新生相關(guān)的疾病。2004年美國FDA批準(zhǔn)的針對 血管新生的抗癌藥物Avastin就是特異性結(jié)合VEGF的單克隆抗體，其機(jī)理就是通過結(jié) 合VEGF達(dá)到阻斷VEGF與其受體結(jié)合的目的(Ferrara et al，Nature Reviews Drug Discovery. 2004,3 =391-400)。但是 Avastin 有兩個主要缺點(diǎn)1.親和力較低 2. 3 * 10、 抗體用量大。2.沒有PLGF結(jié)合能力。因此，理想化的VEGF阻斷劑是VEGF受體的細(xì)胞外片段，其具有天然的針對VEGF 的高特異性禾口親禾口力(Kuo et al, Proceedings of the NationalAcademy of Sciences, 2001,98 4605-4610),比 Avastin 的親禾口力高 20—100 倍(Ferrara N et al, Nature medicine. 2003,9 669-676) 0近年來的研究表明，抗PLGF可以抑制腫瘤的血管新生和轉(zhuǎn) 移，可以顯著增強(qiáng)抗VEGF的抗血管新生治療效果，并且可以抑制一些抗VEGF治療無效的腫 瘤生長(Fischer C. et al, cell,131 :463_475)。因此利用flt-1與PLGF也具有高親和力(Christinger, HW. Et al，J. Biol. Chem. 2004，279 (11) 10382-8)的特點(diǎn)，用含有 flt_l 受 體片段的融合蛋白可以結(jié)合VEGF和PLGF具有更加優(yōu)良的抗血管新生治療效果。美國專利6100071，5952199等描述了幾種用Fit 1部分片段和KDR的部分片段融 合的蛋白，但由于其不穩(wěn)定，副作用大，沒有進(jìn)一步開發(fā)。雖然Fltl胞外區(qū)第2-3免疫球蛋 白結(jié)構(gòu)域具有大部分的Fltl對VEGF和PLGF的結(jié)合活性，但是它的第三免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu) 域的成串堿性氨基酸導(dǎo)致在體內(nèi)的有效活性很低。因此本發(fā)明采用Fltl和KDR的其它部分 免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域與Fit 1第2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組合以保持融合蛋白的對VEGF和PLGF 的結(jié)合活性。此外，一些正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的藥物_如Regeneron公司VEGF trap-與VEGF 分子結(jié)合比例是1 1。本發(fā)明不僅保留了人VEGF受體Fltl (VEGFR I)和KDR(VEGFR II) 與VEGF的結(jié)合性能，及Fltl與PLGF的結(jié)合活性，而且由于兩個與VEGF結(jié)合的免疫球蛋白 結(jié)構(gòu)域距離較遠(yuǎn)，提供了雙價結(jié)合能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于抑制血管新生的融合蛋白，該融合蛋白包括(a) 編碼VEGF受體成分的氨基酸序列，該序列連接于(b)編碼一種多聚成分的氨基酸序列上， 形成(a)-(b)結(jié)構(gòu)。其中，所述VEGF受體成分是這種融合多肽的唯一的VEGF受體成分；所 述多聚成分通常為免疫球蛋白Fc片段。本發(fā)明的另一目的在于提供所述的融合蛋白的用途及組合物。在本發(fā)明的第一方面，提供一種融合蛋白，即VEGF結(jié)合物SR1-3，它們包括(a)編 碼VEGF受體成分的氨基酸序列，該序列連接于(b)編碼一種多聚成分的氨基酸序列上，形 成(a)-(b)結(jié)構(gòu)。其中，所述VEGF受體成分是這種融合多肽的唯一的VEGF受體成分，與多 聚成分Fc多肽鏈結(jié)合，然后兩個Fc作為二聚體來提高體內(nèi)的作用半衰期和生物活性。在一優(yōu)選例中，所述融合蛋白SR1具有SEQ ID NO 6所述的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白SR2具有SEQ ID NO 7所述的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白SR3具有SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供一種核酸分子，所述的核酸分子編碼SEQ IDN0 :6_8所 述的融合蛋白SR1-3。在一優(yōu)選例中，所述核酸分子編碼具有SEQ ID NO :6所述的氨基酸序列的融合蛋 白 SR1。在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子編碼具有SEQ ID NO :7所述的氨基酸序列的融合 蛋白SR2。在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子編碼具有SEQ ID NO :8所述的氨基酸序列的融合 蛋白SR3。在本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的核酸分子。在一優(yōu)選例中，所述的載體是pcDNA3. 1表達(dá)載體。在本發(fā)明的第四方面，提供一種基因工程化的細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有所述的載體；或所述的細(xì)胞基因組中整合有所述的核酸分子。