含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種蛋白的骨基質(zhì)材料及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種蛋白的骨基質(zhì)材料及制備方法，該材料為在同種異體脫鈣骨基質(zhì)表面接種有分泌出成骨誘導(dǎo)功能蛋白而促進(jìn)成骨的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的動(dòng)物骨基質(zhì)材料。該骨基質(zhì)材料具有骨組織的天然結(jié)構(gòu)和特性以及良好的成骨誘導(dǎo)效果，在骨缺損修復(fù)中具有更強(qiáng)的促進(jìn)成骨作用，該骨基質(zhì)材料有助于組織工程骨的規(guī)?；苽浜团R床應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種蛋白的骨基質(zhì)材料及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)學(xué)的骨基質(zhì)材料，特別涉及一種含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種蛋白的骨基質(zhì)材料及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]因外傷、感染、腫瘤等各種原因所致的骨缺損十分常見(jiàn)，其治療和修復(fù)是骨科臨床中最常見(jiàn)的難題之一，而理想的骨缺損修復(fù)方法還在不斷地探索中。近年來(lái)，個(gè)體化組織工程骨的修復(fù)方式給骨缺損修復(fù)帶來(lái)新的希望。然而，該修復(fù)方式需要體外構(gòu)建、細(xì)胞擴(kuò)增、骨回植等一系列冗繁的過(guò)程，周期長(zhǎng)達(dá)3-4周，費(fèi)用昂貴，技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求嚴(yán)格，且受患者自體種子細(xì)胞質(zhì)量、年齡、疾病等多種因素影響，預(yù)期在臨床應(yīng)用尚早。
[0003]骨修復(fù)過(guò)程，是一個(gè)多蛋白、多因子協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜調(diào)控過(guò)程。種子細(xì)胞分泌的多種功能蛋白在組織工程骨成骨修復(fù)的不同階段具有不同的作用。然而，組織工程骨修復(fù)成骨過(guò)程的具體機(jī)制還不明確。其中，種子細(xì)胞在植入體內(nèi)發(fā)揮的具體作用存在較大的爭(zhēng)議。有文獻(xiàn)報(bào)道，種子細(xì)胞植入體內(nèi)后因氧分子彌散距離有限(150-200 μ m)、局部血凝塊形成屏障等因素限制，導(dǎo)致種子細(xì)胞在短期內(nèi)大部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡或調(diào)亡。[1、SunXJ, Peng W，Yang ZL, etal, Heparin-chitosan-coated acellular bone matrix enhancesperfusion of blood and vascularization in bone tissue engineering scaffolds.Tissue Eng Part A..2011.0027.2> Jeroen Rouwkema, Nicolas C,Rivronletal.Vascularization in tissue engineering, cell, 26June2008]。目前，普遍認(rèn)同的觀點(diǎn)是種子細(xì)胞分泌的功能蛋白或細(xì)胞因子在組織工程骨修復(fù)成骨中發(fā)揮著重要作用[2、Hou T,ffuX，Luo F, etal.VEGF and physiological compressive loading synergistically promotebone formation of tissue-engineered bone.Tissue Eng Part A.2013Jun20.]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)、血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(FGF)等，這些因子經(jīng)體外培養(yǎng)觀察，均有復(fù)制細(xì)胞、合成DNA和骨基質(zhì)及刺激細(xì)胞增殖與分化作用，其中有些起直接刺激，有些起中間介導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用。已有的研究也表明多因子作用修復(fù)組織缺損具有協(xié)同作用，其效果明顯優(yōu)于單因子。
[0004]同種異體骨基質(zhì)(DBM)是目前最常用的組織工程骨支架材料，經(jīng)過(guò)深低溫凍存、脫月旨、脫功能蛋白、脫鈣、Y射線輻照等一系列處理后，有極小的免疫源性，因其天然的三維空間結(jié)構(gòu)、一定的骨誘導(dǎo)活性等是一種理想的組織工程骨支架材料。
