專利名稱：臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細胞在心力衰竭細胞移植治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物材料在醫(yī)療領(lǐng)域的用途，特別涉及以人臍帶華通膠為原料制備
的間充質(zhì)干細胞，在制備因冠心病及擴張性心肌病引起的心力衰竭細胞移植材料方面的 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
全球每年有約1700萬人死于心血管疾病。雖然隨著藥物治療、介入技術(shù)和外科 手術(shù)水平的提高，急性心肌梗死的病死率明顯下降，但循證醫(yī)學發(fā)現(xiàn)，即使早期成功接 受再血管化治療的急性心肌梗死患者中，仍有超過30%的患者發(fā)展為缺血性心力衰竭， 甚至進一步發(fā)展為終末期缺血性心力衰竭。終末期缺血性心力衰竭是指①有心肌梗死 史；②有嚴重心力衰竭臨床表現(xiàn)并反復住院；③強化內(nèi)科藥物治療無效；④無內(nèi)科介入 及外科搭橋手術(shù)指征；⑤左心室射血分數(shù)(LVEF)小于40% 。終末期缺血性心力衰竭年 死亡率在60%以上。對終末期缺血性心力衰竭所能采取的治療手段僅有兩項①心臟移 植；②安裝心室輔助裝置。心臟移植因為手術(shù)耐受、供體、免疫排斥等原因不可能廣泛 使用；安裝心室輔助裝置則僅適用于短期支持過渡期嚴重血液動力學障礙急性患者，不 能長期維持應(yīng)用。因此，當前國際醫(yī)學界尚無有效方法逆轉(zhuǎn)終末期缺血性心力衰竭患者 的病情。 除缺血性心臟病所致的心力衰竭，擴張性心肌病是慢性心力衰竭又一常見原 因，其中包括病因不清的特發(fā)性心肌病和繼發(fā)于心肌炎后的心肌病。擴張性心肌病引起 的慢性心力衰竭l年病死率約25-30%，心臟移植是唯一有效治療措施。由于受供體來源 和技術(shù)的限制，全球心臟移植每年只有三千余例，中國僅數(shù)十例。 當代細胞生物學的發(fā)展給這些慢性心力衰竭患者帶來了新的希望。臨床研究發(fā) 現(xiàn)，自體骨髓單個核細胞、自體骨髓間充質(zhì)干細胞，以及內(nèi)皮祖細胞、骨髓側(cè)群細胞等 成體干細胞移植治療缺血性心力衰竭、陳舊性心肌梗死及心肌梗死后心衰，可以不同程 度改善心臟收縮和舒張功能、阻止左室重構(gòu)、改善預(yù)后。 然而，細胞療法在臨床應(yīng)用中遇到了來自種子細胞的重重障礙應(yīng)用胚胎干細 胞存在倫理、法律、免疫排斥及致腫瘤性等問題；應(yīng)用自體成體干細胞遇到更多問題， 諸如①骨髂肌成肌細胞移植存在嚴重致心律失常性；②骨髓單個核細胞移植成分復雜， 所含具有多向分化潛能的干細胞數(shù)量低，分化潛能有限；③造血干細胞CD34不能分化 為心肌細胞表型；④CD133細胞移植可致冠脈支架再狹窄；⑤內(nèi)皮祖細胞改善心功能作 用有限；⑥骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)材料來源受限，細胞增殖分化潛能隨年齡的增長 而明顯下降，尤其是冠心病患者MSCs增殖分化能力明顯低于同齡健康人，體外長時間 擴增降低體內(nèi)分化歸巢潛能；⑦與自體MSCs相比，臍血MSCs有諸多優(yōu)點，但臍血源 MSCs分離效率低，限制了其廣泛應(yīng)用?？傊?，當前尚無一種理想的種子細胞滿足對這些 慢性心力衰竭患者實施細胞生物學治療的臨床需求，需要突破的技術(shù)瓶頸是解決多能干
3細胞的來源。 本發(fā)明人的在先專利申請"200910157731.6臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞的制備方 法及其產(chǎn)品"為心力衰竭患者實施細胞生物學治療提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，將臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于因冠心 病及擴張性心肌病引起的慢性心力衰竭患者，作為對其實施細胞移植治療的材料，用以 改善以上這些慢性心力衰竭患者的生存質(zhì)量，降低死亡率；同時克服冠心病及老年患者 自體干細胞分化增殖及旁/自分泌功能減低不能達到有效的生物學效應(yīng)的缺陷。