在本發(fā)明的第五方面，提供一種產(chǎn)生所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括在適合表達(dá)所述融合蛋白的條件下，培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，表達(dá)和分離出所述的融合蛋白。在本發(fā)明的第六方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于制備治療或預(yù)防血管新 生或者VEGF相關(guān)疾病的組合物。在一優(yōu)選例中，所述的組合物用于治療或預(yù)防血管新生或者VEGF相關(guān)疾病。在另一優(yōu)選例中，所述的VEGF相關(guān)疾病包括各種實(shí)體腫瘤，AMD，關(guān)節(jié)炎，等等。在本發(fā)明的第七方面，提供一種特異性結(jié)合VEGF的組合物，所述的組合物含有(i)有效量的所述的融合蛋白；(ii)其它VEGF拮抗劑；(iii)藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1. Fit 1胞外區(qū)氨基酸序列圖2 :KDR胞外區(qū)氨基酸序列圖3 融合蛋白SR1-3結(jié)構(gòu)示意圖
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過研究，意外地發(fā)現(xiàn)將VEGF受體的部分氨基酸序列與多聚成分如人 免疫球蛋白的Fc片段相融合，獲得的融合蛋白具有極其優(yōu)異的結(jié)合VEGF的效果，且穩(wěn)定性 好、半衰期長，可多價結(jié)合VEGF分子。如本文所用，除非另外說明，F(xiàn)ltl，flt-1，VEGFR-1可互換使用，都指第一種VEGF 受體。如本文所用，除非另外說明，F(xiàn)lk-1，KDR或VEGFR-2可互換使用，都指第二種VEGF 受體。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)
成”、“基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”；“主要由......構(gòu)成”、“基本上
由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，除非另外說明，所述的融合蛋白是一種分離的蛋白，與其它蛋白、多 肽或分子無聯(lián)系，是重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)的純化產(chǎn)物或作為一種純化的提取物。本發(fā)明的目的在于提供三種用于抑制血管新生的VEGF結(jié)合物SR1-3。它們包括 (a)編碼VEGF受體成分的氨基酸序列，該序列連接于(b)編碼一種多聚成分的氨基酸序列 上，形成(a)-(b)結(jié)構(gòu)。其中，所述VEGF受體成分是這種融合多肽的唯一的VEGF受體成分， 該受體成分和Fc鏈結(jié)合，利用兩個Fc單鏈形成二聚體來提高體內(nèi)的作用半衰期。SR1-3中的VEGF受體成分(a)分別具有以下三種結(jié)構(gòu)SR1 由Fit 1的胞外結(jié)構(gòu)域的第2免疫球蛋白樣區(qū)域，和KDR的胞外結(jié)構(gòu)域的第 2和第3免疫球蛋白樣區(qū)域，融合而成FltlD2-KDRD2-KDRD3 ；SR2 由Fit 1的胞外結(jié)構(gòu)域的第2免疫球蛋白樣區(qū)域，和KDR的胞外結(jié)構(gòu)域的第 4免疫球蛋白樣區(qū)域融合而成FltlD2-KDRD4 ；
SR3:由Fit 1的胞外結(jié)構(gòu)域的第2免疫球蛋白樣區(qū)域，和Fit 1胞外結(jié)構(gòu)域的第4免疫球蛋白樣區(qū)域融合而成FltlD2-FltlD4 ；其中FltlD2代表Fltl胞外結(jié)構(gòu)域的第2免疫球蛋白樣區(qū)域氨基酸序列，F(xiàn)ltlD4 代表Fltl胞外結(jié)構(gòu)域的第4免疫球蛋白樣區(qū)域氨基酸序列，KDRD2代表KDR胞外結(jié)構(gòu)域的 第2免疫球蛋白樣區(qū)域氨基酸序列，KDRD3代表KDR胞外結(jié)構(gòu)域的第3免疫球蛋白樣區(qū)域 氨基酸序列，KDRD4代表KDR胞外結(jié)構(gòu)域的第4免疫球蛋白樣區(qū)域氨基酸序列。Fltl和KDR的各免疫球蛋白樣區(qū)域的氨基酸序列可以從公用數(shù)據(jù)庫獲得，由于 Fltl和KDR中各個免疫球蛋白樣區(qū)域的氨基酸序列之間并沒絕然的分界，因此各免疫球蛋 白樣區(qū)域的氨基酸序列的長度可以有一定的變化。所以，本發(fā)明所涉及的融合蛋白質(zhì)的氨 基酸序列也可以有一定的變化。它們都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。(b)編碼多聚成分的氨基酸序列，通常為但不限于人免疫球蛋白Fc序列，它們都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。其中的免疫球蛋白Fc片段選自人免疫球蛋白Fc如IgG，IgM，IgA 或亞型IgGl，IgG2，IgG3，IgG4。其中的免疫球蛋白Fc片段是Fc全長或是部分Fc序列，選 自CH2片斷，CH3片斷，絞鏈區(qū)域片段。研究表明，fltl的N端第2個免疫球蛋白樣區(qū)域fltlD2和KDR的N端第3個免 疫球蛋白樣區(qū)域KDRD3分別是fltl和KDR與VEGF結(jié)合的區(qū)。fltl的N端第3個免疫球 蛋白樣區(qū)域fltlD3，和KDR的N端第2個免疫球蛋白樣區(qū)域KDRD2分別對維持fltl和KDR 與VEGF結(jié)合的親和力具有非常重要的作用。