[0005]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(ESCs)及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨組織工程臨床應(yīng)用良好的種子細(xì)胞來(lái)源。BMSCs受來(lái)源、手術(shù)操作、擴(kuò)增復(fù)雜等多種條件限制，適應(yīng)于組織工程的個(gè)體化治療，不能規(guī)模制備滿足臨床需求。而源于新生胎兒臍帶的ESCs具有來(lái)源廣泛，取材可控性高，干細(xì)胞分化潛能高等特點(diǎn)，較適合臨床規(guī)?；苽浼皯?yīng)用。但臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種DBM后，通過(guò)不同時(shí)期體外培養(yǎng)后行脫細(xì)胞處理而作為一種骨基質(zhì)材料還未見(jiàn)報(bào)道。
[0006]因此，目前如何解決骨組織工程研究及臨床應(yīng)用中面臨的種子細(xì)胞獲取難、費(fèi)用昂貴、臨床應(yīng)用難、運(yùn)輸難、規(guī)模化制備難等問(wèn)題，是本領(lǐng)域關(guān)注的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種蛋白的骨基質(zhì)材料及制備方法，該骨基質(zhì)材料具有骨組織的天然結(jié)構(gòu)和特性以及良好的成骨誘導(dǎo)效果，在骨缺損修復(fù)中具有更強(qiáng)的促進(jìn)成骨作用，該骨基質(zhì)材料有助于組織工程骨的規(guī)?；苽浜团R床應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0009]一種含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種蛋白的骨基質(zhì)材料，其特征在于:該材料為在同種異體脫鈣骨基質(zhì)表面接種有分泌出成骨誘導(dǎo)功能蛋白而促進(jìn)成骨的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的動(dòng)物骨基質(zhì)材料。
[0010]所述成骨誘導(dǎo)功能蛋白為骨形態(tài)發(fā)生功能蛋白、血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和類胰島素樣生長(zhǎng)因子。
[0011]所述骨基質(zhì)材料為人骨或羊骨。
[0012]接種有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的骨基質(zhì)材料的制備方法，有以下步驟:
[0013]I)取同種異體骨基質(zhì)材料，脫鈣:在密閉容器中盛入0.2~0.6M鹽酸，按5ml/g骨基質(zhì)投入其中浸泡，在常溫下，浸泡24小時(shí)，每8小時(shí)更換鹽酸一次，處理后的骨基質(zhì)呈海綿狀，能壓縮并自動(dòng)恢復(fù)原狀 ，放入無(wú)菌蒸餾水中反復(fù)沖洗浸泡，直至PH~7 ;
[0014]2)步驟I)得到的骨基質(zhì)材料用鈷-60 Y射線滅菌，置_80°C深低凍存；
[0015]3)步驟2)所述的滅菌凍存的骨基質(zhì)材料，室溫下，用DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡，每隔2天更換一次培養(yǎng)液，至培養(yǎng)液不再變色，取出，放入37°C孵箱中蒸干骨基質(zhì)材料中的水分；
[0016]4)獲取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0017]5)擴(kuò)增臍帶間充質(zhì)細(xì)胞得到PO、PU P2、P3、P4、P5代細(xì)胞；
[0018]6) P3-P5代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按I~3X 107/mL接種于步驟3)得到骨基質(zhì)上，放置在細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)孵育2h，再加入DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12d，得到接種有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的骨基質(zhì)材料；
[0019]7)步驟6)接種有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的骨基質(zhì)材料，進(jìn)行無(wú)菌冷凍干燥24h的脫細(xì)胞處理，得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種成骨誘導(dǎo)蛋白的基質(zhì)材料。
[0020]步驟2)所述的鈷-60 Y射線滅菌，用劑量為25KGay的鈷-60 Y射線照射骨基質(zhì)材料12h。
[0021]步驟6)所述的接種時(shí)，在IcmX lcmX0.5cm的骨基質(zhì)材料的正反面分別接種