本發(fā)明所稱"臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細胞"，英文名稱為"Umbilical Cord Wharton' s Jelly-Derived MSCs， UW-MSCs"，是按以下方法制備的
取人新鮮臍帶，以等滲的平衡鹽溶液或無血清培養(yǎng)基洗去臍帶殘留血液，去除 臍動脈、臍靜脈及臍帶外膜，剝離華通膠并剪切成小塊，再以等滲的平衡鹽溶液或無血 清培養(yǎng)液沖洗后，浸泡于0.05 0.3%膠原酶溶液中，置于35 37.5t:溫箱中10 30 小時，組織塊消化，液體呈粘稠狀，然后加入相當于原液1 10倍量的含胎牛血清的培 養(yǎng)基終止消化，分裝于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，置CC^培養(yǎng)箱，待細胞貼壁后更換含胎牛血清 的培養(yǎng)基溶液，以后每隔2 4天換液一次，細胞貼壁融合后傳代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)2 4 代，即時使用或冷凍保存?zhèn)溆谩?本發(fā)明所稱"臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細胞"在生物學表型鑒定中，具有以 下技術(shù)特征①在標準培養(yǎng)條件下粘附于塑料制培養(yǎng)器皿生長；②表達CD90、 CD105、 CD44 ; HLA-ABC ;不表達CD45、 CD34， HLA-DR ;③體外可誘導分化為成骨細胞和 脂肪細胞。 本發(fā)明方法所用細胞移植材料，可以即時使用剛剛完成傳代培養(yǎng)2-4代的
UW-MSCs新鮮品，也可以使用冷凍保存的傳2-4代UW-MSCs備用品。 本發(fā)明所稱"因冠心病及擴張性心肌病引起的心力衰竭"包括心力衰竭的兩個
類別 一類為因冠心病引起的心力衰竭，包括慢性缺血性心力衰竭(Chronic ischemic heart
failure, CIHF)及終末期缺血性心力衰竭(end-stage ischemic heart failure, EIHF);另一類
為擴張性心肌病引起的心力衰竭，包括原發(fā)性擴張性心肌病及心肌炎后繼發(fā)心肌病所致
心力衰竭。 應(yīng)用本發(fā)明方法，移植UW-MSCs手術(shù)方法有①經(jīng)靜脈快速注入UW-MSCs懸 液；②經(jīng)冠狀動脈超選擇性移植UW-MSCs ;③經(jīng)冠狀動脈選擇性移植UW-MSCs ; 經(jīng) 心內(nèi)膜心肌注射器直接心肌注射移植UW-MSCs。 本發(fā)明UW-MSCs移植治療冠心病心肌梗死后及擴張性心肌病所致慢性心力衰竭 的機理是利用UW-MSCs較自體干細胞更強的自我更新及多向分化潛能，及歸巢與旁/ 自分泌功能，釋放大量生物因子，促進血管和心肌再生等生物學效應(yīng)來修復心肌和改善心 功能，改善這些慢性心力衰竭患者的近期和遠期預(yù)后。 本發(fā)明所應(yīng)用的臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細胞，其性能介于胚胎干細胞與成 體干細胞之間，以其替代患者自體干細胞應(yīng)用于治療心力衰竭，解決了目前細胞療法中 困擾醫(yī)學界的多個問題，如①胚胎干細胞存在的倫理道德、法律、免疫排斥及致腫瘤