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種結(jié)構(gòu)利用由Fltl的胞外結(jié)構(gòu)域的第2免疫球 蛋白樣區(qū)域，和KDR的胞外結(jié)構(gòu)域的第2和第3免疫球蛋白樣區(qū)域融合，從而保證了融合蛋 白具有Fltl與VEGF和PLGF的結(jié)合親和力，并具有足夠的空間距離進(jìn)行雙價結(jié)合。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種結(jié)構(gòu)利用由Fltl的胞外結(jié)構(gòu)域的第4免疫 球蛋白樣區(qū)域，融合于Fltl的胞外結(jié)構(gòu)域的第2免疫球蛋白樣區(qū)域從而保證了融合蛋白具 有Fltl與VEGF和PLGF的的結(jié)合親和力。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種結(jié)構(gòu)利用KDR的胞外結(jié)構(gòu)域的第4免疫球 蛋白樣區(qū)域，融合于Fltl的胞外結(jié)構(gòu)域的第2免疫球蛋白樣區(qū)域從而保證了融合蛋白具有 Fltl與VEGF和PLGF的的結(jié)合親和力。融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建技術(shù)基于分子克隆方法，具體實(shí)驗(yàn)方法可參考《分子克隆》第二 版和第三版等實(shí)驗(yàn)手冊。編碼上述融合蛋白的DNA的獲得可以通過常規(guī)技術(shù)，如通過全基 因合成或分別從Fltl，KDR的片斷拼接形成。所用載體可以是分子生物學(xué)所常用的質(zhì)粒載 體。各融合蛋白的氨基末端前加上蛋白分泌信號序列以保證蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分泌出來。載 體序列中包括用于驅(qū)動基因表達(dá)的啟動子，蛋白質(zhì)翻譯起始和終止信號，以及多聚腺苷酸 ((PolyA)序列。載體中有抗菌素抗性基因以利于質(zhì)粒在細(xì)菌中所繁殖。另外，載體中還包 括真核細(xì)胞選擇性基因用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選。在完成上列各種融合蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建以后，即可用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)相應(yīng) 的蛋白質(zhì)。能夠用于表達(dá)這些融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)有多種，它們包括(但不限于)哺乳動 物細(xì)胞，細(xì)菌，酵母，昆蟲細(xì)胞，等等。從哺乳動物細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)具有糖基修飾。由于 本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列中包括可糖基化的氨基酸，因此，哺乳動物細(xì)胞是表達(dá) 這些蛋白質(zhì)的最佳細(xì)胞?？捎糜诘鞍踪|(zhì)大規(guī)模表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞有多種，例如293細(xì)胞，CHO細(xì)胞，SP20細(xì)胞，NSO細(xì)胞，COS細(xì)胞，BHK細(xì)胞，PerC6細(xì)胞，等等。許多其他細(xì)胞也可用于這些蛋白質(zhì)的表達(dá)和生產(chǎn)，因此都包括在本發(fā)明所能使用的細(xì)胞之列。編碼多肽的質(zhì)?？山?jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染方法包括(但不限于)電穿孔，脂質(zhì)體 (liposome)介導(dǎo)等等。融合蛋白質(zhì)表達(dá)后，可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或其他方法測 定細(xì)胞培養(yǎng)液中融合蛋白質(zhì)的濃度。由于這些融合蛋白質(zhì)具有免疫球蛋白Fc片斷，因此可 用蛋白A親和層析法提取所表達(dá)的融合蛋白質(zhì)。由于本發(fā)明的各種融合蛋白質(zhì)的基本作用是阻斷VEGF信號通路，因此這些融合 蛋白質(zhì)可能應(yīng)用于與血管新生或者VEGF相關(guān)的疾病。這些疾病可能包括(但不限于)各 種實(shí)體腫瘤，AMD，關(guān)節(jié)炎，等等。融合蛋白可以作為提取的重組蛋白質(zhì)注射到病人體內(nèi)。也 可以將融合蛋白DNA序列插入到適當(dāng)?shù)妮d體中，用基因治療或細(xì)胞治療的方法在病人體內(nèi) 表達(dá)。所以，本發(fā)明所涉及的融合蛋白質(zhì)的使用方法有多種形式，不僅包括蛋白質(zhì)本身，也 包括編碼融合蛋白氨基酸序列的對應(yīng)DNA序列。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明融合蛋白的藥物組合物，組合物中可以含有藥物可接受 的載體。組合物可以以任何形式的藥物制劑形式存在，優(yōu)選的是注射劑，最優(yōu)選的是冷凍干 燥注射劑。