0.1mL的細(xì)胞懸液，正反面接種的間隔時(shí)間2h。
[0022]步驟4)所述的獲取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，有以下步驟:
[0023](I)剝離血管、筋膜，將其剪成0.5-lmm3的組織塊(盡可能地剪碎)；37°C孵箱倒扣培養(yǎng)2小時(shí)；若未發(fā)生污染，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天；
[0024](2)第6天進(jìn)行半換液，此后每2-3天半換液一次，直至細(xì)胞長(zhǎng)出，組織塊附近細(xì)胞單層融合80%時(shí)，傳代、收集單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以IO5/瓶的密度接種75cm2培養(yǎng)瓶，記為PO代細(xì)胞。
[0025]步驟5)所述的擴(kuò)增臍帶間充質(zhì)細(xì)胞，有以下步驟:
[0026]( I)細(xì)胞貼壁融合至80%時(shí)，對(duì)其傳代處理；
[0027](2)吸去培養(yǎng)液，生理鹽水清洗I遍，加入胰酶，吹打；
[0028](3)離心，棄上清，重懸細(xì)胞，按1:3比例接種培養(yǎng)，記為PO代；
[0029](4)當(dāng)PO代細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，再次對(duì)其進(jìn)行傳代，記為Pl代，如此反復(fù)，得到 P2、P3、P4、P5 代；
[0030](5).種子細(xì)胞用于支架復(fù)合前，其培養(yǎng)液作無(wú)感染原檢測(cè)，種子細(xì)胞作干細(xì)胞表面抗原檢測(cè)。
[0031]步驟(5)中所述種子細(xì)胞作干細(xì)胞表面抗原檢測(cè)為:HIV、梅毒、甲肝、乙肝、丙肝、內(nèi)毒素、真菌、細(xì)菌檢測(cè)。
[0032]采用上述技術(shù)方案，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于脫鈣DBM上，經(jīng)過(guò)深低溫等方法盡可能去除免疫源性，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌出的成骨誘導(dǎo)功能蛋白，在局部微環(huán)境中誘導(dǎo)骨發(fā)生，發(fā)揮骨再生及修復(fù)作用，使已應(yīng)用于臨床的脫鈣骨基質(zhì)材料具有較強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)活性，避免因異體骨成骨能力不足而取自體骨的缺陷，該骨基質(zhì)材料具有較好的成骨誘導(dǎo)功能，有助于組織工程骨的規(guī)?；苽浜团R床應(yīng)用，本發(fā)明所構(gòu)建的復(fù)合材料是組織工程骨支架材料未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)之一。
[0033]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞有著良好的成骨、成軟骨、成內(nèi)皮細(xì)胞的分化潛能，在骨的發(fā)生及血管化中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞來(lái)源充足無(wú)創(chuàng)取材，增殖及擴(kuò)增的代數(shù)遠(yuǎn)高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；并且血管化亦優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞裂解后，其骨發(fā)生相關(guān)因子與骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞類似。所以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是較理想的種子細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于DBM可明顯促進(jìn)其成骨分化及增殖。[l]Honsawek S，Dhitiseith D, PhupongV.Effects of demineralized bone matrix on proliferation and osteogenicdifferentiation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord.J MedAssoc Tha1.2006Sep ; 89Suppl3: S189-95.[2]Liu G，Li Y，Sun J，et al.1n vitro andin vivo evaluation of osteogenesis of human umbilical cord blood-derivedmesenchymal stem cells on partially demineralized bone matrix.Tissue Eng PartA.2010Mar; 16(3):971-82.[0034]本發(fā)明所述基質(zhì)材料與現(xiàn)有的組織工程基質(zhì)材料相比有以下區(qū)別:
[0035]1.組織工程骨的構(gòu)建理念不同:現(xiàn)有構(gòu)建方法為體外接種種子細(xì)胞，體外細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后移植體內(nèi)行個(gè)體化應(yīng)用，利用移植的干細(xì)胞的特性來(lái)誘導(dǎo)成骨；而本發(fā)明所述含有多種功能蛋白的組織工程骨為依靠干細(xì)胞分泌的多種功能蛋白誘發(fā)體內(nèi)成骨機(jī)制而促進(jìn)成骨，該方法構(gòu)建的組織工程骨可以批量制備、廣泛化應(yīng)用、方便存儲(chǔ)及運(yùn)輸。
[0036]2.本發(fā)明所述方法制備的組織工程支架材料除具備脫細(xì)胞骨基質(zhì)的特性外，與現(xiàn)有支架材料不同的是:本發(fā)明利用體外干細(xì)胞分泌的多種功能蛋白及細(xì)胞因子增強(qiáng)其在體內(nèi)的骨誘導(dǎo)活性，而不是采用包裹或滴加細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的方式。
[0037]3.現(xiàn)有的組織工程骨支架材料不具有或具有較低的骨誘導(dǎo)功能，常常需要同費(fèi)用昂貴的生長(zhǎng)因子或自體骨等聯(lián)合使用；本發(fā)明所述材料富含多種成骨誘導(dǎo)功能蛋白，如:骨形態(tài)發(fā)生功能蛋白(BMPs)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、和類胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)等，其中骨形態(tài)發(fā)生功能蛋白一 2 (BMP-2)成骨活性在BMPs家族中最強(qiáng)，是一種可以獨(dú)立誘導(dǎo)骨形成的生長(zhǎng)因子，已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)尚能刺激細(xì)胞復(fù)制和DNA合成。類胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的有絲分裂，影響成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)堿性磷酸酶活性，促進(jìn)骨鈣素合成及增強(qiáng)骨連接素的表達(dá)，從而達(dá)到促進(jìn)骨重建的目的。血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)有TOGF-AA、PDGF-BB和TOGF-AB等多種亞型，在體外具有促進(jìn)纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，它對(duì)所有起源于間葉的細(xì)胞(包括成骨細(xì)胞)具有絲裂原作用，既能促進(jìn)骨形成，又能刺激骨吸收，對(duì)骨重建起雙向調(diào)節(jié)作用，PDGF能夠刺激間充質(zhì)細(xì)胞的增殖及遷移。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種能特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的因子，能誘發(fā)骨折斷端及周圍軟組織新生血管生成，增加血液的通透性，為斷端的氧氣、營(yíng)養(yǎng)成份的運(yùn)輸提供條件，同時(shí)清除斷端的殘留壞死組織，從而促進(jìn)骨愈合。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)能改變成纖維細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)特性而獲得在瓊脂中生長(zhǎng)的能力，并失去生長(zhǎng)中密度信賴的抑制作用。TGF在治療傷口愈合，促進(jìn)軟骨和骨修復(fù)以及通過(guò)免疫抑制治療自身免疫性疾病和移植排斥等方面有潛在的應(yīng)用前景。
[0038]骨生長(zhǎng)因子在骨形成的過(guò)程中作用機(jī)制極其復(fù)雜，它們互相促進(jìn)或抑制，成網(wǎng)絡(luò)狀聯(lián)系，在骨形成中起著重要的作用，其協(xié)同作用主要表現(xiàn)如下:
[0039]UPDGF與IGF的協(xié)同作用:H)GF能使處于靜止期(G1/G0)的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袕?fù)制DNA潛能的細(xì)胞，而IGF則可在TOGF的基礎(chǔ)上，使細(xì)胞通過(guò)G0、G1期進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，繼而發(fā)生有絲分裂，因此二者聯(lián)合應(yīng)用最終有利于骨的增殖
[0040]2、VEGF與BMP的協(xié)同作用:BMP可以上調(diào)VEGF的表達(dá)，而VEGF又通過(guò)促進(jìn)局部血管增生和成骨細(xì)胞分化參與BMP的誘導(dǎo)成骨作用。