4性等問題；②成體干細胞存在的分化增殖歸巢能力低及制備周期長等缺陷；③冠心病患 者抽取自體骨髓醫(yī)從性差、MSCs增殖能力差、劑量不足等問題；④免去體外過長時間 培養(yǎng)及病人長時間等待；⑤可以從根本上改善冠心病心肌梗死后及擴張性心肌病等所致 的慢性心力衰竭患者的預(yù)后，尤其是解決該病高死亡率問題。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。 實施例1 UW-MSCs移植材料的準備——應(yīng)用UW-MSCs新鮮品
將剛剛完成傳代培養(yǎng)2-4代的臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞新鮮品，以0.05-0.25%胰 酶消化l-5分鐘，血清中和，平衡鹽溶液洗滌3遍，離心機的離心力控制在100-1000g， 應(yīng)用含0-100單位肝素/毫升0.9%氯化鈉注射液重懸使用。 實施例2 UW-MSCs移植材料的準備——應(yīng)用冷凍保存的UW-MSCs備用品
從低溫容器中取出凍存的傳2-4代臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞，迅速放入35-38t: 溫箱及水浴箱中，2分鐘內(nèi)溶化，使用完全培養(yǎng)基溶液重懸細胞，培養(yǎng)2-4天細胞融合后 重新消化、洗滌細胞，使用濃度為"肝素1000單位0.9%氯化鈉溶液100毫升"的肝 素氯化鈉注射液，制成細胞濃度為l-2X106/ml的細胞懸液，通常按每支10毫升包裝。
實施例3經(jīng)靜脈移植UW-MSCs手術(shù)方法 將2 X 107UW-MSCs懸液稀釋在20ml肝素鹽水中(肝素200單位+生理鹽水20ml) 從靜脈快速注入。 實施例4經(jīng)冠狀動脈超選擇性移植UW-MSCs手術(shù)方法 對于冠心病慢性缺血性心力衰竭患者在冠脈閉塞血管經(jīng)PCI術(shù)血管再通后執(zhí) 行，將超長(3m)BMW導絲置于閉塞重建血管遠端，沿導絲插入穿導絲球囊置于梗死閉塞 段血管；對于擴張性心肌病慢性心力衰竭者直接將超長(3m)BMW導絲置于左或右優(yōu)勢 冠脈血管遠端，沿導絲插入穿導絲球囊置于優(yōu)勢冠脈血管中遠端之交界處，抽出導絲， 連結(jié)壓力泵，充盈球囊4-8個大氣壓不等，擴張性心肌病患者球囊充盈以不貼血管壁為原 則，冠心病心衰者以阻斷前向血流為標準，高壓快速注入2ml含4Xl()6uW-MSCs(2X106 個/ml)細胞懸液，氣囊保持充盈lmin后恢復灌注，2min后再次重復上述方法注入 UW-MSCs，共注入5 6次。術(shù)中密切心電、血液動力學監(jiān)測。
實施例5經(jīng)冠狀動脈選擇性移植UW-MSCs 采用不進行球囊充盈閉塞的相關(guān)冠脈，在梗死相關(guān)動脈入口，或左右冠狀動脈 主干入口處，或逆灌注血管、側(cè)支血管、橋血管等處同樣分次高壓注入UW-MSCs，細胞
量同實施例4。 此手術(shù)方法適用于部分嚴重冠心病慢性心力衰竭患者。
實施例6經(jīng)心內(nèi)膜直接心肌注射移植UW-MSCs手術(shù)方法 應(yīng)用中國微創(chuàng)公司生產(chǎn)的心肌注射器，經(jīng)股動脈穿剌插入7F心肌旋轉(zhuǎn)注射器經(jīng) 主動脈插入左室，在超聲心動圖聲學造影及電機械標測雙定位下確定梗死心肌部位，于5 個位點共2xl07UW-MSCs細胞數(shù)注入梗死心肌周圍。 此手術(shù)方法適用于冠心病慢性心力衰竭未能血管重建者及部分擴張性心肌病慢 性心力衰竭者。
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實驗例l UW-MSCs體內(nèi)外向心肌細胞分化及功能鑒定 純化3代UW-MSCs用DAPI染色標記后用5-氮胞苷誘導分化，2周后行免疫 熒光染色，共聚焦顯微鏡下檢測發(fā)現(xiàn)，在DAPI染色陽性的UW-MSCs可分化為具有心 肌細胞表型特征的心肌樣細胞，與DAPI共表達肌鈣蛋白(TnT)、肌動蛋白(a-actin)、 GATA-4、 connexin-43。