該藥物制劑形式藥物組合物，可以按照制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備，包括將藥物活性成 分，本發(fā)明的融合蛋白與藥物載體混合，按照制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制成所需要的劑型。本發(fā)明的融合蛋白，特別優(yōu)選的融合蛋白是SR1，與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)明顯，具有 多價，副作用小的特點(diǎn)。實(shí)施例1 融合蛋白質(zhì)及其質(zhì)粒的構(gòu)建。構(gòu)建本發(fā)明的SR1-3融合蛋白的氨基酸序列來自Fltl (NP_002010)和 KDR(NP_002244) cDNA編碼區(qū)相應(yīng)的胞外區(qū)免疫球蛋白域氨基酸序列，融合于人免疫球蛋白 IgGlFc (P01857,104-330)氨基酸序列，信號肽來自Fltl的信號肽序列(NP_002010 :1_26)。SR1-3的結(jié)構(gòu)見圖3。SR1，2，3氨基酸序列分別見序列6，7，8。DNA序列分別通過基因合成和拼接的方式獲得，在兩端分別加上Xbal/Hindlll酶 切位點(diǎn)，克隆入pcDNA3. 1。實(shí)施例2 融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)和純化。本發(fā)明的組成部分之一是在在完成各質(zhì)粒的構(gòu)建以后，提取獲得高純度質(zhì)粒DNA， 在瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)所構(gòu)建的融合蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)被純化后，遞藥給特定的動物模型 來證實(shí)生物學(xué)活性。然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定的CHO細(xì)胞用于生產(chǎn)。瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)首先用生長良好的CHOs細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染的前一天以8女IOVcm2的密度用含10%胎 牛血清的DMEM培養(yǎng)基接種至6孔板或需要的平皿，第二天先將培養(yǎng)液換為optimem，然后以 0. 4ugDNA/cm2的量將質(zhì)粒DNA與lipofectamine2000的復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。繼續(xù)培 養(yǎng)三天，然后收集上清液。用ELISA法定量測定上清液中表達(dá)的融合蛋白，用protein A柱 純化表達(dá)的少量融合蛋白。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)轉(zhuǎn)染同上。但是，在轉(zhuǎn)染第二天，將細(xì)胞用胰酶消化，用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng) 基以5女104/ml的密度分至96孔板，每孔lOOul，第三天加入G418。5天后換一次液，大約 14天后，挑取新酶素抗性單克隆，進(jìn)行細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)。最后，細(xì)胞在發(fā)酵罐中培養(yǎng)生產(chǎn)融合多肽。實(shí)施例3 融合蛋白質(zhì)體外活性測定
融合蛋白與VEGF和PLGF的結(jié)合能力分析本發(fā)明利用高特異性和高靈敏度的VEGF和PLGF ELISA定量檢測試劑盒來確定各 融合蛋白與VEGF和PLGF的親和力。實(shí)驗(yàn)中，將不同濃度((^IjlOOOpM)的融合蛋白和40pM 的人VEGF或PLGF在室溫下相混合，37度2小時，或4度過夜后用VEGF或PLGF ELISA定量 檢測試劑盒檢測游離的VEGF或PLGF濃度。計(jì)算各融合蛋白的結(jié)合親和力。BIAcore分析SRl對VFGF 165的分子結(jié)合比例SRl融合蛋白被首先用胺偶聯(lián)化學(xué)方法固定在BIAcore芯片(BIAC0RE)上的抗Fc 專一性杭體所固定。用空白抗體表面作負(fù)對照，以10微升/分鐘的速度用1個小時將VEGF 165以InM，IOnM和50nM注射在融合蛋白的表面。記錄實(shí)時結(jié)合信號，并在每一次注射結(jié)束 時達(dá)到飽和結(jié)合。計(jì)算SRl融合蛋白對VEGF 165的分子結(jié)合比例。在溶液中，將濃度為InM的SRl融合蛋白與各種濃度的VEGF 165混合。在培養(yǎng)1小 時之后，以與胺結(jié)合的VEGF 165表面結(jié)合信號形式測定溶液中游離的融合蛋白的濃度.利 用校正曲線將BIAcore結(jié)合信號轉(zhuǎn)換成它的摩爾濃度。計(jì)算SRl融合蛋白對VEGF 165的 分子結(jié)合比例。內(nèi)皮細(xì)胞生長分析選用生長良好的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液(Cambrex Bio Scienceffalkersville, Inc.)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2. 5 X IO4個/ml，接種于96孔培養(yǎng)板(100 μ 1/孔)，生長培養(yǎng)液為 EGM基本培養(yǎng)基(Cambrex)，37°C 5% CO2培養(yǎng)至貼壁狀態(tài)，用含0. 