[0041]3、BMP與bFGF的協(xié)同作用:bFGF促進(jìn)血管形成并長(zhǎng)入移植骨和促進(jìn)細(xì)胞增殖是加速了新骨形成的決定因素，彌補(bǔ)了單一使用BMP的不足。
[0042]因此，在同種異體脫鈣骨基質(zhì)表面接種有能分泌出成骨誘導(dǎo)功能蛋白的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，可增加在體內(nèi)的成骨誘導(dǎo)活性。
[0043]本發(fā)明所述基質(zhì)材料具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0044]1.基本沒(méi)有免疫原性；
[0045]2.具有骨傳導(dǎo)性和良好的骨誘導(dǎo)性；
[0046]3.具有天然骨的良好的三維結(jié)構(gòu)和高孔隙率；
[0047]4.可根據(jù)需要隨意加工成各種形狀和大小，并在植入后可保持再生組織的大體形態(tài)內(nèi)態(tài)；
[0048]5.便于保存和運(yùn)輸，可實(shí)現(xiàn)臨床“隨取隨用”的原則。
[0049]本發(fā)明所述骨基質(zhì)材料仍保留骨組織的天然三維結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性及低免疫原性，同時(shí)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌出的成骨誘導(dǎo)功能蛋白具有良好的局部成骨誘導(dǎo)功能。該材料作為骨缺損修復(fù)材料、脊柱融合填充材料或組織工程骨支架具有明顯的促進(jìn)成骨誘導(dǎo)作用且，且加工制作科學(xué)合理、簡(jiǎn)便易行、便于運(yùn)輸，并有助于組織工程骨的規(guī)?；苽浜团R床應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0050]圖1為含有多種蛋白的基質(zhì)材料孔徑觀察電鏡掃描圖；
[0051]圖2為凍干后細(xì)胞殘?bào)w的電鏡掃描圖；
[0052]圖3為不同時(shí)相點(diǎn)凍干后和未凍干DBM/細(xì)胞復(fù)合體的蛋白量的柱狀圖；
[0053]圖4為蛋白芯片檢測(cè)凍干DBM/細(xì)胞復(fù)合體富含的功能蛋白的柱狀圖；
[0054]圖5為用單純DBM對(duì)12周裸鼠股骨股四頭肌肌袋異位成骨的示圖；
[0055]圖6為用本發(fā)明所述骨基質(zhì)材料對(duì)12周裸鼠股骨股四頭肌肌袋異位成骨的示圖；
[0056]圖7為用單純DBM對(duì)16周山羊股骨2cm骨缺損修復(fù)的骨塑形示圖；
[0057]圖8為用本發(fā)明所述骨基質(zhì)材料對(duì)對(duì)16周山羊股骨2cm骨缺損修復(fù)的骨塑形的示圖。
【具體實(shí)施方式】
[0058]一.試劑和材料:鹽酸(市售的分析純)，DMEM/F12培養(yǎng)液(hyclone公司，美國(guó))，DBM (北京大清生物技術(shù)有限責(zé)任公司，北京)，羊臍帶(中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院，中國(guó))，
[0059]二.接種有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的骨基質(zhì)材料的制備方法:
[0060]1.脫鈣
[0061](I)取市售的或自制的同種異體骨基質(zhì)材料，在密閉玻璃容器中盛入0.2~0.6M鹽酸，按5ml/g骨基質(zhì)投入其中 浸泡，在常溫下，浸泡24小時(shí)，每8小時(shí)更換鹽酸一次，處理后的骨基質(zhì)呈海綿狀，能壓縮并自動(dòng)恢復(fù)原狀，放入無(wú)菌蒸餾水中反復(fù)沖洗浸泡，直至PH ^ 7 ；
[0062](2)滅菌儲(chǔ)存
[0063]采用鈷-60 Y射線滅菌，劑量為25KGay，時(shí)間12h，置_80°C深低溫冰箱凍存3個(gè)月后待用。
[0064]2.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種
[0065](I)將已滅菌并在-70°C凍存的DBM取出，恢復(fù)至室溫，用DMEM/F12培養(yǎng)液(hyclone公司，美國(guó))浸泡7天，每隔2天換液一次，直到培養(yǎng)液不再變色為止，吸出培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放入取出水盆的37°C孵箱中使DBM中的水分緩慢蒸發(fā)干。
[0066](2)將P3-P5代的長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的人或山羊的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以I~3X107/mL的濃度均勻接種于DBM上,每塊IcmX lcmX0.5cm大小的DBM支架正反面分別接種0.1mL的細(xì)胞懸液，間隔時(shí)間2h，再加入一定量DMEM/F12培養(yǎng)液(hyclone公司，美國(guó))繼續(xù)培養(yǎng)12d。
[0067]3.冷凍干燥脫細(xì)胞處理