進一步在體內(nèi)，在大鼠缺血性心力衰竭模型上，將綠色熒光蛋白 基因(EGFP)轉(zhuǎn)染UW-MSCs作為UW-MSCs標記，將1 X 106UW-MSCs-EGFP注入大鼠梗 死心肌周圍，4周后心肌組織冷凍切片，免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測，可見原梗死心肌組 織中有EGFP標記的移植細胞UW-MSCs存活生長及分化，EGFP陽性的移植細胞與EGFP 共表達肌鈣蛋白(TnT)、肌動蛋白(aactin)、 GATA-4、 connexin-43等心肌細胞表型標志。 為了進一步鑒定UW-MSCs移植后整體心功能效應(yīng)，于AMI制備后及UW-MSCs移植后應(yīng) 用2維超聲心動圖進行動態(tài)心功能監(jiān)測，結(jié)果顯示，UW-MSCs移植后7天LVEF絕對值 增加5.3%、 28天增加6.8%，短軸縮短率亦明顯增加，而對照組心功能惡化，應(yīng)用TTC 染色心肌梗死范囲明顯縮小。
實驗例2 UW-MSCs免疫源性鑒定 本發(fā)明將UW-MSCs作細胞移植材料，與自體BMSCs所不同的是，采用的是同 種異體干細胞作為種子細胞來源，即異基因種子細胞。異基因種子細胞移植的關(guān)鍵是移 植免疫學問題，此也是本發(fā)明實用性所系。為此，發(fā)明人進行了系統(tǒng)的UW-MSCs體內(nèi) 外免疫源性鑒定。 體外實驗以流式細胞儀進行UW-MSCs免疫表型鑒定，結(jié)果為UW-MSCs僅 表達HLA-ABC，不表達HLA-II類抗源HLA-DR及協(xié)同剌激抗源CD80， CD86，表明 UW-MSCs體外無免疫源性。 UW-MSCs移植后進行整體免疫學觀察，觀察項目和結(jié)果為①動態(tài)混合淋巴 細胞培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)UW-MSCs對異體淋巴細胞有明顯抑制增殖反應(yīng)；②外周血T細胞亞 群檢測，流式細胞儀動態(tài)檢測移植后大鼠周圍血T淋巴細胞CD3、 CD4、 CD8變化， UW-MSCs均無剌激增加；③局部組織病理學檢測光鏡檢測UW-MSCs移植區(qū)域心肌組 織未見淋巴細胞、巨噬細胞增殖侵潤等心肌組織免疫反應(yīng)性變化。
實驗例3 UW-MSCs移植對動物模型心肌恢復作用實驗 大鼠給鹽酸氯胺酮10mg/kg、速眠新80mg/kg腹腔注射麻醉，氣管插管人工呼吸 支持下，于左3-4肋間逐層切開，暴露左心耳與肺動脈交界前室間溝，7-0絲線模穿冠狀 動脈左前降支近段全層結(jié)扎，顯示左室前壁心肌變紫黑色，局部心電圖顯示ST段-T明顯 抬高，為AMI模型成功。于AMI后5天，應(yīng)用2-D超聲心動圖檢測確定左室射血分 數(shù)(LVEF) < 50%為心衰模型成功。心衰大鼠分兩組①UW-MSCs移植組；②對照生 理鹽水注射組。于AMI后7天，將經(jīng)ad-EGFP基因轉(zhuǎn)染的1X 106UW-MSCs分5點注入 梗死心肌周圍。 大鼠存活4周末行2-D超聲心動圖檢測，UW-MSCs移植組心衰大鼠心功能明 顯改善，其左室射血分數(shù)(LVEF)較移植前絕對值平均增加10.2±2.3% (n = 8)，對照組 LVEF減低2.7±0.8% (n = 8)， 二組相比P < 0.01 ;左室短軸縮短率UW-MSCs移植組 較術(shù)前增加絕對值3.9%，對照組減低4.5， 二者相比P〈0.01， UW-MSCs移植后左室舒 張末容量減低，但與對照組未構(gòu)成統(tǒng)計學差異。
大鼠存活5周處理，UW-MSCs移植心衰大鼠及對照組心衰大鼠心肌組織冷凍 切片，免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測，可見原梗死組織中有EGFP標記-UW-MSCs分化的 心肌樣細胞存在，EGFP陽性心肌樣細胞共表達肌鈣蛋白(TnT)、肌動蛋白(a-actin)、 GATA-4、 connexin-43等心肌細胞表型標志。