2%明膠的PBS系列稀釋 純化的VEGF抑制劑待測樣品，加入抑制劑濃度為l-5000ng/ml，2-3小時后每孔加VEGF165 至終濃度3ng/ml，2-3天后，每孔加入10微升CCK-8溶液。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2小 時。以加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照，在 450nm測定吸光度，以650nm作為參考波長雙波長測定。實(shí)施例4 融合多肽抑制小鼠腫瘤的生長。將培養(yǎng)的人A673成橫紋肌細(xì)胞瘤細(xì)胞(ATCC;CRL 1598)懸浮于生理鹽水中。在 6-10周齡的雌性BLAB/c裸鼠背部區(qū)域皮下注射100微升體積、IX IO6個腫瘤細(xì)胞。在腫 瘤細(xì)胞接種開始后24小時，用融合蛋白或同劑量的提純?nèi)嗣庖咔虻鞍譌c注射動物。注射 劑量為每小鼠每次400微克，每周兩次。每組由10只小鼠構(gòu)成。每周測定腫瘤大小。在腫 瘤細(xì)胞接種4周后，動物被安樂死亡，然后取出腫瘤并稱量分析。序列表<110>欣潤(上海)生物藥業(yè)有限公司<120>抗血管新生融合蛋白<160>8
<210>1<211>103<212>PRT<213>人工序列<400>l(FltlD2)
1 SDTGRPFVEM YSEIPEIIHM TEGRELVIPC RVTSPNITVT LKKFPLDTLI51 PDGKRIIffDS RKGFIISNAT YKEIGLLTCE ATVNGHLYKT NYLTHRQTNT101 IID<210>2<211>204<212>PRT<213>人工序列<400>2(KDRD2-KDRD3)1 PFIASVSDQH GVVYITENKN KTVVIPCLGS ISNLNVSLCA RYPEKRFVPD51 GNRISffDSKK GFTIPSYMIS YAGMVFCEAK INDESYQSIM YIVVVVGYRI101 YDVVLSPSHG IELSVGEKLV LNCTARTELN VGIDFNWEYP SSKHQHKKLV151 NRDLKTQSGS EMKKFLSTLT IDGVTRSDQG LYTCAASSGL MTKKNSTFVR201 VHEK<210>3<211>93<212>PRT<213>人工序列<400>3 (KDRD4)1 FVAFGSGMES LVEATVGERV RIPAKYLGYP PPEIKffYKNG IPLESNHTIK51 AGHVLTIMEV SERDTGNYTV ILTNPISKEK QSHVVSLVVY VPP<210>4<211>96<212>PRT<213>人工序列<400>4(FItlD4)1 FITVKHRKQQ VLETVAGKRS YRLSMKVKAF PSPEVVffLKD GLPATEKSAR51 YLTRGYSLII KDVTEEDAGN YTILLSIKQS NVFKNLTATL IVNVKP<210>5<211>227<212>PRT<213>人工序列<400>5 (IgGlFc)1 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED51 PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDffLNGKEYK101 CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK151 GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRffQQG201 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
<210>6<211>534
<212>PRT<213>人工序列<400>6 (SRl)1 SDTGRPFVEM YSEIPEIIHM TEGRELVIPC RVTSPNITVT LKKFPLDTLI51 PDGKRIIffDS RKGFIISNAT YKEIGLLTCE ATVNGHLYKT NYLTHRQTNT101 IIDPFIASVS DQHGVVYITE NKNKTVVIPC LGSISNLNVS LCARYPEKRF151 VPDGNRISffD SKKGFTIPSY MISYAGMVFC EAKINDESYQ SIMYIVVVVG201 YRIYDWLSP SHGIELSVGE KLVLNCTART ELNVGIDFNW EYPSSKHQHK251 KLVNRDLKTQ SGSEMKKFLS TLTIDGVTRS DQGLYTCAAS SGLMTKKNST301 FVRVHEKDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV351 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDff401 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV451 SLTCLVKGFY PSDIAVEffES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD501 KSRffQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK<210>7<211>423<212>PRT<213>人工序列<400>7(SR2)1 SDTGRPFVEM YSEIPEIIHM TEGRELVIPC RVTSPNITVT LKKFPLDTLI51 PDGKRIIffDS RKGFIISNAT