[0068]將培養(yǎng)12d的組織工程骨在無(wú)菌操作下行冷凍干燥24h脫細(xì)胞處理，得到含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種蛋白的骨基質(zhì)材料，放進(jìn)_80°C深低溫冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0069]三.含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種蛋白的骨基質(zhì)材料的生物安全性評(píng)價(jià)
[0070]1.熱源試驗(yàn):
[0071 ] 收集培養(yǎng)細(xì)胞3d后的培養(yǎng)液，稱作浸提液，在BALB/c小鼠皮下注射前后體溫波動(dòng)在0.5°C以內(nèi)，且注射后不高于注射前體溫.波動(dòng)幅度小于1.(TC。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為前后體溫波動(dòng)為0.2±0.05°C，波動(dòng)幅度為0.3±0.18°C。
[0072]2.皮膚刺激試驗(yàn):
[0073]注射BALB/c腹部皮下后各時(shí)間點(diǎn)觀察顯示，注射浸提液(培養(yǎng)細(xì)胞3d后的培養(yǎng)液)及生理鹽水處未發(fā)現(xiàn)有紅斑，水腫或壞死出現(xiàn)，注射20%酒精生理鹽水后6小時(shí)至72小時(shí)可見(jiàn)注射區(qū)有1.0—1.5cn直徑的紅斑，中心部分水腫明顯，且水腫中心部分出現(xiàn)不規(guī)則的壞死，并有結(jié)痂形成。
[0074]3.肌肉埋植試驗(yàn):
[0075]將本發(fā)明所述骨基質(zhì)材料植入BALB/c小鼠股骨后48小時(shí)傷口有稍微的紅腫并有輕微炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，I周后傷口愈合。植入2周后.有明顯的纖維包膜形成，且炎性細(xì)胞減少，材料周圍可見(jiàn)多核巨噬細(xì)胞吞噬外來(lái)小顆粒。鏡下未見(jiàn)有肌肉組織變性、壞死或植入物被排斥現(xiàn)象發(fā)生。
[0076]4.細(xì)胞毒性試驗(yàn):
[0077]取含有多種蛋白的骨基質(zhì)材料5g，按0.lml/g的比例加入浸提介質(zhì)DMEM培養(yǎng)基，37°C恒溫箱中保持72小時(shí)，無(wú)菌過(guò)濾，得到浸提液。100%、50%濃度的浸提液為實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組為DMEM培養(yǎng)基，通過(guò)MTT比色法觀察，具體方法:將濃度為6 X 104cell/mL的L-929細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)懸液種植于96孔板中，按100 μ L/孔種植9組，每組8孔，共3板。培養(yǎng)IOh,細(xì)胞牢固貼壁后倒掉原培養(yǎng)液，按100 μ L/孔加入浸提液。培養(yǎng)72h時(shí)棄去，加入MTT液(全稱為溴化3-(4，5- 二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四唑，Sigma公司，美國(guó))繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出孔內(nèi)液體，加入DMSO(二甲基亞砜，Sigma公司，美國(guó))震蕩10分鐘，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(波長(zhǎng)490nm)測(cè)定OD值。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative growth rate, RGR), RGR=(各材料組OD均值/陰性對(duì)照組OD均值)X 100%。根據(jù)ISO和GB/T中細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定材料的毒性，RGR<100為O級(jí)，75~99%為I級(jí)，50~74%為2級(jí)，25~49%為3級(jí)，I~24%為4級(jí)，O為5級(jí)，其中毒性反應(yīng)O~I級(jí)為合格醫(yī)用材料。結(jié)果示:100%、50%、DMEM三組的OD值分別為0.31 ±0.05,0.33±0.03,0.36±0.07，兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05，在許多研究領(lǐng)域，0.05的P值通常被認(rèn)為是可接受錯(cuò)誤的邊界水平，P值的結(jié)果< 0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的邊界線)，RGR%分別為105.8、108.6、112.4，細(xì)胞毒性均為O級(jí)，說(shuō)明含有多種蛋白的骨基質(zhì)材料沒(méi)有毒性，對(duì)細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響。