實驗例4臨床應(yīng)用典型病例 患者李某，男性，71歲，發(fā)作性心前區(qū)悶痛10余年，冠脈造影為3支病變，于 2007年11月行搭橋術(shù)，術(shù)后6月出現(xiàn)活動時呼吸困難，逐漸加重，發(fā)作夜間陣發(fā)性呼吸 困難，后進展為夜間不能平臥，雙下肢無水腫，活動嚴重受限，左室射血分數(shù)29%，經(jīng) 優(yōu)化內(nèi)科藥物治療無效。于2009年6月18日予UW-MSCs 6xl06靜注，后2周，心功能 LVEF由29%升至42%， 6分鐘步行試驗由原20米至450米，病人夜間平臥入睡，再無 夜間陣發(fā)性呼吸困難發(fā)作。UW-MSCs細胞移植后2月，可每日散步1小時。
權(quán)利要求
臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細胞作為治療因冠心病及擴張性心肌病引起的心力衰竭細胞移植材料的應(yīng)用。
2. 權(quán)利要求1所述因冠心病引起的心力衰竭為慢性缺血性心力衰竭。
3. 權(quán)利要求1所述因冠心病引起的心力衰竭為終末期缺血性心力衰竭。
4. 權(quán)利要求1所述因擴張性心肌病引起的心力衰竭為原發(fā)性擴張性心肌病所致心力衰竭。
5. 權(quán)利要求1所述因擴張性心肌病引起的心力衰竭為心肌炎后繼發(fā)心肌病所致心力衰竭。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞的用途，其特征在于，所用細胞移 植材料為完成2-4代傳代培養(yǎng)的臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞新鮮品。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞的用途，其特征在于，所用細胞移 植材料為經(jīng)傳代培養(yǎng)2-4代的臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞冷凍保存品。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞的用途，其特征在于，使用冷凍保 存的臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞的方法是，從低溫容器中取出凍存的細胞迅速放入35-38°C 溫箱及水浴箱中，2分鐘內(nèi)溶化，使用完全培養(yǎng)基溶液重懸細胞，培養(yǎng)2-4天細胞融合后 重新消化、洗滌細胞，使用濃度為"肝素1000單位0.9%氯化鈉溶液100毫升"的肝 素氯化鈉注射液制成細胞濃度為l-2X106/ml的臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞懸液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞的用途，其特征在于，經(jīng)冠狀動 脈超選擇性移植或超選擇性移植，每次注入4X10e臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞，間斷注射 5 6次。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞的用途，其特征在于，經(jīng)心內(nèi) 膜直接心肌注射移植，于5個位點共注入2X 107臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細胞作為治療因冠心病及擴張性心肌病引起的心力衰竭細胞移植材料的應(yīng)用，包括心肌梗死后引起的慢性缺血性心力衰竭、終末期缺血性心力衰竭，及原發(fā)性擴張性心肌病和心肌炎后繼發(fā)心肌病所致的心力衰竭。
文檔編號A61P9/04GK101690731SQ200910170248
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月9日
發(fā)明者丁青艾, 張寧坤, 曹毅, 朱智明, 楊曄, 陳宇, 高連如 申請人:中國人民解放軍海軍總醫(yī)院