YKEIGLLTCE ATVNGHLYKT NYLTHRQTNT101 IIDFVAFGSG MESLVEATVG ERVRIPAKYL GYPPPEIKffY KNGIPLESNH151 TIKAGHVLTI MEVSERDTGN YTVILTNPIS KEKQSHVVSL VVYVPPDKTH201 TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK251 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDffL NGKEYKCKVS301 NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP351 SDIAVEffESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRffQQGNVFS401 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK<210>8<211>426<212>PRT<213>人工序列<400>8 (SR3)1 SDTGRPFVEM YSEIPEIIHM TEGRELVIPC RVTSPNITVT LKKFPLDTLI51 PDGKRIIffDS RKGFIISNAT YKEIGLLTCE ATVNGHLYKT NYLTHRQTNT
101 IIDFITVKHR KQQVLETVAG KRSYRLSMKV KAFPSPEVVff LKDGLPATEK151 SARYLTRGYS LIIKDVTEED AGNYTILLSI KQSNVFKNLT ATLIVNVKPD201 KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP251 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DffLNGKEYKC
301 KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG351 FYPSDIAVEff ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRffQQGN 401 VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
權(quán)利要求
一種抗血管新生融合蛋白，其特征在于，包括(a)編碼VEGF受體成分的氨基酸序列，該序列連接于(b)編碼一種多聚成分的氨基酸序列上，形成(a)-(b)結(jié)構(gòu)。其中，所述VEGF受體成分是這種融合多肽中唯一的VEGF受體成分；所述多聚成分通常為免疫球蛋白Fc片段。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于(a)編碼VEGF受體成分的多肽具有SEQ ID NO :6所述的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于(a)編碼VEGF受體成分的多肽具有SEQ ID NO :7所述的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于(a)編碼VEGF受體成分的多肽具有SEQ ID NO :8所述的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于(b)編碼一種多聚成分的氨基酸序列可 為來源于人 IgG，IgM, IgA 或亞型 IgGl，IgG2，IgG3，IgG4 的 Fc 段。
6.如權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其特征在于(b)編碼一種多聚成分的氨基酸優(yōu)選為 來源于人IgGl的Fc段。
7.—種核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子編碼權(quán)利要求1-6任一所述的融合蛋白。
8.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括在適合 表達(dá)所述融合蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞，表達(dá)和分離出所述的融合 蛋白。
9.權(quán)利要求1-6任一所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制備治療或預(yù)防血管 新生或者VEGF相關(guān)疾病的組合物。
10.一種用于制備治療或預(yù)防血管新生或者VEGF相關(guān)疾病的組合物，其特征在于，所 述的組合物含有⑴有效量的權(quán)利要求1-6所述的融合蛋白；和/或 ( )其它VEGF拮抗劑；和/或 (iii)藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種抗血管新生融合蛋白及其用途。本發(fā)明利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了幾種人VEGFR受體片斷與IgFc片斷的融合蛋白，可用于治療或預(yù)防血管新生或者VEGF相關(guān)疾病。該融合蛋白具有優(yōu)良的VEGF及PLGF結(jié)合能力，且穩(wěn)定性好、半衰期長，并可多價結(jié)合VEGF分子。
文檔編號A61K38/17GK101838329SQ20091005695
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月18日
發(fā)明者周新華, 孫九如, 趙建陽 申請人:嘉和生物藥業(yè)有限公司