[0078]四.含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種蛋白的骨基質(zhì)材料的有效性評(píng)價(jià)
[0079]1.含多種蛋白的骨基質(zhì)具有天然骨的三維立體網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，孔徑約為390±205 μ m，孔隙連通率為72±21%，(參見(jiàn)圖1)，這種結(jié)構(gòu)適合細(xì)胞的長(zhǎng)入、生長(zhǎng)及基質(zhì)分泌(參見(jiàn)圖2)。
[0080]2.不同時(shí)相點(diǎn)凍干骨與未凍干骨的蛋白量檢測(cè)
[0081 ] 實(shí)驗(yàn)方法:將DBM+ESCs組(對(duì)照組)和DBM+ESCs凍干組(實(shí)驗(yàn)組)組織剪碎后加入裂解液，用高速機(jī)械勻漿器破碎組織。加抽提試劑充分混勻。室溫靜置10分鐘。離心后，溶液分為兩相，中間為蛋白膜。吸除上層液體；隨后用吸頭或針頭輕輕撥開(kāi)蛋白膜，吸除下液體。蛋白膜將附著于離心管壁。室溫10分鐘空氣干燥沉淀。(參見(jiàn)圖3)
[0082]3.蛋白芯片定量檢測(cè)
[0083]實(shí)驗(yàn)方法:將DBM與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(ESCs)培養(yǎng)一定時(shí)間后，隨機(jī)分選DBM+ESCs組(對(duì)照組)和DBM+ESCs凍干組(實(shí)驗(yàn)組)，提取蛋白后，通過(guò)蛋白芯片技術(shù)高通量定量篩選檢測(cè)相關(guān)成骨的蛋白表達(dá)量。
[0084]結(jié)果:對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均含有多種成骨相關(guān)蛋白表達(dá)(參見(jiàn)圖4)。
[0085]4.裸鼠股四頭肌肌袋異位成骨實(shí)驗(yàn):
[0086]實(shí)驗(yàn)方法:4-6周齡的裸鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供)16只，雌雄不限，麻醉后，制備股骨股四頭肌，完全去除骨膜后分別在左右股骨后外側(cè)植入2x2x2_DBM(對(duì)照組)和含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種蛋白的骨基質(zhì)材料(實(shí)驗(yàn)組)，術(shù)后8周觀察肌袋異位成骨效果。
[0087]Micro-CT結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組新生骨面積大，骨質(zhì)密度高，連續(xù)性好，對(duì)照組新生骨面積小，骨質(zhì)密度低，連續(xù)性差，實(shí)驗(yàn)組的成骨效果明顯高于對(duì)照組(參見(jiàn)圖5-6 )。
[0088]5.山羊股骨原位臨界骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn):
[0089]實(shí)驗(yàn)方法:12-15個(gè)月的雄性青山羊(中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供)麻醉后，用髓內(nèi)釘固定，截取2cm臨界骨缺損(參見(jiàn)圖7)，分別用DBM材料(對(duì)照組)及含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種蛋白的骨基質(zhì)材料(實(shí)驗(yàn)組)修復(fù)骨缺損，術(shù)后16周觀察原位成骨效果。
[0090]結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組 骨塑型良好，對(duì)照組還未完全骨連接，實(shí)驗(yàn)組的成骨效果明顯高于對(duì)照組(參見(jiàn)圖8)。
【權(quán)利要求】
1.一種含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種蛋白的骨基質(zhì)材料，其特征在于:該材料為在同種異體脫鈣骨基質(zhì)表面接種有分泌出成骨誘導(dǎo)功能蛋白而促進(jìn)成骨的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的動(dòng)物骨基質(zhì)材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的材料，其特征在于:所述成骨誘導(dǎo)功能蛋白為骨形態(tài)發(fā)生功能蛋白、血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和類胰島素樣生長(zhǎng)因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的材料，其特征在于:所述骨基質(zhì)材料為人骨或羊骨。
4.接種有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的骨基質(zhì)材料的制備方法，其特征在于，有以下步驟: 1)取同種異體骨基質(zhì)材料，脫鈣:在密閉容器中盛入0.2~0.6M鹽酸，按5ml/g骨基質(zhì)投入其中浸泡，在常溫下，浸泡24小時(shí)，每8小時(shí)更換鹽酸一次，放入無(wú)菌蒸餾水中反復(fù)沖洗浸泡，直至PH~7 ; 2)步驟I)得到的骨基質(zhì)材料用鈷-60Y射線滅菌，置_80°C深低凍存； 3)步驟2)所述的滅菌凍存的骨基質(zhì)材料，室溫下，用DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡，每隔2天更換一次培養(yǎng)液，至培養(yǎng)液不再變色，取出，放入37°C孵箱中蒸干骨基質(zhì)材料中的水分； 4)獲取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞； 5)擴(kuò)增臍帶間充質(zhì)細(xì)胞得到PO、PUP2、P3、P4、P5代細(xì)胞； 6)P3-P5代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按I~3XIOVmL接種于步驟3)得到骨基質(zhì)上，放置在細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)孵育2h，再加入DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12d，得到接種有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的骨基質(zhì)材料；` 7)步驟6)接種有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的骨基質(zhì)材料，進(jìn)行無(wú)菌冷凍干燥24h的脫細(xì)胞處理，得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種成骨誘導(dǎo)蛋白的基質(zhì)材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:步驟2)所述的鈷-60Y射線滅菌，用劑量為25KGay的鈷-60 Y射線照射骨基質(zhì)材料12h。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:步驟6)所述的接種時(shí)，在IcmX lcmX0.5cm的骨基質(zhì)材料的正反面分別接種0.1mL的細(xì)胞懸液,正反面接種的間隔時(shí)間2h。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:步驟4)所述的獲取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，有以下步驟: (1)剝離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的血管、筋膜，將其剪成0.5-1_3的組織塊，37°C培養(yǎng)2小時(shí)，若未發(fā)生污染，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天； (2)第6天進(jìn)行半換液，此后每2-3天半換液一次，直至細(xì)胞長(zhǎng)出，組織塊附近細(xì)胞單層融合80%時(shí)，傳代、收集單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以IO5/瓶的密度接種75cm2培養(yǎng)瓶，記為PO代細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:步驟5)所述的擴(kuò)增臍帶間充質(zhì)細(xì)胞，有以下步驟: (1)細(xì)胞貼壁融合至80%時(shí)，對(duì)其傳代處理； (2)吸去培養(yǎng)液，生理鹽水清洗I遍,加入胰酶,吹打； (3)離心，棄上清，重懸細(xì)胞，按1:3比例接種培養(yǎng)，記為PO代； (4)當(dāng)PO代細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，再次對(duì)其進(jìn)行傳代，記為Pl代，如此反復(fù)，得到P2、P3、P4、P5 代； (5).種子細(xì)胞用于支架復(fù)合前，其培養(yǎng)液作無(wú)感染原檢測(cè)，種子細(xì)胞作干細(xì)胞表面抗原檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:步驟(5)中所述種子細(xì)胞作干細(xì)胞表面抗原檢測(cè)為:HIV、梅毒、甲 肝、乙肝、丙肝、內(nèi)毒素、真菌、細(xì)菌檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK103480040SQ201310449152
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】許建中, 侯天勇, 常正奇, 李志強(qiáng), 羅飛, 吳雪暉, 鄧墨淵, 王品品 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院